BR102017000511A2 - nanohidroxiapatita com e sem substituições iônicas associadas a polímeros para liberação controlada de antibiótico - Google Patents

Abstract

nanohidroxiapatita com e sem substituições fónicas associadas a polímeros para liberação controlada de antibiótico a presente invenção proporciona um biocompósito à base de hidroxiapatita ca10(po4)6(oh)2. alginato de sódio e poli-c-caprolactona. 0 produto na forma de pós, grânulos, arcabouços densos e porosos e esferas/rnicroesferas é associado preferencialmente ao agente antimicrobiano cloridrato de vancomicina (c66h75c12n9o24.hci), com o objetivo de promover a regeneração de lesões teciduais e combater infecções microbianas por funcionar como veículo de liberação controlada da substância.

Description

(54) Título: NANOHIDROXIAPATITA COM E SEM SUBSTITUIÇÕES IÔNICAS ASSOCIADAS A POLÍMEROS PARA LIBERAÇÃO

CONTROLADA DE ANTIBIÓTICO (51) Int. Cl.: A61K 47/04; A61K 47/36; A61K 47/34; A61K 31/7028; A61K 9/52; (...) (73) Titular(es): CENTRO BRASILEIRO DE PESQUISAS FÍSICAS, UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO - UFRJ, UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE UFF (72) Inventor(es): ALEXANDRE MALTA ROSSI; CARLOS ALBERTO SORIANO DE SOUZA; MARIA HELENA MIGUEZ ROCHA LEÃO; PRISCILLA VANESSA FINOTELLI; VINÍCIUS SCHOTT GARNEIRO; ALMIR LUIZ ANTUNES JÚNIOR (85) Data do Início da Fase Nacional:

10/01/2017 (57) Resumo: Nanohidroxiapatita com e sem substituições fônicas associadas a polímeros para liberação controlada de antibiótico A presente invenção proporciona um biocompósito à base de hidroxiapatita Cal0(PO4)6(OH)2. alginato de sódio e poli-c-caprolactona. 0 produto na forma de pós, grânulos, arcabouços densos e porosos e esferas/rnicroesferas é associado preferencialmente ao agente antimicrobiano cloridrato de vancomicina (C66H75C12N9O24.HCI), com o objetivo de promover a regeneração de lesões teciduais e combater infecções microbianas por funcionar como veículo de liberação controlada da substância.

M G /16

Nanohidroxiapatita com e sem substituições iônicas associadas a polímeros para liberação controlada de antibiótico

Campo da Invenção [0001] A presente invenção refere-se a um biocompósito reabsorvível a base de hidroxiapatita nanoestruturada [Caio(P04)6(OH)₂], alginato de sódio e poliε-caprolactona, ao seu processo de produção e a um método de liberação controlada de substância antimicrobiana. Mais especificamente, o produto da invenção é associado preferencialmente ao agente antimicrobiano clorídrato de vancomicina (CeeHzõChNgC^HCI), que ao ser liberado de forma controlada, promove a regeneração de lesões teciduais e combate infecções microbianas.

Antecedentes da Invenção [0002] A produção de biomateriais nanoestruturados tem crescido e se diversificado fortemente nos últimos anos devido a demandas das terapias de regeneração tecidual por novas matrizes bioativas e sistemas para carreamento de fatores de crescimento e fármacos (“drug delivery systems”). A tecnologia de liberação controlada de moléculas por materiais biocompatíveis representa uma das fronteiras da ciência com aplicações em diversas vertentes tecnológicas, em especial quando nanopartículas e nanodispositivos são utilizados como agentes carreadores e liberadores.

[0003] No caso do tratamento de lesões ósseas, um dos maiores obstáculos na regeneração tecidual é a presença de microrganismos em tais sítios ou a contaminação bacteriana das áreas afetadas durante os procedimentos terapêuticos. Uma vez que a infecção se forma, um processo inflamatório é deflagrado em resposta, não possibilitando assim a proliferação de células ósseas.

2/16 [0004] Neste contexto, a osteomielite aparece como uma importante patologia. A osteomielite é caracterizada por um processo inflamatório, acompanhado de uma destruição óssea causada por um microrganismo infectante. É uma doença de tratamento complexo e prognóstico variado, que pode ocorrer em qualquer idade, tipo de osso e que apresenta diversas formas clínicas de manifestação. Em função da diversidade de apresentação clínica, são inúmeras as formas de abordar esta patologia. Frequentemente, é necessária a abordagem cirúrgica associada ao uso de antibióticos sistêmicos e locais. [0005] Vários fatores inflamatórios e leucócitos, presentes na área da osteomielite, contribuem para a necrose tecidual e destruição da matriz e do trabeculado ósseo. Os canais vasculares são obstruídos pelo processo inflamatório, resultando em isquemia que também contribui para a necrose óssea. O segmento de osso desprovido de suprimento sanguíneo poderá não se reintegrar ao osso principal, formando um sequestro ósseo, e com isso continuar a abrigar bactérias, apesar do uso do antibiótico sistêmico intravenoso. Devido a esse processo avascular, antibióticos administrados de forma intravenosa e células inflamatórias de defesa não irão atingir a osteomielite, levando à falha do tratamento.

[0006] Staphylococcus aureus é o patógeno mais frequentemente relacionado à osteomielite. O S. aureus tem a capacidade de se organizar na forma de biofilme, que é uma comunidade microbiana composta por espécies distintas ou não, aderidas a uma superfície, tais como os tecidos ósseos, e embebida em uma matriz extracelular intermicrobiana composta principalmente por polissacarídeos e proteínas. A organização microbiana na forma de biofilme funciona como uma barreira para difusão de agentes antimicrobianos e fatores imunológicos, dificultando de forma significativa a eliminação destes microrganismos.

[0007] No tratamento e na profilaxia de tais infecções, diversos dispositivos de liberação local controlada já foram propostos, pela associação de polímeros ou fosfatos de cálcio, e antibióticos. Uma vantagem destes sistemas de liberação local de medicamentos nas infecções ósseas está relacionada ao

3/16 fato de que nestas regiões a circulação sanguínea está prejudicada, o que reduz a concentração de antibióticos utilizados de forma sistêmica, influenciando negativamente sua eficácia. Além disso, a concentração terapêutica dos fármacos é alcançada e mantida a partir de doses muito inferiores àquelas necessárias quando se estabelece o uso de medicações sistêmicas, em função da aplicação do dispositivo diretamente no sítio infectado. Outra vantagem dos sistemas de liberação local é a redução de complicações da terapia por antibiótico sistêmico devido a menores concentrações da droga, o que leva a menores níveis de toxicidade.

[0008] No tratamento de tecidos duros, os fosfatos de cálcio constituem um dos materiais mais utilizados internacionalmente em aplicações médicas envolvendo a substituição e a regeneração ósseas, e mais recentemente como agentes carreadores e liberadores de drogas, justamente por terem como características a biocompatibilidade, a previsibilidade, a facilidade de aplicação clínica, a ausência de riscos transoperatórios, sequelas pósoperatórias mínimas e a aceitação por parte do paciente.

[0009] Dentre eles, a hidroxíapatita (HA - Caio(P0₄)6(OH)2) aparece em destaque por se tratar de um biomaterial nanoestruturado, devido a suas propriedades físico-químicas e biológicas, forte biocompatibilidade com células e tecidos, capacidade de associação com moléculas, íons e metais, estabilidade no meio biológico, atividade osteocondutora e versatilidade no processamento em diferentes formatos e porosidades. Metanálises comprovaram seu papel como substituto ósseo em alguns procedimentos ortopédicos.

[00010] O antibiótico cloridrato de vancomicina (CeeH/sCÇNgC^rHCI) foi preferencialmente selecionado como agente antimicrobiano por ser a droga de primeira escolha no caso de tratamento de osteomielites de origem ortopédica. É um glicopeptídeo que tem como principal mecanismo de ação antibacteriana a inibição da síntese do peptideoglicano constituinte da parede celular das bactérias, causando alteração da permeabilidade da membrana citoplasmática. Recentemente foi observado também que este antibiótico

4/16 desencadeia uma interferência na síntese de RNA nas amostras de S. aureus. A vancomicina é mal absorvida pelo trato gastrointestinal, sendo frequentemente necessária a administração intravenosa para o tratamento da osteomielite, o que leva a necessidade de internação do paciente, geralmente por um período mínimo de 14 dias. O uso prolongado da vancomicina venosa, acima de 14 dias, pode levar a quadros de ototoxidade e nefrotoxicidade, além de poder ocasionar um processo inflamatório no local da infusão venosa. [00011] Na produção de sistema de liberação controlada de fármacos é necessário que a dose terapêutica seja mantida por períodos préestabelecidos o que é alcançado pela combinação adequada dos métodos de interação entre os fármacos e carreadores, e pela introdução de determinados materiais como biopolímeros.

[00012] Na presente invenção são utilizados os polímeros alginato de sódio e ροΐί-ε-caprolactona.

[00013] O alginato é um polissacarídeo aniônico linear composto por copolímeros de α-L-guluronato e β-D-manuronato. Ele é obtido através da extração de ácido algínico presente em algas marrons (Phaeophyceae) (GAZORl et al„ Carbohydr Polym 2009; 77: 599-606; T0NNESEN & KARLSEN, Drug Dev Ind Pharm. 2002; 28(6): 621-30). Dependendo da fonte onde o alginato é obtido, sua cadeia pode apresentar-se de forma homopolimérica (composta por apenas um tipo de bloco) ou heteropolimérica (composta pelos dois tipos de blocos), como representado na Figura 1.

[00014] O alginato tem a propriedade de formar géis resistentes e termoestáveis. Tal efeito é observado devido às ligações coordenadas cruzadas entre íons bivalentes como, por exemplo, o Ca²⁺, e os átomos de oxigênio presentes nos blocos de ácido-L-gulurônico. Estas ligações formam estruturas tridimensionais, conhecidas como “egg box” permeáveis apenas por moléculas pequenas e líquidos, onde o ativo se encontrará interiorizado (Figura 2) (PONGJANYAKUL & PUTTIPIPATKHACHORN, AAPS PharmSciTech. 2007;8: E72; CABALLERO et al., Int J Pharm. 2014; 460:1818; PAQUES JP et al., Adv Colloid Interface Sei. 2014; 209:163-71).

5/16 [00015] Por ser um polímero muito utilizado na indústria alimentícia como espessante e na farmacêutica com função excipiente, e aprovada pelo “U S Food and Drug Administration” (FDA), o alginato vem sendo bastante explorado nas sínteses de nanopartículas poliméricas. Sendo utilizado em formulações orais (AHMAD et al., Indian J Chest Dis Allied Sei. 2006;48:1716), pulmonares, (AHMAD et al., Int J Antimicrob Agents. 2005; 26: 298-303), transdérmicas (AHMED & EL-SAY, Life Sei. 2014,110(1):35-43), entre outras. [00016] Poli-e-caprolactona (PCL) é um poliéster alifãtico sintético composto por unidades repetidas de hexanoato (Figura 3). É um polímero semicristalino, podendo chegar a 70% de cristalinidade dependendo de sua massa molar (SISSON, EKINCI & LENDLEIN, Polymers. 2013; 54: 4333-50). É degradado por esterases, mas também é susceptível a degradação por lipases e outras enzimas (KULKARNi et al., Langmuir. 2007;23: 12202-07). Por apresentar tempo de degradação muito lento, é ideal para sistemas de liberação prolongados. Dependendo da formulação, essa liberação pode se estender ao longo de um ano ou mais.

[00017] O PCL também é alvo de estudos para implantes de longa duração por ser facilmente manipulado física, química e biologicamente, além de sua cinética de degradação ser modulada de forma que se adapte ao local da aplicação (WOODRUFF & HUTMACHER, Prog. Polym. Sei. 2010;35. 121756). Quando comparado aos implantes de poliglicóis, comumente usados, o PCL possui vantagem por liberar uma quantidade mais reduzida de bioprodutos de degradação, assim diminuindo a ocorrência de processos inflamatórios (SISSON, EKINCI & LENDLEIN, Polymers, 2013; 54: 4333-50). [00018] Moinard-Chécot e colaboradores (Journal of Colloid and Interface Science 317, 458-468, 2007) demonstraram que nanopartículas poliméricas de PCL, utilizando método de emulsificação e evaporação de solvente, apresentam elevado rendimento de encapsulação, reprodutividade e uniformidade nos tamanhos das partículas.

[00019] Atualmente o material carreador de antibiótico para tratamento de lesões ósseas mais utilizado é o polímero polimetil metacrilato (PMMA). No

6/16 entanto, ainda que apresente uma boa biocompatibilidade, o carreador não possui propriedades de regeneração óssea e não é absorvivel pelo organismo, o que implica na necessidade de novo procedimento cirúrgico para remoção do implante.

[00020] Na literatura patentária foram encontrados alguns documentos que se relacionam ao assunto descrito na presente invenção, sem, contudo, antecipar ou sugerir o escopo da mesma.

[00021] A patente norte-americana US 7,001,371, de titularidade de MED USA e intitulada Porous drug delivery system”, descreve dispositivo implantável com material para controle da angiogênese pelo uso de biomaterial fibroso que apresenta espaços feitos sob medida para inibir ou estimular angiogênese.

[00022] A patente européia EP 0216621, de titularidade de Toa Nenryo Kogyo Kabushiki Kaisha e intitulada “Calcium-phosphate type hydroxyapatite and process for producing it”, descreve um novo tipo de fosfato de cálcio com estrutura cristalina hexagonal e rede definida utilizada para regeneração óssea.

[00023] O pedido internacional de patente WO 05/007599, depositado por Rhodia Chimie e intitulado “Hydroxyapatite Calcium Phosphate Granules, Method for Preparing the Same and Uses Thereof”, descreve a preparação de grânulos de fosfato de cálcio do tipo hidroxiapatita de uma suspensão de fosfato dicálcio brushita, utilizado como base para produtos farmacêuticos ativos.

[00024] O pedido de patente brasileiro PI 0412580-0, intitulado “Grânulos de fosfatos de cálcio do tipo de hidroxiapatita, processo para a sua preparação e suas aplicações”, descreve a produção de fosfatos de cálcio em forma de grânulos apresentando um padrão de difração de raios-X característico da hidroxiapatita e com características de compressibilidade e de escoamento em aplicações de compressão direta.

[00025] O pedido de patente brasileiro PI 8903641-7, depositado por Enduro Indústria e Comércio Ltda. (arquivado) e intitulado “Processo de obtenção de

7/16 material biocerâmico hidroxiapatita”, descreve um processo de produção de material cerâmico: hidroxiapatita, utilizada em enxertos odontológicos, ortopédicos, em revestimentos cerâmicos de próteses odontológicas, ortopédicas metálicas, em próteses cerâmicas, maxilo-faciais, estéticas, entre outros.

[00026] O pedido internacional de patente WO 2012/006698 A1, intitulado “Biocompósito, Usos relacionados, Processo para a Produção do Mesmo, e Método de Liberação Controlada de Substância Antimicrobiana”, descreve a preparação de fosfato de cálcio do tipo hidroxiapatita na forma de esferas/microesferas associado ao agente antimicrobiano vancomicina.

[00027] Apesar deste documento descrever um processo que utiliza hidroxiapatita, não houve relata ou prevê a combinação da mesma com o alginato de sódio, poli-e-caprolactona e vancomicina, como na presente invenção.

[00028] O documento WO2013123509, de titularidade da Bacterin Int. Inc, descreve uma cobertura polimérica. A US2013164346 trata de revestimentos cerâmicos utilizando hidroxiapatita. O documento US20140128990 também se refere a um material biocerâmico. A presente invenção não descreve um revestimento de material cerâmico. O material da presente invenção é uma hidroxiapatita nanoestruturada, com síntese específica, dopada ou não com estrôncio e zinco, e ainda possuindo substituições duplas de estrôncio e zinco. [00029] Embora sejam conhecidas tecnologias relacionadas ao desenvolvimento de biomatenais e ao controle da liberação de medicamentos, os presentes inventores desconhecem o uso de nanohidroxiapatitas associadas à alginato de sódio, poli-e-caprolactona e cloridrato de vancomicina como biomaterial para regeneração tecidual com ação antimicrobiana. Adicionalmente, a presente invenção mantém a liberação dos princípios ativos a longo prazo.

Breve descrição dos desenhos

8/16 [00030] A Figura 1 descreve uma representação estrutural de três formas de alginato. A primeira estrutura representa homopolímero de ácido-L-gulurônico, a segunda estrutura representa homopolímero de ácido-D-manurônico e a terceira estrutura um heteropolímero. G = ácido-L-gulurônico, M = ácido-Dmanurônico (TONNESEN & KARLSEN, 2002).

[00031] A Figura 2 descreve a formação do gel de alginato a partir da ligação com o Ca²⁺ resultando na estrutura tridimensional “egg box” (PAQUES et al., 2014).

[00032] A Figura 3 apresenta uma representação estrutural da poli-εcaprolactona (PCL) (FONTE: CHEMDRAW).

[00033] A Figura 4 apresenta as cinéticas de liberação de vancomicina presente nos materiais produzido.

[00034] A Figura 5 apresenta a análise do ensaio de viabilidade e proliferação celular através dos marcadores Prestoblue (a) e CVDE (b). Para análise estatística foi utilizado o método (ANOVA) e pos-test de Dunnett, representativo de dois experimentos independentes e em sextuplicata. As amostras foram normalizadas em porcentagem e comparadas ao controle negativo. Os valores significativos são indicados na figura. *p <0.001.

Sumário da invenção [00035] É um objeto da presente invenção proporcionar um biocompósito absorvível na forma de pó, grânulos, arcabouços densos e porosos e esferas/microesferas de nanohidroxiapatita, combinados preferencialmente com alginato de sódio ροϋ-ε-caprolactona e cloridrato de vancomicina. Outro objeto da invenção é proporcionar um processo para sua obtenção, [00036] Em um aspecto da presente invenção, o processo para produção de biocompósito é dividido em duas etapas, uma etapa de adsorção do cloridrato de vancomicina com a nanohidroxiapatita, seguida da incorporação ροϋ-εcaprolactona e posteriormente de alginato de sódio.

[00037] Em outro aspecto da presente invenção, na primeira etapa do processo de produção do biocompósito, a mistura de

9/16 nanohidroxiapatita/vancomicina e ροϋ-ε-caprolactona a 20% (peso por volume) e alginato de sódio é realizada na razão de 15:1.

[00038] Em outro aspecto da presente invenção, na primeira etapa do processo de produção do biocompósito, a mistura de nanohidroxiapatita/vancomicina e poli-e-caprolactona e alginato de sódio é gotejada, preferencialmente na solução aquosa de cloreto de cálcio, na concentração de a 0,35 molar.

[00039] É também um objeto da presente invenção o produto obtido, ou seja, o biocompósito, contendo o agente com ação antimicrobiana comprovada contra patógenos frequentemente relacionados às infecções ósseas.

[00040] Em outro aspecto, é provido um método para liberação controlada de substância antimicrobiana, preferencialmente de cloridrato de vancomicina. [00041] Estes e outros objetos da invenção serão valorizados e melhor compreendidos a partir da descrição detalhada de invenção.

Descrição Detalhada da Invenção [00042] A presente invenção proporciona alternativas para superar as limitações do estado da técnica para o desenvolvimento de biocompósito, sistema de liberação controlada de fármacos e uso relacionado desse biocompósito. O biocompósito aqui detalhado é à base de nanohidroxiapatita (HA) adsorvida de cloridrato de vancomicina (VANCO), e associado aos polímeros poli-e-caprolactona (PCL) e alginato de sódio (ALG) que acrescentam a nanohidroxiapatita, com comprovadas propriedades osteocondutoras e osteoindutoras, uma ação antimicrobiana com cinética de liberação controlada, sem a necessidade de novo ato cirúrgico para sua remoção ao final da terapia. Tais propriedades conferem ao biocompósito a possibilidade de aplicação nos seguintes tratamentos médicos: a) adjuvante no tratamento de osteomielites: como componente de enxertos ósseos; b) profilaxia de infecções ósseas após cirurgias ortopédicas.

[00043] Para detalhar melhor a invenção são descritas, a seguir, as etapas do processo de produção do biocompósito, o método de incorporação e liberação

10/16 da substância antimicrobiana, os ensaios microbiológicos e de biocompotibilidade in vitro.

Etapa 1: Síntese de hidroxiapatita nanoestruturada com ou sem substituições iônicas [00044] A síntese dos pós nanométricos de hidroxiapatita com cristais de dimensões na ordem de 20 nm é realizada seguindo rotas de precipitação em via úmida com controle dos seguintes parâmetros de preparação: concentração dos reagentes, temperatura de precipitação e digestão, pH, velocidade de adição dos reagentes, velocidade de agitação do meio reacional, e tempo de digestão.

[00045] A hidroxiapatita (HA) é sintetizada pela reação por precipitação a partir de uma solução de nitrato de cálcio, Ca(NO3)2-4H₂O 0,5 M (fluxo de 30 mL/min) gotejada sobre uma solução de fosfato de amônio dibásico, (NH₄)₂HPO₄, 0,3 M, com o auxílio de uma bomba peristáltica, mantendo-se o pH 9 com hidróxido de amônio (NH₄OH) concentrado e com agitação utilizando-se uma placa magnética. Para a obtenção de hidroxiapatitas com substituições iônicas Ca²⁺ é substituído pelo Sr²·*' ou Zn²⁺, [(Ca₁₀. _xZn_x,Sr_x(PO₄)fi(OH)2(0<x<10)]. As sínteses das hidroxiapatitas com substituições de Sr²* e Zn²⁺ são realizadas por adição no meio racional de soluções de nitratos de estrôncio ou zinco, respectivamente. Após a adição dos reagentes o precipitado permanece sob agitação e temperatura constante por 3 horas. Após esta fase, a mistura é filtrada em funil de Buckner e ressuspendidas em água deionizada até atingir o pH neutro e, posteriormente, liofilizada. Com isto, é possível produzir materiais com estequiometria, composição de fases, textura, cristalinidade, morfologia e tamanhos de partícula controlados. A redução das dimensões dos cristais contribui para aumentar a reatividade superficial do biomaterial, aprimorar as propriedades mecânicas e modular a taxa de dissolução, abrindo novas possibilidades para aplicações biomédicas destes biomateriais.

Etapa 2: Adsorção de cloridrato de vancomicina (VANCO) na nanohidroxiapatita (HA) / 16 [00046] Para promover a adsorção cloridrato de vancomicina (VANCO) na hidroxiapatita, é utilizada uma hidroxiapatita nanoestruturada (HA) incubada em soluções de vancomicina com as concentrações variando entre 0,25% a 1,5%. Todos os ensaios são realizados em triplicata de testes e triplicata de amostras com temperatura controlada a 25°C e pH 7. São utilizados recipientes de vidro tipo Becker contendo pó de HA e soluções aquosas de VANCO numa razão de 50 mg HA/mL, que permanecem em agitação magnética durante 24 horas. A incorporação do antibiótico é determinada pela espectrometria UV a 281 nm.

[00047] Os resultados de adsorção indicam aumento dos valores de vancomicina adsorvidos na HA em função da concentração do antibiótico [Tabela 1], A sofução de vancomicina a 0,25 % foi menos eficiente, enquanto a solução a 1,5 % demonstra ser a concentração mais indicada para máxima adsorção relativa.

Tabela 1. Valores de adsorção na HA em função das concentrações de vancomicina (VANCO).

VANCO (g/100 mL)	% adsorvido)	massa adsorvida (pg VANCO / mg HA)	razão HAVANCO
0,25	6,81	3,4	294
0,50	35,30 ί	35,2	28
1,00	42,00 !	82,7	12
1,50	47,60	144,7	7

[00048] Os níveis de vancomicina associados à HA atingem valores compatíveis com formulações já existentes utilizados na clínica médica atualmente onde a relação entre carreador e antibiótico é da ordem de 10 para 1.

Etapa 3: Incorporação dos polímeros poli-s-caprolactona (PCL) e alginato de sódio (ALG) na nanohidroxiapatita/vancomicina (HAVANCO) e produção de microesferas.

12/16 [00049] Para a incorporação dos biopolímeros é utilizada a HA tratada com soluções de vancomicina a 1,5%, por ser esta a adsorção do antibiótico mais eficiente.

[00050] A incorporação do polímero ροϋ-ε-caprolactona (PCL) tem como objetivo aprimorar as condições de adsorção e dessorção da vancomicina. Para a obtenção do compósito HAVANCO/PCL, uma solução 20% m/v de poliε-caprolactona (PCL) em acetona é adicionada em 1500 mg de HAVANCO sob intensa agitação com dispersor de alta performance durante 40 segundos. Esta suspensão é disposta em placa de Petri e seca à temperatura ambiente. O compósito HAVANCO/PCL é macerado, peneirado em granulometrias específicas e armazenado para posterior caracterização.

[00051] Microesferas de HA associadas à vancomicina e o polímero poli εcaprolactona (HAVANCO/PCL) em matriz de alginato são preparadas pelo método de extrusão. Misturas do biocompósito HAVANCO/PCL e alginato de sódio são suspensas em água deionizada e homogeneizadas vigorosamente numa razão de 15:1. Em seguida, é realizada a extrusão da mistura através de agulhas 24 G 1 % e gotejada numa solução de cloreto de cálcio (CaCI₂) 0,35 M, com um fluxo constante de 10 mL por minuto. As microesferas se formam instantaneamente ao entrar em contato com a solução de cloreto de cálcio. Após a formação das microesferas, as mesmas permanecem na solução de CaCb durante o período de 10 minutos, são lavadas em água deionizada e liofilizadas. As microesferas obtidas são, em seguida, separadas por faixa granulométrica com o auxílio de peneiras.

[00052] O método descrito nesta etapa pode ser usado também para processamento do biocompósito em outras formas de apresentação, tais como grânulos densos e porosos, arcabouços densos e porosos e na forma de pó, pasta ou membrana.

[00053] Após a realização das etapas anteriores de preparação do biocompósito, realizou-se um ensaio de dessorção de cloridrato de vancomicina (VANCO) a partir de microesferas do biocompósito de HA associada à vancomicina e o polímero poli ε-caprolactona em matriz de

13/16 alginato (HAVANCO/PCL/ALG), verificando a liberação gradativa dessa substância ao longo do tempo. O método de liberação dessa substância é descrito a seguir.

[00054] Os ensaios de dessorção foram desenvolvidos em solução tampão fosfato (PBS pH 7,4) e os resultados quantitativos foram obtidos através da espectrofotometria UV-Vis a partir da construção de uma curva padrão.

[00055] A cinética de liberação apresentada nos ensaios de dessorção demonstrou um padrão adequado para a finalidade do biocompósito. Aproximadamente 15% de vancomicina presente no biocomposito HAVANCO/PCL/ALG foi liberado nos primeiros 30 minutos, havendo uma liberação gradual ao longo do tempo, enquanto cerca de 70% de vancomicina carreada pela HA sem a presença dos polímeros foi dessorvida nos momentos iniciais. Ao finai do período de observação cerca de 30% do antibiótico ainda se encontrava presente no biocompósito. (Ver Figura 4) [00056] A liberação lenta de vancomicina pode resultar num longo período de ação antimicrobiana, o que permite o uso restrito de antibióticos sistêmicos no tratamento de infecções ósseas, o que é bastante desejável.

[00057] A fim de comprovar as excelentes propriedades do biocompósito da presente invenção, assim como o grande potencial do método de liberação do antibiótico vancomicina, proposto na presente invenção, foram realizados ensaios microbiológicos e de citotoxicidade, os quais são citados a seguir:

1° Ensaio: Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) [00058] Foram desenvolvidos ensaios com o objetivo de determinar a concentração mínima inibitória (MIC) de pós de HA tratados com soluções de vancomicina a 0,25%, 0,50%, 1,0% e 1,5% (grupos HAVANCO 0.25%, HAVANCO 0.5%, HAVANCO 1,0% e HAVANCO 1,5% respectivamente). Os testes foram realizados segundo as normas de métodos de diluição seriada publicadas pela Clinicai and Laboratory Standards Institute (CLSl), 2006. Culturas da cepa S. aureus (ATCC 25923), principal patógeno relacionado à osteomielites de origem ortopédica, foram preparadas em meio TSB e

14/ 16 padronizadas para a escala 0,5 de McFarland de turbidez, aproximadamente 1,5χ10⁸ unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. As células bacterianas foram misturadas com os materiais testados em concentrações variando de 0,025 mg/mL a 25 mg/mL em meio TSB. Após 18 horas, a turbidez do meio de cultura foi observada para permitir a determinação dos valores de MIC, que é definido pela menor diluição que mantém o meio de cultura sem turvação. Após a determinação do MIC, amostras com volume de 1 μΙ_ do meio de cultura da diluição que inibiu o crescimento foram aplicadas em placas de Petri em meio de cultura ágar TSA. O plaqueamento por esgotamento foi realizado para obtenção de crescimento de colônias bacterianas isoladas para quantificação da ação antimicrobiana do material.

[00059] A Tabela 2 apresenta os valores de MIC, definido pela inibição do crescimento de S. aureus, para as amostras na forma de pós de HA tratadas com VANCO 0,25%, 0,50%, 1,0% e 1,5%.

Tabela 2. Atividade antimicrobiana de pós de HA tratados com o antibiótico

vancomicina.
Amostras	MIC mg/mL (d.p.)
HAVANCO 0,25%	2,189(+0,81) )
HAVANCO 0,50%	0,104 (±0,05) |
HAVANCO 1,00% HAVANCO 1,50%	0,098 (±0,08) 5 0,031 (±0,01)

[00060] As amostras do biocompósito HAVANCO/PCL/ALG, após período de 30 dias de dessorção em tampão PBS, apresentou valor de MIC de 7,5 mg/mL, demostrando a manutenção da atividade antimicrobiana do material produzido pelo período desejado para uso terapêutico.

2° Ensaio: Citotoxicidade in vitro.

[00061] Os ensaios de viabilidade celular seguiram o protocolo da ISO-10993. Foram avaliadas a atividade metabólica e a densidade celular. O marcador

15/16 usado para a atividade metabólica foi o reagente PrestoBlue®Cell Viability Reagent (solução à base de resazurina, Invitrogen). Para a densidade celular foi usado o CVDE-eluição de corante cristal violeta- ligação com DNA nuclear (kit KXRCV 96.300/310, Xenometrix AG). A concentração do reagente Prestoblue foi estimada por espectrometria UV-Vis a 590 nm, enquanto a concentração do CVDE foi determinada em 540 nm. Utilizou-se um leitor de microplacas UV-Vis (Multiskan GO, Thermo Scientific) para a quantificação dos reagentes.

[00062] Os materiais testados foram pós de HA tratados que foram encubados em soluções aquosas de vancomicina a 0,5% (grupo HAV 0.5), 1,0% (grupo HAV 1) e 1,5% (grupo HAV 1.5) por 24 horas. Após a adsorção dos antibióticos, os materiais obtidos foram colocados em meio de cultura a-MEM (Sigma) na concentração de 100 mg/mL (material/meio de cultura a-MEM), durante 24 h, a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. A seguir, as microesferas foram retidas do meió de cultura. O sobrenadante formado pelo meio de cultura e os produtos de degradação dos biomateriais, denominado de extrato, foi filtrado e utilizado nos ensaios de citotoxicidade, [00063] Foram avaliadas, concomitantemente, amostras do cimento ósseo Osteobond® (grupos OSTEOB) usadas atualmente nas cirurgias ortopédicas e amostras de HA sem vancomicina (HA C).

[00064] A viabilidade celular para cada material foi determinada utilizando-se células do tipo FOST (fêmur de camundongo Balb/c) numa concentração de 1 X 10⁴ células por poço, que foram expostas a 200 pL do extrato de cada material durante 24 horas. Após este período os reagentes marcadores Prestoblue e CDVE foram adicionados e incubados por 30 minutos a 37°C. Os meios de cultura contendo os extratos e reagentes foram então removidos para análises. Os marcadores das células na ausência dos extratos dos materiais testes (meio de cultura padrão a-MEM) foram considerados como controle negativo, enquanto para o controle positivo foi utilizado dodecil sulfato de sódio (SDS 1%), um surfactante aniônico que ocasiona a lise celular. Na análise estatística do ensaio de viabilidade celular (a), e de proliferação celular

16/16 (b) as médias e desvio padrão foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e pos-test de Dunnett considerando diferenças significativas se p<0,001.

[00065] Os resultados de viabilidade celular através do reagente Prestoblue e CVDE não indicaram diferenças na atividade metabólica das amostras HA, HAV 0.5, HAV 1, HAV 1.5 em relação ao controle negativo (células) [Figura 5], [00066] Os versados na arte valorizarão imediatamente os importantes benefícios decorrentes do uso da presente invenção. Variações na forma de concretizar o conceito inventivo aqui exemplificado devem ser compreendidas como dentro do espírito da invenção e das reivindicações anexas.

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Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Biocompósito, caracterizado pelo fato de compreender;

   a) hidroxiapatita nanoestruturada de fórmula (Ca₁₀(PO4)6(OH)₂), com ou sem substituições iônicas de estrôncio e zinco e;

   b) alginato de sódio e ροΐί-ε-caprolactona.
2. 2. Biocompósito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de adicionaimente compreender o agente antimicrobiano vancomicina de fórmula (CesHysClaNgC^HCI).
3. 3. Biocompósito, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de se apresentar sob a forma de esferas ou microesferas, grânulos densos e porosos, arcabouços densos e porosos, ou em forma de pó ou pasta.
4. 4. Biocompósito, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato da hidroxiapatita ser de tamanho de partícula menor ou igual a 100 nm.
5. 5. Processo de produção de biocompósito compreendendo hidroxiapatita nanoestruturada de fórmula (Ca-io(PC>4)6(OH)₂) e alginato de sódio e ροϋ-ε-caprolactona, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

   i. preparo de uma mistura de hidroxiapatita/poli-εcaprolactona/alginato de sódio na proporção de 10:3,6:0,6;

   ii. gotejamento essa mistura de uma solução de cloreto de cálcio na concentração a 0,35 molar;

   iii. formação de esferas e microesferas ao entrar em contato com a solução de cloreto de cálcio;

   iv. permanência das esferas e microesferas na solução de cloreto de cálcio (CaCI₂) durante o período de 10 minutos, para completa troca iônica.

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6. 6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma etapa de adição do agente antimicrobiano vancomicina de fórmula (CesHzõCbN^^HCI).
7. 7. Processo, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de a hidroxiapatita ser nanoestruturada, com tamanho menor ou igual a 100 nm.
8. 8. Processo para liberação controlada de substância antimicrobiana, caracterizado por liberar a referida substância antimicrobiana de forma lenta e gradual a partir de um biocompósito compreendendo hidroxiapatita nanoestruturada de fórmula (Ca₁₀(PO4)6(OH)2), alginato de sódio e ροϋ-ε-caprolactona.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato de a referida substância antimicrobiana ser a vancomicina.
10. 10. Uso de biocompósito compreendendo hidroxiapatita nanoestruturada de fórmula (Caio(P04)6(OH)2), alginato de sódio e ροΐϊ-ε-caprolactona caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento curativo ou profilático de infecções bacterianas ósseas.
11. 11. Uso de biocompósito compreendendo hidroxiapatita nanoestruturada de fórmula (Ca-io(PC>4)6(OH)₂) e alginato de sódio e ροϋ-εcaprotactona de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento ortopédico.

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