BR102018000665A2

BR102018000665A2 - IRON DETECTION AND QUANTIFICATION KIT, USE OF THE KIT AND METHOD OF COLORIMETRIC IRON DETERMINATION IN BIOLOGICAL SAMPLES

Info

Publication number: BR102018000665A2
Application number: BR102018000665-7A
Authority: BR
Inventors: Koiti Araki; Christiane Pavani; Daiana Kotra Deda Nogueira; Maurício Da Silva Baptista; Mayara Klimuk Uchiyama; Roberta Mansini Cardoso; Sérgio Hiroshi Toma
Original assignee: Universidade De São Paulo - Usp
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2019-07-30

Abstract

a presente invenção refere-se a um kit para a detecção e quantificação de ferro, em compostos ou na forma de nanopartículas, presente em amostras convencionais e em sistemas biológicos através de método colorimétrico. o referido kit compreende pelo menos um agente de lise; um agente de digestão; um agente redutor; um agente de ajuste de ph; e um agente complexante ou colorimétrico. adicionalmente, a presente invenção refere-se a um método de determinação colorimétrica do ferro em amostras biológicas utilizando o kit da presente invenção, o qual realiza a lise do material com detergente e depois uma digestão ácida sob aquecimento, possibilitando assim a determinação do ferro presente em diversas formas químicas na amostra.The present invention relates to a kit for the detection and quantification of iron, in compounds or in the form of nanoparticles, present in conventional samples and biological systems by colorimetric method. said kit comprises at least one lysing agent; a digestion agent; a reducing agent; a ph adjusting agent; and a complexing or colorimetric agent. Additionally, the present invention relates to a method of colorimetric determination of iron in biological samples using the kit of the present invention which performs lysis of the material with detergent and then acid digestion upon heating, thereby enabling the determination of the iron present. in various chemical forms in the sample.

Description

KIT PARA A DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE FERRO, USO DO KIT E MÉTODO DE DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE FERRO EM AMOSTRAS BIOLÓGICASKIT FOR IRON DETECTION AND QUANTIFICATION, USE OF THE IRON COLORIMETRIC DETERMINATION KIT AND METHOD IN BIOLOGICAL SAMPLES

Campo da invenção:Field of the invention:

[1] A presente invenção se insere no campo de aplicação de medição, mais especificamente na área de investigação ou análise dos materiais pela determinação de suas propriedades químicas ou físicas, uma vez que se refere a um kit e método para determinação colorimétrica de ferro em diferentes meios, incluindo o ferro proveniente de nanopartículas de óxido de ferro, tais como nanopartículas superparamagnéticas (SPIONs), incorporadas ou dispersas em meio biológico.[1] The present invention falls within the measurement application field, more specifically in the area of investigation or analysis of materials by determining their chemical or physical properties, since it refers to a kit and method for colorimetric determination of iron in different media, including iron from iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic nanoparticles (SPIONs), incorporated or dispersed in biological media.

Fundamentos da invenção e Estado da técnica:Basics of the invention and state of the art:

[2] Sistemas biológicos constantemente sintetizam, transformam e degradam compostos orgânicos e inorgânicos, para sustentar os processos necessários para a manutenção da vida. Os elementos químicos principais (C, H, N, O, P, S) se combinam entre si para formar carboidratos, lipídeos, aminoácidos e nucleotídeos, que por sua vez são os blocos de construção” de proteínas, DNA, membranas, etc. Por outro lado, a química orgânica que promove a vida não acontece sem a participação de alguns elementos químicos essenciais como metais.[2] Biological systems constantly synthesize, transform and degrade organic and inorganic compounds, to support the processes necessary for the maintenance of life. The main chemical elements (C, H, N, O, P, S) combine to form carbohydrates, lipids, amino acids and nucleotides, which in turn are the building blocks ”of proteins, DNA, membranes, etc. On the other hand, organic chemistry that promotes life does not happen without the participation of some essential chemical elements such as metals.

[3] O ferro é um elemento químico essencial para quase todos os organismos conhecidos. É geralmente armazenado e transportado por metaloproteínas, como ferritina e transferrina, respectivamente, além de participar diretamente no transporte de oxigênio por meio do complexo heme presente nas hemoglobinas. O ferro apresenta diferentes estados de oxidação, por isso também contribui para reações[3] Iron is an essential chemical element for almost all known organisms. It is generally stored and transported by metalloproteins, such as ferritin and transferrin, respectively, in addition to participating directly in the transport of oxygen through the heme complex present in hemoglobins. Iron has different oxidation states, so it also contributes to reactions

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2/25 redox de muitas enzimas, como nitrogenases e hidrogenases. Sua deficiência no organismo leva à diminuição dos eritrócitos, causando anemia que se caracteriza pelo cansaço, falta de energia, fadiga, taquicardia, palidez e hipotensão. Desta forma, é imprescindível medir a quantidade de ferro presente em fluidos biológicos e intracelulares para avaliar sua biodisponibilidade e participação nos mais variados processos biológicos.2/25 redox of many enzymes, such as nitrogenases and hydrogenases. Its deficiency in the body leads to a decrease in erythrocytes, causing anemia that is characterized by tiredness, lack of energy, fatigue, tachycardia, pallor and hypotension. Thus, it is essential to measure the amount of iron present in biological and intracellular fluids to assess its bioavailability and participation in the most varied biological processes.

[4] Além do ferro iônico presente naturalmente no organismo na forma de complexos com diversas biomoléculas, nos últimos 15 anos tem-se estudado e explorado o uso de nanopartículas magnéticas ou superparamagnéticas de óxidos de ferro para diferentes finalidades, principalmente no campo do diagnóstico e tratamento de doenças. Nanopartículas superparamagnéticas (SPIONs) formadas majoritariamente por magnetita (Fe3O4) e/ou maguemita (y-Fe2O3) são os óxidos mais utilizados por apresentarem boa magnetização, estabilidade, baixo custo de produção e biocompatibilidade.[4] In addition to the ionic iron naturally present in the organism in the form of complexes with several biomolecules, in the last 15 years the use of magnetic or superparamagnetic nanoparticles of iron oxides has been studied and explored for different purposes, mainly in the field of diagnosis and disease treatment. Superparamagnetic nanoparticles (SPIONs) formed mainly by magnetite (Fe3O4) and / or magemite (y-Fe2O3) are the most used oxides because they present good magnetization, stability, low production cost and biocompatibility.

[5] Por uma questão ainda não totalmente conhecida, partículas de dimensões nanométricas tendem a ser opsonizadas (processo de internalização) in vivo e in vitro pelas células numa taxa bastante elevada. Além disso, no campo da toxicologia, identificar e dosar ferro presente em diferentes órgãos após administração endovenosa sistêmica de nanopartículas de óxido de ferro é essencial. Sem mencionar a importância da pesquisa básica, onde tenta-se compreender a interação dessas nanopartículas com células e macromoléculas presentes no organismo, e como esses processos afetam a sua biodistribuição e eliminação do organismo (clearance) em função do tempo.[5] As a matter not yet fully known, particles of nanometric dimensions tend to be opsonized (internalization process) in vivo and in vitro by cells at a very high rate. In addition, in the field of toxicology, identifying and dosing iron present in different organs after systemic intravenous administration of iron oxide nanoparticles is essential. Not to mention the importance of basic research, where one tries to understand the interaction of these nanoparticles with cells and macromolecules present in the organism, and how these processes affect their biodistribution and elimination from the organism (clearance) as a function of time.

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3/25 [6] Entretanto, ainda não há metodologias disponíveis e adequadas para realizar tal quantificação, principalmente no que concerne às aplicações voltadas para a área da nanobiomedicina. Assim, o desenvolvimento, comercialização e monitoramento de produtos baseados em nanopartículas de óxido de ferro implica na necessidade de se gerar métodos simples e precisos para determinação de tais nanopartículas no organismo ou incorporadas por células, tecidos e órgãos.3/25 [6] However, there are still no methodologies available and adequate to perform such quantification, mainly with regard to applications aimed at the nanobiomedicine area. Thus, the development, commercialization and monitoring of products based on iron oxide nanoparticles implies the need to generate simple and precise methods for determining such nanoparticles in the body or incorporated by cells, tissues and organs.

[7] Kits comerciais como QuantiChrom Iron Assay kit (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) e Ferrozine Iron Assay, tendem a apresentar resultados discrepantes e com erros inaceitáveis, pois, são voltados para análise de ferro iônico e não para a dosagem de ferro proveniente de nanopartículas incorporadas em sistemas biológicos como células, tecidos e órgãos. De fato, devido à ausência de um procedimento de abertura de amostra, não se pode garantir que todo o ferro presente nas nanopartículas esteja quimicamente disponível para sua quantificação por aqueles métodos.[7] Commercial kits such as QuantiChrom Iron Assay kit (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) and Ferrozine Iron Assay, tend to present discrepant results and with unacceptable errors, since they are aimed at the analysis of ionic iron and not at the dosage of iron from nanoparticles incorporated in biological systems such as cells, tissues and organs. In fact, due to the absence of a sample opening procedure, it cannot be guaranteed that all the iron present in the nanoparticles is chemically available for quantification by those methods.

[8] A análise quantitativa colorimétrica é a mais utilizada nos laboratórios de análise clínica e de pesquisa ao redor do mundo, pois é a forma mais simples de análise espectrofotométrica, além de ser rápida e reprodutível. Baseia-se na alteração da cor de uma solução na presença de determinados analitos, devido à formação de complexos ou compostos de coordenação, cuja densidade óptica é diretamente proporcional à concentração do complexo formado.[8] Colorimetric quantitative analysis is the most used in clinical analysis and research laboratories around the world, as it is the simplest form of spectrophotometric analysis, in addition to being fast and reproducible. It is based on changing the color of a solution in the presence of certain analytes, due to the formation of complexes or coordination compounds, whose optical density is directly proportional to the concentration of the complex formed.

[9] Devido às características químicas do ferro, este se coordena a diversos ligantes através de grupos químicos como carboxilatos, fenolatos, aminas, piridinas e polipiridinas, cianeto, tiocianato e tióis, dentre outros.[9] Due to the chemical characteristics of iron, it coordinates with several ligands through chemical groups such as carboxylates, phenolates, amines, pyridines and polypyridines, cyanide, thiocyanate and thiols, among others.

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4/254/25

Os complexos de ferro formados, devido à sua natureza,The iron complexes formed, due to their nature,

absorvem absorb luz na região do visível, conferindo às suas light in the visible region, giving its soluções solutions colorações intensas características. Por isso, a characteristic intense colorings. Therefore, the detecção detection e quantificação do ferro podem ser facilmente and quantification of iron can be easily

realizadas através de métodos colorimétricos, utilizando-seperformed through colorimetric methods, using

uma curva a curve de calibração obtida a partir de uma solução-padrão calibration obtained from a standard solution

de ferro.of iron.

[10] [10] Entretanto, os complexos são formados a partir de However, complexes are formed from

íons livres de ferro num dado estado de oxidação. Todavia, os íons ferro das nanopartículas de óxido de ferro encontramse numa forma não disponível, ou seja, não estão presentes numa forma solúvel e livre. Por isso, as amostras biológicasfree iron ions in a given oxidation state. However, the iron ions of the iron oxide nanoparticles are in an unavailable form, that is, they are not present in a soluble and free form. Therefore, biological samples

contendo containing nanopartículas precisam ser submetidas a um nanoparticles need to be subjected to a processo process inicial de abertura química (lise, digestão e initial chemical opening (lysis, digestion and redução), reduction), para que o ferro esteja disponível quimicamente so that iron is available chemically

numa forma adequada para a formação de complexos com os agentes colorimétricos selecionados.in a form suitable for the formation of complexes with the selected colorimetric agents.

[11] [11] Nesse sentido, a presente invenção propõe um kit In this sense, the present invention proposes a kit

para detecção e quantificação de ferro proveniente ou não de nanopartículas de óxido de ferro em meio biológico, que difere dos métodos e kits atualmente disponíveis quanto ao preparo da amostra, ao limite de detecção e, principalmente, ao fato de possibilitar a quantificação de ferro presente na forma de nanopartículas de óxido de ferro.for the detection and quantification of iron originating or not from iron oxide nanoparticles in biological medium, which differs from the methods and kits currently available regarding sample preparation, the detection limit and, mainly, the fact that it allows the quantification of iron present in the form of iron oxide nanoparticles.

[12] [12] O presente método se baseia no preparo inicial da The present method is based on the initial preparation of

amostra biológica (cultura de células aderentes ou não, fluidos biológicos e/ou tecidos), iniciando pela lise dobiological sample (culture of adherent or non-adherent cells, biological fluids and / or tissues), starting with the lysis of

material material quando faz-se necessária a dosagem total de when total dosage of

proteínas, seguida pela digestão ácida, redução dos íonsproteins, followed by acid digestion, reduction of ions

Fe(III) presentes a Fe(II), correção de pH e complexação comFe (III) present to Fe (II), pH correction and complexation with

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5/25 ligantes adequados, formando complexos de ferro(II) estáveis e altamente coloridos que podem ser quantificados espectrofotometricamente.5/25 suitable binders, forming stable and highly colored iron (II) complexes that can be quantified spectrophotometrically.

[13] Alguns documentos de patente descrevem métodos colorimétricos de detecção de ferro em amostras biológicas.[13] Some patent documents describe colorimetric methods for detecting iron in biological samples.

[14] Em US3506404A é descrito um método colorimétrico de detecção de ferro em soro e sangue total, partindo de um processo de precipitação de proteínas, extraindo o íon ferro para uma solução aquosa, reduzindo-o e reagindo-o com o ligante 5-(2-piridil)-2H-1,4-benzodiazepina, formando um complexo colorido na região do roxo que pode ser quantificado pelo método colorimétrico padrão. Embora a presente invenção também utilize agentes redutores e complexantes para determinação colorimétrica de ferro, a principal diferença reside no fato de que, na presente invenção, as amostras são submetidas a um processo de digestão total através de lise e digestão ácida, garantindo inclusive a digestão de nanopartículas de óxido de ferro, o que não seria possível utilizando o protocolo descrito em US3506404A visto que o mesmo é limitado à determinação de ferro, presente somente em amostras de sangue total e soro. Além disso, a classe de ligantes utilizada em US3506404A (benzodiazepinas) também difere da classe de ligantes proposta na presente invenção tais como 1,10-fenantrolina, 2,2-bipiridina, 2,2':6',2terpiridinas, ou seja, derivados de piridinas e polipiridinas e outros ligantes N-heterocíclicos.[14] US3506404A describes a colorimetric method for detecting iron in serum and whole blood, starting with a protein precipitation process, extracting the iron ion into an aqueous solution, reducing it and reacting it with the 5- (2-pyridyl) -2H-1,4-benzodiazepine, forming a colored complex in the purple region that can be quantified by the standard colorimetric method. Although the present invention also uses reducing and complexing agents for colorimetric determination of iron, the main difference lies in the fact that, in the present invention, the samples are subjected to a process of total digestion through lysis and acid digestion, even guaranteeing digestion of iron oxide nanoparticles, which would not be possible using the protocol described in US3506404A since it is limited to the determination of iron, present only in whole blood and serum samples. In addition, the class of binders used in US3506404A (benzodiazepines) also differs from the class of binders proposed in the present invention such as 1,10-phenanthroline, 2,2-bipyridine, 2,2 ': 6', 2terpiridines, ie derivatives of pyridines and polypyridines and other N-heterocyclic linkers.

[15] O documento KR101675347B descreve um método qualitativo de detecção de ferro 3+ presente em amostras biológicas e em alimentos/bebidas utilizando nanopartículas de ouro recobertas com quitosana que apresentam mudança de[15] Document KR101675347B describes a qualitative method of detecting iron 3+ present in biological samples and in food / beverages using gold nanoparticles coated with chitosan that show a change in

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6/25 coloração na presença deste íon. Diferentemente, a presente invenção propõe um método e um kit completo para determinação quantitativa colorimétrica de ferro presente em amostras biológicas, incluindo ferro presente em nanopartículas de óxido de ferro, mas que não utiliza qualquer tipo de nanopartícula como constituinte/reagente do kit.6/25 staining in the presence of this ion. In contrast, the present invention proposes a method and a complete kit for quantitative colorimetric determination of iron present in biological samples, including iron present in iron oxide nanoparticles, but which does not use any type of nanoparticle as a constituent / kit reagent.

[16] O artigo “Determination of iron (III) in food, biological and environmental samples (2016) de Verma et al. descreve um método de determinação colorimétrica de ferro 3+ presente em amostras de alimento, biológicas e ambientais utilizando o ligante tiocianato para a formação do complexo, que é extraído pelo solvente N-octilacetamida e, em seguida, determinado espectrofotometricamente. Embora este documento também descreva um método de determinação colorimétrica de ferro, tanto as etapas quanto os reagentes empregados diferem da presente invenção. Primeiramente, não está descrito uma etapa de lise e digestão das amostras, não há a utilização de um agente redutor visto que o ferro é determinado na forma de Fe3+, além do agente de complexação ser tiocianato, formando um complexo que é isolado e pré-concentrado utilizando N-octilacetamida para sua posterior determinação.[16] The article “Determination of iron (III) in food, biological and environmental samples (2016) by Verma et al. describes a method of colorimetric determination of iron 3+ present in food, biological and environmental samples using the thiocyanate ligand to form the complex, which is extracted by the solvent N-octylacetamide and then determined spectrophotometrically. Although this document also describes a method of colorimetric determination of iron, both the steps and the reagents employed differ from the present invention. First, a step of lysis and digestion of the samples is not described, there is no use of a reducing agent since iron is determined in the form of Fe3 +, in addition to the complexing agent being thiocyanate, forming a complex that is isolated and pre- concentrated using N-octylacetamide for further determination.

[17] Portanto, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve um método e kit para detecção e quantificação de ferro proveniente ou não de nanopartículas de óxido de ferro em meio biológico, tal como proposto pela presente invenção.[17] Therefore, none of the prior art documents describes a method and kit for detecting and quantifying iron whether or not it comes from iron oxide nanoparticles in a biological medium, as proposed by the present invention.

Breve descrição da invenção:Brief description of the invention:

[18] A presente invenção refere-se a um kit para a detecção e quantificação de ferro, em compostos ou na forma de nanopartículas, presente em amostras e/ou sistemas[18] The present invention relates to a kit for the detection and quantification of iron, in compounds or in the form of nanoparticles, present in samples and / or systems

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7/25 biológicos através de método colorimétrico. O referido kit compreende pelo menos um agente de lise; um agente de digestão; um agente redutor; um agente de ajuste de pH; e um agente complexante ou colorimétrico.7/25 biological through colorimetric method. Said kit comprises at least one lysis agent; a digestion agent; a reducing agent; a pH adjusting agent; and a complexing or colorimetric agent.

[19] Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um método de determinação colorimétrica do ferro em amostras biológicas utilizando o kit da presente invenção. Com o referido método, é possível realizar a lise do material com detergente e depois, uma digestão ácida sob aquecimento, possibilitando assim a determinação do ferro presente inicialmente em diversas formas, tais como íon, complexado ou em nanomateriais, além de garantir uma melhor extração do ferro em diversos tipos de amostras biológicas.[19] Additionally, the present invention relates to a method of colorimetric determination of iron in biological samples using the kit of the present invention. With this method, it is possible to perform the lysis of the material with detergent and then an acid digestion under heating, thus enabling the determination of the iron present initially in various forms, such as ion, complexed or in nanomaterials, in addition to guaranteeing a better extraction of iron in several types of biological samples.

Breve descrição das figuras:Brief description of the figures:

[20] Para auxiliar na total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.[20] To assist in the total and complete visualization of the object of this invention, the figures to which reference is made are presented, as follows.

[21] A Figura 1 apresenta as unidades constituintes do kit para determinação de ferro em amostras biológicas.[21] Figure 1 shows the constituent units of the kit for determining iron in biological samples.

[22] A Figura 2 ilustra o método de aplicação do kit in vitro, tomando como exemplo a determinação de ferro proveniente de nanopartículas de óxido de ferro incorporadas em células aderentes.[22] Figure 2 illustrates the method of application of the kit in vitro, taking as an example the determination of iron from iron oxide nanoparticles incorporated in adherent cells.

[23] A Figura 3 representa graficamente o efeito da concentração do agente de digestão na determinação de ferro pelo método colorimétrico, utilizando a técnica de fluorescência de raios X (TXRF) como controle.[23] Figure 3 graphically represents the effect of the concentration of the digesting agent on the determination of iron by the colorimetric method, using the X-ray fluorescence (TXRF) technique as a control.

[24] A Figura 4 representa graficamente o efeito do tempo de digestão no método colorimétrico de determinação de ferro, usando a técnica de fluorescência de raios X (TXRF)[24] Figure 4 graphically depicts the effect of digestion time on the colorimetric iron determination method, using the X-ray fluorescence (TXRF) technique

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8/25 como controle.8/25 as a control.

[25] A Figura 5 representa graficamente o efeito da concentração do agente redutor na determinação de ferro pelo método colorimétrico, utilizando a técnica de fluorescência de raios X (TXRF) como controle.[25] Figure 5 graphically represents the effect of the concentration of the reducing agent on the determination of iron by the colorimetric method, using the X-ray fluorescence (TXRF) technique as a control.

[26] A Figura 6 apresenta o efeito do pH na determinação de ferro pelo método colorimétrico, utilizando a técnica de fluorescência de raios X (TXRF) como controle.[26] Figure 6 shows the effect of pH on the determination of iron by the colorimetric method, using the X-ray fluorescence (TXRF) technique as a control.

[27] A Figura 7 apresenta em (A) os espectros de absorção do complexo formado entre o agente complexante e o ferro 2+ de amostras obtidas a partir de células aderentes do tipo Hela (2x10⁵ células por poço) incubadas por 24h na ausência de nanopartículas de óxido de ferro (controle), ou na presença de SPION-NF, SPION-PEA ou SPION-PEA/FA, todas na concentração de 4,44 pg Fe/mL; em (B) são apresentados os espectros de absorção das amostras obtidas a partir da adição de 0 a 3,8 pg de Fe de SPION-NF (In situ) ao lisado de células Hela; em (C) tem-se a correlação da absorbância em 520 nm e a concentração de ferro proveniente da adição de 0 a 3,8 pg de Fe de SPION-NF (in situ) ao lisado de células Hela; em (D) a correlação do sinal de TXRF (Net, eixo da esquerda) e a quantidade de ferro determinada a partir de padrões internos, adicionados posteriormente à amostra para confirmação da concentração de ferro (eixo da direita).[27] Figure 7 shows in (A) the absorption spectra of the complex formed between the complexing agent and 2+ iron from samples obtained from Hela-type adherent cells (2x10 ⁵ cells per well) incubated for 24 hours in the absence of iron oxide nanoparticles (control), or in the presence of SPION-NF, SPION-PEA or SPION-PEA / FA, all at a concentration of 4.44 pg Fe / mL; in (B) the absorption spectra of the samples obtained from the addition of 0 to 3.8 pg of Fe from SPION-NF (In situ) to the Hela cell lysate are presented; in (C) there is a correlation of absorbance at 520 nm and the concentration of iron from the addition of 0 to 3.8 pg Fe of SPION-NF (in situ) to the lysate of Hela cells; in (D) the correlation of the TXRF signal (Net, left axis) and the amount of iron determined from internal standards, added later to the sample to confirm the iron concentration (right axis).

[28] A Figura 8 ilustra a utilização do kit para quantificação de ferro em células aderentes do tipo HeLa, após 24 horas de incubação com três diferentes nanopartículas de óxido de ferro (SPION-NF, SPION-PEA ou SPION-PEA/FA) utilizando a técnica de fluorescência de raios X como controle.[28] Figure 8 illustrates the use of the kit for quantifying iron in adherent HeLa cells, after 24 hours of incubation with three different iron oxide nanoparticles (SPION-NF, SPION-PEA or SPION-PEA / FA) using the X-ray fluorescence technique as a control.

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9/25 [29] As Figuras 9A a 9D são imagens de ultramicroscopia hiperespectral de campo escuro de (A) células HeLa não submetidas a incubação com nanopartículas de óxido de ferro (SPIONs), e incubadas com (B) SPION-NF, (C) SPION-PEA e (D) SPION-PEA/FA, onde a barra lateral equivale a 20 micrômetros.9/25 [29] Figures 9A to 9D are dark field hyperspectral ultramicroscopy images of (A) HeLa cells not subjected to incubation with iron oxide nanoparticles (SPIONs), and incubated with (B) SPION-NF, ( C) SPION-PEA and (D) SPION-PEA / FA, where the sidebar is equivalent to 20 micrometers.

Descrição detalhada da invenção:Detailed description of the invention:

[30] A presente invenção refere-se a um kit para a detecção e quantificação de ferro, em compostos ou na forma de nanopartículas, presente em amostras e/ou sistemas biológicos através de método colorimétrico.[30] The present invention relates to a kit for the detection and quantification of iron, in compounds or in the form of nanoparticles, present in samples and / or biological systems through colorimetric method.

[31] O referido kit compreende pelo menos:[31] The kit includes at least:

- um agente de lise;- a lysis agent;

- um agente de digestão;- a digestion agent;

- um agente redutor;- a reducing agent;

- um agente de ajuste de pH; e- a pH adjusting agent; and

- um agente complexante ou colorimétrico.- a complexing or colorimetric agent.

[32] O agente de lise é responsável por romper a membrana das células e possibilitar a dosagem de proteínas. O mesmo é utilizado exclusivamente para aplicações em ensaios in vitro utilizando células em cultura, nos quais seja necessária a inclusão de método para dosagem de proteína. Assim, o agente de lise é selecionado do grupo que consiste em tensoativos iônicos e neutros, tais como dodecil sulfato de sódio, brometo de cetiltrimetilamônio, octilfenol etoxilado, éter mono[p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenílico] de polietilenoglicol, dextran, Triton X-100 e monolaurato de sorbitan etoxilado, em concentrações variando de 0,0001% a 1% m/v ou v/v.[32] The lysis agent is responsible for breaking the cell membrane and making it possible to measure proteins. It is used exclusively for in vitro assay applications using cultured cells, in which it is necessary to include a method for protein measurement. Thus, the lysis agent is selected from the group consisting of ionic and neutral surfactants, such as sodium dodecyl sulfate, cetyltrimethylammonium bromide, ethoxylated octylphenol, mono [p- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether] polyethylene glycol, dextran, Triton X-100 and ethoxylated sorbitan monolaurate, in concentrations ranging from 0.0001% to 1% m / v or v / v.

[33] O agente de digestão é responsável por promover a digestão química do material biológico e das nanopartículas[33] The digestion agent is responsible for promoting the chemical digestion of biological material and nanoparticles

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10/25 de óxido de ferro, disponibilizando o ferro para análise na forma de íons solúveis em água. Assim, o referido agente de digestão é selecionado do grupo que consiste em espécies ácidas tais como ácido nítrico, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfâmico, ácido trifluorometanossulfônico, ácido trifluoroacético, ácido glucônico e/ou ácido cítrico, em concentrações na faixa de 10 mg/mL a 1000 mg/mL.10/25 iron oxide, making the iron available for analysis in the form of water-soluble ions. Thus, said digestion agent is selected from the group consisting of acidic species such as nitric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, sulfamic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid and / or citric acid, in concentrations in the range of 10 mg / ml to 1000 mg / ml.

[34] O agente redutor é responsável pela redução do ferro presente no estado de oxidação 3+ para o estado de oxidação 2+. Assim, o referido agente redutor é selecionado do grupo que consiste em espécies tais como ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido tioglicólico, cloridrato de hidroxilamina, hidrazina, sulfito, ditionito e borohidreto de sódio, em concentrações na faixa de 0,5 mg/mL a 500 mg/mL.[34] The reducing agent is responsible for reducing the iron present in the oxidation state 3+ to the oxidation state 2+. Thus, said reducing agent is selected from the group consisting of species such as citric acid, ascorbic acid, thioglycolic acid, hydroxylamine hydrochloride, hydrazine, sulfite, dithionite and sodium borohydride, in concentrations in the range of 0.5 mg / mL at 500 mg / ml.

[35] O agente de ajuste de pH é responsável por tornar o pH da amostra adequado para a formação do complexo altamente colorido desejado, possibilitando a determinação do teor de ferro. O referido agente de ajuste de pH é selecionado do grupo que consiste em espécies capazes de ajustar o pH para o valor adequado para a formação do complexo, tais como acetato de sódio, hidróxido de amônio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio em concentrações entre 5 mg/mL a 1 g/mL.[35] The pH adjusting agent is responsible for making the pH of the sample suitable for the formation of the desired highly colored complex, enabling the determination of the iron content. The said pH adjusting agent is selected from the group consisting of species capable of adjusting the pH to the appropriate value for the formation of the complex, such as sodium acetate, ammonium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide in concentrations between 5 mg / ml to 1 g / ml.

[36] O agente complexante ou colorimétrico responsável por formar um complexo de coloração intensa com o ferro no estado de oxidação 2+, permitindo assim a sua determinação espectrofotométrica.[36] The complexing or colorimetric agent responsible for forming an intense staining complex with iron in the 2+ oxidation state, thus allowing its spectrophotometric determination.

O referido agente é selecionado do grupo que consiste em ligantes capazes de formar complexos estáveis com o ferro no estado de oxidação + , tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, 2,2'Said agent is selected from the group consisting of binders capable of forming stable complexes with iron in the oxidation + state, such as 1.10-phenanthroline and its derivatives, 2.2 '

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 21/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 21/55

11/25 bipiridina e seus derivados, 2,2^,:6^,,2-terpiridina, e seus derivados e outros ligantes N-heterocíclicos aromáticos, sendo empregados em concentrações compreendidas entre 0,1 mg/mL a 100 mg/mL.11/25 bipyridine and their derivatives, 2.2: ^6, 2-terpyridine, and derivatives and other aromatic N-heterocyclic ligands and are used at concentrations of 0.1 mg / ml to 100 mg / ml.

[37] Um exemplo do kit da presente invenção é apresentado na Figura 1.[37] An example of the kit of the present invention is shown in Figure 1.

[38] Portanto, o kit aqui descrito permite a determinação colorimétrica do ferro em amostras biológicas. Ainda, particular atenção foi dada à quantificação de ferro presente na forma de nanopartículas de óxido de ferro, tendose em vista que os kits de determinação de ferro atualmente comercializados não possibilitam tal aplicação, pois os reagentes empregados não são capazes de solubilizar totalmente as nanopartículas e assim disponibilizar quimicamente todo o ferro presente na amostra para as reações colorimétricas.[38] Therefore, the kit described here allows colorimetric determination of iron in biological samples. Still, particular attention was given to the quantification of iron present in the form of iron oxide nanoparticles, considering that the iron determination kits currently marketed do not allow such application, because the reagents employed are not able to fully solubilize the nanoparticles and thus chemically making available all the iron present in the sample for colorimetric reactions.

[39] Nesse sentido, adicionalmente, a presente invenção refere-se a um método de determinação colorimétrica do ferro em amostras biológicas utilizando o kit aqui descrito.[39] In this sense, in addition, the present invention relates to a method of colorimetric determination of iron in biological samples using the kit described here.

[40] O referido método compreende as etapas de:[40] This method comprises the steps of:

a) Adicionar água destilada ao frasco contendo o agente de digestão até a marca indicada (3,0 mL), e ao agente redutor também até a marcação indicada (1,0 mL);a) Add distilled water to the bottle containing the digestion agent up to the indicated mark (3.0 mL), and to the reducing agent also up to the indicated mark (1.0 mL);

b) Adicionar pelo menos 1 mL de etanol no frasco do agente complexante;b) Add at least 1 ml of ethanol to the complexing agent bottle;

c) Diluir de 5 a 20 vezes, em água destilada, uma alíquota da solução estoque do agente complexante preparada em etanol de acordo com a etapa b.c) Dilute 5 to 20 times, in distilled water, an aliquot of the stock solution of the complexing agent prepared in ethanol according to step b.

d) Realizar a incubação das células aderentes provenientes das amostras biológicas em análise com ad) Carry out the incubation of adherent cells from biological samples under analysis with the

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 22/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 22/55

12/25 suspensão de nanopartículas de óxido de ferro dispersas em meio de cultura, por um período de 1 a 48 horas;12/25 suspension of iron oxide nanoparticles dispersed in culture medium, for a period of 1 to 48 hours;

e) Remover o sobrenadante e lavar cuidadosamente as células aderidas com duas alíquotas de tampão fosfato salino (PBS);e) Remove the supernatant and carefully wash the adhered cells with two aliquots of phosphate buffered saline (PBS);

f) Após lavagem com tampão, adicionar de 100 a 400 microlitros do agente de lise por 500.000 células, que variam em função do tamanho da microplaca escolhida para o teste (12, 24, 48 ou 96 poços), incubar à temperatura de 20 a 40 °C durante 5 a 30 minutos e homogeneizar;f) After washing with buffer, add 100 to 400 microliters of the lysing agent per 500,000 cells, which vary according to the size of the microplate chosen for the test (12, 24, 48 or 96 wells), incubate at 20 to 40 ° C for 5 to 30 minutes and mix;

g) Adicionar ao restante do lisado de 200 a 500 microlitros do agente de digestão;g) Add to the rest of the lysate 200 to 500 microliters of the digesting agent;

h) Transferir as soluções para microtubos e incubar à temperatura de 70 a 90 °C, por um período superior a 10 horas;h) Transfer the solutions to microtubes and incubate at 70 to 90 ° C for more than 10 hours;

i) Adicionar de 10 a 50 microlitros do agente redutor em cada amostra;i) Add 10 to 50 microliters of the reducing agent to each sample;

j) Ajustar o pH na faixa de 2 a 7, homogeneizar e transferir de 50 a 250 microlitros de cada amostra para os poços de uma microplaca, de acordo com a quantidade de ferro presente na amostra, de maneira a garantir um sinal de absorbância até 1;j) Adjust the pH in the range of 2 to 7, homogenize and transfer 50 to 250 microliters of each sample to the wells of a microplate, according to the amount of iron present in the sample, in order to guarantee an absorbance signal until 1;

k) Adicionar de 10 a 50 microlitros do agente complexante a cada um dos poços e homogeneizar;k) Add 10 to 50 microliters of the complexing agent to each well and mix thoroughly;

l) Efetuar a leitura da absorbância em 520 nm, após 10 a 30 minutos da etapa k;l) Take the absorbance reading at 520 nm, after 10 to 30 minutes of step k;

m) Para a curva padrão de ferro e para o controle (branco), transferir de 50 a 250 microlitros do lisado de células não incubadas com a suspensão de nanopartículas de óxido de ferro, 5 a 10 microlitros da solução padrão dem) For the standard iron curve and for the control (white), transfer 50 to 250 microliters of the non-incubated cell lysate with the suspension of iron oxide nanoparticles, 5 to 10 microliters of the standard iron solution

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 23/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 23/55

13/25 sulfato ferroso amoniacal, e 10 a 50 microlitros do agente complexante para os poços de uma microplaca;13/25 ferrous ammonium sulfate, and 10 to 50 microliters of the complexing agent for the wells of a microplate;

n) Efetuar a leitura da absorbância em 520 nm após homogeneização, e montar um gráfico de absorbância (520 nm) em função da concentração de ferro(II), que será aplicado como curva padrão.n) Read the absorbance at 520 nm after homogenization, and draw up an absorbance graph (520 nm) as a function of the iron (II) concentration, which will be applied as a standard curve.

[41] Na etapa d, para a incubação das células aderentes provenientes das amostras biológicas em análise, utilizam-se entre 100 a 500.000 células por poço de acordo com a placa de incubação selecionada (96, 48, 24, 12 e 6 poços). Alternativamente, as referidas nanopartículas de óxido de ferro podem ser substituídas por outras fontes de ferro.[41] In step d, for the incubation of adherent cells from the biological samples under analysis, between 100 and 500,000 cells are used per well according to the selected incubation plate (96, 48, 24, 12 and 6 wells) . Alternatively, said iron oxide nanoparticles can be replaced by other sources of iron.

[42] Ainda na etapa d, realizar amostras controle em poços através da incubação apenas com meio de cultura, ou seja, para as amostras controle é realizado o mesmo procedimento anteriormente descrito, exceto pela adição da fonte de ferro. Para tal, o meio de cultura deve ser selecionado e suplementado conforme recomendado para cada tipo de célula. Por exemplo, no caso de células HeLa utilizase o meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de antibióticos antimicóticos. Este controle é essencial para eliminar o sinal de ferro naturalmente presente na matriz biológica.[42] Still in step d, perform control samples in wells by incubating only with culture medium, that is, for the control samples, the same procedure described above is performed, except for the addition of the iron source. For this, the culture medium must be selected and supplemented as recommended for each cell type. For example, in the case of HeLa cells, DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% antimycotic antibiotics is used. This control is essential to eliminate the iron signal naturally present in the biological matrix.

[43] Na etapa f, preferencialmente, após a lavagem com tampão fosfato salino, adicionam-se 200 microlitros do agente de lise, e incuba-se a 37 °C durante 30 minutos. Ainda, opcionalmente, na etapa f é retirada uma alíquota para a dosagem de proteína.[43] In step f, preferably, after washing with phosphate buffered saline, 200 microliters of the lysing agent are added, and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Also, optionally, in step f an aliquot is removed for the protein dosage.

[44] Na etapa g, preferencialmente, adicionam-se ao[44] In step g, preferably, they are added to the

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 24/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 24/55

14/25 restante do lisado 400 microlitros do agente de digestão.14/25 remainder of the lysate 400 microliters of the digesting agent.

[45] Na etapa h, preferencialmente transferem-se as soluções para microtubos e incuba-se a 70 °C.[45] In step h, the solutions are preferably transferred to microtubes and incubated at 70 ° C.

[46] Na etapa i, preferencialmente adicionam-se 10 microlitros do agente redutor em cada amostra.[46] In step i, preferably 10 microliters of reducing agent are added to each sample.

[47] Na etapa j, preferencialmente ajusta-se o pH de 2 a 7, homogeneízam-se e transferem-se 180 microlitros de cada amostra para os poços de uma microplaca de 96 poços, em que o sinal de absorbância é de até 1.[47] In step j, the pH is preferably adjusted from 2 to 7, homogenized and 180 microliters of each sample are transferred to the wells of a 96-well microplate, where the absorbance signal is up to 1 .

[48] Na etapa k, preferencialmente adicionam-se 10 microlitros do agente complexante a cada um dos poços.[48] In step k, preferably 10 microliters of the complexing agent are added to each of the wells.

[49] Na etapa l, para a leitura da absorbância, é realizada uma curva de calibração que deve ser construída através do preparo de soluções padrão de sulfato ferroso amoniacal nas seguintes concentrações, por exemplo: 3,90 mg/mL, 2,34 mg/mL, 1,56 mg/mL, 0,624 mg/mL, 0,248 mg/mL, 0,0992 mg/mL. Esta faixa de concentração deve ser adequada à faixa de concentração de ferro presente nas amostras em análise.[49] In step 1, for the absorbance reading, a calibration curve is made, which must be constructed by preparing standard solutions of ammoniacal ferrous sulfate in the following concentrations, for example: 3.90 mg / mL, 2.34 mg / ml, 1.56 mg / ml, 0.624 mg / ml, 0.248 mg / ml, 0.0992 mg / ml. This concentration range must be appropriate to the iron concentration range present in the samples under analysis.

[50] Na etapa m, preferencialmente, transferem-se 180 microlitros de amostras do lisado, não incubadas com a suspensão de nanopartículas de óxido de ferro ou com soluções de fonte de ferro (amostras controle), e 10 microlitros das soluções padrão de sulfato ferroso amoniacal, e 10 microlitros do agente complexante para os poços de uma microplaca de 96 poços. Ainda, para manter a proporcionalidade, recomenda-se utilizar o mesmo volume selecionado na etapa j.[50] In step m, preferably 180 microliters of lysate samples are transferred, not incubated with the suspension of iron oxide nanoparticles or with iron source solutions (control samples), and 10 microliters of the standard sulfate solutions ferrous ammonia, and 10 microliters of the complexing agent for the wells of a 96-well microplate. Also, to maintain proportionality, it is recommended to use the same volume selected in step j.

[51] E finalmente na etapa n, após homogeneização, efetua-se a leitura da absorbância em 520 nm e monta-se um[51] And finally in step n, after homogenization, the absorbance is read at 520 nm and a

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 25/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 25/55

15/25 gráfico de absorbância (520 nm) em função da concentração de ferro(II).15/25 absorbance graph (520 nm) as a function of iron (II) concentration.

[52] Para tal, é utilizada a curva padrão para determinar a concentração de ferro em cada uma das amostras da microplaca de 96 poços, e corrigir o valor obtido para o volume total de amostra, de modo a obter o teor de ferro total presente na amostra.[52] To do this, the standard curve is used to determine the iron concentration in each of the 96-well microplate samples, and to correct the value obtained for the total sample volume, in order to obtain the total iron content present in the sample.

[53] Todavia, vale ressaltar que a determinação de ferro nas amostras controle deve ser também realizada para eventualmente corrigir os valores anteriormente encontrados, inclusive os valores utilizados para construção da curva padrão, subtraindo-se o valor encontrado para o controle. Assim, obtém-se a quantidade de ferro incorporada excluindose o teor de ferro naturalmente presente nas células.[53] However, it is worth mentioning that the determination of iron in the control samples must also be carried out to eventually correct the values previously found, including the values used to construct the standard curve, subtracting the value found for the control. Thus, the amount of iron incorporated is obtained excluding the iron content naturally present in the cells.

[54] Portanto, os limites de branco e de detecção alcançados pelo método são pelo menos, respectivamente, 0,076 e 0,143 gg Fe/mL.[54] Therefore, the blank and detection limits achieved by the method are at least 0.076 and 0.143 gg Fe / mL, respectively.

[55] Vale ressaltar que, com o intuito de exemplificar a invenção, todos os processos foram realizados em recipientes adequados, tais como béqueres, microtubos de centrifugação, microplacas, entre outros, todos descartáveis ou limpos. Todavia, é oportuno ressaltar que a presente invenção não é limitada pelos referidos exemplos, podendo ser utilizados outros recipientes para reprodução em escala industrial.[55] It is worth mentioning that, in order to exemplify the invention, all the processes were carried out in suitable containers, such as beakers, centrifugation microtubes, microplates, among others, all disposable or clean. However, it is worth noting that the present invention is not limited by the said examples, and other containers for reproduction on an industrial scale can be used.

Modalidade preferida da invenção:Preferred mode of the invention:

[56] A Figura 2 ilustra as etapas do método de determinação colorimétrica do ferro, em amostras biológicas da presente invenção, em um exemplo de aplicação do kit para determinação de ferro em células aderentes incubadas com[56] Figure 2 illustrates the steps of the colorimetric iron determination method, in biological samples of the present invention, in an example application of the kit for determining iron in adherent cells incubated with

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 26/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 26/55

16/25 nanopartículas de óxido de ferro.16/25 iron oxide nanoparticles.

[57] Para aplicação do kit apresentado, foi empregado o seguinte exemplo: 2x10⁵ células HeLa foram transferidas para cada poço de uma placa de cultura de 12 poços e incubadas durante 15 horas para total aderência. Então, o meio de cultura foi removido, e as células incubadas durante 24 horas com 1 mL de uma suspensão de SPION, preparada pela diluição de uma suspensão estoque com meio de cultura DMEM (contendo 1% de soro bovino fetal), obtendo-se assim as concentrações finais de ferro de 4,44, 8,88 e 14,8 pg/mL.[57] For the application of the kit presented, the following example was used: 2x10 ⁵ HeLa cells were transferred to each well of a 12-well culture plate and incubated for 15 hours for total adherence. Then, the culture medium was removed, and the cells incubated for 24 hours with 1 mL of a SPION suspension, prepared by diluting a stock suspension with DMEM culture medium (containing 1% fetal bovine serum), obtaining thus the final iron concentrations of 4.44, 8.88 and 14.8 pg / mL.

[58] Após 24 horas, removeram-se as soluções de incubação, lavaram-se os poços, cuidadosamente, duas vezes com tampão fosfato salino, seguido da lise das células com 200 pL de Triton X-100 (0,01% v/v). Retirou-se uma alíquota de 10 pL de cada poço para determinação da quantidade de proteína. Em seguida, adicionaram-se 400 pL de solução de ácido cítrico (0,3 M) ao restante do lisado, transferiramse as amostras para microtubos, mantendo-os a 70 °C durante pelo menos 12 horas para garantir a completa digestão das amostras.[58] After 24 hours, incubation solutions were removed, the wells were washed carefully twice with phosphate buffered saline, followed by lysis of the cells with 200 pL of Triton X-100 (0.01% v / v). A 10 µl aliquot was taken from each well to determine the amount of protein. Then, 400 µL of citric acid solution (0.3 M) was added to the rest of the lysate, the samples were transferred to microtubes, keeping them at 70 ° C for at least 12 hours to ensure complete digestion of the samples.

[59] Adicionaram-se, então, 10 pL de uma solução de ácido ascórbico 0,6 M e 18 pL de uma solução de NaOH 10 M a cada microtubo para que o pH final da solução fosse 4,5, seguido da homogeneização das amostras. Então, 190 pL de cada amostra foram transferidos para os poços de uma microplaca de 96 poços e 10 pL de uma solução aquosa 6,0x10² M de 2,2-bipiridina (preparada a partir da diluição de uma solução estoque preparada em etanol) foram adicionados a cada poço, seguido de incubação durante 20 minutos. Os experimentos controle foram realizados da mesma forma,[59] 10 pL of a 0.6 M ascorbic acid solution and 18 pL of a 10 M NaOH solution were then added to each microtube so that the final pH of the solution was 4.5, followed by homogenization of the samples. Then, 190 pL of each sample was transferred to the wells of a 96-well microplate and 10 pL of a 6.0x10 ² M aqueous solution of 2,2-bipyridine (prepared by diluting a stock solution prepared in ethanol) were added to each well, followed by incubation for 20 minutes. The control experiments were carried out in the same way,

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 27/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 27/55

17/25 exceto pela ausência de SPIONs.17/25 except for the absence of SPIONs.

[60] A absorbância em 520 nm, ou os espectros de absorção na faixa de 350 a 800 nm, como aqueles descritos nas Figuras 7A e 7B, de todas as amostras (incluindo os controles) foram obtidos, sendo o valor da absorbância média das amostras controle subtraído de todas as amostras, e a quantidade de ferro determinada utilizando uma curva padrão construída de acordo com o seguinte procedimento: 180 pL de amostras sem SPIONs (amostras controle) foram transferidos para poços de uma microplaca de 96 poços, seguido da adição de 10 pL de soluções 10x10^-3, 6x10^-3, 4x10^-3, 1,6x10^-3, 0,64x10³ e 0,26x10^-3 M de sulfato ferroso amoniacal e 10 pL de 2,2bipiridina 6.0x10^-2 M. Os valores de absorbância obtidos se referem a concentração de ferro presente em 190 pL das amostras originais, de maneira que a concentração total de ferro proveniente das SPIONs incorporadas nas células HeLa, deve ser calculada considerando o volume total de amostra, neste exemplo de ~640 pL, resultante da adição dos agentes de lise, digestão e redução, e ajuste do pH para 4,5.[60] The absorbance at 520 nm, or the absorption spectra in the range 350 to 800 nm, as those described in Figures 7A and 7B, of all samples (including controls) were obtained, with the mean absorbance value of Control samples subtracted from all samples, and the amount of iron determined using a standard curve constructed according to the following procedure: 180 pL of samples without SPIONs (control samples) were transferred to wells of a 96-well microplate, followed by addition of 10 pL of solutions 10x10 ^-3 , 6x10 ^-3 , 4x10 ^-3 , 1.6x10 ^-3 , 0.64x10 ³ and 0.26x10 ^-3 M of ferrous ammonium sulfate and 10 pL of 2.2bipyridine 6.0x10 ^-2 M The absorbance values obtained refer to the iron concentration present in 190 pL of the original samples, so that the total iron concentration from the SPIONs incorporated in the HeLa cells, must be calculated considering the total sample volume, in this example of ~ 640 pL, results before adding lysis, digestion and reduction agents, and adjusting the pH to 4.5.

[61] Finalmente, os resultados foram normalizados pela quantidade de proteína presente em cada amostra (a qual é proporcional ao número de células presentes). A quantidade de proteína pode ser determinada através de métodos como o Biureto, Bradford e Lowry, sendo que no presente exemplo o último método foi empregado consistindo das seguintes etapas: 10 pL do lisado foram transferidos para microplacas de 96 poços e então 10 pL de água deionizada e 175 pL do reagente Biureto foram adicionados a cada poço e homogeneizados. A mistura foi então incubada em temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido da adição de 10 pL do[61] Finally, the results were normalized by the amount of protein present in each sample (which is proportional to the number of cells present). The amount of protein can be determined using methods such as Biuret, Bradford and Lowry, and in the present example the last method was used consisting of the following steps: 10 pL of the lysate were transferred to 96-well microplates and then 10 pL of water deionized and 175 pL of the Biuret reagent were added to each well and homogenized. The mixture was then incubated at room temperature for 10 minutes, followed by the addition of 10 pL of the

Petição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 28/55Petition 870180002778, of 12/01/2018, p. 28/55

18/25 reagente Folin-Ciocalteu e imediata homogeneização. Após incubação durante 30 minutos a temperatura ambiente e ausência de luz, registrou-se a absorbância em 770 nm. A quantidade total de proteína foi determinada utilizando uma curva padrão, obtida utilizando soluções de Albumina de Soro Bovino (BSA) na faixa de concentração de 0,05 a 1,00 mg/mL, preparadas a partir da diluição de uma solução estoque de BSA 1 mg/mL preparada em tampão PBS.18/25 Folin-Ciocalteu reagent and immediate homogenization. After incubation for 30 minutes at room temperature and absence of light, the absorbance was recorded at 770 nm. The total amount of protein was determined using a standard curve, obtained using Bovine Serum Albumin (BSA) solutions in the concentration range of 0.05 to 1.00 mg / mL, prepared from the dilution of a BSA stock solution 1 mg / mL prepared in PBS buffer.

[62] Ainda, é oportuno ressaltar que o volume utilizado dos reagentes de digestão, de redução e de complexação, bem como os volumes dos agentes de lise e de correção do pH devem ser ajustados de acordo com o tipo de amostra e quantidade de ferro a ser detectada. Por exemplo, quantidades maiores de reagentes podem ser necessários no caso de materiais biológicos mais complexos. Adicionalmente, a curva padrão de sulfato ferroso amoniacal deve também ser construída de maneira a contemplar a faixa de concentração de ferro a ser determinada.[62] In addition, it should be noted that the volume used for digestion, reduction and complexing reagents, as well as the volumes of lysis and pH correction agents, must be adjusted according to the type of sample and the amount of iron to be detected. For example, larger amounts of reagents may be needed for more complex biological materials. In addition, the standard curve of ammoniacal ferrous sulfate must also be constructed in order to contemplate the iron concentration range to be determined.

[63] Para avaliar o potencial do método de determinação colorimétrica do ferro em amostras biológicas da presente invenção, a seguir são apresentados os resultados dos testes realizados.[63] To assess the potential of the colorimetric iron determination method in biological samples of the present invention, the results of the tests performed are presented below.

Testes Realizados:Tests:

[64] Diversos ensaios foram realizados no sentido de avaliar a faixa adequada de concentração dos agentes empregados. Tais ensaios foram realizados através da adição de uma quantidade conhecida de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs) sem funcionalização em sua superfície (SPION-NF) ou funcionalizadas com o-fosforiletanolamina (SPION-PEA) ou oPetição 870180002778, de 12/01/2018, pág. 29/55[64] Several tests have been carried out to assess the appropriate concentration range of the agents employed. Such tests were performed by adding a known quantity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) without functionalization on their surface (SPION-NF) or functionalized with o-phosphoryl ethanolamine (SPION-PEA) or Opposition 870180002778, from 12/01 / 2018, p. 29/55

19/25 fosforiletanolamina/ácido fólico (SPION-PEA/FA) a uma matriz constituída de um lisado de células aderentes do tipo HeLa, cuja concentração de ferro foi previamente determinada por fluorescência de raios X.19/25 phosphoryl ethanolamine / folic acid (SPION-PEA / FA) to a matrix consisting of a lysate of adherent cells of the type HeLa, whose iron concentration was previously determined by X-ray fluorescence.

Assim, a concentração de cada agente foi ajustada de modo a minimizar o erro e maximizar a reprodutibilidade dos ensaios. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e as amostras também analisadas pela técnica de fluorescência de raios X (TXRF) como forma de controle.Thus, the concentration of each agent was adjusted in order to minimize the error and maximize the reproducibility of the assays. All tests were performed in triplicate and the samples were also analyzed using the X-ray fluorescence (TXRF) technique as a control.

[65] A[65] A

Figura apresenta o resultado do efeito da concentração do agente de digestão na determinação colorimétrica de ferro, utilizando técnica de fluorescência de raios X como controle.Figure shows the result of the effect of the concentration of the digestion agent on the colorimetric determination of iron, using the X-ray fluorescence technique as a control.

Verifica-se que concentrações acima de 50 mg/mL (concentração final na amostra) são indicadas para a digestão da amostra visando a determinação da quantidade de ferro total presente na amostra.It is verified that concentrations above 50 mg / mL (final concentration in the sample) are indicated for the digestion of the sample in order to determine the amount of total iron present in the sample.

66] O tempo de digestão da amostra °C também mostrou ser fundamental para a determinação da quantidade de ferro total na amostra. Tempos de digestão inferiores a 10 horas são insuficientes para assegurar a digestão e liberação de todo o conteúdo de ferro das nanopartículas de óxido de ferro, impossibilitando assim, a formação da quantidade esperada de complexo, como ilustra a Figura66] The digestion time of the sample ° C also proved to be fundamental for determining the amount of total iron in the sample. Digestion times of less than 10 hours are insufficient to ensure the digestion and release of the entire iron content of the iron oxide nanoparticles, thus preventing the formation of the expected amount of complex, as shown in Figure

4. Em geral tempos superiores a 10 horas são adequados para o emprego do kit, podendo as amostras serem mantidas com o agente de digestão a 70°C overnight.4. In general, times longer than 10 hours are suitable for using the kit, and the samples can be kept with the digestion agent at 70 ° C overnight.

67] No gráfico da67] In the graph of

Figura 5 pode-se verificar o efeito da concentração do agente redutor na determinação colorimétrica de ferro.Figure 5 shows the effect of the concentration of the reducing agent on the colorimetric determination of iron.

Pode-se observar que concentraçõesIt can be seen that concentrations

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20/25 acima de 0,02 mg/mL são adequadas para promover a redução total do ferro do estado de oxidação 3+ para o estado de oxidação 2+, possibilitando assim a sua reação com o agente complexante e quantificação pelo método colorimétrico/espectrofotométrico.20/25 above 0.02 mg / mL are suitable to promote the total reduction of iron from the oxidation state 3+ to the oxidation state 2+, thus enabling its reaction with the complexing agent and quantification by the colorimetric / spectrophotometric method .

[68] A formação do complexo depende de condições adequadas de pH como pode ser verificado através do gráfico da Figura 6, no qual observa-se que a faixa mais adequada para a formação do complexo encontra-se entre 2 e 7, onde a quantidade de ferro determinada correspondeu ao valor esperado. Todavia, a solução resultante da digestão e redução é muito mais ácida, demonstrando a importância do agente para ajuste de pH no kit, de modo a favorecer a formação do complexo garantindo assim ensaios com resultados reprodutíveis e elevado grau de exatidão.[68] The formation of the complex depends on adequate pH conditions as can be seen through the graph in Figure 6, in which it is observed that the most suitable range for the formation of the complex is between 2 and 7, where the amount determined iron content corresponded to the expected value. However, the solution resulting from digestion and reduction is much more acidic, demonstrating the importance of the agent for pH adjustment in the kit, in order to favor the formation of the complex thus guaranteeing tests with reproducible results and a high degree of accuracy.

[69] As amostras do controle (lisado de células não incubadas com SPIONs) apresentam uma concentração muito baixa de ferro em comparação às amostras incubadas com as SPIONs como pode ser observado no espectro (linha preta) mostrado na Figura 7a. O aumento da absorbância na presença de SPION-NF é um indicativo de que as nanopartículas foram incorporadas pelas células HeLa após 24 horas de incubação, mesmo considerando a ausência de moléculas bioativas na superfície. Quando as SPIONs foram modificadas com PEA, observou-se maior captação por células HeLa em comparação às SPION-NF, provavelmente devido ao aumento da carga positiva superficial das nanopartículas (potencial zeta de +22,4 mV) que aumentam a interação com a membrana celular negativamente carregada.[69] Control samples (cell lysate not incubated with SPIONs) have a very low concentration of iron compared to samples incubated with SPIONs as can be seen in the spectrum (black line) shown in Figure 7a. The increase in absorbance in the presence of SPION-NF is an indication that the nanoparticles were incorporated by HeLa cells after 24 hours of incubation, even considering the absence of bioactive molecules on the surface. When SPIONs were modified with PEA, greater uptake by HeLa cells was observed compared to SPION-NF, probably due to the increase in the positive surface charge of the nanoparticles (zeta potential of +22.4 mV) that increase the interaction with the membrane negatively charged cell.

[70] A conjugação de 2% de ácido fólico na superfície[70] The conjugation of 2% folic acid on the surface

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21/25 de SPIONs modificadas com PEA aumentou a captação em mais de duas vezes, como pode ser observado analisando o espectro verde da Figura 7a. As células HeLa apresentam um maior número de receptores de folato na superfície celular, favorecendo a interação e incorporação de SPION-PEA/FA, demonstrando um forte efeito sinérgico entre as moléculas bioativas conjugadas.21/25 of SPIONs modified with PEA increased the uptake more than twice, as can be seen by analyzing the green spectrum of Figure 7a. HeLa cells have a greater number of folate receptors on the cell surface, favoring the interaction and incorporation of SPION-PEA / FA, demonstrating a strong synergistic effect between the conjugated bioactive molecules.

[71] As células cancerígenas têm uma taxa elevada de divisão celular, por este motivo o consumo de ácido fólico é bastante elevado nestes tecidos. Deste modo, o ácido fólico tem sido explorado como um agente de direcionamento molecular para tratamento e diagnóstico de câncer, pois quando ligado/conjugado a fármacos ou nanopartículas, aumenta a sua acumulação em células cancerígenas ou tumores.[71] Cancer cells have a high rate of cell division, which is why the consumption of folic acid is quite high in these tissues. In this way, folic acid has been explored as a molecular targeting agent for the treatment and diagnosis of cancer, because when linked / conjugated to drugs or nanoparticles, it increases its accumulation in cancer cells or tumors.

[72] Observou-se uma correlação linear entre a absorbância em 520 nm (Figura 7b-c) e o sinal TXRF (Figura 7d) em função da concentração de ferro de SPION-NF (0 a 3,8 pg de Fe) adicionado ao lisado de células, mostrando que o ensaio colorimétrico pode ser aplicado em uma ampla gama de concentrações de ferro e que a técnica TXRF é confiável como método de controle. Para a TXRF esta relação permanece linear mesmo após a padronização interna (Figura 7d, eixo do lado direito) mostrando confiabilidade na quantificação de ferro sob matriz biológica.[72] There was a linear correlation between the absorbance at 520 nm (Figure 7b-c) and the TXRF signal (Figure 7d) as a function of the iron concentration of SPION-NF (0 to 3.8 pg of Fe) added to cell lysate, showing that the colorimetric assay can be applied over a wide range of iron concentrations and that the TXRF technique is reliable as a control method. For the TXRF this relationship remains linear even after internal standardization (Figure 7d, axis on the right side) showing reliability in the quantification of iron under biological matrix.

[73] Ainda, nas Figuras 7C-D, os sinais foram obtidos em função da concentração de ferro nas amostras preparadas pela adição de SPION-NF (de 0 a 3,8 pg de Fe por poço) ao lisado de células aderentes do tipo HeLa. O sinal de TXRF é expresso como a área do pico do elemento-analito, expresso em contagens. SPION-NF se refere às nanopartículas de óxido[73] Also, in Figures 7C-D, the signals were obtained as a function of the iron concentration in the samples prepared by the addition of SPION-NF (from 0 to 3.8 pg Fe per well) to the lysate of adherent cells of the type HeLa. The TXRF signal is expressed as the peak area of the analyte element, expressed in counts. SPION-NF refers to oxide nanoparticles

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22/25 de ferro superparamagnéticas sem funcionalização, SPION-PEA se refere às nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com fosforiletanolamina, e SPION-PEA/FA se refere às nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com fosforiletanolamina e ácido fólico.22/25 superparamagnetic iron without functionalization, SPION-PEA refers to iron oxide nanoparticles functionalized with phosphoryl ethanolamine, and SPION-PEA / FA refers to iron oxide nanoparticles functionalized with phosphoryl ethanol and folic acid.

[74] Portanto, os resultados obtidos confirmaram a eficiência do kit para determinação colorimétrica do ferro proveniente de nanopartículas de óxido de ferro incorporadas em células aderentes. Os limites de branco e de detecção alcançados pelo método são, pelo menos e respectivamente, 0,076 e 0,143 pg Fe/mL.[74] Therefore, the results obtained confirmed the efficiency of the kit for colorimetric determination of iron from iron oxide nanoparticles incorporated in adherent cells. The blank and detection limits achieved by the method are at least 0.076 and 0.143 pg Fe / mL, respectively.

Exemplos da invenção:Examples of the invention:

[75] Os exemplos aqui mostrados têm o objetivo de exemplificar algumas das aplicações da invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.[75] The examples shown here are intended to exemplify some of the applications of the invention, however without limiting the scope of it.

- Determinação de ferro proveniente de nanopartículas de óxido de ferro incorporadas em células aderentes:- Determination of iron from iron oxide nanoparticles incorporated in adherent cells:

[76] Para avaliar a eficiência do kit na determinação de ferro proveniente de nanopartículas de óxido de ferro incorporadas em células aderentes do tipo HeLa, utilizaramse três tipos de nanopartículas cuja diferença reside na presença ou não de uma camada de funcionalização na superfície das partículas, bem como nos agentes de funcionalização utilizados. Assim, foram empregadas as seguintes nanopartículas de óxido de ferro: nanopartículas de óxido de ferro sem funcionalização (SPION-NF), nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com fosforiletanolamina (SPION-PEA), e nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com o-fosforiletanolamina e ácido fólico (SPION-PEA/FA).[76] To assess the efficiency of the kit in determining iron from iron oxide nanoparticles incorporated into adherent cells of the HeLa type, three types of nanoparticles were used whose difference lies in the presence or absence of a functionalization layer on the surface of the particles, as well as the functionalization agents used. Thus, the following iron oxide nanoparticles were used: non-functionalized iron oxide nanoparticles (SPION-NF), iron oxide nanoparticles functionalized with phosphoryl ethanolamine (SPION-PEA), and iron oxide nanoparticles functionalized with o-phosphoryl ethanolamine and folic acid (SPION-PEA / FA).

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23/25 [77] A Figura 8 ilustra a utilização do kit para quantificação de ferro em células aderentes do tipo HeLa, após 24 horas de incubação, com as três diferentes nanopartículas de óxido de ferro.23/25 [77] Figure 8 illustrates the use of the kit for quantifying iron in adherent HeLa-type cells, after 24 hours of incubation, with the three different iron oxide nanoparticles.

[78] Novamente, a técnica de fluorescência de raios X foi utilizada como controle. Pode-se observar que os valores obtidos pelo método colorimétrico utilizando o kit foram muito próximos dos valores esperados e também obtidos pela técnica de fluorescência de raios X, indicando a eficiência do kit na determinação do ferro proveniente das partículas incorporadas nas células. Como era esperado, a funcionalização das nanopartículas alterou a eficiência de incorporação pelas células, de maneira que a presença da fosforiletanolamina resultou em um aumento na taxa de incorporação em relação às não funcionalizadas. Esta tendência foi ainda mais intensificada nas partículas tendo ácido fólico ligado à superfície, onde a incorporação foi cerca de 10 vezes maior em relação às nanopartículas não funcionalizadas e 3 vezes maior em relação às funcionalizadas apenas com PEA.[78] Again, the X-ray fluorescence technique was used as a control. It can be observed that the values obtained by the colorimetric method using the kit were very close to the expected values and also obtained by the X-ray fluorescence technique, indicating the efficiency of the kit in determining the iron from the particles incorporated in the cells. As expected, the functionalization of the nanoparticles changed the incorporation efficiency by the cells, so that the presence of phosphoryl ethanolamine resulted in an increase in the incorporation rate in relation to the non-functionalized ones. This trend was further intensified in the particles having folic acid bound to the surface, where the incorporation was about 10 times greater in relation to non-functionalized nanoparticles and 3 times greater in relation to those functionalized only with PEA.

[79] Tal fato pode ser explicado pela presença de um grande número de receptores de folato na superfície da membrana citoplasmática das células HeLa que aumentam a interação e consequentemente a incorporação das partículas modificadas com ácido fólico. O resultado apresentado na Figura 8 se refere à média de três experimentos independentes realizados em triplicata.[79] This fact can be explained by the presence of a large number of folate receptors on the surface of the cytoplasmic membrane of HeLa cells that increase the interaction and consequently the incorporation of the particles modified with folic acid. The result shown in Figure 8 refers to the average of three independent experiments carried out in triplicate.

[80] Nas Figuras 9A a 9D são apresentadas imagens de microscopia hiperespectral de campo escuro de (A) células HeLa não submetidas a incubação com as nanopartículas de[80] Figures 9A to 9D show dark field hyperspectral microscopy of (A) HeLa cells not subjected to incubation with the nanoparticles of

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24/25 óxido de ferro (SPION), e incubadas com (B) SPION-NF, (C) SPION-PEA e (D) SPION-PEA/FA, onde a barra lateral equivale a 20 micrômetros. Em concordância com os resultados apresentados na Figura 8, pode-se observar o aumento da quantidade de nanopartículas de óxido de ferro (pontos luminosos) no citoplasma das células após a incubação durante 24 horas com as nanopartículas funcionalizadas, sendo as SPION-PEA/FA presentes em maior quantidade.24/25 iron oxide (SPION), and incubated with (B) SPION-NF, (C) SPION-PEA and (D) SPION-PEA / FA, where the sidebar is equivalent to 20 micrometers. In agreement with the results presented in Figure 8, it is possible to observe an increase in the amount of iron oxide nanoparticles (luminous dots) in the cytoplasm of cells after incubation for 24 hours with the functionalized nanoparticles, with SPION-PEA / FA present in greater quantity.

- Determinação de ferro em células não aderentes:- Determination of iron in non-adherent cells:

[81] O kit também permite a determinação de ferro em células não aderentes, sendo que a metodologia a ser empregada é a mesma, exceto pelo fato de que a etapa e de remoção da solução de incubação e posterior lavagem com tampão PBS deve ser realizada por centrifugação das células.[81] The kit also allows the determination of iron in non-adherent cells, and the methodology to be used is the same, except that the step and removal of the incubation solution and subsequent washing with PBS buffer must be performed by centrifuging the cells.

- Outras aplicações:- Other applications:

[82] Além de possibilitar a determinação de ferro em células em cultura submetidas a incubação com nanopartículas de óxido de ferro, o kit também permite a determinação de ferro proveniente de espécies tais como fármacos ou outros compostos de interesse contendo íons ferro. Adicionalmente, o kit pode também ser empregado para a determinação de ferro em amostras de sangue, fluídos corporais e também tecidos e órgãos, nos quais a concentração de ferro presente seja superior ao limite de quantificação. Nestes casos, as concentrações dos agentes constituintes do kit devem ser ajustadas de maneira a assegurar a completa digestão/liberação do ferro da amostra e complexação dos íons ferro presentes pelo agente colorimétrico.[82] In addition to allowing the determination of iron in cultured cells subjected to incubation with iron oxide nanoparticles, the kit also allows the determination of iron from species such as drugs or other compounds of interest containing iron ions. Additionally, the kit can also be used for the determination of iron in blood samples, body fluids and also tissues and organs, in which the concentration of iron present is higher than the limit of quantification. In these cases, the concentrations of the constituent agents of the kit must be adjusted in order to ensure the complete digestion / release of the iron in the sample and complexation of the iron ions present by the colorimetric agent.

[83] A aplicação deste kit para determinação de ferro presente em fígado de boi mostrou forte dependência dos[83] The application of this kit for the determination of iron present in ox liver showed a strong dependence on

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25/25 resultados em função do método de digestão do homogenato tecidual seco utilizado, sendo que o método de digestão básica com hidróxido de amônio foi o que apresentou os melhores resultados em comparação com a digestão com ácido trifluoracético, ácido clorídrico ou solução piranha por 24 horas.25/25 results according to the digestion method of the dry tissue homogenate used, and the basic digestion method with ammonium hydroxide was the one that presented the best results in comparison with the digestion with trifluoroacetic acid, hydrochloric acid or piranha solution for 24 hours.

[84] Assim, as unidades constituintes do presente kit foram selecionadas de maneira a atender todas as etapas do método, incluindo a etapa de digestão da amostra, e possibilitar inclusive a determinação de ferro proveniente de fontes mais complexas como as nanopartículas, ou mesmo a determinação de ferro em amostras biológicas mais complexas, como tecidos e órgãos, nas quais a etapa de digestão é considerada fundamental.[84] Thus, the constituent units of the present kit were selected in order to meet all stages of the method, including the sample digestion stage, and even make it possible to determine iron from more complex sources such as nanoparticles, or even the determination of iron in more complex biological samples, such as tissues and organs, in which the digestion stage is considered fundamental.

[85] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.[85] Those skilled in the art will value the knowledge presented here and will be able to reproduce the invention in the modalities presented and in other variants, covered by the scope of the attached claims.

Claims

1. Kit for the detection and quantification of iron characterized by the fact that it comprises at least:

- one agent of lysis, - one agent digestion, - one agent reducer, - one agent adjustment pH, and - one agent complexing or colorimetric. 2. Kit, according with the claim 1

characterized by the fact that the lysis agent is selected from the group consisting of ionic and neutral surfactants, such as sodium dodecyl sulfate, cetyltrimethylammonium bromide, ethoxylated octylphenol, phenyl mono [p (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ] of polyethylene glycol, dextran, Triton X-100 and ethoxylated sorbitan monolaurate, in concentrations ranging from 0.0001% to 1% m / v or v / v.

3. Kit according to claim 1, characterized in that the digesting agent is selected from the group consisting of acidic species such as nitric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, sulfamic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid and / or citric acid, in concentrations ranging from 10 mg / mL to 1000 mg / mL.

4. Kit according to claim 1, characterized in that the reducing agent is selected from the group consisting of species such as citric acid, ascorbic acid, thioglycolic acid, hydroxylamine hydrochloride, hydrazine, sulfite, dithionite and sodium borohydride , in concentrations ranging from 0.5 mg / mL to 500 mg / mL.

5. Kit according to claim 1,

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2/6 characterized by the fact that the pH adjusting agent is selected from the group consisting of species capable of adjusting the pH to the appropriate value for the complex formation, such as sodium acetate, ammonium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide in concentrations between 5 mg / ml to 1 g / ml.

6. Kit, according to claim

1, characterized by the fact that a complexing or colorimetric agent is selected from the group consisting of ligands capable of forming stable complexes with iron in the oxidation state

2 +, such as 1,10-phenanthroline and its derivatives, 2,2'-bipyridine and its derivatives, 2,2 ': 6', 2terpyridine, and its derivatives and other aromatic heterocyclic ligands, being used in concentrations between 0 , 1 mg / ml to 100 mg / ml.

7. Use of the kit for the detection and quantification of iron as defined in any one of claims 1 to 6, characterized by the fact that it allows the colorimetric determination of iron in biological samples and the quantification of iron present in the form of iron oxide nanoparticles .

8. Method of colorimetric determination of iron in biological samples characterized by the fact that it uses the kit as defined in any of claims 1 to 6 and comprises the steps of:

a) Add distilled water in the bottle containing the digesting agent and the digesting reducing agent to the indicated mark (3.0 mL), and to the reducing agent also until the indicated mark (1.0 mL),

b) Add at least 1 ml of ethanol to the bottle of

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3/6 complexing agent also up to the indicated mark,

c) Dilute 5 to 20 times, in distilled water, an aliquot of the stock solution of the complexing agent prepared in ethanol according to step b,

d) Incubate the adherent cells from the biological samples under analysis with the suspension of iron oxide nanoparticles dispersed in culture medium, for a period of 1 to 48 hours,

e) Remove the supernatant and carefully wash the adhered cells with two aliquots of phosphate buffered saline (PBS),

f) After washing with buffer, add 100 to 400 microliters of the lysing agent per 500,000 cells, incubate at 20 to 40 ° C for 5 to 30 minutes and mix,

g) Add to the rest of the lysate 200 to 500 microliters of the digesting agent,

h) Transfer the solutions to microtubes and incubate at 70 to 90 ° C for more than 10 hours,

i) Add 10 to 50 microliters of the reducing agent to each sample,

j) Adjust the pH in the range of 2 to 7, homogenize and transfer 50 to 250 microliters of each sample to the wells of a microplate that vary depending on the amount of iron present in the sample until an absorbance signal of up to 1 is guaranteed,

k) Add 10 to 50 microliters of the complexing agent to each well and homogenize,

l) Take the absorbance reading at 520 nm after 10

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4/6 to 30 minutes from step k,

m) Transfer 50 to 250 microliters of the lysate of cells not incubated with the suspension of iron oxide nanoparticles, and 5 to 10 microliters of the standard solution of ferrous ammonium sulfate, and 10 to 50 microliters of the complexing agent to the wells of a microplate, and

n) Read the absorbance at 520 nm after homogenization, and draw up an absorbance graph (520 nm) as a function of the iron concentration (II).

9. Method, according to claim 8, characterized by the fact that, in step d, between 100 and 500,000 cells are used per well according to the selected incubation plate that varies from 6 to 96 wells, in which alternatively, the said iron oxide nanoparticles are replaced by other sources of iron.

10. Method, according to claim 8 or 9, characterized by the fact that, still in step d, control samples are prepared in wells by incubating only with culture medium for a period of 1 to 48 hours.

11. Method according to claim 8, characterized in that, in step f, preferably, after washing with phosphate buffered saline, 200 microliters of the lysing agent are added per 500,000 cells according to the selected incubation plate that ranges from 12

96 wells, and incubate 37 ° C for 30 minutes in what optionally is withdrawn an aliquot for dosing in protein. 12. Method, according to claim 8,

characterized by the fact that, in step g, 400 microliters of

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5/6 digestion agent.

13. Method according to claim 8, characterized in that, in step h, the solutions are preferably transferred to microtubes and incubated at 70 ° C.

14. Method according to claim 8, characterized in that in step i, preferably add 10 microliters of the reducing agent to each sample.

15. Method, according to claim 8, characterized in that in step j, homogenize and transfer 180 microliters of each sample to the wells of a 96-well microplate, where the absorbance signal is up to 1.

16. Method according to claim 8, characterized in that, in step k, preferably 10 microliters of the complexing agent are added to each of the wells.

17. Method, according to claim 8, characterized by the fact that, in step 1, a calibration curve is constructed by preparing standard solutions of ferrous ammonium sulfate, in which this concentration range is suitable for the concentration range of iron present in the samples under analysis.

18. Method, according to claim 8, characterized in that, in step m, preferably 180 microliters of lysate samples are transferred, not incubated with the suspension of iron oxide nanoparticles or with iron source solutions ( control samples), and 10 microliters of the standard solutions of ferrous ammonium sulfate, and 10 microliters of the complexing agent for the

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6/6 wells of a 96-well microplate.

19. Method, according to claim 8, characterized by the fact that, in step n, after homogenization, the absorbance reading is carried out at 520 nm and a plot of absorbance at 520 nm is made as a function of the iron concentration (II) , in which a standard curve is used to determine the iron concentration in each of the samples from the 96-well microplate.

20. Method according to claim 8, characterized in that the blank and detection limits reached are at least 0.076 and 0.143 pg Fe / mL, respectively.