BR102017001381A2

BR102017001381A2 - synthetic peptides, method and kit for diagnosis of bovine leptospirosis, and use

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Publication number: BR102017001381A2
Application number: BR102017001381-2A
Authority: BR
Inventors: Menezes Souza Daniel; Antônio Ferraz Coelho Eduardo; Emanuele Costa Lourena; Maria Ravena Severino Carvalho Ana; Costa Duarte Mariana; Mendes Roatt Bruno; Monteiro De Moura Franco Dênia; Caetano Garcia Guilherme; Fernandes Costa E Silva Matheus; Antônio De Oliveira Silva Tiago; Resende Bittar Eustáquio; Ferreira Figueiredo Bittar Joely
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais; Sociedade Educacional Uberabense
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2018-08-14

Abstract

peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leptospirose bovina, e uso. a presente tecnologia trata de 24 (vinte e quatro) peptídeos altamente específicos e reativos com soros de animais com leptospirose bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da leptospirose bovina, que utilizam como antígenos os 24 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados; ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.synthetic peptides, method and kit for diagnosis of bovine leptospirosis, and use. the present technology deals with 24 (twenty-four) highly specific peptides reactive with bovine leptospirosis animal sera, as well as a method and kit for the diagnosis of bovine leptospirosis, which use the 24 peptides in synthetic form as antigens, isolated or associated; or bacteriophage clones expressing such peptides, isolated or associated.

Description

(54) Título: PEPTÍDEOS SINTÉTICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE BOVINA, E USO (51) Int. Cl.: C07K 7/06; C07K 14/20; G01N 33/543; G01N 33/569 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS, SOCIEDADE EDUCACIONAL UBERABENSE (72) Inventor(es): DANIEL MENEZES SOUZA; EDUARDO ANTÔNIO FERRAZ COELHO; LOURENA EMANUELE COSTA; ANA MARIA RAVENA SEVERINO CARVALHO; MARIANA COSTA DUARTE; BRUNO MENDES ROATT; DÊNIA MONTEIRO DE MOURA FRANCO; GUILHERME CAETANO GARCIA; MATHEUS FERNANDES COSTA E SILVA; TIAGO ANTÔNIO DE OLIVEIRA SILVA; EUSTÁQUIO RESENDE BITTAR; JOELY FERREIRA FIGUEIREDO BITTAR (85) Data do Início da Fase Nacional:(54) Title: SYNTHETIC PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, AND USE (51) Int. Cl .: C07K 7/06; C07K 14/20; G01N 33/543; G01N 33/569 (73) Holder (s): FEDERAL UNIVERSITY OF MINAS GERAIS, UBERABENSE EDUCATIONAL SOCIETY (72) Inventor (s): DANIEL MENEZES SOUZA; EDUARDO ANTÔNIO FERRAZ COELHO; LOURENA EMANUELE COSTA; ANA MARIA RAVENA SEVERINO CARVALHO; MARIANA COSTA DUARTE; BRUNO MENDES ROATT; DENIA MONTEIRO DE MOURA FRANCO; GUILHERME CAETANO GARCIA; MATHEUS FERNANDES COSTA E SILVA; TIAGO ANTÔNIO DE OLIVEIRA SILVA; EUSTÁQUIO RESENDE BITTAR; JOELY FERREIRA FIGUEIREDO BITTAR (85) Date of the Start of the National Phase:

23/01/2017 (57) Resumo: PEPTÍDEOS SINTÉTICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE BOVINA, E USO. A presente tecnologia trata de 24 (vinte e quatro) peptídeos altamente específicos e reativos com soros de animais com leptospirose bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da leptospirose bovina, que utilizam como antígenos os 24 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados; ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.23/01/2017 (57) Abstract: SYNTHETIC PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, AND USE. This technology treats 24 (twenty-four) highly specific peptides and reactive with sera from animals with bovine leptospirosis, in addition to a method and kit for the diagnosis of bovine leptospirosis, which use the 24 peptides as antigens in synthetic form, isolated or associated; or clones of bacteriophages expressing such peptides, isolated or associated.

ELISA-PRSTSHL Curva ROC-PRSTSHLELISA-PRSTSHL ROC-PRSTSHL curve

1/17 “PEPTÍDEOS SINTÉTICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE BOVINA, E USO” [001] A presente tecnologia trata de 24 (vinte e quatro) peptídeos altamente específicos e reativos a soros de animais com leptospirose bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da leptospirose bovina, que utilizam como antígenos os 24 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados; ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.1/17 “SYNTHETIC PEPTIDES, METHOD AND KIT FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, AND USE” [001] The present technology treats 24 (twenty four) highly specific peptides and reactive to sera from animals with bovine leptospirosis, in addition to a method and a kit for the diagnosis of bovine leptospirosis, which uses the 24 peptides in synthesis, isolated or associated, as antigens; or clones of bacteriophages expressing such peptides, isolated or associated.

[002] A leptospirose é uma doença amplamente distribuída, e, por conseguinte, de grande importância mundial. A doença já foi diagnosticada em todos os continentes, mas na Ásia, África e América Latina a prevalência é maior, uma vez que nestes continentes as condições ambientais favorecem a perpetuação do agente etiológico. É causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira spp. e acomete principalmente animais de produção como caprinos, ovinos, suínos, equinos e bovinos. (Brasil. Manual de Leptospirose. 2^a ed. Fundação Nacional de Saúde, Ministério da Saúde, Brasília. 98p. 1995; Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia Leptospirose: Diagnóstico e Manejo Clínico/Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, 2009). As consequências econômicas da leptospirose na produção animal podem ser grandes, perda esta causada por transtornos reprodutivos nos animais infectados, tais como abortos, nascimento de crias fracas e diminuição da produção leiteira (Cervantes, L. P. M. et al. 2002. Estudio serológico de leptospirosis bovina en México. Revista Cubana de Medicina Tropical. v.54 n .1, p. 24-27, 2002).[002] Leptospirosis is a widely distributed disease, and therefore of great worldwide importance. The disease has already been diagnosed on all continents, but in Asia, Africa and Latin America the prevalence is higher, since in these continents environmental conditions favor the perpetuation of the etiological agent. It is caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira spp. and mainly affects livestock such as goats, sheep, pigs, horses and cattle. (Brazil Leptospirosis Manual 2nd ed National Health Foundation, Ministry of Health, Brasilia 98p 1995; Brazil Ministry of Health Secretariat of Health Surveillance Leptospirosis Guide..... Diagnosis and Clinical Management / Ministry of Health,... Health Surveillance Secretariat, 2009). The economic consequences of leptospirosis in animal production can be great, a loss caused by reproductive disorders in infected animals, such as abortions, birth of weak offspring and decreased milk production (Cervantes, LPM et al. 2002. Serological study of bovine leptospirosis en Mexico, Revista Cubana de Medicina Tropical. V.54 n .1, p. 24-27, 2002).

[003] As bactérias do gênero Leptospira apresentam morfologia espiralada e por isso são também chamadas de espiroquetas. Atualmente, são reconhecidas duas espécies neste gênero, a Leptospira biflexa, que compreende os microorganismos não patogênicos do gênero; e Leptospira[003] Bacteria of the genus Leptospira have spiral morphology and are therefore also called spirochetes. Currently, two species in this genus are recognized, Leptospira biflexa, which comprises the non-pathogenic microorganisms of the genus; and Leptospira

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 22/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 22/50

2/17 interrogans, que engloba de mais de 200 sorovariedades diferentes e que são patogênicas, sendo essas agrupadas em sorogrupos segundo o grau de similaridade entre as elas. Nos bovinos brasileiros, a doença é endêmica e os principais sorotipos encontrados são Hardjo, Wolffi, Pomona, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae e Canicola (Favero, M. et al. Leptospirose bovina: variantes sorológicas predominantes em colheitas efetuadas no período de 1984 a 1997 em rebanhos de 21 estados do Brasil. Arquivos Instituto Biológico, São Paulo, v.68, n.2, p.29-35, 2001; Lilenbaum, W. et. al. Factors associated with bovine leptospirosis in Rio de Janeiro, Brazil Research in Veterinary Science v.75, p.249-251, 2003; Araújo, V.E.M. et al. Frequência de aglutininas anti-Leptospira interrogans em soros sanguíneos de bovinos, em Minas Gerais, de 1980 a 2002. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia v.57, n.4, p.430-435, 2005).2/17 interrogans, which comprises more than 200 different serovarieties and are pathogenic, which are grouped into serogroups according to the degree of similarity between them. In Brazilian cattle, the disease is endemic and the main serotypes found are Hardjo, Wolffi, Pomona, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae and Canicola (Favero, M. et al. Bovine leptospirosis: serological variants prevalent in harvests from 1984 to 1997 in herds from 21 states in Brazil Archives Instituto Biológico, São Paulo, v.68, n.2, p.29-35, 2001; Lilenbaum, W. et. al. Factors associated with bovine leptospirosis in Rio de Janeiro, Brazil Research in Veterinary Science v.75, p.249-251, 2003; Araújo, VEM et al. Frequency of anti-Leptospira interrogans agglutinins in bovine blood serum, in Minas Gerais, from 1980 to 2002. Brazilian Archive of Veterinary Medicine and Animal Science v .57, n.4, p.430-435, 2005).

[004] A sintomatologia clínica da leptospirose nos bovinos é ampla, e depende da forma como a doença se manifesta. Na fase subclínica, que acomete animais não gestantes e não lactentes não há presença de sinais clínicos. Na fase aguda, onde há febre, anorexia, hemoglobinúria e podem ocorrer abortos, e na fase crônica, onde há abortos de animais em terço final de gestação, hemoglobinúria, distúrbios reprodutivos, crias natimortas, nascimento de crias fracas, redução na produção de leite, queda de fertilidade e aumento do intervalo entre partos. Na fase crônica, por conta da gama de sinais clínicos, a leptospirose é mais claramente observada (Ellis, W. A. Leptospirosis as a cause of reproductive failure. Veterinary Clinical. North America: Food Animal Practice, v.10, p.463-78, 1994).[004] The clinical symptomatology of leptospirosis in cattle is wide, and depends on how the disease manifests itself. In the subclinical phase, which affects non-pregnant and non-nursing animals, there are no clinical signs. In the acute phase, where there is fever, anorexia, hemoglobinuria and abortions can occur, and in the chronic phase, where there are abortions of animals in the final third of gestation, hemoglobinuria, reproductive disorders, stillborn pups, birth of weak pups, reduction in milk production , drop in fertility and increased interval between births. In the chronic phase, due to the range of clinical signs, leptospirosis is more clearly observed (Ellis, WA Leptospirosis as a cause of reproductive failure. Veterinary Clinical. North America: Food Animal Practice, v.10, p.463-78, 1994).

[005] Do ponto de vista epidemiológico, ratos desempenham um papel importante como vetores naturais e reservatórios mais em meios urbanos quando comparado aos meios rurais, uma vez que no meio rural, os bovinos infectados tornam-se reservatórios da Leptospira, contaminando[005] From an epidemiological point of view, rats play an important role as natural vectors and reservoirs more in urban environments when compared to rural areas, since in rural areas, infected cattle become Leptospira reservoirs, contaminating

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 23/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 23/50

3/17 outros animais e homem que entrem em contato secreções. O contato com urina ou órgãos de animais infectados pode desencadear a infecção. A infecção também pode ocorrer via mamária, transplacentária ou mesmo pelo hábito de limpeza de genitálias que os animais apresentam (Guimarães, M.C. Epidemiologia e controle da leptospirose em bovinos: papel de portador e seu controle terapêutico. Revista Faculdade Medicina Veterinária Zootecnia.USP, v.6/7, p. 21-34, 1982; Brasil, Manual de Leptospirose. 2^a ed. Fundação Nacional de Saúde, Ministério da Saúde, Brasília. p. 98, 1995).3/17 other animals and humans that come into contact with secretions. Contact with urine or organs of infected animals can trigger the infection. The infection can also occur via breast, transplacental or even by the habit of cleaning the genitalia that the animals present (Guimarães, MC Epidemiology and control of leptospirosis in cattle: carrier role and its therapeutic control. Revista Faculdade Medicina Veterinária Zootecnia.USP, v .6 / 7, p 21-34, 1982;. Brazil, Leptospirosis Manual 2nd ed National Health Foundation, Ministry of Health, Brasilia p 98, 1995).....

[006] O diagnóstico da leptospirose bovina compreendem anamnese e exame clínico, além de histórico de vacinação do rebanho. O diagnóstico direto pode ser realizado a partir de amostras oriundas de animais mortos, porém exige-se que as amostras sejam encaminhadas o mais breve possível para o laboratório para serem fixadas e coradas com prata. Tal método facilita a pesquisa histológica do agente especialmente em amostras de fígado e rim. O diagnóstico também pode ser por cultivo de amostras de urina, líquor, amostras de fetos abortados, e conteúdos de rins, fígado e baço, porém tal maneira diagnóstica corre sérios riscos de confiabilidade, uma vez que as chances das amostras encaminhadas ao laboratório estarem contaminadas é muito grande. O diagnóstico indireto pode ser realizado pela técnica de aglutinação microscópica rápida. Consiste observar aglutinação de soros de animais a serem testados com diferentes sorotipos de Leptospira após o período de incubação de uma hora em microplacas de 96 poços. Estes sorotipos são mantidos no laboratório em repiques semanais em meio Stuart ou TPB (Triphtose Phosphate Broth). Cepas podem ser incluídas em cada laboratório e região diferentes, dependendo de como é a situação epidemiológica regional. Após o período de incubação, as placas são observadas em microscópio e aquelas que apresentam aglutinação na diluição de 1:100 são consideradas[006] The diagnosis of bovine leptospirosis includes anamnesis and clinical examination, in addition to a history of vaccination of the herd. The direct diagnosis can be made from samples from dead animals, however it is required that the samples be sent as soon as possible to the laboratory to be fixed and stained with silver. This method facilitates histological research of the agent, especially in liver and kidney samples. The diagnosis can also be made by cultivating samples of urine, CSF, samples of aborted fetuses, and contents of kidneys, liver and spleen, however such a diagnostic way runs serious risks of reliability, since the chances of the samples sent to the laboratory are contaminated It's very big. The indirect diagnosis can be performed using the fast microscopic agglutination technique. It consists of observing agglutination of animal sera to be tested with different Leptospira serotypes after the one-hour incubation period in 96-well microplates. These serotypes are maintained in the laboratory in weekly peaks in Stuart or TPB (Triphtose Phosphate Broth) medium. Strains can be included in each different laboratory and region, depending on the regional epidemiological situation. After the incubation period, the plates are observed under a microscope and those that show agglutination at a dilution of 1: 100 are considered

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 24/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 24/50

4/17 positivas. É um diagnóstico de fácil realização, porém necessita-se pessoal treinado, e a interpretação dos resultados é de acordo com o olhar do veterinário responsável podem ser empregados, embora menos frequente, no diagnóstico da leptospirose são eles a fixação de complemento, imunofluorescência indireta e ELISA. Embora alguns estudos demonstrem vantagens destes métodos em comparação ao teste de aglutinação microscópica, em regiões onde a vacinação é comumente realizada podem ocorrer resultados falso-positivos (Araújo, V.E.M. et al. Frequência de aglutininas anti-Leptospira interrogans em soros sanguíneos de bovinos, em Minas Gerais, de 1980 a 2002, Arq. Bras. Med. Vet. Zootecnia, v.57, n 4, p.430-435, 2005).4/17 positive. It is an easy diagnosis, but trained personnel are required, and the results are interpreted according to the eyes of the responsible veterinarian, although they are less frequent, in the diagnosis of leptospirosis they are complement fixation, indirect immunofluorescence and ELISA. Although some studies demonstrate advantages of these methods in comparison to the microscopic agglutination test, in regions where vaccination is commonly performed, false positive results may occur (Araújo, VEM et al. Frequency of anti-Leptospira interrogans agglutinins in bovine blood serum, in Minas Gerais, from 1980 to 2002, Arq. Bras. Med. Vet. Zootecnia, v.57, n 4, p.430-435, 2005).

[007] Atualmente, não se encontra um teste disponível para o diagnóstico da leptospirose bovina que apresenta todas as características desejáveis de elevadas sensibilidade e especificidade, facilidade de execução e baixo custo. Neste contexto, a tecnologia de phage display, técnica baseada na expressão de peptídeos na superfície externa de bacteriófagos recombinantes, vem sendo utilizada em diversos trabalhos para a pesquisa de novos antígenos, para que sob a forma de clones de bacteriófagos expressando peptídeos de interesse, ou sob a forma dos peptídeos individuais produzidos sinteticamente, possam ser testados para o diagnóstico laboratorial de várias doenças, como nas infecções infecciosa, no câncer e em doenças auto-imunes (Noya, O. et al. Immunodiagnosis of parasitic diseases with synthetic peptides. Curr. Prot. Peptide Sci., v. 4, p. 299-308, 2003; Sartorius R et al. The use of filamentous bacteriophage fd to deliver MAGE-A10 or MAGE-A3 HLA-A2-restricted peptides and to induce strong antitumor CTL responses. J Immunol. 15;180(6). p. 3719-28, 2008). [008] A tecnologia de phage display é baseada na expressão de peptídeos, proteínas ou fragmentos de anticorpos associados a proteínas presentes na superfície externa de bacteriófagos recombinantes. A sequência de[007] Currently, there is no test available for the diagnosis of bovine leptospirosis that has all the desirable characteristics of high sensitivity and specificity, ease of execution and low cost. In this context, the phage display technology, a technique based on the expression of peptides on the external surface of recombinant bacteriophages, has been used in several studies to search for new antigens, so that in the form of bacteriophage clones expressing peptides of interest, or in the form of individual peptides produced synthetically, can be tested for laboratory diagnosis of various diseases, such as infectious infections, cancer and autoimmune diseases (Noya, O. et al. Immunodiagnosis of parasitic diseases with synthetic peptides. Curr Prot. Peptide Sci., V. 4, pp. 299-308, 2003; Sartorius R et al. The use of filamentous bacteriophage fd to deliver MAGE-A10 or MAGE-A3 HLA-A2-restricted peptides and to induce strong antitumor CTL responses. J Immunol. 15; 180 (6). P. 3719-28, 2008). [008] The phage display technology is based on the expression of peptides, proteins or fragments of antibodies associated with proteins present on the external surface of recombinant bacteriophages. The sequence of

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 25/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 25/50

5/17 nucleotídeos codificadora dos peptídeos inseridos é geneticamente fundida a uma sequência codificadora de algumas proteínas do bacteriófago, originando um produto híbrido, que é então exposto na superfície externa das partículas virais (Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, v. 228, p. 1315-1317, 1985). Bibliotecas de bacteriófagos expressando peptídeos exógenos têm sido usadas na identificação de diversos receptores celulares, facilitando a identificação de pequenas moléculas que se ligam com alta afinidade e mimetizam a interação com seus ligantes naturais, bem como na identificação de peptídeos que interagem com anticorpos, sem a necessidade do conhecimento prévio da região antigênica reconhecida pelo anticorpo.5/17 nucleotides encoding the inserted peptides is genetically fused to a sequence encoding some bacteriophage proteins, creating a hybrid product, which is then exposed on the outer surface of the viral particles (Smith GP Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Science, v. 228, p. 1315-1317, 1985). Bacteriophage libraries expressing exogenous peptides have been used in the identification of several cell receptors, facilitating the identification of small molecules that bind with high affinity and mimic the interaction with their natural ligands, as well as in the identification of peptides that interact with antibodies, without the need for prior knowledge of the antigenic region recognized by the antibody.

[009] A identificação dos peptídeos reativos na superfície dos fagos permite sua utilização e/ou a construção sintética posterior dos mesmos, seguida pelo seu emprego nos testes laboratoriais, objetivando o diagnóstico laboratorial e/ou o desenvolvimento de vacinas contra diversas doenças. Entretanto, por meio da realização de pesquisas bibliográficas, não há nenhum trabalho disponível ou publicado na literatura no qual a técnica de phage display foi utilizada para a seleção de novos antígenos diagnósticos utilizando soros de animais infectados pela bactéria causadora da leptospirose bovina.[009] The identification of reactive peptides on the surface of the phages allows their use and / or their subsequent synthetic construction, followed by their use in laboratory tests, aiming at laboratory diagnosis and / or the development of vaccines against various diseases. However, through bibliographic research, there is no work available or published in the literature in which the phage display technique was used for the selection of new diagnostic antigens using sera from animals infected by the bacterium that causes bovine leptospirosis.

[010] O documento de patente PI 1103869-1, intitulado “Meio para diagnóstico laboratorial da leptospirose e vacina contra leptospirose animal”, depositado em 8 de agosto de 2011, trata de um método para diagnóstico e também de vacina para leptospirose. Em relação ao método, a invenção compreende um meio de diagnóstico qualitativo utilizando um “pool” de diferentes cepas de leptospiras, pela técnica de aglutinação macroscópica em placa de vidro, através da detecção de anticorpos IgM e IgG. A tecnologia se diferencia da presente invenção por não compreender[010] Patent document PI 1103869-1, entitled “Laboratory diagnostic means for leptospirosis and vaccine against animal leptospirosis”, deposited on August 8, 2011, deals with a method for diagnosis and also a vaccine for leptospirosis. In relation to the method, the invention comprises a qualitative diagnostic means using a "pool" of different strains of leptospires, by the technique of macroscopic agglutination on a glass plate, through the detection of IgM and IgG antibodies. Technology differs from the present invention in that it does not

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 26/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 26/50

6/17 nenhuma das 24 sequencias de peptídeos descritos no presente pedido, isoladas ou expressas em bacteriófagos. Por necessitar de um “pool” de amostras pré-definido, a técnica do referido pedido de patente dispende mais recursos financeiros e técnicos.6/17 none of the 24 peptide sequences described in the present application, isolated or expressed in bacteriophages. As it requires a pre-defined sample pool, the technique of the aforementioned patent application costs more financial and technical resources.

[011] O documento de patente US2015313982, intitulado “Methods and compositions of protein antigens for the diagnosis and treatment of leptospirosis”, depositado em 12 de dezembro de 2012, trata de proteínas e peptídeos obtidos por técnicas de proteômica utilizados para o diagnóstico e vacina para leptospirose. A tecnologia se diferencia da presente invenção por compreender sequencias diferentes das contidas no presente pedido; além do processo de obtenção de tais sequencias e o método de diagnóstico serem diferentes, não utilizando a técnica de phage display.[011] Patent document US2015313982, entitled “Methods and compositions of protein antigens for the diagnosis and treatment of leptospirosis”, filed on December 12, 2012, deals with proteins and peptides obtained by proteomics techniques used for diagnosis and vaccine for leptospirosis. The technology differs from the present invention in that it comprises sequences different from those contained in the present application; in addition to the process of obtaining such sequences and the diagnostic method being different, not using the phage display technique.

[012] O documento de patente RU2493569, intitulado “Method of diagnostics of leptospirosis in farm animals”, depositado em 21 de agosto de 2012, trata de método de diagnóstico da leptospirose em animais como, por exemplo, os bovinos, através de anticorpos específicos para antígenos de sete sorogrupos de Leptospira. A tecnologia se difere da contida no presente pedido pelo método de detecção ser diferente, por não utilizar nenhum dos antígenos a serem reconhecidos por anticorpos produzidos em soro definidos pelas sequencias contidas na presente invenção; além de não fazer uso da técnica de phage display para obtenção das moléculas para reconhecimento.[012] Patent document RU2493569, entitled “Method of diagnostics of leptospirosis in farm animals”, filed on August 21, 2012, deals with the method of diagnosing leptospirosis in animals, for example, cattle, using specific antibodies for antigens from seven Leptospira serogroups. The technology differs from that contained in the present application in that the detection method is different, in that it does not use any of the antigens to be recognized by antibodies produced in serum defined by the sequences contained in the present invention; besides not using the phage display technique to obtain molecules for recognition.

[013] O documento de patente US2007197432, intitulado “Peptides for preventing, diagnosing and treating animal and/or human leptospirosis”, depositado em 30 de outubro de 2002, trata de sequencias peptídicas utilizadas para o diagnóstico in vitro de cepas de Leptospira. A tecnologia se difere do presente pedido por compreender sequencias diferentes das contidas no presente pedido; além do processo de obtenção de tais[013] Patent document US2007197432, entitled “Peptides for preventing, diagnosing and treating animal and / or human leptospirosis”, filed on October 30, 2002, deals with peptide sequences used for the in vitro diagnosis of Leptospira strains. The technology differs from the present application in that it comprises different sequences than those contained in the present application; beyond the process of obtaining such

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 27/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 27/50

7/17 sequencias e o método de diagnóstico ser diferente, não utilizando a técnica de phage display.7/17 sequences and the diagnostic method is different, not using the phage display technique.

[014] A presente tecnologia trata de 24 peptídeos altamente específicos e reativos com amostras de animais (bovinos) infectados com a bactéria Leptospira interrogans, além de um método e um kit para o diagnóstico da leptospirose bovina, que utilizam como antígenos os 24 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados, ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.[014] The present technology treats 24 highly specific and reactive peptides with samples from animals (cattle) infected with the bacterium Leptospira interrogans, as well as a method and kit for the diagnosis of bovine leptospirosis, which use the 24 peptides as antigens. the synthetic form, isolated or associated, or clones of bacteriophages expressing such peptides, isolated or associated.

[015] No estado da técnica não foi encontrada nenhuma tecnologia para diagnóstico da leptospirose bovina que compreenda o uso desses vinte e quatro peptídeos selecionados pela técnica de phage display descritos na presente invenção. Os 24 peptídeos apresentam acurácia de 100,00% para detectar animais com leptospirose bovina por meio de ensaios sorológicos. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [016] A figura 1 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°1 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[015] In the state of the art, no technology has been found for the diagnosis of bovine leptospirosis that includes the use of these twenty-four peptides selected by the phage display technique described in the present invention. The 24 peptides have 100.00% accuracy to detect animals with bovine leptospirosis through serological tests. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES [016] Figure 1 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 1 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[017] A figura 2 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°2 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[017] Figure 2 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID N ° 2 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[018] A figura 3 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°3 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[018] Figure 3 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID N ° 3 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[019] A figura 4 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°4 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose[019] Figure 4 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID N ° 4 contained in the present technology to the sera of animals with Leptospirosis

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 28/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 28/50

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Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.Bovine, indicated by the results of the ELISA assays and the ROC curve.

[020] A figura 5 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°5 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[020] Figure 5 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 5 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[021] A figura 6 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°6 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[021] Figure 6 represents the sensitivity of the SEQ ID No. 6 peptide contained in the present technology to sera from animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and the ROC curve.

[022] A figura 7 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°7 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[022] Figure 7 represents the sensitivity of the SEQ ID No. 7 peptide contained in the present technology to sera from animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and the ROC curve.

[023] A figura 8 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°8 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[023] Figure 8 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 8 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[024] A figura 9 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°9 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[024] Figure 9 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 9 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[025] A figura 10 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°10 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[025] Figure 10 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 10 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[026] A figura 11 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°11 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose[026] Figure 11 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID N ° 11 contained in the present technology to the sera of animals with Leptospirosis

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 29/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 29/50

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[027] A figura 12 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°12 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[027] Figure 12 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 12 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[028] A figura 13 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°13 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[028] Figure 13 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 13 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[029] A figura 14 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°14 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[029] Figure 14 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID N ° 14 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[030] A figura 15 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°15 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[030] Figure 15 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 15 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[031] A figura 16 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°16 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[031] Figure 16 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 16 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[032] A figura 17 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°17 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[032] Figure 17 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 17 contained in the present technology to sera from animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[033] A figura 18 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°18 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose[033] Figure 18 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 18 contained in the present technology to the sera of animals with Leptospirosis

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[034] A figura 19 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°19 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[034] Figure 19 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 19 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[035] A figura 20 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°20 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[035] Figure 20 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 20 contained in the present technology to the sera of animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[036] A figura 21 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°21 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[036] Figure 21 represents the sensitivity of the SEQ ID No. 21 peptide contained in the present technology to sera from animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[037] A figura 22 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°22 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[037] Figure 22 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 22 contained in the present technology to sera from animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[038] A figura 23 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°23 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[038] Figure 23 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 23 contained in the present technology to sera from animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

[039] A figura 24 representa a sensibilidade do peptídeo SEQ ID N°24 contido na presente tecnologia aos soros de animais com Leptospirose Bovina, indicados pelos resultados dos ensaios de ELISA e pela curva ROC.[039] Figure 24 represents the sensitivity of the peptide SEQ ID No. 24 contained in the present technology to sera from animals with Bovine Leptospirosis, indicated by the results of the ELISA assays and by the ROC curve.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [040] A presente tecnologia trata de 24 (vinte e quatro) peptídeos altamente específicos e reativos a amostras de animais com leptospiroseDETAILED TECHNOLOGY DESCRIPTION [040] The present technology treats 24 (twenty four) highly specific peptides and reactive to samples of animals with leptospirosis

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11/17 bovina, além de um método e um kit para o diagnóstico da leptospirose bovina, que utilizam como antígenos os 24 peptídeos sob a forma sintética, isolados ou associados, ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.11/17 bovine, in addition to a method and kit for the diagnosis of bovine leptospirosis, which use the 24 peptides in synthetic form, isolated or associated, or clones of bacteriophages expressing such peptides, isolated or associated, as antigens.

[041] Mais especificamente, a presente invenção trata dos peptídeos definidos pelas SEQ ID N° 1 a 24, de bacteriófagos capazes de expressar tais peptídeos; e do uso de tais peptídeos e/ou bacteriófagos no diagnóstico da leptospirose bovina.[041] More specifically, the present invention deals with the peptides defined by SEQ ID NO: 1 to 24, with bacteriophages capable of expressing such peptides; and the use of such peptides and / or bacteriophages in the diagnosis of bovine leptospirosis.

[042] O método proposto para o diagnóstico da leptospirose bovina compreende as seguintes etapas:[042] The proposed method for the diagnosis of bovine leptospirosis comprises the following steps:

a. Exposição de uma amostra a pelo menos um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N^o1 a 24, ou a pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando pelo menos um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N^o1 a 24, estando tais peptídeos ou bacteriófagos ligados a um suporte sólido ou a um carreador;The. Exposing a sample to at least one of the peptides defined by amino acid sequence SEQ ID NO 1 to 24 or at least one of bacteriophage clones expressing at least one of the peptides defined by amino acid sequence SEQ ID NO: ^The 1 to 24 such peptides or bacteriophages being attached to a solid support or a carrier;

b. Adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);B. Addition of a secondary antibody or protein, which are conjugated to an enzyme or a marker and which bind to the antibodies in the sample in step (a);

c. Detecção dos anticorpos específicos para leptospirose bovina na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).ç. Detection of antibodies specific for bovine leptospirosis in the sample mentioned in step (a), using reagents capable of detecting the enzyme or marker mentioned in step (b).

[043] Na etapa “a”, as amostras utilizadas são selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.[043] In step “a”, the samples used are selected from the group consisting of blood, serum, plasma and / or other body fluid.

[044] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode ser IgG, IgM, IgA, IgE ou respectivas subclasses; a proteína pode ser a Proteína A e/ou a Proteína G; e a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou à proteína é selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, betagalactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Já o[044] In step “b”, the secondary antibody can be IgG, IgM, IgA, IgE or respective subclasses; the protein can be Protein A and / or Protein G; and the enzyme that is conjugated to the secondary antibody or protein is selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase. The

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12/17 marcador é selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes. Por fim, na etapa “c”, o reagente para detectar a enzima ou o marcador é selecionado do grupo compreendendo qualquer substrato cromógeno que seja reconhecido por alguma das enzimas supracitadas, ou algum dos marcadores supracitados.12/17 marker is selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents. Finally, in step “c”, the reagent to detect the enzyme or the marker is selected from the group comprising any chromogenic substrate that is recognized by any of the aforementioned enzymes, or any of the aforementioned markers.

[045] O kit para o diagnóstico da leptospirose bovina compreende:[045] The kit for the diagnosis of bovine leptospirosis comprises:

a. Suporte sólido ou carreador contendo pelo menos um dos peptídeos sintéticos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N^o1 a 24 ou pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando pelo menos um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N^o1 a 24;The. The solid support or carrier containing at least one synthetic peptide defined by the amino acid sequences SEQ ID NO 1 to 24 or at least one of bacteriophage clones expressing at least one of the peptides defined by amino acid sequence SEQ ID NO: ^The 1 to 24;

b. Anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador;B. Secondary antibody or protein, conjugated to an enzyme or a marker;

c. Reagente para detectar a enzima ou o marcador.ç. Reagent to detect the enzyme or the marker.

[046] O suporte sólido do ítem “a” pode ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno. Preferencialmente, deve consistir em placas de microtitulação de 96 poços, tubos, esferas ou papéis de nitrocelulose e/ou nylon.[046] The solid support of item “a” can be selected from the group of materials comprising nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and / or polystyrene. Preferably, it should consist of 96-well microtiter plates, tubes, spheres or nitrocellulose and / or nylon papers.

[047] No item “b” o anticorpo secundário pode ser IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses e a proteína pode ser a proteína A e/ou proteína G.[047] In item “b” the secondary antibody can be IgG, IgM, IgA, IgE and / or their respective subclasses and the protein can be protein A and / or protein G.

[048] Para os itens “b” e “c”, a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou proteína pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Já o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e/ou quimioluminescentes.[048] For items "b" and "c", the enzyme that is conjugated to the secondary antibody or protein can be selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase. The marker can be selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and / or chemiluminescents.

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 33/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 33/50

13/17 [049] O reagente para detectar a enzima ou o marcador do item “c” pode ser selecionado do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas supracitadas, ou algum dos marcadores supracitados.13/17 [049] The reagent to detect the enzyme or the marker of item “c” can be selected from the group comprising chromogenic substrates that are recognized by any of the aforementioned enzymes, or any of the aforementioned markers.

[050] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes da tecnologia.[050] The present invention can be better understood through the following examples, which do not limit the technology.

EXEMPLO 1. SELEÇÃO DOS BACTERIÓFAGOS PARA O SORODIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE BOVINA [051] Amostras de soros. As seguintes amostras de soro foram utilizadas para a realização dos ciclos de bio-pannings na técnica de phage display e nos ensaios de ELISA para o sorodiagnóstico da leptospirose bovina: soros de animais não-infectados (controle negativo, n=5) e soros de animais infectados pela bactéria causadora da leptospirose bovina (leptospirose, n=5). A seleção dos clones para o diagnóstico sorológico foi realizada utilizando pool de soros de animais não infectados e soro de animais infectados pela bactéria causadora da leptospirose bovina.EXAMPLE 1. BACTERIOPHAGUS SELECTION FOR THE BOVINE LEPTOSPIROSIS SORODIAGNOSIS [051] Serum samples. The following serum samples were used to perform bio-panning cycles using the phage display technique and ELISA assays for bovine leptospirosis serodiagnosis: sera from non-infected animals (negative control, n = 5) and sera from animals infected by the bacterium that causes bovine leptospirosis (leptospirosis, n = 5). The selection of clones for serological diagnosis was performed using pool of sera from uninfected animals and serum from animals infected by the bacterium that causes bovine leptospirosis.

[052] Amplificação e extração do DNA dos bacteriófagos selecionados para o sorodiagnóstico da leptospirose bovina. As colônias de E. coli ER2738 individualizadas contendo os bacteriófagos selecionados foram coletadas para a extração do DNA. Para a amplificação dos fagos, 1,2 mL da cultura de células E. coli ER2738 em fase early-log (OD_600nm~0,3) foram distribuídos em cada poço de uma placa deepwell. Com palitos de dente esterilizados, 96 colônias azuis foram retiradas da placa de Petri e transferidas para a placa de cultura. A cada poço, apenas uma colônia de fago foi adicionada, totalizando 96 colônias na placa. A mesma foi vedada e incubada por 5 horas, sob agitação constante e a 37^oC. Após a incubação, a placa foi centrifugada por 20 minutos a 2.250 x g, sendo o sobrenadante transferindo para outra placa. A essa 2^a placa, foi adicionado PEG/NaCl (1/6 do volume total do sobrenadante), sendo a mesma incubada por 14[052] Amplification and DNA extraction of selected bacteriophages for bovine leptospirosis serodiagnosis. The individualized E. coli ER2738 colonies containing the selected bacteriophages were collected for DNA extraction. For phage amplification, 1.2 mL of the E. coli ER2738 cell culture in early-log phase (OD _600nm ~ 0.3) was distributed into each well of a deepwell plate. With sterile toothpicks, 96 blue colonies were removed from the Petri dish and transferred to the culture dish. To each well, only one phage colony was added, totaling 96 colonies on the plate. It was sealed and incubated for 5 hours, under constant agitation and at 37 ^o C. After incubation, the plate was centrifuged for 20 minutes at 2,250 xg, the supernatant being transferred to another plate. To this 2 ^the plate, PEG / NaCl (1/6 of the total volume of the supernatant) was added, the same being incubated for 14

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14/17 horas e a 4^oC. Após, a placa foi centrifugada por 1 hora, o sobrenadante foi retirado e o precipitado foi ressuspendido em tampão iodeto (10 mM de Tris HCl pH 8.0, 1 mM de EDTA e 4 M de NaI). As placas foram agitadas vigorosamente e, em seguida, adicionou-se etanol absoluto. Após uma incubação de 10 minutos, as placas foram centrifugadas (2.250 x g a 4°C e por 10 minutos), sendo o sobrenadante descartado. O precipitado contendo o DNA foi lavado com 500 pL de etanol 70% e novamente centrifugado. Finalmente, o DNA foi diluído em 20 pL de água ultra-pura e sua qualidade foi avaliada após uma corrida eletroforética realizada em gel de agarose 0,8%, corado com uma solução de brometo de etídio.14/17 hours and at 4 ^o C. Afterwards, the plate was centrifuged for 1 hour, the supernatant was removed and the precipitate was resuspended in iodide buffer (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA and 4 M NaI ). The plates were shaken vigorously and then absolute ethanol was added. After a 10-minute incubation, the plates were centrifuged (2,250 xga at 4 ° C and for 10 minutes), with the supernatant discarded. The precipitate containing the DNA was washed with 500 pL of 70% ethanol and again centrifuged. Finally, the DNA was diluted in 20 pL of ultra-pure water and its quality was assessed after an electrophoretic run performed on 0.8% agarose gel, stained with an ethidium bromide solution.

[053] Sequenciamento dos clones de bacteriófagos selecionados. Com a realização da técnica de ELISA, 24 clones foram selecionados por apresentaram melhor reatividade sorológica para distinção dos soros positivos e negativos para a bactéria causadora da leptospirose bovina. A reação de sequenciamento utilizando o DNA desses fagos foi realizada com 500 ng de DNA de cada fago selecionado, 5 pmol do Primer 96 glII (5'OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'-Biolabs) e o pré-mix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences). A reação de 35 ciclos ocorreu em um termociclador de placas, nas seguintes condições: desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento a 58°C por 15 segundos e extensão a 60°C por 60 segundos. Os amplicons gerados da reação de sequenciamento foram precipitados com 1 pL de acetato de amônio e 27,5 pL de etanol absoluto. A placa foi centrifugada por 45 minutos a 2.432 x g e o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se 150 pL de etanol 70% ao pellet e o material foi centrifugando novamente por 10 min e a 2.432 x g, sendo o sobrenadante descartado. A placa permaneceu invertida sobre um papel toalha e nesta posição foi centrifugada a 486 x g, durante 1 minuto. Em seguida, a placa foi coberta com papel alumínio, permanecendo por 5 minutos, para a evaporação completa do etanol[053] Sequencing of selected bacteriophage clones. With the ELISA technique, 24 clones were selected because they showed better serological reactivity to distinguish positive and negative sera for the bacterium that causes bovine leptospirosis. The sequencing reaction using the DNA of these phages was performed with 500 ng of DNA from each selected phage, 5 pmol of Primer 96 glII (5'OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'-Biolabs) and the pre-mix ( DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences). The reaction of 35 cycles occurred in a plate thermocycler, under the following conditions: denaturation at 95 ° C for 20 seconds, annealing at 58 ° C for 15 seconds and extension at 60 ° C for 60 seconds. The amplicons generated from the sequencing reaction were precipitated with 1 pL of ammonium acetate and 27.5 pL of absolute ethanol. The plate was centrifuged for 45 minutes at 2,432 x g and the supernatant was discarded. 150 pL of 70% ethanol was added to the pellet and the material was centrifuged again for 10 min and at 2,432 x g, the supernatant being discarded. The plate remained inverted on a paper towel and in this position it was centrifuged at 486 x g, for 1 minute. Then, the plate was covered with aluminum foil, remaining for 5 minutes, for complete ethanol evaporation

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 35/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 35/50

15/17 remanescente. O precipitado foi ressuspendido em tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences) e o sequenciamento foi realizado no sequenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences). A dedução in silico das sequências de aminoácidos do DNA dos 24 fagos de interesse, para a identificação dos peptídeos exógenos, foi realizada pelo programa DNA2PRO12, que é designado para a dedução de sequências de insertos das bibliotecas da New England Biolabs (Ph.D.-12TM ou Ph.D.-C7CTM), como de outras bibliotecas de interesse que contenham as sequências inicial e final do vetor. O programa automaticamente localiza a posição do inserto, traduz o mesmo e indica os possíveis erros na tradução (tais como códons inesperados ou erros na sequência próxima). As sequências que não puderam ser traduzidas pelo programa foram analisadas manualmente.Remaining 15/17. The precipitate was resuspended in dilution buffer (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences) and sequencing was performed on the MegaBace 1000 automatic sequencer (Amersham Biosciences). The in silico deduction of the DNA amino acid sequences of the 24 phages of interest, for the identification of exogenous peptides, was performed by the program DNA2PRO12, which is designed for the deduction of insert sequences from the New England Biolabs (Ph.D. -12TM or Ph.D.-C7CTM), as well as other libraries of interest that contain the initial and final vector sequences. The program automatically locates the position of the insert, translates it and indicates possible errors in the translation (such as unexpected codons or errors in the next sequence). The sequences that could not be translated by the program were analyzed manually.

[054] Ensaios de ELISA para seleção de bacteriófagos específicos para diagnóstico da leptospirose bovina. Os 24 clones foram selecionados em um experimento de ELISA utilizando pool de soros negativos e positivos, com o propósito de pré-selecionarmos aqueles com melhor atividade sorodiagnóstica para a leptospirose bovina. Para esse fim, placas de ELISA com 96 poços (Jet Biofil) foram sensibilizadas por 16 horas a 37°C com 100 mL de uma solução contendo 1x10⁹ fagos de cada um dos 24 clones de fagos, sendo diluídos em tampão carbonato/bicarbonato pH 9.6. Após, as placas foram lavadas por 3 vezes com solução de lavagem (PBS 1x e Tween 20 0.05%) e bloqueadas com a solução de bloqueio (BSA 5% diluída em PBS 1x) por 1 hora e a 37°C. Após, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem e amostras contendo pools de soros de animais com leptospirose bovina (pool positivo) e de indivíduos não-infectados (pool negativo) foram adicionadas na diluição de 1:500 diluídas em solução de bloqueio (BSA 5% diluída em PBS 1x). A reação ocorreu por 1 hora e na temperatura de 37°C.[054] ELISA assays for the selection of specific bacteriophages for the diagnosis of bovine leptospirosis. The 24 clones were selected in an ELISA experiment using a pool of negative and positive sera, in order to pre-select those with the best serodiagnostic activity for bovine leptospirosis. For this purpose, 96-well ELISA plates (Jet Biofil) were sensitized for 16 hours at 37 ° C with 100 mL of a solution containing 1x10 ⁹ phages from each of the 24 phage clones, being diluted in carbonate / bicarbonate pH buffer 9.6. Afterwards, the plates were washed 3 times with washing solution (1x PBS and 0.05% Tween 20) and blocked with the blocking solution (5% BSA diluted in 1x PBS) for 1 hour and at 37 ° C. Afterwards, the plates were washed 5 times with washing solution and samples containing pools of sera from animals with bovine leptospirosis (positive pool) and from non-infected individuals (negative pool) were added at a dilution of 1: 500 diluted in blocking solution (5% BSA diluted in PBS 1x). The reaction took place for 1 hour and at 37 ° C.

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 36/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 36/50

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Após, as placas foram lavadas 5 vezes com a solução de lavagem e o anticorpo anti-IgG bovino conjugado à peroxidase (Sigma; diluído 1:10.000 em tampão de incubação) foi acrescentado. A reação foi desenvolvida pela adição de 100 pL de uma solução composta por orto-fenilenodiamino (0,33 mg/mL), 4 pL de H₂O₂ e 10 mL de tampão citrato/fosfato, pH 5,0. Após 30 minutos de incubação ao abrigo da luz, a reação foi interrompida pela adição de 25 mL de ácido sulfúrico 2 N. A leitura das absorbâncias foi realizada no comprimento de onda de 492 nm, em leitor de ELISA (Molecular Devices, Spectra Max Plus, Canada) (Molecular Devices, Spectra Max Plus, Canada).Afterwards, the plates were washed 5 times with the washing solution and the peroxidase-conjugated anti-bovine IgG antibody (Sigma; diluted 1: 10,000 in incubation buffer) was added. The reaction was carried out by adding 100 pL of a solution composed of ortho-phenylenediamine (0.33 mg / mL), 4 pL of H ₂ O ₂ and 10 mL of citrate / phosphate buffer, pH 5.0. After 30 minutes of incubation in the dark, the reaction was stopped by adding 25 mL of 2 N sulfuric acid. The absorbance reading was performed at a wavelength of 492 nm in an ELISA reader (Molecular Devices, Spectra Max Plus , Canada) (Molecular Devices, Spectra Max Plus, Canada).

[055] As reações individuais dos 24 clones frente às amostras de soro dos animais positivos e dos animais não infectados são mostradas na Tabela 1. [056] Tabela 1. Sequências dos 24 clones selecionados e resultados de análises sorológicas obtidas usando os clones de bacteriófagos selecionados expressando cada um dos vinte e quatro peptídeos para o diagnóstico da leptospirose bovina. Abreviaturas: Se: sensibilidade; Ep: especificidade; IC: intervalo de confiança; AUC: área abaixo da curva.[055] The individual reactions of the 24 clones against serum samples from positive and uninfected animals are shown in Table 1. [056] Table 1. Sequences of the 24 selected clones and results of serological analyzes obtained using bacteriophage clones selected expressing each of the twenty-four peptides for the diagnosis of bovine leptospirosis. Abbreviations: If: sensitivity; Ep: specificity; CI: confidence interval; AUC: area below the curve.

Clone Clone Sequência Sequence Cut-off Cut-off Se (%) If (%) IC 95 (%) CI 95 (%) Es (%) Es (%) IC 95 (%) CI 95 (%) Ac (%) Ac (%) AUC AUC IC 95 (%) CI 95 (%) Valor de P P value 1 1 PRSTSHL PRSTSHL 0,2230 0.2230 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,07 47.82-100.07 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0011 p = 0.0011 2 2 NPFCGSR NPFCGSR 0,1859 0.1859 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,06 47.82-100.06 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 3 3 TSPPLHA TSPPLHA 0,3143 0.3143 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,05 47.82-100.05 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 4 4 QSTSGSS QSTSGSS 0,2677 0.2677 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,04 47.82-100.04 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 5 5 FPHLSRY FPHLSRY 0,1708 0.1708 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,03 47.82-100.03 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 6 6 TFLVPLQ TFLVPLQ 0,1290 0.1290 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,02 47.82-100.02 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 7 7 RYVSVAS RYVSVAS 0,1710 0.1710 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,01 47.82-100.01 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 8 8 VLLGPFP VLLGPFP 0,0466 0.0466 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0119 p = 0.0119 9 9 VALLPHH VALLPHH 0,0617 0.0617 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0017 p = 0.0017 10 10 NPFLADP NPFLADP 0,0324 0.0324 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0001 p = 0.0001 11 11 ALTPQLL ALTPQLL 0,1318 0.1318 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 12 12 MSPTYLL MSPTYLL 0,0283 0.0283 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 13 13 FPLFGLS FPLFGLS 0,0355 0.0355 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 14 14 DRAALSL DRAALSL 0,0228 0.0228 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 15 15 VHSPFWP VHSPFWP 0,0400 0.0400 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0119 p = 0.0119 16 16 DLCTQIT DLCTQIT 0,0611 0.0611 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0058 p = 0.0058 17 17 GSRSYPR GSRSYPR 0,0545 0.0545 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 18 18 SPDSLFP SPDSLFP 0,0620 0.0620 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0033 p = 0.0033 19 19 PSPSRFP PSPSRFP 0,0849 0.0849 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0024 p = 0.0024 20 20 DSAFRLK DSAFRLK 0,0642 0.0642 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p < 0,0001 p <0.0001 21 21 AETVESC AETVESC 0,1058 0.1058 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0008 p = 0.0008 22 22 VYSALVE VYSALVE 0,0559 0.0559 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0044 p = 0.0044 23 23 GYSALVE GYSALVE 0,0836 0.0836 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0044 p = 0.0044 24 24 DRRGYGL DRRGYGL 0,0661 0.0661 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 47,82-100,00 47.82-100.00 100,00 100.00 1,00 1.00 1,00-1,00 1.00-1.00 p = 0,0045 p = 0.0045

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 37/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 37/50

17/17 [057] Observa-se na Tabela 1 e nas Figuras 1 a 24 que os 24 clones avaliados foram reconhecidos pelos soros de animais com leptospirose bovina com elevada sensibilidade (100,00%), especificidade (100,00%), acurácia (100,00%) e área abaixo da curva (AUC: 1,00). Cabe ressaltar que esses 24 peptídeos com 100,00% de sensibilidade, especificidade e acurácia, além de obter valor de área abaixo da curva de 1,00, simultaneamente, conseguem identificar os casos positivos de leptospirose sem a ocorrência de resultados falsos positivos e falsos negativos. Dessa forma, apresentam-se como novos antígenos para compor um método e um kit para o diagnóstico sensível e específico da leptospirose bovina.17/17 [057] It is observed in Table 1 and Figures 1 to 24 that the 24 clones evaluated were recognized by the sera of animals with bovine leptospirosis with high sensitivity (100.00%), specificity (100.00%), accuracy (100.00%) and area below the curve (AUC: 1.00). It should be noted that these 24 peptides with 100.00% sensitivity, specificity and accuracy, in addition to obtaining an area value below the 1.00 curve, simultaneously manage to identify positive cases of leptospirosis without the occurrence of false positive and false results negative. Thus, they present themselves as new antigens to compose a method and a kit for the sensitive and specific diagnosis of bovine leptospirosis.

Petição 870170004592, de 23/01/2017, pág. 38/50Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 38/50

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Claims

1. SYNTHETIC PEPTIDES defined by ^the SEQ ID 1 to 24.

2. METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS characterized by understanding the following steps:

a) exposing a sample to at least one of the peptides defined by amino acid sequence SEQ ID NO 1 to 24, or at least one of bacteriophage clones expressing at least one of the peptides defined by amino acid sequence SEQ ID NO: 1 to 24, such peptides or bacteriophages being attached to a solid support or a carrier;

b) Addition of a secondary antibody or a protein, which are conjugated to an enzyme or a marker and which bind to the antibodies in the sample of step (a);

c) Detection of antibodies specific for bovine leptospirosis in the sample mentioned in step (a), using reagents capable of detecting the enzyme or marker mentioned in step (b).

3. METHOD FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, according to claim 2, step “a”, characterized by the samples used being selected from the group consisting of blood, serum, plasma and / or other body fluid.

4. METHOD FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, according to claim 2, step “b”, characterized by the secondary antibody being selected from the group comprising IgG, IgM, IgA, IgE and / or respective subclasses; the protein is preferably Protein A and / or Protein G; the enzyme is selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase; and by the marker being selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents.

Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 39/50

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5. METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, according to claim 2, step “c”, characterized by the detection of the secondary antibody or protein specifically linked to the anti-bacterial antibodies that cause bovine leptospirosis to be carried out using reagents selected from the group comprising substrates chromogens that are recognized by any of the enzymes or any of the markers of claim 4.

6. KIT FOR THE DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS characterized by understanding:

a) solid support or carrier containing at least one synthetic peptide defined by the amino acid sequences SEQ ID NO 1 to 24 or at least one of bacteriophage clones expressing at least one of the peptides defined by amino acid sequence SEQ ID NO: 1 to 24;

b) Secondary antibody or protein, conjugated to an enzyme or a marker;

c) Reagent to detect the enzyme or the marker.

7. KIT FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, according to claim 6, item a, characterized by the solid support being selected from the group of materials comprising nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and / or polystyrene.

8. KIT FOR THE DIAGNOSIS OF BOVINE LEPTOSPIROSIS, according to claim 6, items b and c, characterized by secondary antibodies, proteins, enzymes, markers and reagents being selected from the groups described in claims 4 and 5.

9. USE of synthetic peptides defined in claim 1, characterized by being for the diagnosis and / or kits for the diagnosis of bovine leptospirosis.

Petition 870170004592, of 01/23/2017, p. 40/50

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ELISA-PRSTSHL

DRAWINGS

ROC curve -PRSTSHL

AtJ4J0nm AbiSúnm

The cow

0.45 ¢ .30 ¢ .15

3 = 10C- CC-ΐά

A = -CtCfflá! J-CCC11_ |

¢ .60-1 -, -, Leptospirosis Negative Control

ELISA-NPF CG SR

ELISA-TSPPLHA

0.00

¢ .45

5 0.30 ¢ .15Mtt cc it h ΊΚΚ4 j- = c ccci

166- | B** £ 0- Φ O O 00- Z 40- Φ ç & 20- ¢ -