BR102017004036A2

BR102017004036A2 - Natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid to control salmonella enteritidis

Info

Publication number: BR102017004036A2
Application number: BR102017004036A
Authority: BR
Inventors: Geovane Rose De Oliveira; Willian Klassen De Oliveira; Fernando Bittencourt Luciano; Leandro Batista Costa; Renata Ernlund Freitas De Macedo
Original assignee: Associacao Paranaense De Cultura - Apc
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2018-10-30

Abstract

"composição antimicrobiana natural a base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de salmonella enteritidis", descreve-se a presente patente de invenção como uma composição antimicrobiana natural a base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de salmonella enteritidis que, de acordo com as suas características, possui como princípio básico uma composição antimicrobiana natural à base de baixas concentrações de óleo essencial de isotiocianato de alila (ita) e ácido orgânico de cadeia média capróico (cap), com vistas a ser aplicado sinergicamente como antimicrobiano natural nos procedimentos de controle de salmonella enteritidis em rações animais e no trato digestório de frangos de corte, aliado a uma sólida alternativa na substituição dos tradicionais antibióticos na redução da contaminação em rações e, consequentemente em seres humanos."Natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid for the control of salmonella enteritidis", the present invention is described as a natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid for the control of salmonella enteritidis which according to Its characteristics have as its basic principle a natural antimicrobial composition based on low concentrations of allyl isothiocyanate (ita) essential oil and caproic medium chain organic acid (cap), in order to be applied synergistically as natural antimicrobial in control of salmonella enteritidis in animal feed and broiler digestive tract, combined with a solid alternative to replace traditional antibiotics to reduce contamination in feed and, consequently, in humans.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA NATURAL A BASE DE ÓLEO ESSENCIAL E ÁCIDO ORGÂNICO PARA CONTROLE DE SALMONELLA ENTERITIDIS (51) Int. CL: A01N 47/46; A01N 37/02; A01P 3/00; A01P 1/00 (73) Titular(es): ASSOCIACAO PARANAENSE DE CULTURA - APC (72) Inventor(es): GEOVANE ROSE DE OLIVEIRA; WILLIAN KLASSEN DE OLIVEIRA; FERNANDO BITTENCOURT LUCIANO; LEANDRO BATISTA COSTA; RENATA ERNLUND FREITAS DE MACEDO (85) Data do Início da Fase Nacional:(54) Title: NATURAL ANTIMICROBIAL COMPOSITION BASED ON ESSENTIAL OIL AND ORGANIC ACID FOR THE CONTROL OF SALMONELLA ENTERITIDIS (51) Int. CL: A01N 47/46; A01N 37/02; A01P 3/00; A01P 1/00 (73) Holder (s): PARANAENSE CULTURE ASSOCIATION - APC (72) Inventor (s): GEOVANE ROSE DE OLIVEIRA; WILLIAN KLASSEN DE OLIVEIRA; FERNANDO BITTENCOURT LUCIANO; LEANDRO BATISTA COSTA; RENATA ERNLUND FREITAS DE MACEDO (85) Start date of the National Phase:

24/02/2017 (57) Resumo: COMPOSIÇÃO02/24/2017 (57) Summary: COMPOSITION

ANTIMICROBIANA NATURAL A BASE DE ÓLEO ESSENCIAL E ÁCIDO ORGÂNICO PARA CONTROLE DE SALMONELLA ENTERITIDIS, DESCREVE-SE A PRESENTE PATENTE DE INVENÇÃO COMO UMA COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA NATURAL A BASE DE ÓLEO ESSENCIAL E ÁCIDO ORGÂNICO PARA CONTROLE DE SALMONELLA ENTERITIDIS QUE, DE ACORDO COM AS SUAS CARACTERÍSTICAS, POSSUI COMO PRINCÍPIO BÁSICO UMA COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA NATURAL À BASE DE BAIXAS CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO ESSENCIAL DE ISOTIOCIANATO DE ALILA (ITA) E ÁCIDO ORGÂNICO DE CADEIA MÉDIA CAPRÓICO (CAP), COM VISTAS A SER APLICADO SINERGICAMENTE COMO ANTIMICROBIANO NATURAL NOS PROCEDIMENTOS DE CONTROLE DE SALMONELLA ENTERITIDIS EM RAÇÕES ANIMAIS E NO TRATO DIGESTÓRIO DE FRANGOS DE CORTE, ALIADO A UMA SÓLIDA ALTERNATIVA NA SUBSTITUIÇÃO DOS TRADICIONAIS ANTIBIÓTICOS NA REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO EM RAÇÕES E, CONSEQUENTEMENTE EM SERES HUMANOS.ANTIMICROBIAL NATURAL BASED ON ESSENTIAL OIL AND ORGANIC ACID FOR THE CONTROL OF SALMONELLA ENTERITIDIS, THIS INVENTION PATENT IS DESCRIBED AS A NATURAL ANTIMICROBIAL COMPOSITION BASED ON ESSENTIAL AND ORGANIC ACID THERAPY AND ACIDIC THERAPY , HAS AS A BASIC PRINCIPLE A NATURAL ANTIMICROBIAL COMPOSITION BASED ON LOW CONCENTRATIONS OF ESSENTIAL OIL OF ALILA ISOTIOCIANATE (ITA) AND ORGANIC CAPRICHIC CHAIN ORGANIC ACID (CAP), WITH NATURAL ANTICHAMES IN SALVAGE. ENTERITIDIS IN ANIMAL FEEDS AND IN THE DIGESTORY TREATMENT OF CHICKENS, ALLIED TO A SOLID ALTERNATIVE IN THE SUBSTITUTION OF TRADITIONAL ANTIBIOTICS IN REDUCING CONTAMINATION IN FEEDS AND, THEREFORE, IN HUMAN BEINGS.

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COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA NATURAL A BASE DE ÓLEO ESSENCIAL E ÁCIDO ORGÂNICO PARA CONTROLE DE SALMONELLA ENTERITIDISNATURAL ANTIMICROBIAL COMPOSITION BASED ON ESSENTIAL OIL AND ORGANIC ACID FOR SALMONELLA ENTERITIDIS CONTROL

001 Refere-se a presente patente de invenção a composições antimicrobianas em geral, mais especificamente a uma composição antimicrobiana natural a base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis que, de acordo com as suas características, possui como princípio básico uma composição antimicrobiana natural à base de baixas concentrações de óleo essencial de isotiocianato de alila (ITA) e ácido orgânico de cadeia média capróico (CAP), com vistas a ser aplicado sinergicamente como antimicrobiano natural nos procedimentos de controle de Salmonella Enteritidis em rações animais e no trato digestório de frangos de corte, aliado a uma sólida alternativa na substituição dos tradicionais antibióticos na redução da contaminação em rações e, consequentemente em seres humanos e, tendo como base, uma composição antimicrobiana natural de formulação geral diferenciada e grande resistência, durabilidade e versatilidade que apresenta características de praticidade no manuseio e na aplicação para melhor adaptação e segurança dos usuários, de custo bastante acessível e, devido às suas características gerais e composição, facilmente adaptável a uma vasta gama de rações, animais, usuários e locais, independentes das características que estes possam apresentar.001 Refers to the present invention patent to antimicrobial compositions in general, more specifically to a natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid for the control of Salmonella Enteritidis which, according to its characteristics, has as a basic principle a composition natural antimicrobial based on low concentrations of essential oil of allyl isothiocyanate (ITA) and organic acid of medium chain capróico (CAP), with a view to be applied synergistically as natural antimicrobial in the control procedures of Salmonella Enteritidis in animal feed and in the tract digestion of broilers, combined with a solid alternative in the replacement of traditional antibiotics in reducing contamination in diets and, consequently in humans, and based on a natural antimicrobial composition with a differentiated general formulation and great resistance, durability and versatility that presents practicality characteristics in the man use and application for better adaptation and safety of users, at a very affordable cost and, due to its general characteristics and composition, easily adaptable to a wide range of diets, animals, users and places, regardless of the characteristics they may present.

002 Atualmente, a ausência de segurança alimentar coloca em elevado risco a saúde pública, sendo motivo de grande preocupação para os consumidores, agências reguladoras e indústrias de alimentos em todo o mundo. A maioria das iniciativas estudadas para controle de doenças transmitidas por alimentos visam reduzir, inibir ou retardar o crescimento de micro-organismos sobre os produtos alimentares através da utilização de compostos de origem natural.002 Currently, the lack of food security puts public health at high risk, and is a major concern for consumers, regulatory agencies and food industries worldwide. Most of the initiatives studied to control foodborne diseases aim to reduce, inhibit or delay the growth of microorganisms on food products through the use of compounds of natural origin.

003 A produtividade na avicultura tem se destacado de forma expressiva nos últimos anos com elevados índices de aumento, e este avanço pode ser claramente observado principalmente na produção de frangos de corte. O Brasil é considerado, atualmente, o segundo maior produtor e o maior exportador de carne de frango do003 Poultry productivity has stood out significantly in recent years with high rates of increase, and this advance can be clearly seen mainly in the production of broilers. Brazil is currently considered the second largest producer and exporter of chicken meat in the world.

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2/20 mundo.2/20 world.

004 Com a intensificação da produção de frangos, o controle sanitário tomou-se um procedimento prioritário nas granjas. Entre os patógenos mais veiculados pelos produtores avícolas está à bactéria Salmonella Enteritidis, causadora de doenças entéricas de origem alimentar em humanos e capaz de provocar perdas na produtividade animal. É de amplo conhecimento que a Salmonella Enteritidis está entre os principais micro-organismos causadores de doenças entéricas transmitidas por alimentos em humanos no mundo, além de provocar perdas significativas na produtividade animal, com elevado índice de mortalidade.004 With the intensification of chicken production, sanitary control became a priority procedure on farms. Among the pathogens most commonly carried by poultry producers is the bacterium Salmonella Enteritidis, which causes food-borne enteric diseases in humans and capable of causing losses in animal productivity. It is widely known that Salmonella Enteritidis is among the main microorganisms causing enteric diseases transmitted by food in humans in the world, in addition to causing significant losses in animal productivity, with a high mortality rate.

005 Anualmente, são documentados pela European Food Safety Authority EFSA, aproximadamente cem mil casos de doenças entéricas, sendo a salmonelose a segunda doença mais relatada. De acordo com os dados do Centers for Disease Control and Prevention - CDC, cerca de um milhão de casos de salmonelose ocorrem a cada ano nos Estados Unidos e entre duzentos milhões a um bilhão e trezentos milhões de casos em todo o mundo. A Salmonella Enteritidis representa oitenta e cinco por cento dos casos de salmonelose na Europa, trinta e oito por cento da Ásia e trinta e um por cento na América Latina e no Caribe.005 Annually, approximately one hundred thousand cases of enteric diseases are documented by the European Food Safety Authority EFSA, with salmonellosis being the second most reported disease. According to data from the Centers for Disease Control and Prevention - CDC, about one million cases of salmonellosis occur each year in the United States and between two hundred million to one billion and three hundred million cases worldwide. Salmonella Enteritidis represents eighty-five percent of salmonellosis cases in Europe, thirty-eight percent in Asia and thirty-one percent in Latin America and the Caribbean.

006 Cerca de oitocentos tipos de produtos de origem animal estão envolvidos em intoxicações alimentares causadas por Salmonella Enteritidis, destacando-se a carne de frango, os ovos e seus derivados. No Brasil, os ovos e seus derivados são o terceiro alimento responsável por casos de doenças transmitidas por alimentos (DTA), enquanto a carne de frango e seus derivados ocupam a oitava posição.006 About eight hundred types of animal products are involved in food poisoning caused by Salmonella Enteritidis, especially chicken meat, eggs and their derivatives. In Brazil, eggs and their derivatives are the third food responsible for cases of foodborne diseases (DTA), while chicken meat and its derivatives occupy the eighth position.

007 Uma das principais formas de contaminação das aves é o contato com a Salmonella Enteritidis nas granjas, através do consumo da ração contaminada, sendo esta contaminação transferida para a carcaça durante o processamento, tomando a carne de frango uma das principais formas de contaminação para o homem. Os alimentos cámeos de origem animal podem ser contaminados, ainda, durante o transporte, manipulação e armazenamento, enquanto os ovos podem sofrer contaminação transovariana por Salmonella Enteritidis durante sua formação. Neste caso, a contaminação é transmitida via corrente sanguínea para o007 One of the main forms of contamination of birds is the contact with Salmonella Enteritidis in the farms, through the consumption of the contaminated feed, this contamination being transferred to the carcass during processing, making chicken meat one of the main forms of contamination for the man. Animal milk products may also be contaminated during transport, handling and storage, while eggs may suffer transovarian contamination by Salmonella Enteritidis during their formation. In this case, the contamination is transmitted via the blood stream to the

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3/20 ovário. A ocorrência e a concentração de Salmonella Enteritidis na carne variam de acordo com as condições de manejo durante a criação do animal.3/20 ovary. The occurrence and concentration of Salmonella Enteritidis in meat varies according to the management conditions during the animal's creation.

008 Já as espécies de Lactobacillus (crispatus, reuteri e salivarius) são colonizadoras autóctones do trato gastrintestinal de frangos de corte, presentes desde a primeira semana de vida das aves, desempenhando papel importante na nutrição, desempenho e prevenção de doenças, como a enterite necrótica, provocada por Clostridium perfringens no trato gastrintestinal. Os Lactobacillus são bactérias produtoras do ácido láctico, atuando também no controle de Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis e Campylobacter jejuni, muito utilizados como probióticos para humanos e animais, reduzindo a incidência de doenças intestinais.008 Already the species of Lactobacillus (crispatus, reuteri and salivarius) are native colonizers of the gastrointestinal tract of broilers, present since the first week of life of birds, playing an important role in nutrition, performance and prevention of diseases, such as necrotic enteritis , caused by Clostridium perfringens in the gastrointestinal tract. Lactobacillus are lactic acid-producing bacteria, also acting in the control of Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis and Campylobacter jejuni, widely used as probiotics for humans and animals, reducing the incidence of intestinal diseases.

009 No caso específico de aves, as bactérias patogênicas (Salmonella spp.) atingem o trato digestório após passarem pelo papo (inglúvio), onde existe um ambiente com pH baixo, atuando como importante barreira para impedir ou diminuir a colonização de patógenos. Com as mudanças químicas e microbiológicas que ocorrem neste compartimento, há aumento da população de bactérias láticas (Lactobacillus), capazes de reduzir o crescimento de Enterobactérias no papo, por exclusão competitiva, diminuindo a capacidade de aderência das bactérias com fímbrias às paredes do trato intestinal, beneficiando a mucosa intestinal das aves em geral.009 In the specific case of birds, pathogenic bacteria (Salmonella spp.) Reach the digestive tract after passing through the crop (English), where there is a low pH environment, acting as an important barrier to prevent or decrease the colonization of pathogens. With the chemical and microbiological changes that occur in this compartment, there is an increase in the population of lactic bacteria (Lactobacillus), capable of reducing the growth of Enterobacteria in the crop, by competitive exclusion, decreasing the ability of bacteria with fimbriae to the intestinal tract walls. , benefiting the intestinal mucosa of birds in general.

0010 O amplo uso de antibióticos como melhoradores de desempenho na produção animal vem sendo restringido cada vez mais, devido aos riscos de surgimento de micro-organismos resistentes a estes antibióticos, além de possíveis resíduos que podem contaminar a carcaça, acarretando em prejuízo econômico em muitos setores da agroindústria. A Comunidade Européia eliminou progressivamente e acabou por proibir, em primeiro de janeiro de dois mil e seis, a comercialização e utilização de antibióticos como melhoradores de desempenho. Com isso, o Brasil passou a proibir o uso de alguns antibióticos (virginiamicina, tilosina, espiramicina, tetraciclinas, quinolonas, eritromicina e avoparcina) na produção de animais destinados ao consumo humano desde o ano de dois mil e treze.0010 The widespread use of antibiotics as performance enhancers in animal production has been increasingly restricted, due to the risks of the emergence of microorganisms resistant to these antibiotics, in addition to possible residues that can contaminate the carcass, causing economic damage in many agribusiness sectors. The European Community gradually eliminated and ended up banning, on January 1st, two thousand and six, the commercialization and use of antibiotics as performance enhancers. As a result, Brazil began to ban the use of some antibiotics (virginiamycin, tylosin, spiramycin, tetracyclines, quinolones, erythromycin and avoparcin) in the production of animals intended for human consumption since the year two thousand and thirteen.

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0011 Por estes motivos, na última década, um dos grandes desafios das indústrias foi à busca por aditivos alimentares para os animais que substituíssem os antibióticos melhoradores de desempenho, na tentativa de inibir o crescimento de micro-organismos patogênicos presentes na ração e no trato digestório dos animais, melhorando o desempenho animal.0011 For these reasons, in the last decade, one of the great challenges of the industries has been the search for food additives for animals to replace antibiotics that improve performance, in an attempt to inhibit the growth of pathogenic microorganisms present in the feed and digestive tract. of animals, improving animal performance.

0012 Nas buscas por alternativas aos tradicionais antibióticos, desde o início dos anos noventa, aumentou-se o interesse por melhoradores de desempenho à base de plantas, uma vez que estes são quimicamente distintos dos antibióticos e possuem grande potencial antimicrobiano. Deste modo, procura-se atender à demanda do consumidor por produtos sem aditivos químicos, com vida útil prolongada e sem causar prejuízos ao desempenho animal. Com isso, novos aditivos com potencial antimicrobiano vêm sendo difundidos na cadeia produtiva como um todo.0012 In the search for alternatives to traditional antibiotics, since the beginning of the nineties, interest in plant-based performance enhancers has increased, since they are chemically distinct from antibiotics and have great antimicrobial potential. In this way, it seeks to meet consumer demand for products without chemical additives, with a long shelf life and without causing damage to animal performance. As a result, new additives with antimicrobial potential have been disseminated throughout the production chain as a whole.

0013 Nesta linha de ação, tem se tomado imprescindível para o comercio nacional e internacional o efetivo controle destes patógenos (Salmonella Enteritidis) nas granjas e, consequentemente, nas carnes de frango e outros produtos avícolas em geral, através da estruturação de uma versátil, prática, segura e eficiente composição ou procedimento que favoreça o sistema produtivo de frangos de corte e aumente a segurança alimentar dos animais e seres humanos.0013 In this line of action, the effective control of these pathogens (Salmonella Enteritidis) in farms and, consequently, in chicken meat and other poultry products in general, has become essential for national and international trade, through the structuring of a versatile, practical , safe and efficient composition or procedure that favors the production system of broilers and increases the food security of animals and humans.

0014 Desta forma, a concepção geral da presente composição antimicrobiana natural a base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis, objeto da presente patente, é baseada totalmente na sua formulação simples com um mínimo necessário de componentes e aplicação na forma líquida ou em pó extremamente simplificada, segura e otimizada, aliado aos procedimentos de obtenção e conservação bastante práticos, de modo a gerar uma composição antimicrobiana natural que, através de compostos utilizados como antimicrobianos e melhoradores da conversão alimentar, com formulações à base de baixas concentrações de óleo essencial de isotiocianato de alila (ITA) e ácido orgânico de cadeia média capróico (CAP) possibilitam uma sinergia nos procedimentos de controle de Salmonella Enteritidis em rações animais e no trato digestório de frangos de corte.0014 In this way, the general design of the present natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid for the control of Salmonella Enteritidis, object of the present patent, is totally based on its simple formulation with a minimum of necessary components and application in liquid or in extremely simplified, safe and optimized powder, combined with very practical obtaining and conservation procedures, in order to generate a natural antimicrobial composition that, through compounds used as antimicrobials and feed conversion enhancers, with formulations based on low oil concentrations essential oil of allyl isothiocyanate (ITA) and organic acid of medium chain capróico (CAP) allow a synergy in the control procedures of Salmonella Enteritidis in animal feed and in the digestive tract of broilers.

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0015 De forma mais específica, a presente composição antimicrobiana natural baseia-se na CIM dos óleos essenciais (OE) e ácidos orgânicos (AO) contra Salmonella Enteritidis, caracterizando-se como um antimicrobiano obtido da combinação de um óleo essencial (OE) e um ácido orgânico (AO) contra Salmonella Enteritidis em rações de frango.0015 More specifically, the present natural antimicrobial composition is based on the MIC of essential oils (OE) and organic acids (AO) against Salmonella Enteritidis, characterized as an antimicrobial obtained from the combination of an essential oil (OE) and a organic acid (AO) against Salmonella Enteritidis in chicken diets.

0016 Em uma ampla análise da literatura com o intuito de se estabelecer o estado da técnica vigente frente a composições antimicrobianas naturais em geral, primordialmente para aplicação na área de avicultura - frangos, objeto da presente patente, não foram descritos documentos relevantes ao estado da técnica que relacionem o objeto específico reivindicado na presente patente, ou seja, uma composição antimicrobiana natural tendo como base óleos essenciais (OE) e ácidos orgânicos (AO) atuante no controle da Salmonella Enteritidis.0016 In a wide analysis of the literature in order to establish the current state of the art in relation to natural antimicrobial compositions in general, primarily for application in the poultry industry - chickens, the object of this patent, no relevant documents on the state of the art were described that relate the specific object claimed in the present patent, that is, a natural antimicrobial composition based on essential oils (OE) and organic acids (AO) acting in the control of Salmonella Enteritidis.

0017 Os óleos essenciais (OEs), também chamados óleos voláteis, são líquidos e aromáticos, obtidos a partir de material vegetal (flores, brotos, sementes, folhas, galhos, cascas, ervas, madeira, frutos e raízes). Os óleos essenciais (OEs) são misturas complexas (fenilpropenos e terpenos, entre outros) de baixo ponto de ebulição, associados com essências de plantas com aromas característicos, definidos como ervas e especiarias. Eles são metabólitos secundários que desempenham papel fundamental na proteção das plantas contra ataques de insetos, doenças bacterianas ou fungicas.0017 Essential oils (OEs), also called volatile oils, are liquid and aromatic, obtained from plant material (flowers, buds, seeds, leaves, branches, bark, herbs, wood, fruits and roots). Essential oils (OEs) are complex mixtures (phenylpropenes and terpenes, among others) with a low boiling point, associated with plant essences with characteristic aromas, defined as herbs and spices. They are secondary metabolites that play a fundamental role in protecting plants against insect attacks, bacterial or fungal diseases.

0018 A utilização de extratos herbais é considerada uma abordagem complementar ou alternativa à medicina convencional (alopatia) e tem recebido maior atenção como melhoradores de desempenho animal na última década. O isotiocianato de alila (ITA) e o carvacrol (CV) são os principais componentes dos óleos essenciais de mostarda e orégano, respectivamente, e têm sido muito utilizados como antimicrobianos em outros estudos.0018 The use of herbal extracts is considered a complementary or alternative approach to conventional medicine (allopathy) and has received greater attention as animal performance improvers in the last decade. Allyl isothiocyanate (ITA) and carvacrol (CV) are the main components of mustard and oregano essential oils, respectively, and have been widely used as antimicrobials in other studies.

0019 De maneira geral, os isotiocianatos são caracterizados pela presença das ligações entre grupos de -N=C=S, em que o átomo de carbono central é altamente eletrofílico, sendo atribuído a isto o seu potencial biológico. O sistema de glucosinolatos-mirosinase é descrito como um sistema de defesa química ativada0019 In general, isothiocyanates are characterized by the presence of bonds between groups of -N = C = S, in which the central carbon atom is highly electrophilic, with its biological potential being attributed to this. The glucosinolate-mirosinase system is described as an activated chemical defense system

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6/20 após danos no tecido de plantas especializadas e, ainda há indícios de que pode ocorrer hidrólise dos glucosinolatos no trato gastrintestinal sob a ação de alguns micro-organismos, atuando contra um amplo espectro de agentes potencialmente patogênicos.6/20 after damage to the tissue of specialized plants and there is still evidence that hydrolysis of glucosinolates in the gastrointestinal tract may occur under the action of some microorganisms, acting against a wide spectrum of potentially pathogenic agents.

0020 Os ácidos orgânicos, constituintes normais de plantas ou de tecidos de origem animal, vêm sendo empregados há muitos anos como aditivos conservantes de alimentos e melhoradores de desempenho animal, prevenindo e minimizando infecções causadas por bactérias patogênicas na produção de aves e suínos. Nesta categoria de aditivos, encontram-se os ácidos graxos de cadeia curta (propiônico, fórmico, acético, cítrico, lático, benzoico, butírico e fumárico) e os ácidos graxos de cadeia média (cáprico, caprílico, caproico e láurico). Eles são componentes de numerosos óleos de origem animal e vegetal, não apresentam toxicidade para os humanos e são reconhecidos como seguros pelos órgãos governamentais.0020 Organic acids, normal constituents of plants or animal tissues, have been used for many years as food preservative additives and animal performance improvers, preventing and minimizing infections caused by pathogenic bacteria in poultry and swine production. In this category of additives, there are short-chain fatty acids (propionic, formic, acetic, citric, lactic, benzoic, butyric and fumaric) and medium-chain fatty acids (capric, caprylic, caproic and lauric). They are components of numerous animal and vegetable oils, are non-toxic to humans and are recognized as safe by government agencies.

0021 Dentre os ácidos orgânicos empregados na nutrição animal, os de cadeia curta, como o propiônico, com quatro carbonos, e os de cadeia média, como o caproico, com eis carbonos, pertencem ao grupo de ácidos carboxílicos (R-COOH). Estes ácidos são amplamente distribuídos na natureza como componentes naturais de vegetais e tecidos animais. Além disso, são obtidos através da fermentação de carboidratos, proteínas, gorduras e matéria orgânica no trato gastrintestinal dos animais e humanos, realizada estritamente pela microbiota anaeróbia predominante no intestino, e constituem parte importante do suprimento energético dos animais hospedeiros.0021 Among the organic acids used in animal nutrition, those of short chain, such as propionic, with four carbons, and those of medium chain, like caproic, with three carbons, belong to the group of carboxylic acids (R-COOH). These acids are widely distributed in nature as natural components of plants and animal tissues. In addition, they are obtained through the fermentation of carbohydrates, proteins, fats and organic matter in the gastrointestinal tract of animals and humans, carried out strictly by the anaerobic microbiota predominant in the intestine, and constitute an important part of the energy supply of the host animals.

0022 Os óleos essenciais e os ácidos orgânicos têm sido eficientes em inibir a proliferação de micro-organismos patógenos, quando adicionados à dieta dos animais. A aplicabilidade desses compostos (óleos essenciais e ácidos orgânicos) está associada ao seu efeito inibidor sobre o desenvolvimento de bactérias indesejáveis no alimento e no trato gastrintestinal. Os ácidos orgânicos podem melhorar a digestibilidade e a palatabilidade da dieta, melhorando assim a conversão alimentar e o crescimento dos animais, principalmente aves e suínos,0022 Essential oils and organic acids have been effective in inhibiting the proliferation of pathogenic microorganisms when added to the animals' diet. The applicability of these compounds (essential oils and organic acids) is associated with their inhibitory effect on the development of undesirable bacteria in the food and gastrointestinal tract. Organic acids can improve the digestibility and palatability of the diet, thus improving feed conversion and the growth of animals, especially poultry and pigs,

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7/20 controlando a incidência de patógenos intestinais.7/20 controlling the incidence of intestinal pathogens.

0023 Apesar dos óleos essenciais serem considerados potentes antimicrobianos, não é possível afirmar que estas substâncias sejam realmente efetivas em uma simulação de digestão, por apresentarem elevada volatilidade e baixa solubilidade em água, o que pode dificultar sua aplicação. Já os ácidos orgânicos apresentam elevada capacidade de dissociação em meios líquidos, o que pode facilitar sua utilização durante a simulação.0023 Although essential oils are considered potent antimicrobials, it is not possible to state that these substances are really effective in a digestion simulation, as they present high volatility and low solubility in water, which can make their application difficult. Organic acids, on the other hand, have a high dissociation capacity in liquid media, which can facilitate their use during simulation.

0024 De forma mais específica, a patente em apreço caracteriza-se por reunir componentes e processos em uma concepção diferenciada, a qual atenderá às diversas exigências que a natureza da utilização demanda, isto é, controle de Salmonella Enteritidis em rações animais e no trato digestório de frangos de corte. Concepção esta que garante uma composição antimicrobiana natural de grande eficiência, resistência, confiabilidade, desempenho, precisão, segurança, atuação e durabilidade em razão das excelentes qualidades técnicas, o que proporciona vantagens e melhoras nos procedimentos de controle de doenças transmitidas por rações e alimentos em geral e, cujas características gerais, diferem das demais formas e modelos amplamente conhecidos pelo atual estado da técnica.0024 More specifically, the patent in question is characterized by bringing together components and processes in a differentiated design, which will meet the diverse requirements that the nature of the use demands, that is, control of Salmonella Enteritidis in animal feed and in the digestive tract broilers. This conception guarantees a natural antimicrobial composition of great efficiency, resistance, reliability, performance, precision, safety, performance and durability due to the excellent technical qualities, which provides advantages and improvements in the procedures for controlling diseases transmitted by feed and food in general and, whose general characteristics, differ from other forms and models widely known by the current state of the art.

0025 A presente patente consiste no emprego de uma moderna, eficiente e versátil composição antimicrobiana natural a base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis formada por um conjunto de soluções antimicrobianas e físico-químicas corretamente incorporadas, constituindo uma composição antimicrobiana natural, de composição geral diferenciada e consistente e excelentes qualidades finais que, por suas características próprias, é obtido mediante um processo específico e uma composição geral baseada em proporções definidas de isotiocianato de alila (ITA) como óleo essencial, e ácido capróico (CAP) como ácido orgânico de cadeia média, de modo a possibilitar a obtenção de uma excelente composição antimicrobiana natural para utilização nos procedimentos de controle de Salmonella Enteritidis em rações animais e no trato digestório de frangos de corte em geral.0025 The present patent consists of the use of a modern, efficient and versatile natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid to control Salmonella Enteritidis formed by a set of correctly incorporated antimicrobial and physicochemical solutions, constituting a natural antimicrobial composition, with a differentiated and consistent general composition and excellent final qualities which, due to their own characteristics, are obtained through a specific process and a general composition based on defined proportions of allyl isothiocyanate (ITA) as essential oil, and capróic acid (CAP) as acid organic medium chain, in order to obtain an excellent natural antimicrobial composition for use in the control procedures of Salmonella Enteritidis in animal feed and in the digestive tract of broilers in general.

0026 A presente composição antimicrobiana natural baseia-se na aplicação de0026 The present natural antimicrobial composition is based on the application of

Petição 870170013001, de 24/02/2017, pág. 29/44Petition 870170013001, of 2/24/2017, p. 29/44

8/20 componentes e processos em uma concepção diferenciada, com o objetivo de se alcançar a excelência na obtenção deste, sem, no entanto, atingir um alto grau de sofisticação e complexibilidade, tomando possível solucionar alguns dos principais inconvenientes das demais formas e modelos conhecidos pelo atual estado da técnica e empregados no controle de Salmonella Enteritidis e na substituição dos tradicionais antibióticos na redução da contaminação em rações, que se situam em uma faixa de trabalho na qual são frequentes as dificuldades de utilização e aplicação, baixa eficiência, elevada insegurança, pouca durabilidade e resistência, baixa versatilidade, elevadas perdas, baixo rendimento, custo elevado, manuseio complexo, e grande desperdício de tempo.8/20 components and processes in a differentiated design, with the objective of achieving excellence in obtaining this, without, however, reaching a high degree of sophistication and complexity, making it possible to solve some of the main drawbacks of the other known shapes and models by the current state of the art and employed in the control of Salmonella Enteritidis and in the replacement of traditional antibiotics in reducing contamination in diets, which are located in a working range in which the difficulties of use and application are frequent, low efficiency, high insecurity, low durability and resistance, low versatility, high losses, low yield, high cost, complex handling, and great waste of time.

0027 Os objetivos, vantagens e demais características importantes da patente em apreço poderão ser mais facilmente compreendidas quando lidas em conjunto com a composição.0027 The objectives, advantages and other important characteristics of the patent in question can be more easily understood when read in conjunction with the composition.

0028 A presente patente de invenção de Composição Antimicrobiana Natural a Base de Óleo Essencial e Ácido Orgânico para Controle de Salmonella Enteritidis, é compreendido por uma composição antimicrobiana natural que, por suas características próprias, é obtido mediante um processo específico e uma composição geral baseada em proporções definidas de óleos essenciais (OE) e ácidos orgânicos (AO), sendo a formulação e, consequentemente, as quantidades empregadas, baseadas diretamente nas aplicações a que se destinam.0028 The present patent for the invention of Natural Antimicrobial Composition based on Essential Oil and Organic Acid for the Control of Salmonella Enteritidis, is comprised of a natural antimicrobial composition that, due to its own characteristics, is obtained through a specific process and a general composition based on defined proportions of essential oils (OE) and organic acids (AO), with the formulation and, consequently, the amounts used, based directly on the applications for which they are intended.

0029 A composição antimicrobiana natural à base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis, de acordo com as necessidades de aplicação, pode ser compreendido por uma composição antimicrobiana natural na qual o óleo essencial (OE) é o isotiocianato de alila (ITA) e o ácido orgânico (AO) de cadeia média é o ácido capróico (CAP), mantendo todas as demais características inerentes à composição antimicrobiana natural.0029 The natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid to control Salmonella Enteritidis, according to the application needs, can be comprised of a natural antimicrobial composition in which the essential oil (OE) is allyl isothiocyanate (ITA ) and medium chain organic acid (AO) is capróic acid (CAP), maintaining all other characteristics inherent to the natural antimicrobial composition.

0030 A composição antimicrobiana natural à base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis, de acordo com as necessidades de aplicação, pode ser compreendido por uma composição antimicrobiana natural na qual sua composição geral é baseada em uma concentração inibitória mínima (CIM)0030 The natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid to control Salmonella Enteritidis, according to the application needs, can be comprised of a natural antimicrobial composition in which its general composition is based on a minimum inhibitory concentration (MIC)

Petição 870170013001, de 24/02/2017, pág. 30/44Petition 870170013001, of 2/24/2017, p. 30/44

9/20 que consiste de aproximadamente 6,25ppm de isotiocianato de alila (ITA) e l,5mM de ácido capróico (CAP) para uma sinergia com IFIC de 0,4, mantendo todas as demais características inerentes à composição antimicrobiana natural.9/20 consisting of approximately 6.25 ppm of allyl isothiocyanate (ITA) and 1.5 mM of capróic acid (CAP) for a synergy with IFIC of 0.4, maintaining all other characteristics inherent to the natural antimicrobial composition.

0031 EXEMPLO0031 EXAMPLE

0032 A eficiência desta composição antimicrobiana a base de óleos essenciais e ácidos orgânicos para controle de Salmonella Enteritidis em rações animais e no trato digestório de frangos de corte, aliado a uma alternativa na substituição dos antibióticos na redução da contaminação de rações e alimentos, pode ser melhor analisada e interpretada através de exemplo prático e não restritivo de sua aplicação. 0033 Os experimentos foram realizados no Laboratório de Tecnologia de Produtos Agropecuários (LTPA) da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR). Os antimicrobianos de origem natural utilizados foram o óleo essencial de carvacrol (Sigma-aldrich, Sant-Louis, MO, EUA), o óleo essencial de isotiocianato de alila (Sigma-aldrich, Sant-louis, MO), o ácido orgânico de cadeia curta - ácido propiônico (Vetec Química Fina Ltda. Duque de Caxias, RJ, Brasil), e o ácido orgânico de cadeia média - ácido caproico (Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brasil). As cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas foram: S. Enteritidis 9SUSP, S. Enteritidis 33SUSP, S. Enteritidis CRIFS1016 6FP, S. Enteritidis 56301 e S. Enteritidis CRIFS, da coleção de cultura do laboratório de TPA. As cepas de Lactobacillus plantarum utilizadas foram: L. plantarum 131, L. plantarum 192, L. plantarum 341 e L. plantarum 442 e L. plantarum 343 da coleção de cultura do laboratório de TPA.0032 The efficiency of this antimicrobial composition based on essential oils and organic acids to control Salmonella Enteritidis in animal feed and in the digestive tract of broiler chickens, combined with an alternative in the replacement of antibiotics in reducing feed and food contamination, can be best analyzed and interpreted through a practical and non-restrictive example of its application. 0033 The experiments were carried out at the Agricultural Products Technology Laboratory (LTPA) of the Pontifical Catholic University of Paraná (PUCPR). The antimicrobials of natural origin used were the essential oil of carvacrol (Sigma-aldrich, Sant-Louis, MO, USA), the essential oil of allyl isothiocyanate (Sigma-aldrich, Sant-louis, MO), the organic chain acid short - propionic acid (Vetec Química Fina Ltda. Duque de Caxias, RJ, Brazil), and medium chain organic acid - caproic acid (Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazil). The strains of Salmonella Enteritidis used were: S. Enteritidis 9SUSP, S. Enteritidis 33SUSP, S. Enteritidis CRIFS1016 6FP, S. Enteritidis 56301 and S. Enteritidis CRIFS, from the culture collection of the TPA laboratory. The strains of Lactobacillus plantarum used were: L. plantarum 131, L. plantarum 192, L. plantarum 341 and L. plantarum 442 and L. plantarum 343 from the culture collection of the TPA laboratory.

0034 - Experimento 1: Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). 0035 O inóculo foi preparado pela ativação das cepas de Salmonella Enteritidis, individualmente, em 8mL de caldo Triptona de Soja (TSB) (HiMedia Laboratórios, Mumbai, índia) incubado em estufa por 24 h a 37°C. Em seguida foi preparado um pool com 100pL de cada cepa em 9,5mL de caldo TSB, ativado pela incubação por 2 h a 37°C.0034 - Experiment 1: Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). 0035 The inoculum was prepared by activating the strains of Salmonella Enteritidis, individually, in 8mL of Soy Triptona broth (TSB) (HiMedia Laboratórios, Mumbai, India) incubated in an oven for 24 h at 37 ° C. Then a pool with 100pL of each strain was prepared in 9.5mL of TSB broth, activated by incubation for 2 h at 37 ° C.

0036 Para determinar as concentrações inibitórias mínimas dos óleos essenciais foi preparada uma solução mãe com 20pL de óleo e 980pL de dimetil sulfóxido0036 To determine the minimum inhibitory concentrations of essential oils, a stock solution was prepared with 20pL of oil and 980pL of dimethyl sulfoxide

Petição 870170013001, de 24/02/2017, pág. 31/44Petition 870170013001, of 2/24/2017, p. 31/44

10/20 (DMSO) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) para melhor diluição dos óleos. Os ácidos foram adicionados diretamente no caldo de cultura, sem diluição em solução mãe.10/20 (DMSO) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) for better oil dilution. The acids were added directly to the culture broth, without dilution in the mother solution.

0037 A CIM dos óleos essenciais e dos ácidos orgânicos frente ao pool de Salmonella foi determinada pela técnica de diluição em tubos. Foram inoculados 80pL do pool de Salmonella em caldo TSB com pH 6,0, que recebeu diferentes concentrações dos antimicrobianos. Para os OEs, foram testadas doses de 12,5 a 800ppm de isotiocianato de alila (ITA) e doses de 50 a 800ppm de carvacrol (CV). Para os AO, foram utilizadas doses de 37 a 297ppm de ácido propiônico (PROP) e doses de 23 a 930ppm de ácido caproico (CAP). Além disso, foi preparado um teste sem a adição de antimicrobianos. Os tubos foram incubados a 37°C por 24h. Todos os testes foram realizados em triplicatas. A CIM foi definida como a menor concentração do antimicrobiano onde não houve crescimento visível do microorganismo (turvação).0037 The MIC of essential oils and organic acids in front of the Salmonella pool was determined by the tube dilution technique. 80pL of the Salmonella pool was inoculated in TSB broth with pH 6.0, which received different concentrations of antimicrobials. For OEs, doses of 12.5 to 800ppm of allyl isothiocyanate (ITA) and doses of 50 to 800ppm of carvacrol (CV) were tested. For OA, doses of 37 to 297ppm of propionic acid (PROP) and doses of 23 to 930ppm of caproic acid (CAP) were used. In addition, a test was prepared without the addition of antimicrobials. The tubes were incubated at 37 ° C for 24h. All tests were performed in triplicates. MIC was defined as the lowest concentration of the antimicrobial where there was no visible growth of the microorganism (turbidity).

0038 - Experimento 2: Determinação do efeito combinado de óleos essenciais e ácidos orgânicos.0038 - Experiment 2: Determination of the combined effect of essential oils and organic acids.

0039 Foram testadas combinações óleo-óleo, ácido-ácido e óleo-ácido a partir das CIM obtidas no ensaio anterior contra o pool de Salmonella Enteritidis. As cepas foram preparadas utilizando o mesmo procedimento do experimento um. Para avaliação do efeito combinado, as CIM (150ppm de CV, 25ppm de ITA, 70ppm de CAP e 75ppm de PROP) individuais dos antimicrobianos foram reduzidas em 1/2, 1/4 e 1/8. As combinações (óleo-óleo, óleo-ácido e ácido-ácido) foram inoculadas em tubos contendo caldo TSB com pH 6,0, previamente inoculado com 80pL do pool de Salmonella Enteritidis, incubados por 24h a 37°C.0039 Oil-oil, acid-acid and oil-acid combinations were tested from the MICs obtained in the previous test against the Salmonella Enteritidis pool. The strains were prepared using the same procedure as in experiment one. To assess the combined effect, the individual MICs (150ppm CV, 25ppm ITA, 70ppm CAP and 75ppm PROP) of the antimicrobials were reduced by 1/2, 1/4 and 1/8. The combinations (oil-oil, oil-acid and acid-acid) were inoculated in tubes containing TSB broth with pH 6.0, previously inoculated with 80pL of the Salmonella Enteritidis pool, incubated for 24h at 37 ° C.

0040 A CIM dos antimicrobianos combinados foi definida como a menor concentração dos antimicrobianos onde não houve crescimento visível do microorganismo (turvação). Para verificar se houve efeito sinérgico entre os antimicrobianos testados, utilizou-se a metodologia descrita por Palaniappan e Holley (2010), na qual foi calculado o índice de concentração inibitória fracionada (FIC) pela seguinte equação: índice FIC = FIC^A + FIC^B, onde A representa o0040 The MIC of the combined antimicrobials was defined as the lowest concentration of the antimicrobials where there was no visible growth of the microorganism (turbidity). To verify whether there was a synergistic effect between the tested antimicrobials, the methodology described by Palaniappan and Holley (2010) was used, in which the fractional inhibitory concentration index (FIC) was calculated using the following equation: index FIC = FIC ^A + FIC ^B , where A represents the

Petição 870170013001, de 24/02/2017, pág. 32/44Petition 870170013001, of 2/24/2017, p. 32/44

11/20 antimicrobiano 1 e Β o antimicrobiano 2. O FIC foi calculado da seguinte forma: FIC^a do óleo = CIM do antimicrobiano 1 em combinação/CIM antimicrobiano 1 individualmente; e FIC^B do ácido = CIM do antimicrobiano 2 em combinação/CIM antimicrobiano 2 individualmente. As interações entre os antimicrobianos foram interpretadas da seguinte forma: efeito sinérgico: IFIC < 0,5; nenhuma interação: IFIC > 0,5 ou < 4,0; e efeito antagônico: IFIC > 4,0.11/20 antimicrobial 1 and Β antimicrobial 2. The FIC was calculated as follows: oil FIC ^a = MIC of antimicrobial 1 in combination / antimicrobial MIC 1 individually; and acid FIC ^B = MIC of antimicrobial 2 in combination / MIC of 2 individually. The interactions between antimicrobials were interpreted as follows: synergistic effect: IFIC <0.5; no interaction: IFIC> 0.5 or <4.0; and antagonistic effect: IFIC> 4.0.

0041 - Experimento 3: Efeito dos Antimicrobianos Naturais Adicionados à Ração Sobre Salmonella Enteritidis.0041 - Experiment 3: Effect of Natural Antimicrobials Added to Food on Salmonella Enteritidis.

0042 Para a realização desta etapa do experimento, foi utilizada ração comercial para frangos de corte em fase inicial de crescimento, sem a adição prévia de qualquer antimicrobiano. Para o estudo com a ração, foram selecionados apenas os compostos que obtiveram melhor desempenho nos testes em combinação, sendo 6,25ppm de isotiocianato de alila e 17,5ppm de ácido caproico.0042 To carry out this stage of the experiment, commercial feed was used for broilers in the initial growth phase, without the prior addition of any antimicrobial. For the study with the ration, only the compounds that obtained the best performance in the tests in combination were selected, being 6.25ppm of allyl isothiocyanate and 17.5ppm of caproic acid.

0043 Para a obtenção de células viáveis de Salmonella Enteritidis para inoculação na ração, foi necessário realizar a pré-adaptação das cepas com objetivo de aumentar sua resistência ao ambiente com baixa umidade. Utilizou-se metodologia adaptada de Yoon et al. (2013). As cepas foram ativadas em lOmL de caldo TSB e incubadas por 24h a 37°C. Em seguida, preparou-se o pool de Salmonella em 9,5mL de TSB, adicionando 100pL de das 5 cepas, e incubou-se por 20h a 37°C. O pool de Salmonella foi exposto a concentrações sequenciais de NaCl, onde 100pL do pool foram diluídos em lOmL de caldo TSB contendo dois por cento de NaCl, incubado por 24h a 37°C. Após este período, 100 pL foram coletados e diluídos em lOmL de caldo TSB com quatro por cento de NaCl, incubado por 24h a 37°C. Após a exposição ao NaCl, lOOpL do caldo foram semeados em placas ágar Padrão para Contagem - PCA (Kasvi, Itália) contendo quatro por cento de NaCl, incubadas por 24h a 37°C. As colônias crescidas no Agar foram consideradas adaptadas ao meio e utilizadas para a inoculação na ração.0043 In order to obtain viable Salmonella Enteritidis cells for inoculation in the feed, it was necessary to pre-adapt the strains in order to increase their resistance to the environment with low humidity. Methodology adapted from Yoon et al. (2013). The strains were activated in 10 ml of TSB broth and incubated for 24 hours at 37 ° C. Then, the pool of Salmonella was prepared in 9.5mL of TSB, adding 100pL of the 5 strains, and incubated for 20h at 37 ° C. The Salmonella pool was exposed to sequential concentrations of NaCl, where 100pL of the pool was diluted in 10mL of TSB broth containing two percent NaCl, incubated for 24h at 37 ° C. After this period, 100 pL were collected and diluted in 10 ml of TSB broth with four percent NaCl, incubated for 24 hours at 37 ° C. After exposure to NaCl, 100pL of the broth were seeded on Standard Agar plates for Contagem - PCA (Kasvi, Italy) containing four percent NaCl, incubated for 24 hours at 37 ° C. The colonies grown on the Agar were considered adapted to the medium and used for inoculation in the feed.

0044 Após este procedimento, amostras das colônias foram coletadas por raspagem com uma alça de inoculação e diluídas em lOmL de caldo TSB contendo quatro por cento de NaCl e incubadas por 20h a 37°C para posterior aplicação na0044 After this procedure, samples of the colonies were collected by scraping with an inoculation loop and diluted in 10 ml of TSB broth containing four percent NaCl and incubated for 20 hours at 37 ° C for later application in the

Petição 870170013001, de 24/02/2017, pág. 33/44Petition 870170013001, of 2/24/2017, p. 33/44

12/20 ração. O volume de l,6mL do pool ativado de Salmonella Enteritidis, adaptada ao meio de baixa umidade, foi inoculado em 160g de ração e, posteriormente, homogeneizado por dois minutos com o auxílio de mixer.12/20 ration. The volume of 1.6mL of the activated pool of Salmonella Enteritidis, adapted to the low humidity medium, was inoculated in 160g of feed and, later, homogenized for two minutes with the aid of a mixer.

0045 A CIM dos antimicrobianos obtida in vitro foi aumentada para verificar seu efeito antimicrobiano quando adicionados na ração. Para aplicação dos antimicrobianos na ração foi preparada uma solução mãe contendo 4,80mL de água deionizada + 2,09mL de ácido caproico + 75 pL de isotiocianato de alila. As amostras de ração previamente inoculadas com Salmonella foram pesadas e distribuídas em tubos de plástico com tampa de rosca de 50mL. Após a adição de diferentes concentrações de ITA e CAP, os tubos foram fechados hermeticamente e o conteúdo homogeneizado por agitação manual por sessenta segundos. Um controle positivo, sem a adição de ITA e CAP, também foi realizado. As amostras foram estocadas à temperatura ambiente por um período de 8 dias para a determinação da sobrevivência de Salmonella.0045 The MIC of the antimicrobials obtained in vitro was increased to verify their antimicrobial effect when added to the feed. For the application of antimicrobials in the diet, a stock solution was prepared containing 4.80mL of deionized water + 2.09mL of caproic acid + 75 pL of allyl isothiocyanate. The feed samples previously inoculated with Salmonella were weighed and distributed in plastic tubes with a 50mL screw cap. After adding different concentrations of ITA and CAP, the tubes were hermetically closed and the contents homogenized by manual stirring for sixty seconds. A positive control, without the addition of ITA and CAP, was also performed. The samples were stored at room temperature for a period of 8 days to determine Salmonella survival.

0046 As determinações de Salmonella foram realizadas, em duplicata, nos tempos de estocagem 0, 2, 4, 6 e 8 dias. Para isso, lOg de ração foram diluídas em 90mL de água peptonada a um por cento (Kasvi, Itália), e homogeneizadas em Stomacher (Iul Instruments, Barcelona, Spain) por trinta segundos. As amostras foram posteriormente pré-incubadas em estufa a 37°C por uma hora, para permitir a recuperação de células bacterianas injuriadas. Para o procedimento de contagem de células viáveis, as amostras foram submetidas a diluições decimais seriadas em tubos com lOmL de água peptonada um décimo percentual. A semeadura das diluições foi realizada em placas com Agar Xilose-Lisina Deoxicolato (XLD) (HiMedia, Itália), incubadas em estufa a 37°C por 24h, para posterior contagem de colônias, os resultados foram expressos em log UFC/g.0046 Salmonella determinations were performed, in duplicate, at storage times 0, 2, 4, 6 and 8 days. For that, 10g of feed were diluted in 90mL of one percent pepton water (Kasvi, Italy), and homogenized in Stomacher (Iul Instruments, Barcelona, Spain) for thirty seconds. The samples were then pre-incubated in an oven at 37 ° C for one hour, to allow the recovery of injured bacterial cells. For the viable cell counting procedure, the samples were subjected to serial decimal dilutions in tubes with 10mL of peptoned water one tenth of a percentage. The dilution sowing was performed on plates with Xylose-Lysine Deoxycholate Agar (XLD) (HiMedia, Italy), incubated in a greenhouse at 37 ° C for 24h, for later colony counting, the results were expressed in log CFU / g.

0047 Para a mensuração do pH, amostras de ração com inclusão de isotiocianato de alila e ácido caproico foram coletadas ao final de cada tempo (metodologia adaptada de Krause et al., 1994). Posteriormente, 9,0g de cada ração foram suspensos em lOmL de água deionizada, formando uma massa homogênea. Os valores de pH foram obtidos utilizando um pHmetro.0047 For the measurement of pH, food samples with inclusion of allyl isothiocyanate and caproic acid were collected at the end of each period (methodology adapted from Krause et al., 1994). Subsequently, 9.0 g of each ration were suspended in 10 ml of deionized water, forming a homogeneous mass. The pH values were obtained using a pH meter.

Petição 870170013001, de 24/02/2017, pág. 34/44Petition 870170013001, of 2/24/2017, p. 34/44

13/2013/20

0048 - Experimento 4: Simulação da digestão in vitro de frangos de corte.0048 - Experiment 4: Simulation of in vitro digestion of broilers.

0049 O inóculo foi preparado pela ativação das cepas de Salmonella Enteritidis 9USP, 33SUSP, CRIFS1016 6FP, 56301 e CRIFS em 8mL de caldo TSB incubado por 24h a 37°C. Em seguida, preparou-se o pool de Salmonella em 9,5mL de TSB, adicionando 100pL de das cinco cepas, e incubou-se por 2h a 37°C. O inóculo de Lactobacillus plantarum foi preparado pela ativação de cinco cepas de L. plantarum em 8mL de caldo MRS (Kasvi, Itália), por 24h a 37°C. Em seguida, foi preparado um pool adicionando 100pL de cada cepa em 9,5mL de caldo MRS e incubado em estufa por 2h a 37°C.0049 The inoculum was prepared by activating the strains of Salmonella Enteritidis 9USP, 33SUSP, CRIFS1016 6FP, 56301 and CRIFS in 8mL of TSB broth incubated for 24h at 37 ° C. Then, the pool of Salmonella was prepared in 9.5mL of TSB, adding 100pL of the five strains, and incubated for 2h at 37 ° C. The inoculum of Lactobacillus plantarum was prepared by activating five strains of L. plantarum in 8mL of MRS broth (Kasvi, Italy), for 24h at 37 ° C. Then, a pool was prepared by adding 100pL of each strain in 9.5mL of MRS broth and incubated in an oven for 2h at 37 ° C.

0050 O tratamento contendo 187ppm de ITA e 525ppm de CAP foi selecionado para o teste de simulação da digestão in vitro por ter apresentado o melhor resultado para inibição de Salmonella na ração de frango (fase inicial). Esses antimicrobianos foram previamente adicionados em uma solução mãe contendo 4,8mL de água deionizada esterilizada + 37,5pL de isotiocianato de alila + l,045mL ácido caproico.0050 The treatment containing 187ppm of ITA and 525ppm of CAP was selected for the in vitro digestion simulation test because it showed the best result for inhibiting Salmonella in the chicken diet (initial phase). These antimicrobials were previously added in a stock solution containing 4.8 ml of sterile deionized water + 37.5 ml of allyl isothiocyanate + 1.045 ml of caproic acid.

0051 O modelo da digestão in vitro foi desenvolvido visando reproduzir o processo de digestão que ocorre naturalmente no organismo de frangos de corte. O experimento foi realizado em erlenmeyer de 125mL a temperatura de 41,4°C, mantida com o auxílio de banho-maria com controle de agitação. A digestão foi realizada em cinco etapas que simularam os seguintes compartimentos do sistema digestório de frangos de corte: papo, proventrículo, moela, intestino delgado e intestino grosso, em um tempo total de 4h20min. Os tratamentos foram Tl Controle (ração basal) e T2 ração basal com adição de antimicrobianos (187ppm de ITA e 525ppm de CAP).0051 The in vitro digestion model was developed to reproduce the digestion process that occurs naturally in the broiler organism. The experiment was carried out in a 125mL conical flask at a temperature of 41.4 ° C, maintained with the aid of a water bath with agitation control. Digestion was carried out in five stages that simulated the following compartments of the digestive system of broilers: crop, proventricle, gizzard, small intestine and large intestine, in a total time of 4h20min. The treatments were T1 Control (basal ration) and T2 basal ration with the addition of antimicrobials (187ppm ITA and 525ppm CAP).

0052 Neste compartimento foram utilizados 5,0g de ração, lOmL de água deionizada estéril, ajustando o pH para 6,0 com uma solução de HC1 1M. O tempo de digestão neste compartimento foi de 30 minutos. No mesmo erlenmeyer contendo a solução representativa do papo foi adicionado 25mL de água deionizada autoclavada, ajustado o pH para 2,5 com uma solução 1M de HC1 e adicionadas 3.850U/mL de pepsina (Sigma, USA, Saint Louis). O tempo de permanência nesta0052 In this compartment, 5.0 g of feed, 10 ml of sterile deionized water were used, adjusting the pH to 6.0 with a 1M HCl solution. The digestion time in this compartment was 30 minutes. In the same conical flask containing the representative solution of the crop, 25mL of autoclaved deionized water was added, the pH adjusted to 2.5 with a 1M solution of HCl and 3,850U / ml of pepsin (Sigma, USA, Saint Louis) was added. The length of stay in this

Petição 870170013001, de 24/02/2017, pág. 35/44Petition 870170013001, of 2/24/2017, p. 35/44

14/20 etapa foi de trinta minutos. Foram adicionadas à solução anterior bolas de vidro para a simulação da digestão mecânica que ocorre na moela. Colocou-se o sistema sob agitação de 220rpm, além de ajustar o pH para 3,0 com uma solução 1M de NaHCO₃. O tempo de permanência nesta etapa foi de sessenta minutos. À solução da digestão da moela foram adicionadas 8,0U/mL de pancreatina e 135mg de sais biliares (Sigma, EUA, Saint Louis). Ajustou-se o pH para 6,2, com uma solução de NaHCO₃ 1M. O tempo de permanência nesta etapa foi de cento e vinte minutos. Após o término da simulação da digestão no intestino delgado, o pH da solução foi ajustado para 7,0, através de uma solução 1M de NaHCO₃ O tempo de permanência nesta etapa foi de vinte minutos.14/20 stage was thirty minutes. Glass balls were added to the previous solution to simulate the mechanical digestion that occurs in the gizzard. The system was placed under stirring at 220 rpm, in addition to adjusting the pH to 3.0 with a 1M NaHCO ₃ solution. The residence time in this stage was sixty minutes. To the solution of the gizzard digestion were added 8.0U / mL of pancreatin and 135mg of bile salts (Sigma, USA, Saint Louis). The pH was adjusted to 6.2 with a 1M NaHCO ₃ solution. The time spent in this stage was one hundred and twenty minutes. After the simulation of digestion in the small intestine was finished, the pH of the solution was adjusted to 7.0, using a 1M NaHCO ₃ solution. The residence time in this stage was twenty minutes.

0053 A avaliação do efeito antibacteriano da combinação de 187,5ppm de ITA e 525ppm de CAP foi realizada em diferentes compartimentos simulados do trato digestório de frangos de corte. Para tanto, um pool de Salmonella Enteritidis e um pool de Lactobacillus plantaram pertencentes ao banco de cepas do laboratório de LTPA, foram utilizados. O efeito dos antimicrobianos adicionados na digesta sobre as bactérias testadas foi avaliado pela contagem de células viáveis após a passagem por algumas etapas do processo digestivo.0053 The evaluation of the antibacterial effect of the combination of 187.5ppm ITA and 525ppm CAP was carried out in different simulated compartments of the digestive tract of broilers. For this, a pool of Salmonella Enteritidis and a pool of Lactobacillus planted belonging to the bank of strains of the LTPA laboratory, were used. The effect of the antimicrobials added to the digesta on the tested bacteria was evaluated by counting viable cells after passing through some stages of the digestive process.

0054 No primeiro teste, 50pL do pool de Salmonella Enteritidis contendo aproximadamente 10 UFC/mL foram inoculados em 15mL de digesta, com pH de 6,0, composta de 5g de ração de frango e lOmL de água deionizada estéril, no compartimento que representava o papo. Em seguida, foram adicionados à digesta 150pL de solução mãe contendo 187,5ppm de ITA e 525ppm de CAP, que permaneceram nessas condições durante trinta minutos. Após o tempo de digestão no proventrículo e no intestino delgado, alíquotas da digesta desses compartimentos foram coletadas para a contagem das células viáveis. No proventrículo, a alíquota correspondeu a um volume de lmL e no intestino delgado, a alíquota foi de lOmL. 0055 No segundo teste, no início da digestão no papo, foram adicionados 150pL de solução mãe contendo 187,5ppm de ITA e 525ppm de CAP em 5g de ração de frango em fase inicial. Após o tempo de digestão no papo, proventrículo e na moela, foi inoculado 50pL do pool de Salmonella Enteritidis com aproximadamente0054 In the first test, 50pL of the Salmonella Enteritidis pool containing approximately 10 CFU / mL was inoculated in 15mL of digesta, with a pH of 6.0, made up of 5g of chicken feed and 10mL of sterile deionized water, in the compartment that represented the chat. Then, 150pL of mother solution containing 187.5ppm ITA and 525ppm CAP were added to the digesta, which remained in these conditions for thirty minutes. After the time of digestion in the proventricle and small intestine, aliquots from the digestion of these compartments were collected to count viable cells. In the proventricle, the aliquot corresponded to a volume of 1mL and in the small intestine, the aliquot was 10mL. 0055 In the second test, at the beginning of digestion in the crop, 150pL of mother solution containing 187.5ppm ITA and 525ppm CAP was added to 5g of chicken feed in the initial phase. After digestion time in the crop, proventriculum and gizzard, 50pL of the Salmonella Enteritidis pool was inoculated with approximately

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UFC/mL em 40mL de digesta e pH de 6,2, no compartimento que representava o intestino delgado, sendo o tempo de permanência das bactérias nessas condições de cento e vinte minutos. Ao término da digestão no intestino delgado uma alíquota da digesta foi coletada para contagem das células viáveis de Salmonella Enteritidis. 0056 A contagem de Salmonella foi realizada pela diluição seriada da amostra em água peptonada 0,1 %. Volumes de 100pL das diluições foram semeados por superfície em placa contendo ágar XLD. As placas foram incubadas em estufa a 37°C por 24h para a posterior contagem de colônias e o resultado expresso em log UFC/mL.CFU / mL in 40mL of digesta and pH of 6.2, in the compartment that represented the small intestine, with the bacteria remaining in these conditions for one hundred and twenty minutes. At the end of digestion in the small intestine, an aliquot of the digesta was collected to count viable Salmonella Enteritidis cells. 0056 Salmonella counting was performed by serial dilution of the sample in 0.1% peptone water. Volumes of 100pL of the dilutions were seeded by surface in a plate containing XLD agar. The plates were incubated in an oven at 37 ° C for 24h for subsequent colony counting and the result expressed in log UFC / mL.

0057 O terceiro teste foi realizado para verificar o efeito da combinação de antimicrobianos sobre a microbiota intestinal benéfica, representada por um poo\ de cepas de L. plantaram. No início da digestão no papo, contendo5 g de ração, foram adicionados 150pL de solução mãe contendo 187,5ppm de ITA e 525ppm de CAP. Após o tempo de digestão nos compartimentos que representavam o papo, proventrículo e moela, foi inoculado o pool de L. plantaram em ± 40mL de digesta com pH ajustado para 6,2, no compartimento que representava o intestino delgado, o tempo de permanência neste compartimento de cento e quarenta minutos. Ao término da digestão no intestino grosso uma alíquota da digesta foi coletada para contagem das células viáveis de Lactobacillus plantarum.0057 The third test was carried out to verify the effect of the combination of antimicrobials on the beneficial intestinal microbiota, represented by a poo \ of L. strains planted. At the beginning of digestion in the crop, containing 5 g of feed, 150pL of stock solution containing 187.5ppm ITA and 525ppm CAP were added. After the digestion time in the compartments that represented the crop, proventriculum and gizzard, the L. pool was inoculated. They planted in ± 40mL of digesta with pH adjusted to 6.2, in the compartment that represented the small intestine, the time of permanence in this one hundred and forty minute compartment. At the end of digestion in the large intestine, an aliquot of the digesta was collected to count the viable cells of Lactobacillus plantarum.

0058 Para realizar a contagem das culturas de L. plantarum, foi realizada diluição seriada da amostra em água peptonada 0,1 %. Em seguida, volumes de l,0mL das diluições foram semeados em profundidade em Agar MRS. As placas foram incubadas em estufa a 37°C por 48h para a posterior contagem das colônias e o resultado expresso em log UFC/mL.0058 To perform the counting of L. plantarum cultures, a serial dilution of the sample in 0.1% peptonated water was performed. Then, 1.0mL volumes of the dilutions were seeded in depth on MRS Agar. The plates were incubated in an oven at 37 ° C for 48h for subsequent colony counting and the result expressed in log UFC / mL.

0059 Os resultados dos tratamentos na ração foram submetidos à análise de variância (ANOVA), e as médias comparadas pelo teste Tukey. Os resultados referentes aos experimentos de digestão simulada foram analisados pelo teste t. Em todas as análises, utilizou-se nível de significância de noventa e cinco por cento (P<0,05) e o programa estatístico Statgraphics® 4.1.0059 The results of the treatments in the diet were submitted to analysis of variance (ANOVA), and the means compared by the Tukey test. The results regarding the simulated digestion experiments were analyzed using the t test. In all analyzes, a significance level of ninety-five percent (P <0.05) and the statistical program Statgraphics® 4.1 were used.

0060 Deste modo, pode-se analisar que, os óleos essenciais, assim como os ácidos0060 In this way, it can be analyzed that essential oils, as well as acids

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16/20 orgânicos apresentaram atividade antibacteriana nas avaliações in vitro contra Salmonella Enteritidis. A menor CIM entre os óleos essenciais foi encontrada para ITA 25ppm, sendo a do carvacrol de 150ppm. Nos testes com os ácidos orgânicos, a menor CIM foi obtida com o ácido caproico 70ppm, sendo a do propiônico de 75ppm.16/20 organisms showed antibacterial activity in in vitro evaluations against Salmonella Enteritidis. The lowest MIC among essential oils was found for ITA 25ppm, with carvacrol being 150ppm. In tests with organic acids, the lowest MIC was obtained with caproic acid 70ppm, with propionic acid being 75ppm.

0061 Foi observado que houve interação entre a associação de 6,25ppm de ITA e 17,5ppm de CAP, com valor de IFIC < 0,5, sendo a menor CIM combinada que teve efeito contra S. Enteritidis. A associação de 12,5ppm de ITA e 75ppm de PROP não apresentou efeito sinérgico. O CV não apresentou efeito sinérgico com os ácidos orgânicos CAP e PROP nas concentrações testadas. Porém, foi observado efeito sinérgico com a associação de 8,75ppm de CAP e 9,37ppm de PROP.0061 It was observed that there was an interaction between the association of 6.25ppm of ITA and 17.5ppm of CAP, with an IFIC value <0.5, with the lowest combined MIC that had an effect against S. Enteritidis. The association of 12.5ppm ITA and 75ppm PROP did not show a synergistic effect. The CV did not show a synergistic effect with the organic acids CAP and PROP in the tested concentrations. However, a synergistic effect was observed with the association of 8.75ppm of CAP and 9.37ppm of PROP.

0062 A combinação de ITA e CAP apresentou efeito sinérgico contra Salmonella Enteritidis, reduzindo consideravelmente a CIM individual de cada antimicrobiano, isto é, a interação de um óleo essencial (ITA) com um ácido orgânico (CAP), com distintos mecanismos de ação antimicrobiano, produziu adição de efeito, potencializando sua ação e reduzindo a resistência bacteriana, indicando que combinação destes compostos pode ter feito contra um amplo espectro de microorganismos em diferentes condições.0062 The combination of ITA and CAP showed a synergistic effect against Salmonella Enteritidis, considerably reducing the individual MIC of each antimicrobial, that is, the interaction of an essential oil (ITA) with an organic acid (CAP), with different mechanisms of antimicrobial action, produced an added effect, potentiating its action and reducing bacterial resistance, indicating what combination of these compounds may have done against a wide spectrum of microorganisms in different conditions.

0063 Foi observada redução significativa (P<0,05) na contagem de Salmonella Enteritidis na ração adicionada da combinação de ITA e CAP. O tratamento T4 diferiu do TI (controle positivo) em todos os dias de análise, e a partir do dia 6 o tratamento T4 reduziu a contagem de Salmonella Enteritidis na ração a níveis indetectáveis.0063 A significant reduction (P <0.05) was observed in the count of Salmonella Enteritidis in the diet added by the combination of ITA and CAP. The T4 treatment differed from the TI (positive control) on all days of analysis, and from day 6 onwards, the T4 treatment reduced the Salmonella Enteritidis count in the diet to undetectable levels.

0064 A ração apresentou pH médio de 5,6 antes da adição dos tratamentos. Foi observada redução significativa nos valores de pH da ração no T4, em comparação aos demais tratamentos no dia 0 e 8 (P<0,05). Nos dias 2, 4 e 6 não houve diferença estatística entre os tratamentos. Em relação ao tempo de análise, foi observado aumento significativo nos valores de pH da ração entre o dia zero e o dia oito nos tratamentos ΤΙ, T2 e T4 e apenas ο T3 manteve seu pH estável durante o período analisado. Os resultados sugerem que provavelmente a volatilização e possível0064 The feed had an average pH of 5.6 before the addition of treatments. A significant reduction was observed in the pH values of the feed at T4, in comparison to the other treatments on days 0 and 8 (P <0.05). On days 2, 4 and 6 there was no statistical difference between treatments. Regarding the time of analysis, a significant increase in the pH values of the diet was observed between day zero and day eight in treatments ΤΙ, T2 and T4 and only ο T3 maintained its pH stable during the analyzed period. The results suggest that volatilization is probably possible

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17/20 degradação dos compostos, juntamente com a capacidade tamponante da ração, podem ter contribuído para elevação do pH com o passar o tempo.17/20 degradation of the compounds, together with the buffering capacity of the feed, may have contributed to an increase in pH over time.

0065 Nos testes realizados a partir da digestão simulada in vitro com inoculação de Salmonella Enteritidis no início da digestão (papo), utilizando a combinação de ITA e CAP, a contagem de Salmonella Enteritidis no proventrículo foi de 2,26 log UFC/mL no controle Tl e no T2 foi reduzida a níveis indetectáveis (<1,25 log UFC). No intestino delgado, a contagem foi 2,46 log UFC/mL para o Tl e 1,34 log de UFC/mL para ο T2 (Figura 8).0065 In tests performed from simulated in vitro digestion with inoculation of Salmonella Enteritidis at the beginning of digestion (crop), using the combination of ITA and CAP, the count of Salmonella Enteritidis in the proventricle was 2.26 log CFU / mL in the control T1 and T2 was reduced to undetectable levels (<1.25 log CFU). In the small intestine, the count was 2.46 log CFU / mL for Tl and 1.34 log CFU / mL for ο T2 (Figure 8).

0066 A redução de 2,551og UFC/mL de S. Enteritidis (Tl) no proventrículo obtida no presente estudo, foi inferior à relatada por Wali e Beal (2011) em simulação da digestão de frangos sem inclusão de qualquer tratamento, onde observaram redução de 31og UFC/g de S. Typhimurium após exposição ao baixo pH do proventrículo/moela. No entanto, com a adição da combinação de ITA e CAP houve uma redução superior a 3,81 log UFC/ml na população de S. Enteritidis (T2). O baixo pH do proventrículo e da moela funcionam como uma barreira química contra o crescimento bacteriano. Além disso, a acidez destes compartimentos pode ter contribuído para o efeito bacteriostático dos antimicrobianos naturais, pois o ITA apresenta maior eficácia contra bactérias em meio ácido, podendo justificar a redução de S. Enteritidis para níveis indetectáveis com a inclusão de ITA + CAP no proventrículo.0066 The reduction of 2.551og CFU / mL of S. Enteritidis (Tl) in the proventricle obtained in the present study, was lower than that reported by Wali and Beal (2011) in simulation of the digestion of chickens without including any treatment, where they observed a reduction of 31og UFC / g of S. Typhimurium after exposure to the low pH of the proventricle / gizzard. However, with the addition of the combination of ITA and CAP, there was a reduction greater than 3.81 log UFC / ml in the population of S. Enteritidis (T2). The low pH of the proventricle and gizzard act as a chemical barrier against bacterial growth. In addition, the acidity of these compartments may have contributed to the bacteriostatic effect of natural antimicrobials, as ITA is more effective against bacteria in acidic environments, which may justify the reduction of S. Enteritidis to undetectable levels with the inclusion of ITA + CAP in the proventriculum. .

0067 Além da acidez do proventrículo favorecer a diminuição na contagem de Salmonella Enteritidis, outro efeito seria a não dissociação do ácido caproico, mantendo seu caráter lipofílico, penetrando a membrana celular bacteriana de forma passiva para o interior do citoplasma, dissociando-se e liberando íons H⁺, que consequentemente, reduzem o pH intracelular. Este efeito altera as funções normais das células bacterianas, aumentando a difusão dos ácidos para o citoplasma, suprimindo o sistema enzimático, o transporte de nutrientes e a síntese de aminoácidos, ATP e DNA, provocando esgotamento energético e a morte bacteriana.0067 Besides the acidity of the proventricle favoring the decrease in the count of Salmonella Enteritidis, another effect would be the non-dissociation of the caproic acid, maintaining its lipophilic character, passively penetrating the bacterial cell membrane into the cytoplasm, dissociating and releasing ions H ⁺ , which consequently reduce intracellular pH. This effect alters the normal functions of bacterial cells, increasing the diffusion of acids to the cytoplasm, suppressing the enzymatic system, the transport of nutrients and the synthesis of amino acids, ATP and DNA, causing energy depletion and bacterial death.

0068 Pode-se dizer que a combinação de ITA + CAP teve efeito em todo trato0068 It can be said that the combination of ITA + CAP had an effect on every treatment

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18/20 digestório, no entanto, o baixo pH pode fazer com que o grupamento isotiocianato, altamente reativo e com grande potencial eletrofílico presentes na estrutura do ITA, interagisse com a camada lipopolissacarídeo (LPS) das bactérias, alterando seu caráter hidrofóbico, provocando perdas de material citoplasmático por extravasamento. O ITA pode reagir com proteínas e enzimas no interior das células, prejudicando o metabolismo das bactérias e provocando reação de oxidação e hidroxilação de DNA, RNA, proteínas, lipídios e enzimas, resultando em morte celular bacteriana. O ITA também pode inibir sítios de ligações de ATP e de PATPase em bactérias, reduzindo o consumo de oxigênio e o teor de ATP intracelular.However, the low pH can cause the isothiocyanate group, highly reactive and with great electrophilic potential present in the structure of the ITA, to interact with the lipopolysaccharide layer (LPS) of the bacteria, changing its hydrophobic character, causing losses of cytoplasmic material by extravasation. ITA can react with proteins and enzymes inside the cells, impairing the metabolism of bacteria and causing an oxidation and hydroxylation reaction of DNA, RNA, proteins, lipids and enzymes, resulting in bacterial cell death. ITA can also inhibit ATP and PATPase binding sites in bacteria, reducing oxygen consumption and intracellular ATP content.

0069 Na simulação da digestão no intestino delgado (pH 6,2), houve menor (l,121og UFC/mL) redução das células de S. Enteritidis entre TI e T2 quando comparado à redução observada no proventrículo, além disso, foi observado uma recuperação das células bacterianas. Uma explicação para este fato é que após passagem pelo proventrículo as células viáveis não cultiváveis de Salmonella Enteritidis, quando em condições favoráveis de pH no intestino delgado voltaram a crescer.0069 In the simulation of digestion in the small intestine (pH 6.2), there was less (1.121 g UFC / mL) reduction of S. Enteritidis cells between TI and T2 when compared to the reduction observed in the proventricle, in addition, a recovery of bacterial cells. An explanation for this fact is that after passing through the proventricle the viable non-cultivable cells of Salmonella Enteritidis, when under favorable conditions of pH in the small intestine they started to grow again.

0070 Em outro teste realizado in vitro, com inoculação de Salmonella Enteritidis e Lactobacillus plantaram separadamente no momento da digestão no intestino delgado, utilizando a mesma combinação (187,5ppm de ITA e 525ppm de CAP), foi observado, após cento e vinte minutos neste compartimento, redução significativa (P<0,05) de 1,11 log UFC/mL de Salmonella Enteritidis, em relação ao Tl, contudo não foi observada diferença significativa (0,53 log UFC/mL) entre os tratamentos na contagem de Lactobacillus plantarum.0070 In another test performed in vitro, with inoculation of Salmonella Enteritidis and Lactobacillus, they planted separately at the time of digestion in the small intestine, using the same combination (187.5ppm ITA and 525ppm CAP), it was observed, after one hundred and twenty minutes in this compartment, significant reduction (P <0.05) of 1.11 log CFU / mL of Salmonella Enteritidis, in relation to Tl, however no significant difference was observed (0.53 log CFU / mL) between treatments in the Lactobacillus count plantarum.

0071 De acordo com o que foi observado, a utilização de um modelo in vitro para simular o trato digestório de frangos de corte permitiu avaliar o efeito antimicrobiano dos compostos naturais ITA e CAP. Os resultados obtidos, como a inibição do crescimento de Salmonela Enteritidis na ração e no trato gastrintestinal, indicam que os antimicrobianos naturais podem vir a substituir o uso de antibióticos convencionais, contribuindo para melhorias no desempenho zootécnico de frangos0071 According to what was observed, the use of an in vitro model to simulate the digestive tract of broilers allowed to evaluate the antimicrobial effect of the natural compounds ITA and CAP. The results obtained, such as the inhibition of the growth of Salmonella Enteritidis in the feed and in the gastrointestinal tract, indicate that natural antimicrobials may come to replace the use of conventional antibiotics, contributing to improvements in the zootechnical performance of chickens

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19/20 de corte, principalmente na fase inicial, reduzindo os riscos de contaminação por bactérias.19/20 cutting, mainly in the initial phase, reducing the risk of contamination by bacteria.

0072 O tratamento de óleo essencial de isotiocianato de alila (ITA) e ácido orgânico de cadeia média capróico (CAP) é eficaz no controle de Salmonella Enteritidis na ração de frangos, apresentando efeito sinérgico do isotiocianato de alila (ITA) e ácido orgânico de cadeia média capróico (CAP) contra a Salmonella Enteritidis in vivo. Deste modo, apresenta-se como uma alternativa bastante eficaz para reduzir a contaminação em rações animais, podendo evitar perdas econômicas provocadas por doença relacionadas à Salmonella Enteritidis em aves e, consequentemente em humanos.0072 The treatment of alila isothiocyanate essential oil (ITA) and organic medium chain caprylic acid (CAP) is effective in the control of Salmonella Enteritidis in chicken feed, presenting a synergistic effect of alila isothiocyanate (ITA) and organic acid of chain caprylic mean (CAP) against Salmonella Enteritidis in vivo. In this way, it presents itself as a very effective alternative to reduce contamination in animal feed, being able to avoid economic losses caused by disease related to Salmonella Enteritidis in birds and, consequently, in humans.

0073 Na simulação da digestão in vitro, a combinação de isotiocianato de alila (ITA) e de ácido capróico (CAP) reduz a contagem de Salmonella Enteritidis no proventrículo e no intestino delgado, sem afetar a contagem de Lactobacillus plantaram após o trânsito intestinal. Os resultados obtidos com os estudos in vitro, sugerem que esses compostos apresentam potencial para reduzir a colonização de bactérias patogênicas no trato gastrintestinal in vivo contribuindo para a saúde do intestino dos animais, proporcionando melhorias nos índices produtivos de frangos de corte.0073 In the simulation of in vitro digestion, the combination of allyl isothiocyanate (ITA) and capronic acid (CAP) reduces the count of Salmonella Enteritidis in the proventricle and small intestine, without affecting the count of Lactobacillus planted after intestinal transit. The results obtained with in vitro studies suggest that these compounds have the potential to reduce the colonization of pathogenic bacteria in the gastrointestinal tract in vivo, contributing to the health of the animals' intestines, providing improvements in the production rates of broilers.

0074 Deste modo, a presente composição antimicrobiana natural apresenta-se com potencial para a sua implantação no mercado, favorecendo o sistema produtivo de frangos de corte e aumentando a segurança alimentar da cadeia, uma vez que reduz a população de Salmonella Enteritidis, sem afetar a população de Lactobacillus plantaram no trato gastrintestinal simulado.0074 In this way, the present natural antimicrobial composition has the potential for its implantation in the market, favoring the production system of broilers and increasing the food security of the chain, since it reduces the population of Salmonella Enteritidis, without affecting the Lactobacillus population planted in the simulated gastrointestinal tract.

0075 A composição antimicrobiana natural à base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis apresenta como vantagens específicas: utilizada como antimicrobiano; melhora a conversão alimentar; reduz lesões no trato digestório; eficaz contra micro-organismos resistentes a antibióticos contribuindo para a saúde intestinal; previne infecções e melhora o desempenho de grãos e rações; gera aumento no ganho de peso e melhora na conversão alimentar; gerar maior eficiência contra bactérias em meios mais ácidos; o baixo pH favorece a0075 The natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid to control Salmonella Enteritidis has the following specific advantages: used as an antimicrobial; improves feed conversion; reduces lesions in the digestive tract; effective against antibiotic-resistant microorganisms contributing to intestinal health; prevents infections and improves the performance of grains and feed; it increases weight gain and improves feed conversion; generate greater efficiency against bacteria in more acidic media; the low pH favors

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20/20 não dissociação dos ácidos, mantendo seu carácter lipofílico; e pode ser adicionado a rações de frangos de corte para eliminar organismos patogênicos e melhorador o desempenho animal (aditivo).20/20 no dissociation of acids, maintaining their lipophilic character; and can be added to broiler diets to eliminate pathogenic organisms and improve animal performance (additive).

0076 Por tudo que foi exposto, trata-se de uma composição antimicrobiana que será bem recebida pelos avicultores em geral, assim como pelos consumidores de aves em geral, pois a presente composição antimicrobiana natural à base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis apresenta inúmeras vantagens, tais como: grande segurança, confiabilidade e agilidade na obtenção e nas aplicações; grande resistência e durabilidade geral, aliado a um baixo grau de deterioração; grande rendimento e desempenho na sua aplicação em virtude de sua concepção geral; elevado conforto, comodidade e segurança aos usuários; custos totalmente acessíveis, o que possibilita uma ótima relação custo/benefício; prática e segura utilização por quaisquer usuários; grande faixa de alcance; perfeita e direta adaptação aos mais diversos tipos de rações; baseada no conceito de ecologicamente correta; e a certeza de se ter uma composição antimicrobiana que atenda plenamente as legislações e normas vigentes e as condições básicas necessárias a sua aplicação.0076 For all that has been exposed, it is an antimicrobial composition that will be well received by poultry farmers in general, as well as by poultry consumers in general, since the present natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid to control Salmonella Enteritidis has numerous advantages, such as: great security, reliability and agility in obtaining and in applications; great resistance and general durability, combined with a low degree of deterioration; great performance and performance in its application due to its general design; high comfort, convenience and safety to users; fully accessible costs, which allows an excellent cost / benefit ratio; practical and safe use by any users; wide range; perfect and direct adaptation to the most diverse types of rations; based on the concept of ecologically correct; and the certainty of having an antimicrobial composition that fully complies with the laws and regulations in force and the basic conditions necessary for its application.

0077 Todos estes atributos permitem classificar esta composição antimicrobiana natural a base de óleo essencial e ácido orgânico para controle de Salmonella Enteritidis como um meio totalmente versátil, eficiente, prático e seguro para ser aplicado diretamente no controle de Salmonella Enteritidis em uma vasta gama de rações animais e no trato digestórios dos mais diversos tios de aves, primordialmente frangos de corte, pelos mais variados usuários e nos mais diversos tipos de locais, independente das características gerais, que estas possam apresentar, sendo ainda de grande facilidade de aplicação e manuseio, aliada ao grande desempenho e excelentes características gerais; contudo as quantidades podem variar de acordo com as necessidades de uso.0077 All these attributes make it possible to classify this natural antimicrobial composition based on essential oil and organic acid to control Salmonella Enteritidis as a totally versatile, efficient, practical and safe way to be applied directly in the control of Salmonella Enteritidis in a wide range of animal feeds and in the digestive tract of the most diverse uncles of birds, primarily broiler chickens, by the most varied users and in the most diverse types of locations, regardless of the general characteristics that they may present, and it is still very easy to apply and handle, combined with great performance and excellent general characteristics; however, the quantities may vary according to the needs of use.

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Claims

1. / 'NATURAL ANTIMICROBIAL COMPOSITION BASED ON ESSENTIAL OIL AND ORGANIC ACID FOR THE CONTROL OF SALMONELLA ENTERITIDIS, characterized by being comprised of a natural antimicrobial composition based on defined proportions of essential oils (OE) and organic acids (AO), being the formulation and, consequently, the quantities used, based directly on the applications for which they are intended.

2.) NATURAL ANTIMICROBIAL COMPOSITION BASED ON ESSENTIAL OIL AND ORGANIC ACID FOR THE CONTROL OF SALMONELLA ENTERITIDIS, according to claim 1 and characterized by being comprised of a natural antimicrobial composition in which the essential oil (OE) is allyl isothiocyanate ( ITA) and medium chain organic acid (AO) is capróic acid (CAP), maintaining all other characteristics inherent to the natural antimicrobial composition.

3. / 'NATURAL ANTIMICROBIAL COMPOSITION BASED ON ESSENTIAL OIL AND ORGANIC ACID FOR THE CONTROL OF SALMONELLA ENTERITIDIS, according to claims 1 and 2 and characterized by being comprised of a natural antimicrobial composition in which its general composition is based on an inhibitory concentration minimum (MIC) consisting of approximately 6.25ppm of allyl isothiocyanate (ITA) el, 5mM of caprylic acid (CAP) for a synergy with IFIC of 0.4, maintaining all other characteristics inherent to the natural antimicrobial composition.

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