BR102017026052A2 - Peptídeos sintéticos baseados em epítopos imunodominantes usados para composição vacinal e imunodiagnóstico - Google Patents

Abstract

peptídeos sintéticos baseados em epítopos imunodominantes usados para composição vacinal e imunodiagnóstico. a presente invenção refere-se a peptídeos sintéticos baseados em epítopos imunodominantes de endoglicosidade corinebacteriana expressa por corynebacterium pseudotuberculosis, usados como antígeno vacinal ou composição para imunodiagnóstico de linfadenite caseosa (lc). a invenção apresenta seis peptídeos desenhados por imunoinformática, sendo compostos por regiões reconhecidas pelas moléculas de mhc classe ii, com uso potencial para formulação vacinal ou composição de um kit de imunodiagnóstico. os ensaios revelaram resposta imunoprotetora em camundongos e em ensaios com soros de animais positivos e negativos para lc apresentou reatividade.

Description

PEPTÍDEOS SINTÉTICOS BASEADOS EM EPÍTOPOS IMUNODOMINANTES USADOS PARA COMPOSIÇÃO VACINAL E IMUNODIAGNÓSTICO

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a peptídeos sintéticos baseados em epítopos imunodominantes de endoglicosidade corinebacteriana expressa por Corynebacterium pseudotuberculosis, usados como antígeno vacinal ou composição para imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa (LC). A invenção apresenta seis peptídeos desenhados por imunoinformática, sendo compostos por regiões reconhecidas pelas moléculas de MHC classe II, com uso potencial para formulação vacinal ou composição de um kit de imunodiagnóstico. Os ensaios revelaram resposta imunoprotetora em camundongos e em ensaios com soros de animais positivos e negativos para LC apresentou reatividade. A invenção pode ser aplicada na indústria farmacêutica veterinária.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Peptídeos sintéticos baseados em epítopos imunodominantes de endoglicosidade corinebacteriana expressa por Corynebacterium pseudotuberculosis, usados como antígeno vacinal ou composição para imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa (LC). A invenção apresenta seis peptídeos desenhados por imunoinformática, sendo compostos por regiões reconhecidas pelas moléculas de MHC classe II, com uso potencial para formulação vacinal ou composição de um kit de imunodiagnóstico. Os ensaios revelaram resposta imunoprotetora em camundongos e em ensaios com soros de animais positivos e negativos para LC apresentou reatividade.

[003] A Linfadenite Caseosa (LC) é uma doença crônica, infectocontagiosa, caracterizada por lesões purulentas e formação de abcessos nos linfonodos superficiais, internos e órgãos em mamíferos em geral (Campardelli, R., Reverchon, E., Della Porta, G., 2012. Biopolymer particles for proteins and peptides sustained release produced by supercritical emulsion extraction . Procedia Eng. 42, 239-246. doi:10.1016/j.proeng.2012.07.415 [004] O agente etiológico da LC é a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis, que apesar de acometer mamíferos em geral (bovinos, equinos, bufalinos) sua maior prevalência é em ovinos e caprinos. A bactéria é classificada como gram positiva e intracelular facultativa, tem a capacidade de sobreviver por longos períodos no ambiente e devido à formação de abcessos no hospedeiro os antibióticos utilizados não conseguem ultrapassar essa barreira, deste modo os granulomas amadurecem e eclodem, característica fundamental para a contribuição da alta taxa de transmissão da doença dentro do rebanho (SOARES, S. C., V. A. ABREU, et al. (2012). "PIPS: pathogenicity island prediction software." PLoS One 7(2): e30848.).

[005] Devido ao amplo espectro de hospedeiros, existem casos de LC relatados em vários países, incluindo Austrália, Nova Zelândia, África do Sul, Estados Unidos, Canadá e Brasil, principalmente, em pequenos ruminantes. De acordo com a Organização Mundial da Saúde Animal, dos 201 países que relataram suas situações sanitárias, 64 declararam a presença de animais com LC (OIE, 2009). O Brasil possui um rebanho de pequenos ruminantes com cerca de 26 milhões, sendo 34 % de caprinos e 66 % de ovinos. O Nordeste possui cerca de 90 % dos rebanhos de caprinos e 56,7 % de ovinos do País, sendo a região de maior prevalência da LC (IBGE, 2013). Em Minas Gerais, uma prevalência de 75,8 % foi relatada para ovinos (Guimarães, a. S. et al. 2009. “Caseous Lymphadenitis in Sheep Flocks of the State of Minas Gerais, Brazil: Prevalence and Management Surveys.” Small Ruminant Research 87: 86-91) e de 78,9 % para caprinos (SEYFFERT, N. et al. 2010. “High Seroprevalence of Caseous Lymphadenitis in Brazilian Goat Herds Revealed by Corynebacterium Pseudotuberculosis Secreted Proteins-Based ELISA.” Research in Veterinary Science 88(1): 50-55. http://dx.doi.org/10.1016Zj.rvsc.2009.07.002).

[006] Sergipe apresenta rebanhos com cerca de 180 mil cabeças de ovinos e 20 mil cabeças de caprinos (IBGE, 2014) e possui potencial para comercialização desses animais e seus derivados. Existem investimentos do governo para o desenvolvimento da ovinocultura no estado de Sergipe, onde abrange 14 municípios e 31 comunidades que são beneficiadas com a criação desses pequenos ruminantes. Diante desses fatores o conhecimento acerca de enfermidades que são responsáveis por perdas econômicas significativas torna-se essencial para que o desenvolvimento aconteça assim como possíveis análises epidemiológicas no estado de Sergipe se tornam de alta relevância. [007] Atualmente não existe profilaxia eficaz para a LC, as vacinas comercializadas no Brasil são baseadas no micro-organismo atenuado produzido a partir da linhagem 1002 da C. pseudotuberculosis, desenvolvida pela Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola S.A (EBDA) e a vacina Biodectin® (Pfizer) que contém toxóides purificados de Clostridium septicum e culturas inativadas de Cl. chauvoei (carbúnculo sintomático) e uma fração do C. pseudotuberculosis e um anti-helmíntico (moxidectina). No entanto, todas essas vacinas ainda precisam de uma avaliação quanto à sua eficácia nos rebanhos de caprinos e ovinos. Portanto, não há uma vacina eficiente e protetora contra C. pseudotuberculosis, levando a diversos estudos que visam o desenvolvimento de uma vacina que forneça proteção de longa duração sem reações adversas, assim como possibilitar a diferença entre animais vacinados de animais infectados naturalmente (COSTA, M. P et al. 2011. “Molecular Characterization of the Corynebacterium Pseudotuberculosis hsp60-hsp10 Operon, and Evaluation of the Immune Response and Protective Efficacy Induced by hsp60 DNA Vaccination in Mice.” BMC research notes 4(1): 243. http://www.biomedcentral.com/1756-0500/4/243).

[008] Diferentes estratégias vacinais têm sido testadas, como frações contendo antígenos da parede bacteriana, sobrenadantes da cultura bacteriana, proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, vacinas de DNA, estratégia de “prime-boost”, mistura de componentes celulares e sobrenadantes. A maioria dessas estratégias requer um conhecimento acerca dos fatores de virulência desse agente etiológico, com isso a análise genômica e proteômica se torna grande aliado da vacinologia. A dinâmica da resposta imunológica à infecção só pode ser compreendida se houver a caracterização das proteínas bacterianas responsáveis pela indução da resposta imune do hospedeiro (PACHECO, LUIS G C et al. 2011. “A Combined Approach for Comparative Exoproteome Analysis of Corynebacterium pseudotuberculosis.” BMC microbiology 11(1): 12. http://www.biomedcentral.com/1471-2180/11/12.), assim como estudos para determinação de condições apropriadas para indução de resposta imune a antígenos, incluindo a definição de adjuvantes, vias de administração e protocolos de imunização, os quais são importantes no aperfeiçoamento de uma vacina eficaz. Com a caracterização de proteínas bacterianas responsáveis pelos fatores de virulência, as estratégias baseadas na tecnologia do DNA recombinante tornam-se ideais, devido ao seu potencial de ativação da resposta imunológica, assim como com o auxílio das ferramentas de bioinformática que tentam suprir diversas carências das análises proteômicas, como a predição de epítopos imunodominantes desses antígenos (GARG, NISHA et al. 2016. “Immunoprotective Potential of in Silico PredictedAcinetobacter Baumannii Outer Membrane Nuclease, NucAb.” International Journal of Medical Microbiology 306(1)).

[009] O uso de peptídeos baseados em epítopos imunodominantes é crescente e a diversidade de utilização é grande, onde estes podem ser usados para o desenvolvimento de vacinas, tratamento e diagnóstico de doenças. Outra finalidade para esse polímero é ser utilizado como material biodegradável com diversas utilidades (por exemplo, nanotubos e nanofios de peptídeos). Para o uso crescente deve-se as ferramentas de bioinformática que conseguem predizer essas regiões imunodominantes, em contraste tinha-se o uso de técnicas como phage display, que possui alto custo. O uso de softwares de bioinformática é um método alternativo para identificação de peptídeos com potencial antigênico e ou imunogênico que conseguem predizer epítopos de célula B e T. Várias ferramentas computacionais de predição de epítopos de célula B e T estão disponíveis para identificação de peptídeos e inúmeros trabalhos científicos vem utilizando essa tecnologia.

[0010] As bases de dados de epítopos consistem em uma coleção de epítopos de patógenos como vírus, bactérias, protozoários e fungos. Esses bancos de dados têm se tornado uma fonte cada vez mais utilizada na busca de antígenos para aplicação em vacinas, no diagnóstico e como imunoterápicos (Garg et al,. 2016). Dentre eles destacam-se: IEDB (Immune Epitope Database and Analyses Resource - Base de Dados de Epitopos Imune e Recursos de Análises), o qual possui dados que permitem a predição de epitopos de anticorpos e de célula T para humanos, outros primatas, roedores e outras espécies. A coleção de epitopos, peptídicos ou não, de agentes infecciosos, alérgenos, doenças autoimunes e aloantígenos é constantemente atualizada. As bases de dados se destacam pela precisão das informações armazenadas e por apresentar os epitopos juntamente com os contextos experimentais em que foram determinados. Os recursos estão disponíveis gratuitamente (http://www.iedb.org) e contêm ferramentas preditivas e analíticas (Sollner et al., 2006). Tem também o BCPREDS (B-cell epitope prediction server), que é um servidor de predição de epitopos que permite aos usuários escolher o método para prever epitopos de células B entre os vários métodos de previsão desenvolvidos. A implementação atual do BCPREDS permite ao usuário selecionar entre três métodos de previsão: (i) a implementação do método AAP; (Chen et al., 2007) (ii) BCPred; (iii) FBCPred. A acurácia desse método é de 58,70%. Adicionalmente, um servidor web foi desenvolvido para operacionalizar o método de predição de epitopos de célula B em uma sequência antigênica. Esse serviço está disponível on line. Outro usado amplamente é o ABCPred que possibilita a predição de epitopos de células B em uma sequência de antígeno, usando redes neurais artificiais. ABCpred é capaz de prever epítopos com precisão de 65,93% usando a rede neural recorrente. Já o BepiPred promove a localização de epítopos de célula B lineares usando uma combinação de um modelo de Markov oculto e um método escala propensão. Quando testado no conjunto de dados de validação este método possui melhor desempenho do que qualquer um dos outros métodos ensaiados.

[0011]Com isso a presente invenção tem como objetivo propor formulações vacinais para Linfadenite Caseosa utilizando peptídeos sintéticos desenhados a partir de um fator de virulência importante (CP40) de C. pseudotuberculosis através do uso de ferramentas de bioinformática, assim como seu uso para diagnóstico sorológico apresentando um teste com maior sensibilidade e especificidade para ser aplicado em ovinos e caprinos, dada a importância econômica da ovinocaprinocultura e a prevalência da doença na região Nordeste assim como Brasil e mundo.

ESTADO DA TÉCNICA

[0012] A literatura técnica especializada revela alguns documentos de patentes que fazem referência a proteína recombinante e/ou composição vacinal contra Linfadenite Caseosa. Para embasar o critério de novidade e atividade inventiva foi realizada uma pesquisa na base de patentes do Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) que compila o acervo de patentes depositadas do Brasil, e na base europeia de Patentes (Espacenet) que compila o acervo de patentes depositadas em mais de 90 países.

[0013] Na pesquisa realizada não foi identificada nenhum documento de patente que faz referência Proteína recombinante para utilização em formulação vacinal e composição de diagnóstico sorológico contra Linfadenite Caseosa com as mesmas características.

[0014] Os documentos de maior relevância serão descritos a seguir, entretanto, é importante deixar claro que nenhum deles fere o quesito de novidade da patente de invenção requerida nesse documento, tendo em vista que o conceito inventivo aqui proposto difere consideravelmente dos documentos citados e revelados.

[0015]O documento WO/2017/174645, 11201706155X e 20170283475 utilizam peptídeos e suas combinações como imunoterápicos ou como vacina contra alguns tipos de câncer. Documento como este mostram a importância da utilização da tecnologia para a saúde.

[0016]O documento 20170216428 utiliza peptídeos para compor vacina contra o herpes vírus, mostrando a diversidade de áreas que podem utilizar essa tecnologia.

[0017]O documento PI 1005625-4 descreve o uso da metodologia Phage Display para a seleção de peptídeos contendo 12 resíduos de aminoácidos derivados de antígenos da Corynebacterium pseudotuberculosis. Ainda, uma composição vacinal e diagnóstico sorológico para LC. A proposta da invenção é semelhante, porém as técnicas de efetuar assim como as sequencias utilizadas são totalmente diferentes, onde a nossa invenção sintetizou peptídeos desenhados a partir de um antígeno específico, a endoglicosidase corinebacteriana.

[0018]O documento WO2012149622 (A1) trata-se de um teste baseado na reação de alguns antígenos pela via cutânea com o objetivo de identificar os casos subclínicos da LC, utilizando a fosfolipase D (PLD) um fator de virulência amplamente explorado no meio científico.

[0019]O documento WO9011351 (A1) descreve a forma pura da toxina fosfolipase D (PLD) de C. pseudotuberculosis e um método de obtê-la advinda da toxina bruta. Ainda, trata-se de uma composição vacinal contendo a fosfolipase D pura e usada contra LC em ovinos.

[0020]O documento CA2078801 (A1) descreve um micro-organismos modificado geneticamente, onde foi feita a inativação do gene PLD, diminuindo sua virulência. Compondo deste modo uma vacina atenuada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0021]Figura 1. Teste de antigenicidade dos epítopos obtidos através de ferramentas de bioinformática com soros de animais negativos para LC e positivos, infectados naturalmente. Onde CN correspondem às absorbâncias obtidas com os animais negativos para LC e CN para os animais positivos para LC.

[0022]Figura 2. Curva de sobrevivência dos animais imunizados com as diferentes formulações vacinais e desafiado com C. pseudotuberculosis com a linhagem virulenta CPNS (UFC 107). Análise estatísticas com teste de Fisher P Value > 0,05, não apresentando diferença estatística entre os grupos.

[0023]Figura 3. Cinética de imunoglobulinas IgG total específicos para os grupos imunizados com controles PBS e saponina e com os peptídeos sintéticos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0024]Previamente, a endoglicosidade corinebacteriana (CP40) (número de acesso no GenBank NC_017730.1) por compor um dos principais fatores de virulência de C. pseudotuberculosis e possuir seu perfil imunogênico avaliado anteriormente (Droppa-almeida et al. 2016) foi utilizada para mapear os epitopos de células B imunodominantes usando os softwares BepiPred que é baseado em métodos de escala de propensão ( http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/), ABCPred, com base em métodos de aprendizado de máquina que se aplicam uma rede neural recorrente ( http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred), BCPreds, que também é baseado em métodos de aprendizado de máquina, mas envolvem os que se aplicam a máquinas de vetores de suporte ( http://ailab.cs.iastate.edu/bcpreds/) e o Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB) (http://www.iedb.org/). Os epitopos foram preditos em diferentes alelos de MHC classe II. Os peptideos após seleção foram sintetizados pelo método quimico de fase sólida pela empresa AminoTech® com alto grau de purificação. Os peptideos liofilizados foram dissolvidos seguindo as instruções do fabricante.

[0025]As sequências que foram identificadas no mapeamento indicam quais os epítopos da CP40 têm maior probabilidade de interagir com anticorpos, e resultaram em 184 epítopos para a CP40. A partir destes resultados foram feitas análises para verificar a sobreposição, deste modo foram escolhidos apenas as sequências que estivessem presentes nas três análises com os três softwares diferentes. Em todos os softwares foram selecionados um tamanho de 10-16 resíduos de aminoácidos para compor o peptídeo, uma vez que a fenda dos anticorpos na qual se ligam os epítopos possui abertura que comporta aproximadamente 10 aminoácidos (Lopes 2006). Na tabela 1 se encontram os epítopos imunodominantes da CP40. Após a seleção, as sequências peptídicas foram enviadas para empresa AminoTech® e pelo método químico de fase sólida foram sintetizados com alto grau de purificação. Os peptídeos liofilizados foram dissolvidos seguindo as instruções do fabricante. Estas sequências foram às selecionadas para testes de antigenicidade, onde, as mais reativas serão utilizadas para imunização dos animais.

Epítopos hbDRDGRTYDGDDFTT

Proteína CP40 YKKDTKESVTQVWN

AESATLSKEPLKASPG YKKDTKESVT ETFHREYQPELKKRGT AIELTTGESSTDLGKP

Avaliação da antigenicidade porDot Blot e Enzyme LinkedImmuno Sorbent Assay (ELISA) [0026]Para avaliar a antigenicidade dos peptídeos sintéticos foram feitos ensaios de ELISA indireto seguindo a metodologia de Oliveira, Langenegger e Meyer (1992) utilizando soros de ovinos infectados naturalmente com a C. pseudotuberculosis.

[0027] Para o Imunoensaio por ELISA placas de 96 poços (PERKINELMER) de alta ligação foram sensibilizadas com 3 pg de peptídeo por poço em Tampão Carbonato Bicarbonato (0,05M, pH 9,6) e incubadas overnight em câmara fria a 4°C. Após três lavagens com tampão fosfato salina contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T20) as placas foram bloqueadas com proteína de leita a 5% diluído em PBS-T20 durante duas horas a 37°C. A seguir as placas foram incubadas soros positivos e negativos de ovinos com concentração de 1:50 durante uma hora a 37°C. Após a incubação a placa novamente foi lavada e foi adicionado o conjugado anti-sheep (IgG total) nas diluições de 1:10.000 e foram incubadas por 1 hora a 37°C. Após as lavagens foi adicionado solução reveladora TMB (Bio-Rad) durante 15 minutos, à temperatura ambiente na ausência de luz. A reação foi interrompida com a adição de uma solução 4N de H2SO4. A leitura da densidade óptica foi realizada em fotocolorímetro automático para ELISA (marca Biorad, EUA), com filtro de 450 nm.

[0028] Para avaliação da antigenicidade dos peptídeos sintéticos desenhados com o auxílio das ferramentas de bioinformática foram usados soros de animais infectados naturalmente e de animais sadios em ensaio de ELISA. A figura 1 mostra as absorbâncias obtidas com a reação desses peptídeos com os soros desses animais, onde nota-se a presença de anticorpos específicos para os animais positivos para LC, comprovando que esses epítopos realmente estão ligados à formação da resposta imune humoral. Esses animais foram expostos à infecção natural e devido à presença frequente da CP40, endoglicosidase corinebacteriana, os soros dos animais apresentam anticorpos de memória. Este resultado é importante porque mostra a especificidade e confiabilidade que as ferramentas de bioinformática possuem ao predizer tais epítopos, o que só seria possível com a obtenção da estrutura tridimensional obtida por cristalografia ou ressonância magnética nuclear, técnicas que além do custo alto apresentam também diversas limitações em relação à determinação das estruturas tridimensionais de proteínas.

Comitê de Ética [0029]Os experimentos com os animais nesse estudo seguiram todas as orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e do Comitê de Ética de em Experimentação Animal (CETEA, orientações nacionais seguindo a Lei 11.794, de 8 de outubro de 2008) da Universidade Tiradentes (UNIT) com o processo de número 010515RR aprovado em 30 de junho de 2015.

Imunização com peptídeos [0030]Camundongos fêmeas da linhagem sw/ss de 9-12 semanas de idade foram utilizadas no estudo. O ensaio foi composto por nove grupos com onze animais em cada grupo. Foram divididos em grupo controle (PBS) inoculado com solução salina, grupo com adjuvante (Saponina) inoculado com 7,5pg de saponina, os grupos Pep1, Pep2, Pep3, Pep4, Pep5 e Pep6 foram inoculados com cada peptídeo (50pg) associados com a saponina (7,5pg). Foram administradas duas doses vacinais no dia 0 e 15 pela via subcutânea e trinta dias após a última imunização os animais foram desafiados com 1,0 x 108 da linhagem virulenta de C. pseudotuberculos/s CPNS para reforçar o teste de potência da vacina. Após o desafio os animais foram monitorados durante 60 dias diariamente, foram observados peso (>75% eram eutanasiados), formação de granulomas, morbidez e mortalidade. Todos os esforços para minimizar o sofrimento foram feitos. Nos dias 0, 15, 30, 60 e 120 após a primeira imunização foram feitas coletas de sangue para obtenção do soro e dosagem das imunoglobulinas. No dia 45 antes do desafio, 1 animal de cada grupo foi eutanasiado para retirada do baço para cultura de esplenócitos e dosagem de citocinas. Após o desafio, os animais que foram a óbito eram retirados o baço, no entanto, após 120 dias os que sobreviveram foram eutanasiados por deslocamento da coluna cervical e os baços foram retirados para cultura de esplenócitos para posterior dosagem de citocinas.

[0031] Diante dos resultados, todos os peptídeos foram utilizados no teste vicinal. Para isso camundongos fêmeas da linhagem sw/ss de 9-12 semanas de idade foram utilizadas no estudo. Os animais foram divididos em nove grupos e vacinados no dia 0 e 15 pela via subcutânea. Após 45 dias da última imunização todos os animais foram desafiados com 2x 1,5 x 108 de CPNS de C. pseudotuberculos/s previamente determinada pela via intraperitoneal.

[0032]Após o desafio os animais foram monitorados durante 60 dias e diariamente foram observados peso (>75% eram eutanasiados), formação de granulomas, morbidez e mortalidade. A figura 2 apresenta a curva de sobrevivência dos animais e seus respectivos grupos.

[0033] Observando os resultados da curva de sobrevivência no grupo Pep3 a formulação vacinal não foi capaz de proteger esses animais contra a LC, os quais todos os animais foram acometidos pela enfermidade o que os levou à óbito. O grupo Pep4 e Pep6 apresentaram 10% de proteção e os grupos Pep5 apresentou 20%, sem contar com os sobreviventes dos grupos controles (PBS e saponina). Os grupos Pep1 e Pep2 foram os que apresentaram maior proteção contra LC apresentando 30% e 40% dos animais vivos respectivamente, também sem contar com os animais vivos dos grupos PBS e Saponina. Através das análises estatísticas pelo teste de Fisher não houve diferenças estatísticas entre os grupos controles e os experimentais. Estes resultados revelam que os peptídeos sintéticos não conseguiram proteger os animais e isso se deve a diversos fatores. O tamanho reduzido dos peptídeos pode ter influenciado no não reconhecimento pelas células dendríticas, células apresentadoras de antígenos (APC) primordiais para a ativação dos linfócitos T, assim como essas biomoléculas podem ter sido eliminadas pelo SFM e não ter adentrado o sistema vascular e atingido o baço para ativação dos linfócitos B. Outra justificativa pode ser a ativação de uma resposta imunológica do tipo TH2, esse tipo de resposta não é a ideal para patógenos intracelulares facultativos possibilitando a evasão microbiana acarretando a piora dos animais (Abbas, Lichtman e Pillai, 2015). Entretanto, necessita-se da dosagem das imunoglobulinas e citocinas para realmente compreender os resultados e entender o que ocasionou os grupos Pep3, Pep4, Pep5 e Pep6 a apresentarem um índice de mortalidade equivalente aos grupos PBS e Saponina, ambos controles.

Resposta humoral [0034] Para avaliar a indução da resposta imunológica dos peptídeos sintéticos inoculados nos animais, ensaios de ELISA indireto seguindo a metodologia de Oliveira, Langenegger e Meyer (1992) foram feitos. Após análises, foi possível perceber a imunogenicidade dos peptídeos, principalmente o Pep2 que apresentou grande quantidade de IgG total específicos, o que provavelmente foi fator determinante para a sobrevivência dos animais, correspondendo ao grupo que mais protegeu. As demais formulações não apresentaram tanta produção dessas imunoglobulinas, o que pode ter desencadeado a não proteção dos mesmos após o desafio.

Análise estatística [0035]A análise estatística será feita utilizando o programa GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Para verificar a homogeneidade dos dados será feito análise com o Teste de Kolmogorov-Smirnov. Para comparar a magnitude das variações das amostras, será realizada a análise de variância através do teste de Kruskal-Wallis (Biostat, 2007) e as tendências centrais dos grupos independentes, dois a dois, serão comparadas pelo teste U de Wilcoxon-Mann-Whitney (Callegari-Jacques, 2003) quando os grupos avaliados apresentavam pelo menos três valores. O teste de Fisher será utilizado para determinar as diferenças significativas na mortalidade e sobrevivência, respectivamente, entre os grupos imunizados com as vacinas recombinantes e peptídicas e os grupos controles. Para verificar a eficácia da vacina o software Epi Info ™ será utilizado. O valor fixado para significância estatística foi de P< 0,05.

REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Peptídeos, caracterizado por, consistir a sequência de aminoácidos no código de acesso no GenBank WP_013242755.1 (CP7041).

2. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa caracterizado por conter a proteína recombinante em questão individualmente ou associada a qualquer outro antígeno, assim como reagentes para a realização de teste imunodiagnóstico.

3. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos reagentes do teste imunodiagnóstico serem selecionados do grupo compreendendo solução de lavagem, solução de bloqueio, tampão de incubação, anticorpo apropriado para revelação, substrato enzimático, solução de diluição do substrato enzimático e solução para parar a revelação.

4. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo suporte ser preferencialmente uma placa de microtitulação de 96 poços de ELISA.

5. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela solução de lavagem consistir preferencialmente de solução de tampão com pH neutro contendo um agente surfactante.

6. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela solução de bloqueio consistir preferencialmente de solução de tampão em pH neutro contendo peptídeo ou proteína.

7. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo tampão de incubação conter solução de tampão pH neutro contendo peptídeo ou proteína em menor concentração que a solução de bloqueio.

8. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo anticorpo consistir preferencialmente em um anticorpo anti IgG conjugado com um marcador enzimático.

9. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo substrato enzimático ser fluorescente ou radioativo e passível de detecção na faixa do UV ao visível.

10. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela solução de diluição do substrato ser selecionado do grupo consistindo em peróxido de hidrogênio, solução tampão pH ácido ou solução surfactante contendo sais de metais.

11. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela solução para parar a reação reveladora ser selecionada de um grupo compreendendo ácidos ou bases fortes.

12. Kit para teste imunodiagnóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a semelhança entre os micro-organismos que fazem parte do grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcos) impossibilita a utilização do mesmo para os micro-organismos que compõem os gêneros descritos acima.

13. Composição vacinal para Linfadenite Caseosa caracterizada por compreender o uso da proteína rCP7041 individual ou associada com outros antígenos de Corynebacterium pseudotuberculosis ou com intuito de vacinas polivalentes, associadas a antígenos de outros patógenos e ao menos um adjuvante fisiologicamente aceitável.

14. Composição vacinal para Linfadenite Caseosa caracterizada por compreender o uso da proteína rCP7041 individual ou associada com qualquer adjuvante ou substância que potencialize sua imunogenicidade.