BR102017018300A2 - Proteína recombinante, kit diagnóstico e composição vacinal da linfadenite caseosa - Google Patents

Abstract

proteína recombinante, kit diagnóstico e composição vacinal da linfadenite caseosa a presente patente de invenção (pi) apresenta diagnóstico sorológico eficiente para linfadenite caseosa (lc) em casos assintomáticos, assim como constituinte de formulação vacinal contra a enfermidade. precisamente a invenção refere-se à seleção, clonagem, expressão em sistema heterólogo, caracterização e utilização de uma proteína ancorada a superfície da membrana com o seguinte código de acesso no genbank wp_013242755.1 (cp7041) codificada pela bactéria corynebacterium pseudotuberculosis. profilaxia da lc.

Description

PROTEÍNA RECOMBINANTE, KIT DIAGNÓSTICO E COMPOSIÇÃO VACINAL DA LINFADENITE CASEOSA

BREVE DESCRIÇÃO [001] A presente patente de invenção (Pl) apresenta diagnóstico sorológico eficiente para Linfadenite Caseosa (LC) em casos assintomáticos, assim como constituinte de formulação vacinai contra a enfermidade. Precisamente a invenção refere-se à seleção, clonagem, expressão em sistema heterólogo, caracterização e utilização de uma proteína ancorada a superfície da membrana com o seguinte código de acesso no GenBank WP_013242755.1 (CP7041) codificada pela bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis. profilaxia da LC.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se à construção de uma proteína recombinante de C. pseudotuberculosis contra Linfadenite Caseosa. Mais especificamente a proteína é capaz de atuar como protetor em processos de infecto-contagiosa que afeta principalmente ovinos e caprinos. A invenção pode ser aplicada na indústria farmacêutica veterinária.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [003] A caprinocultura é considerada uma importante atividade econômica no país, com destaque para a região Nordeste, detentora de 90,6% do rebanho nacional, concentrando nas zonas árida e semiárida, tornando-se uma importante fonte de renda para pequenos produtores dessa região, que obtêm através da venda da carne, leite e pele a garantia para sua sobrevivência (ANCO

- Agência de notícias de caprinos e ovinos. Bahia organiza Câmara Setorial da Carne. 2010. Disponível em:<http://www.anco.cnpc.embrapa.br/index.php>. Acesso em: 09/02/2016). No Brasil entre os estados de maior representatividade são a Bahia, com 33,34%; Pernambuco, com 19,72% e Piauí, com 16,73% (IBGE

- INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Pesquisa

Pecuária Municipal, 2010. Disponível em:

<http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl. asp?c=73&z t&o=23&i=P>. Acesso em: 11 jul. 2016.). O rebanho nordestino de caprinos é de 8,3 milhões de cabeças, representando 90,6% do rebanho nacional, concentrando nas zonas árida e semi-árida.

[004] Na região Nordeste a Linfadenite Caseosa (LC) apresenta elevada frequência, e estima-se que grande parte dos rebanhos possua animais

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 13/64

2/27 infectados, e que 30% destes apresentem a prevalência clínica da doença. Um estudo conduzido por Meyer (2004) (MEYER, R. Corynebacterium pseudotuberculosis e o hospedeiro caprino: aspectos da prevalência, do diagnóstico e da imunidade. 2004. Tese (Doutorado em Imunologia). Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2004.), no semiárido baiano, obteve uma prevalência média de 46,66% da enfermidade nos rebanhos.

[005] A LC é uma doença crônica, infecto-contagiosa, caracterizada por lesões purulentas e formação de abcessos nos linfonodos superficiais, internos e em órgãos como pulmão, fígado, baço, medula e no sistema reprodutor, afetando principalmente ovinos e caprinos (WINDSOR, P. A. Control of Caseous Lymphadenitis. Veterinary Clinics of North América: Food Animal Practice, [S.I.], v. 27, p. 193-202, 2011.). A sua ampla disseminação causa grandes prejuízos econômicos para a ovinocaprinocultura mundial. No Brasil, a importância de estudos neste âmbito se deve ao fato do país ser o 18° e 22° maior criador de ovinos e caprinos do mundo e a maior parte do rebanho está concentrada nas regiões Nordeste e Sul, respectivamente.

[006] A prevalência da LC é alta em muitas regiões do mundo, incluindo a América do Sul, onde o Brasil apresenta 78% de soroprevalência em caprinos, levando a perdas econômicas significativas devido à diminuição de peso, baixa produção de leite e lã e inutilização de carnes e carcaça (PAVAN, Μ. E. et al. Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis from sheep by PCRrestriction analysis using the RNA polymerase beta-subunit gene (rpoB). Research Veterinary Science. [S.I.], v. 92, p. 202-206, 2012.; SEYFFERT, N. A. et al. High seroprevalence of caseous lymphadenitis in Brazilian goat herds revealed by Corynebacterium pseudotuberculosis secreted proteins-based ELISA. Research in Veterinary Science. v.88.p.50-55, 2010.). A transmissão e disseminação de C. pseudotuberculosis estão relacionadas com a sua resistência às condições ambientais encontradas na criação dos animais (AUGUSTINE JL, RENSHAW HW. Corynebacterium pseudotuberculosis survival in soil samples amended with water. Proc Int Conf Goat Prod Dis 1982; 3:526; YERUHAM, I., FRIEDMAN, S., PERL, S., ELAD, D., BERKOVICH, Y., KALGARD, Y., 2004. A herd levei analysis of a Corynebacterium

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 14/64

3/27 pseudotuberculosis outbreak in a dairy cattle herd. Veterinary Dermatology 15, 315-320).

[007] A disseminação da LC ocorre principalmente por contato com a secreção de abscessos superficiais após rompimento natural ou durante a drenagem do conteúdo caseoso, o qual libera grande quantidade de bactérias que contaminam o meio ambiente (ANDRADE, J. S. L. et al. Ocorrência e fatores de risco associados à infecção por Corynebacterium pseudotuberculosis em caprinos e ovinos do semiário paraibano. Pesquisa Veterinária Brasileira, Soropédica - RJ, v. 32, p. 116-120, 2012.). O contágio pode ser direto, por contato físico com um animal infectado, ou indireto, através de utensílios contaminados. Além disso, principalmente no Nordeste brasileiro, o tipo de vegetação existente pode lesionar a pele de animais, aumentando a exposição à contaminação. Estes fatores associados à inexistência de cuidados de manuseio dos próprios tosquiadores são considerados vetores mecânicos na disseminação da doença.

[008] Ainda, um fator determinante para a alta prevalência da LC é a resistência de C. pseudotuberculosis a baixas temperaturas, pois sua viabilidade celular é preservada em locais úmidos, como no solo por oito meses e em galpões de tosquia e feno durante quatro e dois meses, respectivamente. Também a falta de medidas de identificação de animais doentes, de medidas de higiene no manejo e no controle quanto ao transporte e a comercialização dos animais permitem a introdução de animais infectados nos rebanhos. Estudos epidemiológicos ressaltam o contato direto com animais infectados, a falta de higiene das instalações, a poeira, procedimentos de manejo como tosquia, castração, tratamento do cordão umbilical e utilização de agulhas contaminadas como sendo os fatores de risco para a disseminação da LC entre rebanhos caprinos e/ou ovinos. A presença de reprodutores (machos) soropositivos no rebanho; animais com abscessos superficiais, com sinais de doença respiratória, ocorrência de falhas reprodutivas e animais em péssimas condições físicas no rebanho foram responsáveis pelo aumento da soroprevalência de 13.2% para 62.5% em 6 anos, em rebanhos de caprinos leiteiros na Polônia (ΚΑΒΑ, J et.al. Evaluation of the risk factors influencing the spread of caseous lymphadenitis in goat herds. Pol J Vet Sei 14: 231-237. 2011). Ainda neste estudo, os autores reportam que a compra de animais fora do país, mastite e condições de manejo

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 15/64

4/27 (sistema de habitação/alojamento, sistema de alimentação, condições higiênicas) não foram consideradas fatores de risco relevantes nas condições avaliadas (ΚΑΒΑ, J et.al. Evaluation of the risk factors influencing the spread of caseous lymphadenitis in goat herds. Pol J Vet Sei 14: 231 -237. 2011).

[009] Diante dos problemas enfrentados pela grande contaminação com a LC a prevenção e a possibilidade de um diagnóstico sorológico são ferramentas importantes a serem utilizadas. O diagnóstico atual contra a LC é baseado na presença do granuloma seguido de micro-cirurgia para obtenção do material caseoso, o qual irá passar por testes microbiológicos e bioquímicos para que se confirme a presença de C. pseudotuberculosis, esse diagnóstico além de demorado só consegue identificar os casos sintomáticos. No decorrer dos anos inúmeros testes sorológicos foram desenvolvidos na tentativa de superar o problema dos animais com casos assintomáticos da LC, incluindo o teste de soro aglutinação (AWAD, F.J. Serological investigation of Corynebacterium pseudotuberculosis in sheep. I. Agglutination test. Am. J. Vet. Res. [S.l], v.81, p. 251-253,1960.), a imunodifusão em gel (ANDERSON, M.; NAIRN, Μ. E. Contrai of caseous lymphadenitis in goats by vaccination. Colloques de LINRA, [S.I.], v. 28, p. 605-609, 1984), a inibição da hemólise (BURREL, D. H. Caseous lymphadenitis in goats. Aust. Vet. J., [S.I.], n. 57, p. 105-110, 1981) e diferentes ensaios de ELISA, como ELISAs indiretos utilizando varias preparações da célula bacteriana, proteínas secretadas e a toxina PLD de C. pseudotuberculosis, ELISA sanduíche com PLD e ELISA para detectar interferon gama (IFN-γ) como um marcador de imunidade mediada por células contra C. pseudotuberculosis. Contudo, a maioria destes testes não possui sensibilidade e especificidade suficientemente satisfatórias. Alguns testes baseados na reação em cadeia de polimerase (PCR) para identificar isolados de C. pseudotuberculosis foram propostos, como: utilização do gene que codifica o RNA ribossômico 16S (16S rRNA), porém este teste não foi determinante, pois não conseguiu diferenciar C. pseudotuberculosis do C.ulcerans.

[010] Pacheco e colaboradores (PACHECO, L. G.C. et al. Multiplex PCR assay for identification of Corynebacterium pseudotuberculosis from pure culturas and for rapid detection of this pathogen in clinicai samples. J, Med. Microbiology. [S.I.] vol. 56, p. 480-486, 2007) utilizaram múltiplos loci baseada na reação de PCR multiplex (mPCR), para amplificar simultaneamente três sequências de genes

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 16/64

5/27 específicos a partir do material purulento presentes nos granulomas, como: 16S rRNA, gene de escolha no estudo de taxonomia bacteriana; rpoB (subunidade beta da RNA polimerase), amplamente usado para análises filogenéticas; e PLD (fosfolipase D), que codifica uma exotoxina associada com a virulência de C. pseudotuberculosis, C. ulcerans e Arcanobacterium haemolyticum. A proposta que se mostrou tão especifica quanto à cultura bacteriana seguida de testes bioquímicos, no entanto necessita do material caseoso. O uso de imunoensaio vem sendo amplamente utilizado seja para humanos ou para área veterinária, e o sucesso da sensibilidade e especificidade está na seleção do antígeno a ser utilizado, o qual deve ser expresso pela bactéria e estar entre seus principais fatores de virulência. A vantagem do uso dessa técnica é a utilização do soro para identificação da enfermidade, podendo deste modo identificar os casos ditos assintomáticos para LC.

[011] As vacinas utilizadas apresentam aspectos negativos que devem ser considerados quanto à possibilidade de sua utilização. Como exemplo, nem todas as vacinas licenciadas para caprinos têm a mesma eficiência para ovinos. Por não se adequarem a todos os casos, normalmente é necessário ajustar o programa de vacinação a cada caso. A ineficácia do processo de imunização pode ainda ser associada ao uso incorreto das vacinas pelos criadores. Além disso, o estudo da disseminação da bactéria pelo plantei demonstrou que animais aparentemente sem abscessos supurados também são transmissores, provavelmente por transmissão por via aerógena (PATON, M. W.. et al. Prevalence of caseous lymphadenitis and usage of caseous lymphadenitis vaccines in sheep flocks. Aust. Vet. J., [S.I.], v. 81, p. 91-95,2003). Os resultados até então obtidos demonstram a necessidade de desenvolver uma vacina que ofereça proteção eficiente, com a diminuição acentuada dos efeitos colaterais. Além disso, vacinas mais eficientes contra C. pseudotuberculosis seriam aquelas que fornecessem uma proteção esterilizante, ao invés de uma neutralizante. Portanto, ainda não existe até agora uma vacina capaz de conferir proteção total contra a infecção por C. pseudotuberculosis.

LITERATURA ESPECIALIZADA [012] A literatura técnica especializada revela alguns documentos de patentes que fazem referência a proteína recombinante e/ou composição vacinai contra

Linfadenite Caseosa. Para embasar o critério de novidade e atividade inventiva

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 17/64

6/27 foi realizada uma pesquisa na base de patentes do Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) que compila o acervo de patentes depositadas do Brasil, e na base europeia de Patentes (Espacenet) que compila o acervo de patentes depositadas em mais de 90 países. Na pesquisa realizada não foi identificada nenhum documento de patente que faz referência Proteína recombinante para utilização em formulação vacinai e composição de diagnóstico sorológico contra Linfadenite Caseosa com as mesmas características.

[013] Os documentos de maior relevância serão descritos a seguir, entretanto, é importante deixar claro que nenhum deles fere o quesito de novidade da patente de invenção requerida nesse documento, tendo em vista que o conceito inventivo aqui proposto difere consideravelmente dos documentos citados e revelados.

[014] O documento WO2012149622 (A1) trata-se de um teste baseado na reação de alguns antígenos pela via cutânea com o objetivo de identificar os casos subclínicos da LC, utilizando a fosfolipase D (PLD) um fator de virulência amplamente explorado no meio científico. Diferente da atual invenção que usa a proteína recombinante como parte de um kit diagnóstico sorológico.

[015] O documento WO9011351 (A1) descreve a forma pura da toxina fosfolipase D (PLD) de C. pseudotuberculosis e um método de obtê-la advinda da toxina bruta. Ainda, trata-se de uma composição vacinai contendo a fosfolipase D pura e usada contra LC em ovinos, o que difere desta invenção devido ao uso de sistema heterólogo e por se tratar de um antígeno totalmente diferente e que nunca foi explorado anteriormente.

[016] O documento CA2078801 (A1) descreve um micro-organismo modificado geneticamente, onde foi feita a inativação do gene PLD, diminuindo sua virulência. Compondo deste modo uma vacina atenuada, já a vacina proposta nesta invenção se trata de uma vacina proteica, baseada em um fator de virulência da C. pseudotuberculosis.

[017] O documento P11005625-4 descreve o uso da metodologia Phage Display para a seleção de peptídeos contendo 12 resíduos de aminoácidos derivados de antígenos da Corynebacterium pseudotuberculosis. Ainda, uma composição vacinai e diagnóstico sorológico para LC. Apesar da invenção proposta se tratar da formulação de um diagnóstico sorológico e uma composição vacinai contra

LC, as tecnologias são diferentes, pois usamos a Tecnologia do DNA

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 18/64

7/27 recombinante, usando a Escherichia coli como sistema heterólogo, ademais os resultados desta patente possui resultados mais satisfatórios.

[018] O documento BR 10 2015 033023 5 trata de um antígeno CP5582 de C. pseudotuberculosis expresso em sistema heterólogo para formulação de um diagnóstico e composição vacinai. Este documento é semelhante a proposta desta patente, porém o antígeno é totalmente diferente e possui resultados diferentes.

[019] O documento BR 10 2014 011947 7 relata a composição vacinai utilizando uma serina protease de 40 KDa recombinante contra LC. Apesar da tecnologia ser semelhante o antígeno utilizado é diferente e os resultados são diferentes. Estes documentos só reforçam a importância da tecnologia em questão para formulação de vacinas e testes diagnósticos que são carentes para a LC.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[020] Figura 1.	Eletroforese em gel de agarose 1% do fragmento de interesse obtido por PCR.
[021] Figura 2.	Eletroforese em gel de agorose a 1 % seleção e caracterização dos clones recombinantes, após digestão enzimática com BamHI e Kpnl.
[022] Figura 3.	Western Blot para confirmação da expressão da proteína recombinante rCP7041.
[023] Figura 4.	Teste de solubilidade por SDS-Page do Usado bacteriano contendo a proteína rCP7041.
[024] Figura 5.	Avaliação da antigenicidade da proteína recombinante por Dot Blot.
[025] Figura 6.	Análise do ELISA indireto com extrato de C. pseudotuberculosis 1002 e soros ovinos, através do Receiver Operating Characteristic (ROC)
[026] Figura 7.	Resultado do ELISA-indireto com a proteína recombinante rCP7041 e analises por Receiver Operating Characteristhic (ROC).
[027] Figura 8.	Valores de D.O. por ELISA de anticorpos IgG murinos antirCP7041 em camundongos, dos grupos controles e imunizados

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 19/64

8/27 [028] Figura 9.

[029] Figura 10.

com esta proteína e como adjuvante a saponina ou o hidróxido de alumínio, ao longo de 60 dias.

Curva (taxa) de sobrevivência de camundongos desafiados com linhagem virulenta (VD57) de Corynecbacterium pseudotuberculosis.

Valores de D.O. por ELISA, de anticorpos IgG em caprinos, ao longo de 90 dias de imunização.

[030] Figura 11. Cinética da produção in vitro de interferon-gama (IFN-γ) por células do sangue periférico dos caprinos imunizados com rCP7041 e controles após estímulo com 40pg de antígenos secretado/excretado de C. pseudotuberculosis pela técnica de

TPP, ao longo de 90 dias de observação. Para cada grupo, CONTR - sangue sem estímulo; PWM, sangue estimulado com PWM; TPP, sangue estimulado com o antígeno TPP.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [031] O objetivo principal da invenção é descrever o diagnóstico sorológico para Linfadenite Caseosa utilizando uma proteína recombinante de C. pseudotuberculosis, apresentando um teste com maior sensibilidade e especificidade para ser aplicado em ovinos e caprinos, assim como a utilização desta proteína para compor uma vacina dada a importância econômica da ovinocaprinocultura e a prevalência da doença na região Nordeste assim como Brasil e mundo.

[032] Os fatores de virulência podem tanto compor um kit diagnóstico, como auxiliar na ativação da resposta imune, levando a profilaxia desses animais. Para diminuição dos custos na obtenção desse antígenos a expressão através de sistema heterólogo garante todas as características antigênicas e imunogênicas do alvo selecionado com um custo reduzido no isolamento e purificação. De modo geral, a proteção em ovinos e caprinos com subsequente desafio com C. pseudotuberculosis é caracterizada pela diminuição do número de formação de lesões, diminuição do número e tamanho dos abscessos em órgãos viscerais, principalmente nos pulmões.

[033] Atualmente, não existe uma vacina capaz de conferir proteção total contra a doença. As vacinas experimentais e comerciais, tanto nacionais quanto

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 20/64

9/27 internacionais, apresentam aspectos relevantes a serem considerados quanto à possibilidade de sua utilização. A ineficácia do processo de imunização vem sendo suprida com pesquisas que visam elucidar a complexidade da resposta imune humoral e celular contra a infecção por C. pseudotuberculosis nos hospedeiros-alvo, bem como a procura por melhores antígenos e com características imunodominantes e protetoras.

DESCRIÇÃO DETALHADA [034] A carência de diagnóstico sorológico e profilaxia para LC faz com que inúmeras pesquisas busquem alvos com potenciais para suprir essa necessidade. Diante disso, inúmeras linhagens de C. pseudotuberculosis isoladas de diversos hospedeiros foram sequenciadas e com isso foi possível à montagem de um banco de dados exclusivo desse patógeno, o Corynebase serve como suporte para as diversas pesquisas nessa área, seja para conhecer os fatores de virulência dessa bactéria e traçar novos tratamentos ou para utilizar esses fatores como potenciais alvos para formulação de diagnóstico ou vacina. Deste modo pesquisas no Corybase foram feitas e posteriormente um alvo foi selecionado e com o uso da tecnologia do DNA recombinante foi possível expressa-lo em sistema heterólogo. Após obtenção da proteína recombinante CP7041 a mesma foi testada com soros de ovinos naturalmente infectados e sadios, também foi utilizada como formulação vacinai associada a adjuvantes em camundongos e caprinos. A tecnologia do DNA recombinante já bastante difundida em diversos produtos, seja para reposição hormonal, formulação vacinai, diagnóstico, anticorpos, é uma técnica segura e com baixo custo a comparar com a purificação de proteínas nativas, tornando-se um produto viável e funcional.

[035] Para a seleção dos antígenos da presente invenção foram feitas análises in silico de proteínas presentes na membrana de Corynebacterium pseudotuberculosis assim como buscas por proteínas expressas. Foi utilizado primeiramente o banco de dados CoryneBase (http://corynebacterium.um.edu.my/) para seleção de sequências nucleotídicas (ID C127041) e essas sequências foram comparadas a sequências codificantes de proteínas depositadas no GenBank do NCBI (National Center Biotechnology Information), utilizando-se o software BLASTx. A análise de domínios

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 21/64

10/27 conservados foi realizada com o auxílio do software Conserved Domains (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml) do NCBI.

[036] A análise in silico permitiu selecionar um gene cujo produto gênico secretado é associados à membrana externa apresentam potencial antigênico, sendo, portanto, alvo molecular para estudos de testes de diagnóstico e profilaxia. Para a análise uso-se as sequências depositadas no Corynebase comparadas àquelas depositadas no GenBank para verificar a legitimidade das mesmas. A tabela 2 mostra a nomenclatura para designar o gene selecionado. Após, a proteína recombinante foi obtida pela expressão em Escheríchia coli BL21 para dar sequência aos testes frente a soros de ovinos positivos e negativos para LC, assim como compor formulações vacinais que foram testadas em camundongos e caprinos. Para que a presente invenção seja descrita e compreendida seguem exemplos a seguir detalhando cada etapa, desde a obtenção do gene in silico e inserção no plasmídeo até os testes de ELISA.

Tabela 1. Nomenclatura utilizada neste trabalho para designar o gene nos bancos de dados e proteínas recombinantes.

Identificação do gene (Corynebase)	Referência no GenBank (NCBI)	Gene clonado	Proteína recombinante
C127041	WP-013242755. 1	pAE\cp7041	rCP7041

Tabela 2. Análise de homologia do gene selecionado.

ORFs	Produtos gênicos preditos	Domínios conservad os	Homologia a produtos gênicos de outras espécies	Evalu e	Porcenta gem de homologi a
Cp704	Proteína	Superfamíli	C. pseudotuberculosis	0.0	100%
1	ancorada	a a de	(FRC41)
	superfície	proteínas de	C. pseudotuberculosis 258	0.0	98%
		membrana	C. ulcerans
		externa		0.0	85%

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 22/64

11/27

Fonte: NCBI [039] Exemplo 1 - Tecnologia do DNA recombinante [040] Amplificação das ORFs de interesse [041] A metodologia utilizada para a produção da invento seguiu o documento BR10201503302, com as adequações necessárias. O gene cp7041, selecionado para clonagem e posterior expressão das proteínas, foi amplificado por PCR, utilizando-se primers específicos desenhados através do software Vector NT111 (Invitrogen) (primer Foward 5’- ATAGGATCCGGCATCAAGGTAG sítio para BamHI e primer Reverse 5’-ATAGGTACCAACCCGCAAAGAC sítio para Kpnl). A reação de amplificação por PCR foi realizada para um volume final de 50 pl_, contendo DNA genômico de C. pseudotuberculosis cepa 1002 (50 ng), primers (10 μΜ), água MiliQ autoclavada (22 μΙ_) e Mastermix (Promega) (25 μΙ_) contendo Taq DNA polimerase, dNTPs e MgCÍ2 sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C (5 min), seguida de 30 ciclos correspondendo a desnaturação a 94°C (1 min), anelamento a 55°C (1 min), extensão a 72°C (1,5 min), com uma extensão final de 72°C (7 min), em um termociclador (Mastercycler Gradient, Eppendorf, Alemanha). Os amplicons foram analisados em gel de agarose a 1% corado com Blue Green (LGC Biotecnologia).

[042] O produto de amplificação da ORFde interesse, que foi amplificada a partir do DNA genômico de C. pseudotuberculosis 1002, está presente na figura 1 utilizando-se primers descritos, apresentarou tamanho molecular conforme a predição in silico, apresentando um fragmento de cerca de 1650 pb.

Clonagem e expressão das proteínas recombinantes em E. coli Ligação das ORFs ao vetor pAE [043] Os amplicons referentes ao gene cp7041 foram clonados no vetor de expressão pAE (RAMOS, C.R.R.; ABREU, P.A.E.; NASCIMENTO, A.L.T.O.; HO,

P.L. A high-copy T7 Escherichia coli expression vector for the production of recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide

Brazilian Journal of Medicai and Biological Research. 37:1103-1109, 2004) conforme os sítios de restrição estabelecidos. Para isto, cada amplicom e o vetor foram digeridos com as respectivas enzimas de restrição e, posteriormente, em

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 23/64

12/27 temperatura ambiente numa solução contendo 1 pl_ da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen), 0,5 μΙ_ do vetor, 2 μΙ_ de tampão e 15,5 μΙ_ de H2O MiliQ foram utilizados para fazer a ligação plasmídeo-inserto. Os produtos das construções foram transformados em células eletrocompetentes de E. coli TOP 10, e semeadas em placas contendo meio Lúria-Bertani (LB) (40% de Triptona, 5% de Extrato de Levedura e 40% de NaCI) com ampilicina (100 pg/mL) e incubadas por 16 h a 37°C. As colônias obtidas foram submetidas a uma triagem por lise com fenol-clorofórmio (v/v) e analisadas em gel de agarose 1%. Os clones selecionados foram cultivados em meio líquido (LB) com ampicilina (37°C/140 rpm por 12-16h) antes de proceder à extração do DNA plasmidial utilizando o kit Plasmid Miniprep Spin (GE Healthcare Life Sciences). A confirmação da presença do gene nos clones recombinantes foi feita por digestão com as enzimas de restrição utilizadas na clonagem ao vetor pAE.

[044] A construção com o gene (pAE/cp7041) foi transformado por choque térmico na cepa de expressão E. coli BL21 Star utilizando CaCÍ2 (100mM). A expressão das proteínas recombinantes foi induzida pela adição de 1 mM Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG) em cada cultivo sob agitação orbital (37°C/3 h). A expressão das proteínas recombinantes foi confirmada por Western Blot (SAMBROOK, J.; RUSSEL, D. W. Molecular Cloning - A laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor, 2001) utilizando anticorpo anti-histidina, antes de proceder a sua produção em larga escala.

[045] Na figura 2 estão presentes os produtos de digestão após clonagem para verificar a presença do gene de interesse. Após confirmação dos genes no vetor pAE, a construção pAE/cp7041 foram transformadas por choque térmico na linhagem de expressão E. coli BL21 Star. Uma colônia de cada clone recombinante foi selecionada para essa transformação e utilizada para a expressão das respectivas proteínas, após indução com IPTG.

Western Blot para confirmação da expressão de proteínas [046] Amostras do cultivo de E. coli BL21 transformadas com os plasmídeos recombinantes foram misturadas ao tampão dodecil-sulfato de sódio (SDS) com betamercaptoetanol e após aquecidas a 100°C por 10 min, as amostras foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%. Em seguida, as proteínas foram eletrotransferidas para uma membrana de nitrocellulose de

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 24/64

13/27

0,2mm (GE Healthcare Life Sciences). A membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5 % em PBS (NaCI, KCI, NazHPCU e KH2PO₄ pH 7,4) (1h/37°C) e em seguida lavada com PBS Tween a 0,05 % (PBS-T) (3 vezes por 5 min cada), antes de ser incubada com o anticorpo monoclonal anti-6X-his 1:4000 (Sigma) (1h/37°C). Após 3 lavagens da membrana com PBS-T, adicionou-se o anticorpo anti-lgG de camundongo conjugado com peroxidase (Sigma), diluído em PBS-T (1:4000), seguido de etapa de incubação (1h/37°C), antes de revelar com 3,3'diaminobenzidina (DAB) e H2O2.

[047] A expressão das proteínas heterólogas foi verificada por Western Blot, o qual confirmou a expressão de uma proteína com peso molecular de aproximadamente 35kDa (rCP7041), correspondendo à sequência primária de aminoácidos da proteína codificada pelo gene cp7041 selecionado, além da cauda de 6 histidinas (Figura 3).

Avaliação da solubilidade das proteínas recombinantes [048] As proteínas recombinantes foram caracterizadas quanto à solubilidade a partir de 2 mL do meio de cultivo induzido com IPTG. Para isto, as células foram recuperadas através de etapas de centrifugação (14.000 g/ 2 - 5 min), ressuspensão em 500 pL de TE 1x pH 8.0, sonicação em 10 ciclos (10x de 10s à 20Khz) e nova centrifugação (14.000 g/5 min). Em seguida, o sobrenadante e o pellet foram separados, sendo que o pelletfoi ressuspendido em 500 pL de TE 1x pH 8.0. As amostras foram então misturadas com tampão (Tris-HCI 100 mM pH= 6,8, β-mercaptoethanol 100 mM, SDS a 4 %, azul de bromofenol a 0,2 % e glicerol a 20%), aquecidas a 100°C por 10 min e submetidas à eletroforese (SDSPAGE 12%). Os géis foram corados com comassie blue.

[049] Após a expressão, a proteína foi submetida ao teste de solubilidade. Esta etapa é fundamental para determinar o protocolo de purificação a ser utilizado. A maior concentração da proteína rCP7041 foi detectada em corpos de inclusão, portanto insolúveis (Figura 4), decorrente da sua expressão heteróloga em E. coli (ZHENG, X.; DONG, S.; ZHENG, J.; LI, D.; LI, F.; LUO, Z. Expression, stabilization and purification of membrane proteins via diverse protein synthesis systems and detergents involving cell-free associated with selfassembly peptide surfactants. Biothechnology Advances, v. 32, p. 564-574, 2014.). Diante disso, para solubilização da proteína utilizou-se ureia a 8M.

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 25/64

14/27 [050] Proteínas recombinantes de C. pseudotuberculosis já foram expressas com sucesso em E. coli, como é o caso da exotoxina PLD (MENZIES, P. I.; MUCKLE, C. A.; HWANG, Y. T.; SONGER, G. I. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay using an Escherichia coli recombinant phospholipase D antigen for the diagnosis of Corynebacteriumpseudotuberculosis infection. Small Ruminant Research, v. 13, p. 193 - 198, 1994) e a proteína CP40 (DROPPAALMEIDA, et al. 2016. “Protection in Mice after Challenge with a Virulent Strain.” Vaccine. Retrieved (http://dx.doi.Org/10.1016/j.vaccine.2015.12.064).

Purificação das proteínas recombinantes [051] As proteínas foram filtradas em membrana de 0,45 pm, antes da purificação por cromatografia de afinidade em coluna de sepharose (HisTrap™; GE Healthcare Life Science), carregada com níquel. A preparação proteica foi posteriormente submetida à diálise (sacos de celulose, 25nm x 16nm, Sigma) em tampão fosfato salino 1x (PBS)/ureia 0,2%, com duas trocas diárias (1-10 dias/4° - 20°C) para dessalinização. A quantificação proteica foi realizada por BOA™ Protein Assay Kit (Pierce Chemical Company).

Caracterização de antigenicidade das proteínas recombinantes por Dot Blot [052] Para essa caraterização, 5pL da proteína (rCP7041) foi depositado em uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare Life Sciences). Após secagem (2-30 min/temperatura ambiente), a membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5% em PBS (1 h/temperatura ambiente), antes de incubá-la com soros ovinos positivos e negativos para LC (1:50 em PBS-T por 30 min - 2 h h/37°C). Após esta etapa, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário com anti-lgG de ovino (1:4000 em PBS-T) conjugado com peroxidase (Sigma) (30 min - 2 h/37°C). A reação foi revelada com 3,3'- diaminobenzidina (DAB) e H2O2.

[053] A figura 5 mostra a reatividade da proteína recombinante com os soros positivos, não sendo observada reatividade com os negativos. Isto sugere o potencial antigênico das mesmas. O Dot Blot é uma técnica já relatada para determinar a propriedade antigênica da proteína recombinante EMA-1 de

Theileira equ/(NIZOLI, L. Q.; CONCEIÇÃO, F. R.; SILVA, S. S.; DUMMER, L. A.;

SANTOS JR, A. C.; LEITE, F. P. L. Immunogenicity and antigenicity of the

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 26/64

15/27 recombinant EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 18, p. 1-4, 2009), e para a detecção de anticorpos para o vírus da artrite encefalite caprina de forma mais sensível que outras técnicas usadas no controle de lentiviroses.

[054] Exemplo: Biotecnológico 1 - Diagnóstico

ELISA indireto com proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis [055] Para este teste, antígenos secretados por C. pseudotuberculosis cepa 1002 cultivada em meio BHI (Brain Heart infusion) por 48 h foram utilizados como teste padrão para confirmar a soro-positividade ou negatividade das amostras de soro, conforme a metodologia descrita por SEYFFERT et al. (SEYFFERT, N. A.; GUIMARÃES B. A. S.; PACHECO A. L. G. C.; PORTELA C. R. W. P.; BASTOS C. B. L.; DORELLA, F. A.; HEINEMANN Μ. B.; LAGE A. P.; GOUVEIA, A. M. G.; MEYER R.; MIYOSHI, A.; AZEVEDO, V. High seroprevalence of caseous lymphadenitis in Brazilian goat herds revealed by Corynebacterium pseudotuberculosis secreted proteins-based ELISA. Research in Veterinary Science, v. 88, p. 50-55, 2010) com modificações. Resumidamente, placas de ELISA (Maxisorp-Nunc) foram sensibilizadas com antígenos secretados diluídos 1:100 em tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6) em duplicata e incubadas a 4°C por 16 h. Em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS-T, antes de serem bloqueadas com leite desnatado a 5% dissolvido em tampão PBS-T a 37°C por 1 h. Após 3 lavagens com PBS-T, os soros ovinos positivos e negativos foram adicionados separadamente às cavidades correspondentes a cada um deles, diluídos 1:100 em leite a 5% e incubados a 37°C por 1h. Depois de cinco etapas de lavagem com PBS-T), 100 pL/cavidade do anticorpo anti-ovino conjugado com peroxidase, diluído 1:5000 em leite a 5% (Sigma) foram adicionados e incubados (37°C/1 h). Após 5 lavagens com PBS-T, adicionou-se 100 pL/cavidade de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB), seguido de incubação à temperatura ambiente no escuro por 15 min. A reação foi interrompida com a adição de 50 pL de H2SO4 4N em cada cavidade. A absorbância foi determinada entre 450 e 492 nm em leitor de microplaca (Microplate reader MR-96A, Mindray).

[056] Um total de 49 soros positivos e 26 soros negativos foi utilizado no teste de ELISA indireto com proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis 1002, visando confirmar a natureza das amostras dos soros ovinos. Esta metodologia

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 27/64

16/27 foi validada e aplicada por SEYFFERT et al. (2010) ao realizarem um estudo soroepidemiológico da prevalência de LC no Estado de Minas Gerais, com uma sensibilidade de 93% e especificidade de 98,5% na detecção de anticorpos contra os antígenos secretados pela referida bactéria.

[057] Assim, a figura 6 mostra a distribuição da frequência desses soros positivos (1) e soros negativos (0), onde as amostras foram consideradas positivas quando o ponto de corte apresentou um valor de DO 450n >0,10, referente aos valores médios de absorbância do ELISA. Não há soros abaixo da linha de corte em 1 nem acima da linha de corte em 0, portanto, indicam a ausência de falsos negativos e positivos, respectivamente.

ELISA com a proteína rCP7041 [058] De acordo com a padronização, foi utilizado 0,3 a 1000 ng da proteína e 1:50 na diluição de soro. Inicialmente as placas foram sensibilizadas com a proteína diluída em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 (1:100, 100 pL/cavidade, em duplicata). Após etapas de lavagem e bloqueio, os soros ovinos positivos e negativos (100 pL/cavidade, diluição em PBS-T) foram adicionados, separadamente. Após incubação (37°C /1 h) e lavagens com PBS-T, o anticorpo anti-ovino conjugado com peroxidase (Sigma) (100pL/cavidade, diluição 1:5.000 em leite a 5%) foi adicionado e as placas foram novamente incubadas (37°C/1 h). Na etapa final, cinco lavagens com PBS-T foram realizadas antes de adicionar 100 pL de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB). Após interrupção da reação com H2SO4 4N, a absorbância foi determinada entre 450 e 492 nm em leitor de microplaca (Microplate reader MR-96A, Mindray).

[059] A figura 7 indica os resultados do ELISA utilizando a proteína rCP7041. As amostras foram consideradas positivas quando a média das absorbâncias apresentou valor superior ao ponto de corte calculado para cada uma das proteínas. A análise ROC foi utilizada para determinar o ponto de corte, sensibilidade, especificidade e valor preditivo de cada um dos testes. Os valores desses pontos de corte foram de >0,14 para Elisa-rCP7041. A sensibilidade obtida foi de 100% e a especificidade obtida foi de 96,2%, Elisa-rCP7041.

[060] A proteína CP7041 foi empregada em teste de ELISA-indireto para detectar anticorpos específicos de C. pseudotuberculosis, visando desenvolver um diagnóstico eficaz da LC em ovinos. Segundo BASTOS et al. (BASTOS, B. L.;

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 28/64

17/27

PORTELA, R. W.; DORELLA, F.; RIBEIRO, D.; SEYFFERT, N.; CASTRO, T. L.; MYIOSHI, A.; OLIVEIRA, S. C.; MEYER, R.; AZEVEDO, V. Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological Responses in Animal Models and Zoonotic Potential. Clinicai & Cellular Imonology, v. S4, p. 1-15, 2012), a busca por testes que proporcionem uma maior sensibilidade no diagnóstico de LC em ovinos se dá pela baixa sensibilidade em ensaios já realizados nesses animais. Porém, os resultados deste trabalho indicaram que o ELISA com a proteína rCP7041 obteve 100% de sensibilidade em todos os testes, eliminando a probabilidade de se obter resultados falso-negativos em ovinos.

[061] Contudo, em relação às especificidades, foi de 96,2%, os quais se mostram promissores, tendo em vista principalmente as baixas sensibilidades obtidas, por exemplo, por REBOUÇAS et al. (REBOUÇAS, M. F.; PORTELA, R. W.; LIMA, D. D.; LOUREIRO, D.; BASTOS, B. L; MOURA-COSTA, L. F.; VALE, V. V.; MYIOSHI, A.; AZEVEDO, V.; MEYER, R. Corynebacterium pseudotuberculosis secreted antigen-induced specific interferon gamma production by peripheral blood leukocytes: potential diagnostic markerfor caseous lymphadenitis in sheep and goats. Journal Veterinary Diagnosis Investigation, v. 23, p. 213-220, 2011) ao desenvolverem um ELISA diagnóstico para detectar interferon gama (IFN-γ) como um marcador de imunidade mediada por células do hospedeiro contra o patógeno em ovinos, resultando em uma especificidade de 100%, entretanto uma baixa sensibilidade de 55,8%. BINNS et al. (BINNS, S. H.; GREEN, L. E.; BAILEY M. Development and validation of an ELISA to detect antibodies to Corynebacterium pseudotuberculosis in ovine sera. Veterinary Microbiology, v. 123, p. 169-179, 2007) utilizaram uma preparação celular para o desenvolvimento de um ELISA que detectasse anticorpos contra C. pseudotuberculosis nos soros de ovinos, obtendo uma especificidade de 100%, porém uma sensibilidade de 71%. Em relação à utilização do sobrenadante de cultura de C. pseudotuberculosis para detectar anticorpos específicos em soros de ovinos, REBOUÇAS et al. (REBOUÇAS, M. F.; LOUREIRO, D.; BASTOS, B. L.; MOURA-COSTA, L. F.; HANNA, S. A.; AZEVEDO, V.; MEYER, R.; PORTELA, R. W. Development of an indirect ELISA to detect Corynebacterium pseudotuberculosis specific antibodies in sheep employing T1 strain culture supernatant as antigen. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 33, p. 1296-1302, 2013) obtiveram uma especificidade de 99% e uma sensibilidade de 89%.

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 29/64

18/27 [062] No que se refere a proteínas recombinantes, MENZIES et al. (MENZIES, P. I.; HWANG, Y-T.; PRESCOTT, J. F.; Comparison of an interferon-gama to a phospholipase D enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in experimentally infected goats. Veterinary Microbiology, v. 100, p. 129-137, 2004) testaram ao longo de um ano um ELISA com PLD recombinante em caprinos infectados experimentalmente, com uma sensibilidade de 81% e especificidade de 97%. Ainda se tratando da proteína rPLD, STING et al. (STING, R.; WAGNER, B.; SARI-TURAN, A.; STERMANN, M.; REULE, M.; EICHNER, M.; BEYER, W. Serological studies on Corynebacterium pseudotuberculosis infections in goats in Baden Wuerttemberg (Germany) and seroreactions on antigens used for newly developed enzyme - linked immunosorbent assays (ELISA). Berliner und Münchener tieràrztliche Wochenschrift, v. 125, p. 67-75, 2012) correlacionaram dois testes de ELISA (ELISA-antígenos de células inteiras e ELISA-rPLD) para avaliara soroprevalência de C. pseudotuberculosisem caprinos infectados, onde o primeiro conferiu uma sensibilidade de 81% e especificidade de 98%, enquanto o segundo uma sensibilidade de 97% e especificidade de 99%, mostrando assim que o resultado obtido pelo ELISA com a proteína recombinante foi superior. Entretanto, de acordo com estudo feito por HOELZLE et al. (HOELZE, L. E.; SCHERRER, T.; MUNTWYLER, J. C.; WITTENBRINK, Μ. M.; PHILIPP, W.; HOELZLE, K. Difference in the antigen structures of Corynebacterium pseudotuberculosis and the induced humoral immune response in sheep and goats. Veterinary Microbiology, v.164, p. 359-365, 2013), testes sorológicos baseados em PLD como único antígeno não são capazes de identificar todos os ovinos infectados, dado que a PLD foi reconhecida nesse experimento por apenas 70% dos ovinos positivos para LC e por 100% dos caprinos positivos.

[063] Portanto, os resultados deste estudo mostram uma excelente correlação de sensibilidade e especificidade (100% e 96,2%) para o teste ELISA-rCP7041. Contudo, todos os resultados são de forma geral promissores, como já mencionado anteriormente. Nenhum dos valores de especificidade inviabiliza o potencial do ELISA-rCP7041 para uso em ensaios de diagnóstico por ELISA, visto que os resultados deste trabalho são superiores aos de outros estudos sobre diagnóstico de LC, descritos na literatura.

Análise Estatística

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 30/64

19/27 [064] Para avaliar a especificidade, a sensibilidade, o valor preditivo e o ponto de corte, os dados experimentais foram submetidos à análise pelo programa estatístico Receiver Operating Characteristic (ROC) utilizando o software MedCalc estatística (versão 10.3.0). Esta análise visa diferenciar os verdadeiros positivos dos verdadeiros negativos a fim de estipular o ponto de corte. A avaliação da sensibilidade e da especificidade dos dados experimentais foi feita com cada proteína individualmente e em associação.

[065] Exemplo: Biotecnológico 2 - vacina em camundongos Delineamento em camundongos [066] A utilização de camundongos como modelo de estudo para a Linfadenite Caseosa se justifica, uma vez que estes animais são empregados em estudos para a compreensão de agravos crônicos, além de apresentarem sinais clínicos, perfil de hemograma e bioquímica sérica, bem como as alterações histopatológicas em órgãos viscerais similares aos observados em pequenos ruminantes. Para a realização deste experimento, foram utilizados 34 camundongos Sw/ss, de ambos os sexos, com idade entre seis a oito semanas, provenientes do Biotério da UFBA. Os animais receberam água filtrada e ração sem restrições durante todo o experimento. Os camundongos foram utilizados nos experimentos após uma semana de adaptação. Os animais foram mantidos no Biotério do Instituto de Ciências da Saúde-UFBA com instalações próprias, com uma sala para acomodação dos animais com temperatura controlada, controle de luz de 12 horas e exaustão.

Imunização e desafio [067] Os animais foram divididos em 5 grupos, onde o tratamento se manteve igual em todo o experimento. O grupo 1 (G1) foi inoculado com solução salina, gurpo 2 (G2) inolculado com hidróxido de alumínio, grupo 3 (G3) inoculado com saponina, grupo 4 (G4) inoculado com 10-100 pg de rCP7041 associada com hidróxido de alumínio e o grupo 5 (G5) inoculado com 10-100 pg de rCP7041 associada com saponina. Os camundongos foram imunizados três vezes, por via intraperitoneal nos dias 0, 15 e 30, A dose do antígeno por animal foi de 10-100 pg. O desafio foi realizado no dia 45 com 10¹² UFC de uma linhagem virulenta (VD57) de C. pseudotuberculosis, por via peritoneal. Amostras de sangue para dosagem de anticorpos foram coletadas nos dias 0, 15, 30 e 60 e nesta data foi realizada a eutanásia em câmara de dióxido de carbono.

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 31/64

20/27

Avaliação da resposta humoral [068] A avaliação da produção de anticorpos IgG total reativos arCP7041 foi realizada por ELISA indireto utilizando protocolo padronizado por Carminati e colaboradores (2003), com modificações.

[069] Afigura 8 apresenta a resposta por anticorpos daclasse IgG, especícificos contra as proteína recombinante rCP7041. Corynebacterium pseudotuberculosis é um parasita intracelular facultativo e para o seu controle a resposta imune de caprinos, ovinos e murinos envolve tanto mecanismos da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa. Considerando-se que nos mecanismos básicos desta patogênese em modelo murino, ocorre similaridade aos observados em pequenos ruminantes, ampla utilização do referido modelo justifica-se por apresentar vantagens relacionadas à aquisição de reagentes específicos, o fácil manejo e, sobretudo, a existência de linhagens isogênicas, além de propiciar uma maior facilidade de comparação e de interpretação de resultados relativos a mecanismos básicos, com estudos de enfermidades humanas e de outros animais (VALE.V. L. Avaliação de Aspectos da Resposta Imune de Camundongos Balb/C Contra Linhagem T1 de Corynebacterium pseudotuberculosis. 2005. (Tese de Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Imunologia. Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2005).

[070] Na avaliação da resposta imune humoral, a produção de anticorpos específicos IgG foi realizada através do ensaio imunoenzimático ELISA utilizando o soro, aos 60 dias após infecção experimental dos camundongos por C. pseudotuberculosis. Na figura 8 observa-se que a proteína, rCP7041 é capazes de induzir este tipo de resposta no modelo murino, o que já era conhecido para outras proteínas recombinantes como rCP40 (DROPPA et al, 2016).

[071] Seiler e colaboradores (SEILER, P.; AICHELE, P.; BANDERMANN, S.; HAUSER, A.E.; LU, B., et al. Early granuloma formation after aerosol Mycobacterium tuberculosis infection is regulated by neutrophils via CXCR3signaling chemokines. Eur J Immunol. v.33. p.2676-2686, 2003) demonstraram que, em camundongos C57BI/6 infectados com Mycobacterium tuberculosis, no inicio da infecção, houve uma constituição que propicia a contenção da bactéria, com as células PMN tendo papel central na regulação do foco granulomatoso no pulmão para que este granuloma formado possa ter uma função de proteção ao

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 32/64

21/27 longo do tempo. A resposta imune humoral, apesar de não desempenhar papel principal na defesa do hospedeiro frente ao C. pseudotuberculosis, uma vez que isoladamente não é capaz de eliminar a infecção causada por este patógeno, exerce função auxiliar na ativação do sistema imune sendo de extrema importância quando associada à resposta imune celular. Esses anticorpos não interferem com a multiplicação do microrganismo, mas são capazes de impedir a disseminação da infecção do local de inoculação para órgãos internos.

[072] Neste estudo os níveis de anticorpos IgG contra C. pseudotuberculosis no soro, não apresentaram diferenças estatisticamente significantes na comparação entre grupos controle e os animais infectados durante o período de experimentação no tempos de infecção. Adicionalmente, estudos de Paule et.al (PAULE B, J.A. etal. Experimental Corynebacterium pseudotuberculosis primary infection in goats: kinetics of IgG and interferon- γ production, IgG avidity and antigen recognition by Western blotting. Vet. Immunol. Inmunopathol. [S.I.] v. 96, p. 129-139, 2003) avaliando a resposta imune humoral observou uma resposta primária de curta duração no 5^o dia com uma mudança deste quadro a partir do 16° dia, numa forte resposta secundária e de longa duração.

[073] A proteção dos animais foi equivalente a 50%, no entanto houve mais sobreviventes no grupo controle. Esse resultado pode estar associado ao adjuvante escolhido, a saponina. Este adjuvante é amplamente utilizado e tende a apresentar uma resposta mista Th1 e Th2, porém a depender do perfil apresentado pelo antígeno, este pode ter suprimido a resposta Th1 que é a mais ideal para infecções por C. pseudotuberculosis. Com isso, mais testes com outros adjuvantes são necessários, visto que a rCP7041 tem potencial antigênico e imunogênico.

Análise estatística [074] As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software, EUA). Os resultados de viabilidade e de imunoglobulinas específicas da produção intracelular foram expressos como a média ± desvio padrão. Os dados foram considerados estatisticamente significativos quando p < 0,05.

[075] Exemplo: Biotecnológico 3 - vacina em caprinos Delineamentos em caprinos

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 33/64

22/27 [076] Para a realização deste ensaio piloto de imunização, foram selecionados 18 caprinos de ambos os sexos, com idades entre 6-12 meses, sem raça definida (SRD), provenientes de uma criação comercial com exploração de corte na cidade de Jaguarari-BA.

[077] A seleção prévia dos animais foi baseada em testes clínicos e sorológicos: rebanho sem histórico de utilização de vacinas comerciais contra LC, produtos (filhos) de matrizes sem histórico clínico de LC, além de ser soronegativos para o ELISA específico de detecção de anticorpos anti-C. pseudotuberculosis, segundo protocolo de Seyfert e colaboradores (2010).

[078] Os animais selecionados foram mantidos em baias experimentais na Fazenda Riacho da Taboca, localizada na cidade de Itabaianinha-SE, com infraestrutura adequada para criação, manutenção e experimentação. Foram alimentados com capim elefante, ração e suplementação mineral adequadas, e água ad libitum (Apêndice).

Grupos e esquemas de imunização [079] Os animais foram divididos em dois grupos, um grupo experimental com oito e um grupo controle com dez animais. Os animais deste último grupo não receberam nenhum tratamento, o grupo experimental foi inoculado com 50-1000 pg de rCP7041, em um volume final de 1 mL, contendo 0,5-3 mg do adjuvante saponina.

[080] O grupo controle foi designado como G1 e o grupos experimental G2 (inoculação da proteína recombinante CP7041).

Avaliação clínica e coleta sanguínea para sorologia e cultura de células [081]Durante todo o ensaio de imunização, os animais foram examinados e avaliados clinicamente para se detectar qualquer mudança no seu estado fisiológico, bem como observar o desenvolvimento de lesões nos locais de inoculação e presença de abscesso nos linfonodos superficiais regionais drenantes.

[082] Coletas de sangue foram realizadas para avaliação da resposta humoral ao longo do experimento. Sistematicamente, as coletas de sangue ocorreram antes da vacinação, nos dias de tratamento e desafio e no final do experimento quando os animais foram eutanaziados. Para a coleta do soro foi utilizado o sistema de coleta a vácuo, com agulha hipodérmica 21 G (25 mm x

8/10)(Apendice). Após a retração do coágulo sanguíneo, os soros foram

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 34/64

23/27 centrifugados a 5.000 x g entre 3-15 minutos e armazenados a -20 °C até o momento da sua avaliação. Para cultura, o sangue foi coletado em tubos heparinizados, mantido em recipiente resfriado e logo processado.

Ensaio imunoenzimático [083] As amostras de soro foram analisadas por ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto para detecção de imunoglobulinas totais específicas da classe IgG contra antígenos secretados de C. pseudotuberculosis, realizada por ELISA indireto utilizando protocolo padronizado por Carminati e colaboradores (2003), com modificações descritas a seguir.

[084] Placas de poliestireno de 96 poços e de fundo chato (Maxisorp-Nunc®) foram sensibilizadas com a proteínas rCP7041 com 0,01 - 10 pg/mL, em tampão carbonato bicarbonato a 0,05M, pH 9,6. Em cada poço alíquotas de 20-150 pi foram adicionadas e posteriormente incubadas a 4°C por 12 horas. Após duas lavagens com PBS (NaCI, KCI, Na2HPO4 e KH2PO4 pH 7,4) contendo 0,1% de Tween-20, foi realizado o bloqueio, com 200 pi /poço de PBS-T20, contendo 5% de leite desnatado, durante 2 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, foram incubadas com soros testes (50 μΙ/poço) diluídos a 1:100 em PBS-T20 contendo 1% de leite desnatado durante 1 hora. Após cinco lavagens em PBS-T20, foi adicionado às placas 50pl/poço de imunoglobulina de coelho anti-imunoglobulina de caprino, conjugada a peroxidase (Sigma®) na diluição de 1:10.000 em PBST20. As placas foram incubadas a 37°C entre 15-1 h e, em seguida lavadas 5 vezes com PBS-T20 e incubadas com 50 μΙ/poço de OPD diluído em 12 mL de tampão citrato com 12,5 μΙ de peróxido de hidrogênio por cerca de 5-25 minutos, à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. A reação foi interrompida pela adição de 25 μΙ de ácido sulfúrico (2N) e a leitura realizada em leitor de ELISA (Bio Rad, Hercules, CA), com filtro de 490nm.

[085] De modo geral, investigações prévias avaliaram se a proteção contra LC em ovinos e caprinos era efetiva em consequência da imunogenicidade frente aos componentes das formulações e proteção pelo número de abscessos reduzidos ou ausentes após exposição secundária no sítio de inoculação e órgãos viscerais (PIONTKOWSKI, M. D.; SHIWERS, D. W. Evaluation of a commercially available vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis for use in sheep. J. Am. Vet. Med. Assoe., [S.I.], v. 212, p. 1765-1768, 1998; DE ROSE, R. et al. Efficacy of DNA vaccination by different routes of immunisation

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 35/64

24/27 in sheep. Vet Immunol Immunopathol; 90, 55-63. 2002.). A proteção avaliada pela presença ou ausência de lesões macroscópicas compatíveis com a LC é um forte indício de que a vacina foi eficiente, o que se estende aos nossos achados, no qual a análise macroscópica constatou redução significativa da quantidade e intensidade das lesões observadas.

[086] Paule et.al (PAULE B, J.A. et al. Experimental Corynebacterium pseudotuberculosis primary infection in goats: kinetics of IgG and interferon- γ production, IgG avidity and antigen recognition by Western blotting. Vet. Immunol. Inmunopathol. [S.I.] v. 96, p. 129-139,2003.), que observou elevados títulos de IgG após a infecção, porém sem apresentar sinais clínicos característicos nos linfonodos superficiais, mas somente nos órgãos e linfonodos internos. Entretanto, vale ressaltar que tanto a linhagem bacteriana quanto a dosagem de infecciosa foram diferentes.

[087] Meyer e colaboradores (MEYER, R. et al. Avaliação da resposta imune humoral em caprinos inoculados com uma vacina viva atenuada liofilizada contra Corynebacterium pseudotuberculosis. R. Ci. Méd. Biol., [S.I.], v. 1, n. 1, p. 42-48, 2002.) trabalhando com a cepa 1002 observaram o declínio na produção dos anticorpos dosados, provavelmente, ao catabolismo protéico natural dos anticorpos, que voltam a estar incrementados com o ressurgimento do estímulo reiniciado com a proliferação da bactéria que constitui a vacina viva. As diferenças acima podem ser explicadas pela morte de microrganismos após a liofilização, bem como pelo possível aumento da atenuação dos mesmos, tendo em vista o contínuo e sucessivo repique de culturas. Ademais, doses de até 10¹¹ CFU desta cepa são bem toleradas pelos caprinos submetidos à imunização. Em nenhum deles foi notada a presença de abscessos no local da vacinação ou em qualquer linfonodo superficial, detectável ao exame físico.

[088] A correlação direta entre resposta pelos anticorpos e proteção é defendida há vários anos por vários pesquisadores. Eles afirmam que os anticorpos produzidos contra a bactéria inteira (whole cells) podem auxiliar na eliminação do microorganismo no sítio primário de infecção, enquanto anticorpos contra a exotoxina PLD podem prevenir sua disseminação Assim, trabalhos mostraram uma correlação direta da resposta humoral com a proteção contra LC, onde uma baixa porcentagem de proteção induzida pela bactéria viva atenuada foi associada a uma fraca resposta humoral. As proteínas recombinantes testadas

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 36/64

25/27 não geraram um aumento expressivo da resposta humoral, entretanto, induziram a produção de anticorpos específicos. A confirmação do efeito imunoprotetor destes anticorpos no controle da disseminação da infecção pelo hospedeiro, como certamente ocorre com anticorpos gerados contra a PLD, depende de estudos posteriores a serem realizados, bem como da análise dos resultados das avaliações histopatológicas, ainda em execução.

Avaliação da produção in vitro de interferon-γ [089] A quantificação de IFN-γ produzido in vitro, em culturas de sangue total, sob estímulo de antígenos de C. pseudotuberculosis, foi feita a partir do sobrenadante de cultura de sangue total. As amostras de sangue colhidas (5 mL em tubos heparinizados) em cada tempo amostrai foram dispostas em placas de cultivo celular de 24 poços sendo para cada animal utilizados três poços com 1 mL. O primeiro poço, controle negativo, sem adição de estímulo; o segundo poço o controle positivo, sendo adicionado 5pg de mitógeno pokeweed (PWM); e o terceiro poço foi adicionado 40 pg das proteínas secretadas da linhagem VD57 deste micro-organismo, pela técnica de TPP (three phase partitioning). Todo o procedimento foi realizado em condições estéreis no fluxo laminar. As placas foram incubadas por 48 horas a 37°C, em estufa com atmosfera de 5% de CO2. O sobrenadante foi coletado após centrifugação das amostras durante 3-15 minutos a 8.000 rpm e então submetidos à avaliação da produção de INFy, através do teste de ELISA Sandwich, utilizando-se o Kit Ovine INF- γ (Mabtech, Suécia).

[090] Um “kit” comercial foi utilizado para dosara produção de IFN^y em cultura de sangue total sob estímulo do antígeno secretado TPP, para avaliar a possível indução de resposta imune celular pelas moléculas recombinantes utilizadas nas imunizações, tendo como indicador desta resposta a produção desta citocina e os resultados estão apresentados na figura 11.

[091] O desenvolvimento do granuloma pode decorrer na presença de células

Th1, Th2 e citocinas como IFN-γ, IL-12, IL-4, TNF-α e MCP-1, cujos níveis são elevados durante a formação inicial do granuloma, provavelmente atuando no seu desenvolvimento, fator importante na redução da disseminação da bactéria.

Mais recentemente, Fraga (FRAGA, R. Resposta immune de diferentes linhagens marinas à infecção experimental com Corynebacterium

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 37/64

26/27 pseudotoberculosis. Tese de Doutorado, Programa de Pós-Graduação em Imunologia, UFBA, 2012) demonstrou o expressivo aumento de susceptibilidade à infeccção experimental com C. pseudotuberculosis em camundongos C57Black/6 nocauteados para o gene de IFN-ü, quando comparados com murinos da mesma linhagem, sem nocaute deste gene. No presente experimento, analisando a produção de IFN^y frente ao estímulo do antígeno TPP, observa-se que, apesar de não existirem diferenças estatísticas entre os grupos, os animais de todos os grupos apresentaram resposta ao estímulo quando comparados com o grupo controle. Ademais, aqueles imunizados com o pooldas três proteínas foram os que apresentaram uma maior produção de IFNγ aos 90 dias de experimentação. Meyer e colaboradores (MEYER, R. et al. In vitro IFN-gama production by goat blood cells after stimulation with somatic and secreted Corynebacterium pseudotuberculosis antigens. Vet. Immunol. And Immunoptology. [S.I.], v.107, p.249-254, 2005) encontraram altos índices de produção de IFN^y pela indução do antígeno secretado TPP, e baixa produção quando os leucócitos foram estimulados com antígeno somático. Sunil e colaboradores (2007) utilizando um ELISA para dosagem de IFN-γ como método diagnóstico em ovinos vacinados com uma vacina comercial conhecida como Glanvac® (composta por ultrafiltrados de diversos antígenos C. pseudotuberculosis, Clostridium perfringens, C. tetani, C. novyi e C. septicum) observaram que os animais que foram vacinados tinham baixa produção de IFNγ em comparação com um grupo de animais naturalmente infectados. A importância do IFN-γ na resposta imune celular contra a progressão clínica desta doença já foi anteriormente descrita. Entretanto, em um estudo utilizando a dosagem de IFN-γ como um possível marcador para o diagnóstico da Linfadenite Caseosa em caprinos e ovinos, os autores também encontraram uma associação entre altos níveis IFN-γ em animais com granulomas. No presente estudo, aguarda-se a conclusão da avaliação histopatológica para se estabelecer as possíveis correlações entre tais resultados e os níveis desta citocina aqui apresntados.

Análise estatística [092] As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software, EUA). Os resultados de

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 38/64

27/27 viabilidade e de imunoglobulinas específicas da produção intracelular foram expressos como a média ± desvio padrão. Os dados foram considerados estatisticamente significativos quando p < 0,05.

Claims (14)

1. Proteína recombinante,caracterizada por consistir a sequência de aminoácidos no código de acesso no GenBank WP_013242755.1 (CP7041).

2. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa caracterizado por conter a proteína recombinante em questão individualmente ou associada a qualquer outro antígeno, assim como reagentes para a realização de teste imunodiagnóstico.

3. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos reagentes do teste imunodiagnóstico serem selecionados do grupo compreendendo solução de lavagem, solução de bloqueio, tampão de incubação, anticorpo apropriado para revelação, substrato enzimático, solução de diluição do substrato enzimático e solução para parar a revelação.

4. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo suporte ser preferencialmente uma placa de microtitulação de 96 poços de ELISA.

5. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela solução de lavagem consistir preferencialmente de solução de tampão com pH neutro contendo um agente surfactante.

6. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizafo pela solução de bloqueio consistir preferencial mente de solução de tampão em pH neutro contendo peptídeo ou proteína.

7. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo tampão de incubação conter solução de tampão pH neutro contendo peptídeo ou proteína em menor concentração que a solução de bloqueio.

8. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo anticorpo consistir preferencialmente em um anticorpo anti IgG conjugado com um marcador enzimático.

Petição 870170062638, de 25/08/2017, pág. 41/64

2/2

9. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo substrato enzimático ser fluorescente ou radioativo e passível de detecção na faixa do UV ao visível.

10. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela solução de diluição do substrato ser selecionado do grupo consistindo peróxido de hidrogênio, solução tampão pH ácido ou solução surfactante contendo sais de metais.

11. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela solução para parar a reação reveladora ser selecionada de um grupo compreendendo ácidos ou bases fortes.

12. Kit para diganóstico de Linfadenite Caseosa, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a semelhança entre os microorganismos que fazem parte do grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcos) impossibilita a utilização do mesmo para os micro-organismos que compõem os gêneros descritos acima.

13. Composição vacinai, caracterizada por compreender o uso da proteína rCP7041 individual ou associada com outros antígenos de Corynebacterium pseudotuberculosis ou com intuito de vacinas polivalentes, associadas a antígenos de outros patógenos e ao menos um adjuvante fisiologicamente aceitável.

14. Composição vacinai, caracterizada por compreender o uso da proteína rCP7041 individual ou associada com qualquer adjuvante ou substância que potencialize sua imunogenicidade.