BR102018010797A2 - método para detecção e quantificação de gadodiamida (gd-dtpa-bma) em amostras farmacêuticas e biológicas e uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção descreve um método analítico, por cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) utilizando detector de arranjo de diodos (DAD) em uma fase estacionária zwitteriônica, capaz de detectar e quantificar gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas. Este método pode ser utilizado para detectar e quantificar gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas, tais como lipossomas e soro sanguíneo.

Description

MÉTODO PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE GADODIAMIDA (GD-DTPA-BMA) EM AMOSTRAS FARMACÊUTICAS E BIOLÓGICAS E USO

[001] A presente invenção descreve um método analítico, por cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) utilizando detector de arranjo de diodos (DAD) em uma fase estacionária zwitteriônica, capaz de detectar e quantificar gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas. Este método pode ser utilizado para detectar e quantificar gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas, tais como lipossomas e soro sanguíneo.

[002] Gd-DTPA-BMA é um dos agentes de contraste mais utilizados em exames de ressonância magnética, devido à sua baixa quimiotoxicidade. (MAIA, A.L.C. et al. (2015). “Development and validation of high performance liquid chromatographic and derivative spectrophotometric methods for determination of gadodiamide in liposomal formulations”. Anal Methods, 7: 8315-8325). Vários estudos relatam a encapsulação de Gd-DTPA-BMA e outros complexos de gadolínio (Gd) em lipossomas para fins diagnósticos, e para monitorar em tempo real, por meio de imagens, a biodistribuição de fármacos utilizados no tratamento do câncer. A atividade antitumoral desse complexo na forma lipossomal também vem sendo investigada, visto que Gd-DTPA-BMA induz a apoptose de células neoplásicas por meio da ativação de caspase-3 (MAIA, A.L.C. et al., 2017. “Liposomes containing gadodiamide: preparation, physicochemical characterization, and in vitro cytotoxic evaluation”. Curr Drug Deliv, 14 (4): 566-574).

[003] A quantificação de Gd-DTPA-BMA em amostras ambientais e biológicas tem sido realizada, na maioria das vezes, por meio de técnicas dispendiosas que requerem instrumentação complexa, como por exemplo, espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) associada à espectrometria de massas (MS). O método de quantificação de Gd-DTPA-BMA descrito na Farmacopeia Americana, assim como o método descrito por Hvattum e colaboradores, emprega HPLC como técnica de separação e derivatização pós-coluna, para possibilitar a detecção do complexo na região do espectro visível (HVATTUM, E. et al., 1995. “Detection and quantitation of gadolinium chelates in human serum and urine by high-performance liquid chromatography and post-column derivatization of gadolinium with Arsenazo IN”. J Pharm Biomed Anal, 13 (7): 927-932; THE UNITED States Pharmacopeia. 34 ed. Rockville: The United States Pharmacopeial Convention, 2011. Gadodiamide Injection. p. 2934-2937). A derivatização, entretanto, geralmente requer uma instrumentação especial e um elevado consumo de reagentes. Além disso, a inclusão dessa etapa adicional torna a análise mais demorada.

[004] A determinação de Gd-DTPA-BMA por HPLC utilizando detectores de radioatividade também é descrita (KINDBERG, G.M. et al., 2010. “The fate of Gd and chelate following intravenous injection of gadodiamide in rats”. Eur Radiol, 20 (7): 1636-1643). Nesse caso, a principal desvantagem está relacionada à exigência de radiomarcação prévia do complexo.

[005] A detecção de Gd-DTPA-BMA por cromatografia eletrocinética capilar micelar também é descrita na literatura, entretanto a detectabilidade obtida por essa técnica é limitada (ANDRÁSI, M. et al., 2011. “Determination of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents by micellar electrokinetic capillary chromatography”. Electrophoresis, 32 (16): 22232228).

[006] Um método para identificação de complexos de gadolínio por titulação potenciométrica é relatado na literatura (CACHERIS, W.P. et al., 1990. “The relationship between thermodynamics and the toxicity of gadolinium complexes”. Magn Reson Imaging, 8(4): 467-481). Entretanto, este método é apropriado apenas para identificar complexos e avaliar sua estabilidade, não sendo adequado para quantificação de Gd-DTPA-BMA.

[007] Neste contexto, o desenvolvimento de métodos mais simples, rápidos e menos dispendiosos para determinação de Gd-DTPA-BMA pode ser extremamente útil, principalmente para determinação deste complexo em formulações lipossomais. O desenvolvimento de lipossomas pode ser laborioso, complexo e consiste em várias etapas. Dessa forma, durante esse processo, pode ser vantajoso obter informações rápidas sobre a influência da composição da formulação e do método de preparo sobre a quantidade de fármaco encapsulado.

[008] Nosso grupo de pesquisa recentemente desenvolveu dois métodos para quantificação de Gd-DTPA-BMA em lipossomas por cromatografia líquida de fase reversa (RP-LC) e espectrofotometria derivada (MAIA, A.L.C. et al., 2015. “Development and validation of high performance liquid chromatographic and derivative spectrophotometric methods for determination of gadodiamide in liposomal formulations”. Anal Methods, 7: 8315-8325). Em ambos os métodos, a detecção foi realizada na região ultravioleta, sem a necessidade de uma etapa de derivatização pós-coluna. A análise espectrofotométrica apresentou baixa detectabilidade enquanto a retenção de Gd-DTPA-BMA em RP-LC foi um desafio devido a sua alta polaridade. Além disso, o método por RP-LC não é apropriado para determinação desse fármaco em matrizes mais complexas, como plasma, meio de cultura ou tampões fortificados com proteínas. Nesses casos, RP-LC não apresenta adequada resolução. Além disso, devido à impossibilidade de utilizar qualquer solvente orgânico na fase móvel, a otimização é limitada. Comparando a presente invenção (método por HILIC) com o método desenvolvido por nosso grupo anteriormente (método por RP-LC), o método por HILIC apresentou uma detectabilidade cinco vezes maior, utilizando o mesmo tipo de detector (DAD). Além disso, o método por HILIC é apropriado para determinação desse fármaco em matrizes mais complexas como o soro fetal bovino.

[009] HILIC tem sido a técnica de escolha para determinação de compostos polares, principalmente complexos metálicos. O aumento da utilização de HILIC pode estar relacionado à habilidade de resolver limitações da cromatografia convencional, como por exemplo, permitir a análise de substâncias polares que apresentam baixa retenção em RP-LC (GRECO, G.; LETZEL, T., 2013. “Main interactions and influences of the chromatographic parameters in HILIC separations”. J Chromatogr Sci, 51 (7): 684-693). Em HILIC, vários parâmetros cromatográficos podem interferir na retenção e separação de compostos. Por este motivo, a utilização de ferramentas quimiométricas durante o desenvolvimento de métodos pode ser uma abordagem interessante (BUSZEWSKI, B.; NOGA, S., 2012. “Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) - a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem, 402 (1): 231-247”).

[010] Alguns métodos de determinação de Gd-DTPA-BMA, em amostras biológicas e ambientais, por HILIC, são descritos na literatura. Entretanto, nenhum desses estudos relatou a determinação de Gd-DTPA-BMA em lipossomas, ou a utilização de detecção por DAD, tornando necessário maiores investigações nessa área. Além disso, não existem estudos reportados sobre o desenvolvimento de métodos de determinação de Gd-DTPA-BMA por HILIC, nos quais tenha sido empregada uma abordagem racional de desenvolvimento. Os métodos para determinação de Gd-DTPA-BMA por HILIC descritos até o momento utilizam detecção por MS. Apesar da indiscutível detectabilidade proporcionada por MS, o alto custo das análises e instrumentação justifica o desenvolvimento de métodos mais simples e menos dispendiosos.

[011] O documento de patente US9138721 (B2), com data de prioridade de 28 de janeiro de 2011, intitulado “Zwitterionic stationary phase for hydrophilic interaction liquid chromatography and preparation method thereof’, descreve uma fase estacionária para HILIC e seu método de preparação. Tal fase estacionária apresenta grupos funcionais zwitteriônicos na extremidade da fase ligada. O método proposto em US9138721 (B2) pode ser aplicado de maneira ampla, para separação seletiva de vários tipos de amostras, principalmente carboidratos. A tecnologia descrita em US9138721 (B2) não apresenta bons resultados para separação de complexos metálicos, como Gd-DTPA-BMA. A limitação frequente observada nesse tipo de fase estacionária é que ela apresenta alta propensão para adsorções irreversíveis devido à alta reatividade do grupo amino (BUSZEWSKI, B.; NOGA, S., 2012. “Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) - a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem, 402 (1): 231-247”). Além disso, é comum que esse tipo fase requeira um maior tempo de estabilização de linha de base, o que resulta em uma análise mais demorada.

[012] O método descrito na presente invenção mostrou-se simples, rápido e seletivo. Além disso, ele apresentou alta detectabilidade. Embora este método tenha sido desenvolvido para determinar apenas um analito, ele pode ser utilizado para determinar Gd-DTPA-BMA em amostras mais complexas, como o soro fetal bovino. Neste contexto, a utilização de planejamento fatorial Box-Behnken e metodologia de superfície de resposta foram efetivas para o desenvolvimento do método. Essa abordagem permitiu avaliar interação entre os parâmetros e obter resultados que provavelmente não seriam obtidos em uma análise univariada. O método analítico descrito na presente invenção pode ser uma alternativa vantajosa para profissionais que trabalham com Gd-DTPA-BMA encapsulada em lipossomas ou em seu uso tradicional como agentes de contraste.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[013] A figura 1 representa as superfícies de resposta para avaliação da variável dependente: razão sinal/ruído. Os gráficos A, B e C representam os resultados de pH da porção aquosa da fase móvel versus proporção de acetonitrila (ACN). Estes três gráficos foram obtidos empregando a concentração de tampão constante (gráfico A = 5 mmol/L, gráfico B = 15 mmol/L e gráfico C = 25 mmol/L). Os gráficos D, E e F representam os resultados de pH da porção aquosa da fase móvel versus concentração de tampão. Nestes três gráficos o parâmetro fixo foi a proporção de ACN (gráfico D = 60%, gráfico E = 65% e gráfico F = 70%). Os gráficos G, H e I representam os resultados de proporção de ACN versus concentração de tampão. Eles foram elaborados mantendo-se constante os valores de pH da porção aquosa da fase móvel (gráfico G = 3,7, gráfico H = 4,2 e gráfico I = 4.7) .

[014] A figura 2 representa as superfícies de resposta para avaliação da variável dependente: resolução (Rs). Os gráficos A, B e C representam os resultados de pH da porção aquosa da fase móvel versus proporção de acetonitrila (ACN). Estes três gráficos foram obtidos empregando a concentração de tampão constante (gráfico A = 5 mmol/L, gráfico B = 15 mmol/L e gráfico C = 25 mmol/L). Os gráficos D, E e F representam os resultados de pH da porção aquosa da fase móvel versus concentração de tampão. Nestes três gráficos o parâmetro fixo foi a proporção de ACN (gráfico D = 60%, gráfico E = 65% e gráfico F = 70%). Os gráficos G, H e I representam os resultados de proporção de ACN versus concentração de tampão. Eles foram elaborados mantendo-se constante os valores de pH da porção aquosa da fase móvel (gráfico G = 3,7, gráfico H = 4,2 e gráfico I = 4.7) .

[015] A figura 3 representa as superfícies de resposta para avaliação da variável dependente: assimetria (As). Os gráficos A, B e C representam os resultados de pH da porção aquosa da fase móvel versus proporção de acetonitrila (ACN). Estes três gráficos foram obtidos empregando a concentração de tampão constante (gráfico A = 5 mmol/L, gráfico B = 15 mmol/L e gráfico C = 25 mmol/L). Os gráficos D, E e F representam os resultados de pH da porção aquosa da fase móvel versus concentração de tampão. Nestes três gráficos o parâmetro fixo foi a proporção de ACN (gráfico D = 60%, gráfico E = 65% e gráfico F = 70%). Os gráficos G, H e I representam os resultados de proporção de ACN versus concentração de tampão. Eles foram elaborados mantendo-se constante os valores de pH da porção aquosa da fase móvel (gráfico G = 3,7, gráfico H = 4,2 e gráfico I = 4,7).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[016] A presente invenção descreve um método analítico, por cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) utilizando detector de arranjo de diodos (DAD) em uma fase estacionária zwitteriônica, capaz de detectar e quantificar gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas. Este método pode ser utilizado para detectar e quantificar gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas, tais como lipossomas e soro sanguíneo.

[017] O método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas compreende as seguintes etapas:

• a. Submeter a amostra à cromatografia líquida em uma coluna de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) acoplada a um detector de arranjo de diodos (DAD), em que a fase estacionária utilizada na coluna HILIC é uma fase zwitteriônica;
• b. Eluir a amostra utilizando uma fase móvel, com vazão de 0,6 mL/min a 1,0 mL/min, à temperatura controlada, preferencialmente a 30 °C;
• c. Identificar Gd-DTPA-BMA na amostra por meio de detecção na região ultravioleta (200 a 250 nm, preferencialmente 210 nm);
• d. Quantificar Gd-DTPA-BMA na amostra por meio curva de calibração.

[018] Na etapa “a”, a fase estácionária zwitteriônica pode ser selecionada do grupo compreendendo ZIC®-HILIC, ZIC®-pHILIC e ZIC®-cHILIC.

[019] Na etapa “b”, a fase móvel pode ser composta por uma mistura entre um solvente orgânico aprótico e um tampão preparado a partir de um sal; sendo que o solvente orgânico aprótico pode compreender pelo menos um dentre os solventes acetonitrila e acetona ou uma mistura entre acetonitrila e acetona, preferencialmente acetonitrila. A proporção de solvente aprótico deve compreender um intervalo entre 60 e 75%, preferencialmente 60%. O sal deve compreender pelo menos um dentre os sais formiato de amônio (NH4FA) e acetato de amônio (NH4Ac), preferencialmente formiato de amônio, na concentração de 5 a 25 mmol/L, preferencialmente 5 mmol/L. O pH do tampão preparado a partir do sal está compreendidono intervalo entre 3,7 e 5,8, preferencialmente 4,5.

[020] A fase móvel pode ser composta por uma mistura de solvente orgânico aprótico e tampão, como acetonitrila/formiato de amônio ou acetonitrila/acetato de amônio, sendo que a detectabilidade é superior quando utilizado o tampão formiato de amônio.

[021] A proporção de solvente orgânico aprótico deve ser preferencialmente de 60 a 75%, sendo que o tempo de análise aumenta proporcionalmente à maior porcentagem de solvente.

[022] A concentração do tampão deve ser preferencialmente de 5 a 25 mmol/L, sendo que o mínimo de 5 mmol/L é necessário para obtenção de picos simétricos, e o máximo de 25 mmol/L deve ser respeitado para evitar a precipitação do solvente quando entrar em contato com o solvente orgânico.

[023] O pH do tampão formiato de amônio deve ser preferencialmente entre 3,7 e 4,7. Embora a faixa de tamponamento do formiato de amônio seja entre pH 2,7 a 4,7, valores inferiores a 3,7 resultam na degradação de Gd-DTPA-BMA.

[024] O pH do tampão acetato de amônio deve ser preferencialmente entre 3,8 e 5,8.

[025] A combinação entre baixo valor de pH do tampão (3,7) e valores intermediários (15 mmol/L) ou altos (25 mmol/L) de concentração do tampão deve ser evitada na composição da fase móvel, pois pode resultar em inadequada resolução entre o pico de Gd-DTPA-BMA e o pico dos lipossomas.

[026] A detecção pode ser realizada de 200 a 250 nm, obtendo-se máximo de absorção em 210 nm.

[027] A vazão da fase móvel deve ser preferencialmente de 0,6 mL/min a 1,0 mL/min, sendo que quanto menor a vazão utilizada, maior será a eficiência, a resolução e detectabilidade. Entretanto, a menor vazão torna a análise mais demorada.

[028] O método proposto pode ser usado para determinação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) durante o desenvolvimento de lipossomas para utilização no tratamento do câncer ou para utilização como agente de contraste; determinação de Gd-DTPA-BMA durante o controle de qualidade de produção de soluções injetáveis para ressonância magnética; determinação de Gd-DTPA-BMA em amostras de resíduos hospitalares e estações de tratamento de água e esgoto para investigar e controlar a contaminação ambiental com Gd, resultante do uso de agentes de contraste em ressonância magnética; determinação de Gd-DTPA-BMA em amostras biológicas, para investigação dos mecanismos de patogenicidade da Fibrose Sistêmica Nefrogênica.

[029] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.

EXEMPLO 1 - Desenvolvimento e otimização de método analítico por HILIC para determinação de Gd-DTPA-BMA em lipossomas

[030] O método foi desenvolvido e otimizado empregando três etapas: (i) Triagem de variáveis; (ii) Análise de superfície de resposta por meio do planejamento fatorial Box-Behnken; (iii) Curva de Van Deemter.

[031] Para os exemplos apresentados, formulações termossensíveis contendo Gd-DTPA-BMA foram preparadas pelo método de evaporação em fase reversa (REV) com concentração lipídica total de 40 mmol/L. Para o preparo do lipossoma termossensível tradicional (TTSL-Gd) foram utilizadas alíquotas de soluções clorofórmicas de DPPC, DSPC e DSPE-PEG2000, em razão molar lipídica de 80:15:5, respectivamente. Para o preparo do lipossoma termossensível contendo lisofosfolípide (LTSL-Gd), foram utilizadas alíquotas de soluções clorofórmicas de DPPC, MSPC e DSPEPEG2000 em razão molar lipídica de 85:10:5, respectivamente. Após a completa dissolução dos lípides, foi adicionada uma solução aquosa de Gd-DTPA-BMA (250 μmol/mL), respeitando a proporção fase aquosa: fase orgânica de 1:3, respectivamente. A dispersão obtida foi submetida à agitação vigorosa a 3.000 rpm durante 5 minutos, produzindo uma emulsão do tipo A/O. Posteriormente, a emulsão A/O foi submetida à evaporação sob pressão reduzida a fim de eliminar o solvente orgânico, permitindo a formação das vesículas do tipo LUV. Para obtenção dos lipossomas termossensíveis tradicionais (TTSL) e termossensíveis contendo lisofosfolípides (LTSL) “brancos”, ou seja, não contendo Gd-DTPA-BMA, foi realizado o mesmo protocolo experimental, exceto na etapa de adição do fármaco, que foi substituída pela adição de tampão HEPES. A calibração dos lipossomas obtidos foi realizada mediante o emprego de 10 ciclos de extrusão em membranas de policarbonato de tamanho de poro 0,4, 0,2 e 0,1 μm, respectivamente, sob fluxo de nitrogênio e à temperatura de 55 °C. Cada ciclo corresponde à passagem do volume completo da formulação pelo extrusor. A separação de Gd-DTPA-BMA, ou tampão HEPES, não encapsulados foi realizada por ultracentrifugação a 350.000 x g, 4 °C por 2 horas. Antes da purificação, os lipossomas foram diluídos em água purificada, empregando o fator de diluição igual a 3. Após a ultracentrifugação, o pellet foi reconstituído em tampão HEPES a fim de obter o mesmo volume inicial (antes da diluição).

[032] Para a triagem de variáveis, inicialmente foi realizada revisão da literatura a fim de determinar as variáveis independentes críticas para o desenvolvimento de métodos de determinação de Gd-DTPABMA por HILIC. Para escolha do comprimento de onda de detecção, foi realizada a varredura espectral entre 200 e 400 nm, de uma amostra de Gd-DTPA-BMA com concentração de 57 mg/mL. Essa concentração foi escolhida com base no teste de identificação de Gd-DTPA-BMA por espectrometria de absorção na região do ultravioleta, descrito em sua monografia oficial (THE UNITED, 2011). As análises foram realizadas em espectrômetro série 1800 UV-Vis Shimadzu (Tokyo, Japão). A partir do espectro obtido observou-se que, devido à ausência de cromóforos estendidos em sua estrutura, Gd-DTPA-BMA apresentou máximo de absorção em 210 nm.

[033] Após a definição do comprimento de onda de detecção (210 nm), da temperatura (30 °C) e do volume de injeção (20 μL), foram realizados 11 experimentos, com o objetivo de definir as variáveis e investigar a faixa de variação e os níveis em que as variáveis independentes deveriam ser avaliadas em um planejamento fatorial. Em cada experimento, foram realizadas nove determinações, sendo três determinações em uma amostra de Gd-DTPA-BMA 0,5 μmol/mL, três determinações em uma amostra de lipossomas TTSL fortificados com Gd-DTPA-BMA 0,5 μmol/mL (TTSL/Gd) e três determinações em uma amostra de lipossomas LTSL fortificados com Gd-DTPA-BMA 0,5 μmol/mL (LTSL/Gd). Os resultados dessa etapa estão expressos na Tabela 1. A fase móvel empregada em cada experimento foi: 1. ACN/NH4Ac 10 mmol/L, pH 5,8, (70:30 v/v); 2. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 4,7, (70:30 v/v); 3. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 4,7, (60:40 v/v); 4. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 4,7, (70:30 v/v); 5. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 4.7, (75:25 v/v); 6. ACN/NH4FA 5 mmol/L, pH 4,7, (70:30 v/v); 7. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 4,7, (70:30 v/v); 8. ACN/NH4FA 15 mmol/L, pH 4.7, (70:30 v/v); 9. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 2,7,( 70:30 v/v); 10. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 3,7, (70:30 v/v); 11. ACN/NH4FA 10 mmol/L, pH 4.7, (70:30 v/v).

Notas: a Dados expressos como média (n= 3 amostras, sendo 3 injeções para cada amostra). b Nesta condição não foi possível calcular a maioria das variáveis dependentes analisadas, devido a degradação de Gd-DTPA-BMA.

[034] Para a análise de superfície de resposta por meio do planejamento fatorial Box-Behnken, o planejamento foi projetado utilizando três variáveis independentes em três níveis (-1, 0 e 1). As variáveis estudadas e seus níveis foram: X1 = pH do tampão, nível -1 = 3,7, nível 0 = 4,2 e nível +1 = 4,7; X2 = proporção de ACN na fase móvel (%), nível -1 = 60, nível 0 = 65, nível +1 = 70; X3 = concentração do tampão (mmol/L), nível -1 = 5, nível 0 = 15, nível +1 = 25. As variáveis dependentes avaliadas como resposta foram: razão sinal/ruído, resolução (Rs) e assimetria (As). Também foram avaliadas as variáveis dependentes: altura do pico cromatográfico, ruído da linha de base, número de pratos teóricos (N), largura do pico cromatográfico medida a 5% de altura da linha de base, área do pico cromatográfico, tempo de retenção (tr) e fator de retenção (k). Foram realizados 15 experimentos em ordem aleatória, incluindo três replicatas do ponto central. Em cada experimento, foram realizadas seis determinações, sendo três determinações em uma amostra de Gd-DTPA-BMA 0,3 μmol/mL e três determinações em uma amostra de lipossomas TTSL e LTSL fortificados com Gd-DTPA-BMA 0,3 μmol/mL (TTSL/LTSL-Gd). Os coeficientes de determinação (r2) e correlação (r) foram obtidos utilizando o método dos mínimos quadrados. O modelo foi avaliado empregando a análise de variância (ANOVA) e a estimativa dos erros foi calculada por meio de experimentos no ponto central. Os resultados foram avaliados empregando o programa computacional Statistica 7.0 (StatSoft®, Tulsa, EUA). Nessa etapa do estudo, utilizou-se uma análise multivariada empregando planejamento fatorial. As variáveis escolhidas para compor o planejamento, com base na etapa inicial de triagem, foram: pH da porção aquosa da fase móvel (X1), proporção de ACN (X2), e concentração do tampão (X3). As demais condições cromatográficas tiveram seus valores fixados: coluna SeQuant® ZIC®-HILIC (150 x 4,6 mm, 3,5 μm, 100 A°) (Merck, Darmstadt, Alemanha), eluição isocrática a 1,0 mL/min, volume de injeção de 20 μL, temperatura de 30 °C e detecção a 210 nm. As condições experimentais avaliadas e as respostas obtidas estão expressas na Tabela 2.

Notas: a Média de três injeções; b Média de três amostras, sendo três injeções para cada amostra.

[035] A fim de extrapolar os dados obtidos pela matriz Box-Behnken e calcular o ponto ótimo que corresponde aos valores que as variáveis X1, X2 e X3 assumem para gerar melhores respostas, os dados apresentados na Tabela 2 foram utilizados para a construção de modelos matemáticos. Por meio da combinação entre os valores das variáveis e das respostas obtidas, foram calculados os coeficientes das equações que descrevem o sistema estudado (Tabela 3). Essas equações foram elaboradas a partir dos efeitos das interações lineares e quadráticas primárias. As interações secundárias foram excluídas, por gerarem resultados de ponto ótimo incoerentes experimentalmente. Os dados da ANOVA, r, r2 e o erro puro calculado, a partir das replicatas do ponto central, estão descritos na Tabela 3. O valor de r2 obtido foi satisfatório, uma vez que quanto mais próximo de 1 o valor do coeficiente estiver, melhor estará o ajuste do modelo às respostas observadas. Os pontos ótimos, ou seja, os valores críticos para obtenção das melhores respostas de razão sinal/ruído, Rs e As foram calculados a partir da primeira derivada da equação que descreve o sistema. Entretanto, por gerarem resultados incoerentes do ponto de vista experimental, apenas as inclinações dos gráficos de superfície de resposta foram consideradas para escolha dos melhores valores de X1, X2 e X3.

Notas: X1, pH; X2, proporção ACN (%); X3, concentração do tampão (mmol/L); p < 0,05 (ANOVA).

[036] As superfícies de resposta obtidas estão expostas nas Figuras 1, 2 e 3. Nesses gráficos tridimensionais, as variáveis independentes foram agrupadas duas a duas para avaliar a influência da interação entre elas, nas respostas razão sinal/ruído, Rs e As, respectivamente. Nas Figuras 1, 2 e 3, os gráficos A, B e C foram obtidos empregando a concentração de tampão constante. Nos gráficos D, E e F o parâmetro fixo foi a proporção de ACN. Os gráficos G, H e I foram elaborados mantendo-se constante os valores de pH da porção aquosa da fase móvel.

[037] Analisando as superfícies de resposta obtidas, para avaliação da razão sinal/ruído, expressas na Figura 1, observa-se por meio da escala dos gráficos 1A, 1B e 1C, que quanto menor é a concentração do tampão, maior é a resposta. Analisando isoladamente o gráfico A, em que o tampão foi fixado no nível mínimo avaliado (5 mmol/L), observa-se que maiores valores de razão sinal/ruído são obtidos ao empregar pH ≥ 4,4, independente da proporção de ACN utilizada. Os resultados expressos nos gráficos 1D, 1E e 1F estão de acordo com essas observações. Os valores das escalas dos gráficos 1G, 1H e 1I, demonstram que as maiores respostas são obtidas quando o maior valor de pH da faixa de tamponamento de NH4FA é utilizado (gráfico 1I). Analisando isoladamente o gráfico 1I, nota-se que independente da proporção de ACN, a maior razão sinal/ruído é observada quando a concentração do tampão é igual ou inferior a 10 mmol/L. A partir da análise das nove superfícies de resposta expressas na Figura 1, conclui-se que o pH da porção aquosa da fase móvel (valores entre 4,4 a 4,7) e a concentração do tampão (≤ 10 mmol/L) são os fatores que mais influenciam a razão sinal/ruído.

[038] Os resultados de Rs foram avaliados com base na Figura 2. Analisando a escala dos gráficos 2A, 2B e 2C, observa-se que, quando a menor concentração de tampão é empregada (gráfico 2A), qualquer combinação de pH e proporção de ACN resulta em resolução ≥ 2. Os resultados expressos nos gráficos 2D, 2E e 2F confirmam essas observações, e revelam que altos valores de pH também influenciam na obtenção de maiores valores de Rs. Analisando as escalas dos gráficos 2G, 2H e 2I, o benefício da utilização de altos valores de pH fica confirmado, pois as maiores respostas foram encontradas quando o pH foi fixado em 4,7 (gráfico 2I). De maneira geral, a análise das nove superfícies de respostas da Figura 2, revela que maiores valores de Rs são obtidos quando combinadas as seguintes condições: baixa concentração do tampão, alto pH e alta proporção de ACN.

[039] As superfícies de resposta expressas na Figura 3 foram utilizadas para avaliar a As. A análise da escala dos gráficos 3A, 3B e 3C revela que menores valores de As são obtidos quando empregadas menores concentrações de tampão. Analisando isoladamente o gráfico 3A, em que a concentração de tampão foi mantida fixa no menor nível avaliado (5 mmol/L), observa-se que a combinação entre baixa proporção de ACN e alto valor de pH, resulta em menores valores de As. A análise da escala dos gráficos 3D, 3E e 3F confirma essa observação, uma vez que o gráfico 3D, em que a proporção de ACN foi mantida no menor nível, foi o que apresentou melhores respostas. Analisando isoladamente o gráfico 3D, existe uma tendência para obtenção de menores valores de As quando a concentração de tampão é ≤ 6 mmol/L e o pH é ≥ 4,4. Nos gráficos 3G, 3H e 3I, independente do pH empregado, a combinação entre menor proporção de ACN e a baixa concentração de tampão resulta em menores valores de As. Os resultados da metodologia de superfície de resposta estão de acordo com os dados obtidos nos gráficos de pareto, que permitem identificar as variáveis independentes que influenciam a resposta, a extensão dessa influência e as interações significativas entre as variáveis investigadas.

[040] Nesta etapa do desenvolvimento do método analítico, também foram avaliadas as respostas: altura do pico cromatográfico, ruído da linha de base, N, largura do pico cromatográfico medida a 5% de altura da linha de base, área do pico cromatográfico, tr e k. A partir dos resultados dessas análises, expressos nos Anexos B e C, foi possível elaborar a Tabela 4, que permitiu identificar as condições otimizadas, considerando a desejabilidade individual de cada parâmetro e a desejabilidade global para o método proposto.

[041] A fim de verificar se as condições otimizadas definidas resultam em valores de resposta ótimos para o pico cromatográfico referente à Gd-DTPA-BMA, um novo experimento foi realizado, empregando fase móvel composta por 60% de ACN, NH4FA em concentração de 5 mmol/L e pH da porção aquosa igual 4,5. Nessas condições, o valor de razão sinal/ruído obtido foi 9.594.265. Esse resultado está de acordo com o maior valor de razão sinal/ruído encontrado nos experimentos do planejamento Box-Behnken (Experimento 6, Tabela 2). O valor de Rs obtido empregando as condições otimizadas, foi igual a 3,2. Esse resultado foi considerado adequado, pois é superior ao valor preconizado (Rs ≥ 2) para que se obtenha separação satisfatória entre o fármaco e os possíveis interferentes (US-FDA, 2000). O resultado de As obtido após otimização dos parâmetros cromatográficos foi igual a 1,11. Esse valor corresponde à melhor resposta obtida para este parâmetro, considerando todos os experimentos realizados. Além disso, está de acordo com os limites estabelecidos pelo FDA (US-FDA, 1994).

[042] Para a curva de Van Deemter, elaborada com o objetivo de determinar a velocidade linear (diretamente proporcional à vazão da fase móvel) na qual a altura equivalente a um prato teórico (diretamente relacionada ao alargamento do pico cromatográfico) é mínima, variou-se a vazão da fase móvel nos seguintes valores: 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,5 e 2,0 mL/min. Para cada valor de vazão um pico cromatográfico foi obtido, e a ele correspondeu determinado N e determinado tr. A curva foi obtida plotando-se a altura equivalente a um prato teórico (H) em função da velocidade linear da fase móvel (U0). A eficiência máxima observada, empregando as condições cromatográficas do método desenvolvido, ocorreu com um valor de H em torno de 18 μm e em U0 próxima a 0,16 mm/s, que corresponde a uma vazão de 0,1 mL/min. Esse valor de vazão não é viável para utilização no método proposto, uma vez que resulta em um tr de Gd-DTPA-BMA muito longo (tr = 44,15 minutos) para ser empregado nas análises de rotina. Sendo assim, a otimização da vazão da fase móvel foi realizada por meio da avaliação dos parâmetros cromatográficos encontrados durante os experimentos realizados para obtenção da curva de Van Deemter. Com base nos resultados obtidos, a vazão de 0,6 mL/min foi selecionada para utilização no método desenvolvido. O emprego dessa nova condição, em comparação com a utilização de vazão igual a 1,0 mL/mL, resultou em um maior tr de Gd-DTPA-BMA (tr = 7,1 min). Entretanto, essa vazão permitiu aumentar 29% da eficiência (N) e 12% da detectabilidade e Rs do método proposto.

EXEMPLO 2 - Validação do método analítico

[043] As condições cromatográficas utilizadas nesse exemplo foram: coluna Sequant® ZIC®-HILIC Merck (150 x 4,6 mm, 3,5 μm, 100 A°) (Darmstadt, Alemanha), fase móvel composta por acetonitrila/formiato de amônio 5 mmol/L, pH 4,5 (60:40, v/v), volume de injeção de 20 μL, temperatura de 30 °C e detecção em 210 nm. A eluição foi realizada em modo isocrático com vazão de 0,6 mL/min. Durante o desenvolvimento do método foram utilizados: planejamento fatorial Box-Behnken, metodologia de superfície de resposta e curva de Van Deemter a fim de obter alta detectabilidade e resolução. O método foi validado segundo os critérios estabelecidos na Resolução RE n°899 de 29 de maio de 2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e no Guia de Validação de Procedimentos analíticos ICH QR2 (R1). As análises por HILIC foram realizadas utilizando cromatógrafo série 1260 Agilent Technologies (Califórnia, EUA), equipado com desgaseificador, bomba quaternária (G1311B), forno (G1316A), injetor automático (G1329B) e DAD (G4212B), acoplado ao programa de integração EzChrom.

[044] Ao sobrepor os cromatogramas de Gd-DTPA-BMA, TTSL/LTSL, álcool isopropílico e fase móvel não foram observados picos interferentes no tr de Gd-DTPA-BMA (tr = 7,1 min), demonstrando a seletividade do método. A resolução obtida entre Gd-DTPA-BMA e TTSL/LTSL foi adequada (Rs = 3,6). Além disso, a pureza do pico de Gd-DTPA-BMA, calculada por DAD, foi igual a 100% em todas as determinações.

[045] O método mostrou-se linear para determinação de Gd-DTPA-BMA na faixa entre 40 e 120 nmol/mL. A equação da reta obtida foi y = 803.100 x + 964.900. Os valores de r e r2 calculados foram satisfatórios (> 0,999) (BRASIL, 2003). Não houve diferença significativa entre as inclinações das três curvas de calibração obtidas (p <0,05).

[046] A determinação de limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) de Gd-DTPA-BMA foi realizada, inicialmente por meio da avaliação da razão sinal/ruído com o objetivo de incluir LQ como menor nível de concentração do intervalo linear da curva analítica. Foram obtidos cromatogramas para as soluções de Gd-DTPA-BMA a 10 nmol/mL e 40 nmol/mL, considerados LD e LQ, de acordo com essa análise. O pico de Gd-DTPA-BMA foi eluído em 7,1 min. Após avaliação da linearidade, os valores teóricos de LD e LQ também foram calculados com base nos parâmetros da regressão linear. A diferença observada entre os valores de LD e LQ obtidos pelos dois métodos, razão sinal/ruído (LD = 10 nmol/mL, LQ = 40 nmol/mL) e parâmetros da regressão linear (LD = 4,56 nmol/mL, LQ = 6,78 nmol/mL), está relacionada às particularidades de cada tipo de análise.

[047] Em estudo anterior do nosso grupo de pesquisa, foi desenvolvido e validado um método analítico para determinação de Gd-DTPA-BMA em lipossomas, por RP-LC/DAD (MAIA et al., 2015). Esse método apresentou intervalo linear na faixa entre 100 e 500 nmol/mL. No método por HILIC, desenvolvido na presente invenção, foi possível incluir menores concentrações na curva analítica (40 a 120 nmol/mL). Além disso, comparando os valores de LD e LQ obtidos nos dois estudos, conclui-se que o método por HILIC apresentou detectabilidade cinco vezes superior, utilizando o mesmo tipo de detector (DAD) que foi empregado no estudo anterior.

[048] O método desenvolvido demonstrou precisão intra-dia e inter-dias adequada, com valores de DPR em concordância com a especificação estabelecida pela RE 899 que preconiza DPR ≤ 5%, como critério de avaliação destes parâmetros.

[049] A exatidão do método desenvolvido foi demonstrada. O valor médio da porcentagem de recuperação encontrado para as formulações TTSL/LTSL foi de 98,61%. Além disso, o valor de DPR obtido entre as determinações realizadas nos três níveis avaliados foi inferior a 5%.

[050] A robustez do método cromatográfico para determinação de Gd-DTPA-BMA em lipossomas foi avaliada por meio do teste de Youden. A partir dos resultados obtidos nos oito experimentos, foram calculados os efeitos de cada variável e o efeito maior, permitindo avaliar a influência das modificações no método proposto. De acordo com os dados obtidos, pode-se afirmar que o método foi robusto para todos os parâmetros avaliados, uma vez que os efeitos de cada variável foram inferiores aos respectivos efeitos maiores calculados (Tabela 5).

Notas: a Média dos valores obtidos em condições nominais menos a média dos valores obtidos nas condições variadas; b DPR entre os valores obtidos nos 8 experimentos multiplicado por raiz de 2.

Claims (9)

1. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   • a. Submeter a amostra à cromatografia líquida em uma coluna de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) acoplada a um detector de arranjo de diodos (DAD), em que a fase estacionária utilizada na coluna HILIC é uma fase zwitteriônica;
   • b. Eluir a amostra utilizando uma fase móvel, com vazão de 0,6 mL/min a 1,0 mL/min, à temperatura controlada, preferencialmente a 30 °C;
   • c. Identificar Gd-DTPA-BMA na amostra por meio de detecção na região ultravioleta (200 a 250 nm, preferencialmente 210 nm);
   • d. Quantificar Gd-DTPA-BMA na amostra por meio curva de calibração.
2. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas, de acordo com a reivindicação 1 etapa “a”, caracterizado pela fase estácionária zwitteriônica ser selecionada do grupo compreendendo ZIC®-HILIC, ZIC®-pHILIC e ZIC®-cHILIC.
3. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas, de acordo com a reivindicação 1 etapa “b”, caracterizado pela fase móvel ser composta por uma mistura entre um solvente orgânico aprótico e um tampão preparado a partir de um sal.
4. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo solvente orgânico aprótico compreender pelo menos um dentre os solventes acetonitrila e acetona ou uma mistura entre acetonitrila e acetona, preferencialmente acetonitrila.
5. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela proporção de solvente aprótico compreender um intervalo entre 60 e 75%, preferencialmente 60%.
6. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo sal compreender pelo menos um dentre os sais formiato de amônio e acetato de amônio, preferencialmente formiato de amônio.
7. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela concentração de sal compreender um intervalo entre 5 e 25 mmol/L, preferencialmente 5 mmol/L.
8. Método para detecção e quantificação de gadodiamida (Gd-DTPA-BMA) em amostras farmacêuticas e biológicas de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo pH do tampão preparado a partir do sal compreender um intervalo entre 3,7 e 5,8, preferencialmente 4,5.
9. Uso do método definido pelas reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para determinação de Gd-DTPA-BMA durante o desenvolvimento de lipossomas para utilização no tratamento do câncer ou para utilização como agente de contraste; determinação de Gd-DTPA-BMA durante o controle de qualidade de produção de soluções injetáveis para ressonância magnética; determinação de Gd-DTPA-BMA em amostras de resíduos hospitalares e estações de tratamento de água e esgoto para investigar e controlar a contaminação ambiental com Gd, resultante do uso de agentes de contraste em ressonância magnética; determinação de Gd-DTPA-BMA em amostras biológicas, para investigação dos mecanismos de patogenicidade da Fibrose Sistêmica Nefrogênica.

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