BR102016022788A2

BR102016022788A2 - DEVELOPMENT OF A CU3BTC2 METAL-ORGANIC ELECTROCHEMICAL SENSOR BASED FOR DETECTION OF REDUCED GLUTATIONA IN BIOLOGICAL SAMPLES

Info

Publication number: BR102016022788A2
Application number: BR102016022788-7A
Authority: BR
Inventors: Alves Junior Severino; Vanessa De Almeida Ferraz Nadja; Adrião Gomes Filho Manoel; Shelsea Taveira Rocha Do Nascimento Railda; Gentil Da Silva Givaldo; Silva Vasconcelos Wellyton; Paula Silveira Paim Ana; Carneiro Da Cunha Areias Madalena
Original assignee: Universidade Federal De Pernambuco
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-05-02

Abstract

desenvolvimento de um sensor eletroquímico baseado na rede metal-orgânica cu3btc2 para detecção da glutationa reduzida em amostras biológicas. a invenção refere-se ao método de preparação de um sensor eletroquímico baseado na rede metal-orgânica cobre (ii) ? benzeno - 1, 3, 5 ? tricarboxilato (cu3btc2) e a aplicação do mesmo na detecção de glutationa reduzida, utilizando o método voltamétrico. o método de preparação do sensor é caracterizado por compreender os seguintes passos: (a) preparação de resina polimérica de cu-btc; (b) imobilização do filme polimérico de cubtc na superfície de um eletrodo sólido de ouro, obtendo-se um eletrodo quimicamente modificado denominado cubtc-eau. a glutationa é oxidada cataliticamente pelo sensor cubtc-eau em solução tampão fosfato (ph 3.0), apresentando baixo limite de detecção (0.05 µm) e uma faixa de trabalho linear de 0.05-2µm, além de boa estabilidade e reprodutibilidade. a aplicabilidade potencial do sensor foi demonstrada pelo seu uso na determinação analítica da concentração de glutationa em amostras biológicas.development of an electrochemical sensor based on the cu3btc2 metal-organic network for detection of reduced glutathione in biological samples. The invention relates to the method of preparing an electrochemical sensor based on the copper (ii)? benzene - 1, 3, 5? tricarboxylate (cu3btc2) and its application in the detection of reduced glutathione using the voltammetric method. The method of preparing the sensor comprises the following steps: (a) preparing cu-btc polymer resin; (b) immobilizing the cubtc polymeric film on the surface of a solid gold electrode, obtaining a chemically modified electrode called cubtc-eau. Glutathione is catalytically oxidized by the cubtc-eau sensor in phosphate buffer solution (ph 3.0), with a low detection limit (0.05 µm) and a linear working range of 0.05-2 µm, as well as good stability and reproducibility. The potential applicability of the sensor has been demonstrated by its use in the analytical determination of glutathione concentration in biological samples.

Description

(54) Título: DESENVOLVIMENTO DE UM SENSOR ELETROQUÍMICO BASEADO NA REDE METAL-ORGÂNICA CU3BTC2 PARA DETECÇÃO DA GLUTATIONA REDUZIDA EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS (51) Int. Cl.: G01N 27/30; G01N 33/48 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA, UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO (72) Inventor(es): SEVERINO ALVES JUNIOR; NADJA VANESSA DE ALMEIDA FERRAZ; MANOEL ADRIÃO GOMES FILHO; RAILDA SHELSEA TAVEIRA ROCHA DO NASCIMENTO; GIVALDO GENTIL DA SILVA; WELLYTON SILVA VASCONCELOS; ANA PAULA SILVEIRA PAIM; MADALENA CARNEIRO DA CUNHA AREIAS (57) Resumo: DESENVOLVIMENTO DE UM SENSOR ELETROQUÍMICO BASEADO NA REDE METAL-ORGÂNICA Cu3BTC2 PARA DETECÇÃO DA GLUTATIONA REDUZIDA EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS. A invenção referese ao método de preparação de um sensor eletroquímico baseado na rede metal-orgânica cobre (II) ? benzeno -1, 3, 5 ? tricarboxilato (Cu3BTC2) e a aplicação do mesmo na detecção de glutationa reduzida, utilizando o método voltamétrico. O método de preparação do sensor é caracterizado por compreender os seguintes passos: (A) preparação de resina polimérica de Cu-BTC; (B) Imobilização do filme polimérico de CuBTC na superfície de um eletrodo sólido de ouro, obtendo-se um eletrodo quimicamente modificado denominado CuBTCEAu. A glutationa é oxidada cataliticamente pelo Sensor CuBTC-EAu em solução tampão fosfato (pH 3.0), apresentando baixo limite de detecção (0.05 μΜ) e uma faixa de trabalho linear de 0.052μΜ, além de boa estabilidade e reprodutibilidade. A aplicabilidade potencial do sensor foi demonstrada pelo seu uso na determinação analítica da concentração de glutationa em amostras biológicas.(54) Title: DEVELOPMENT OF AN ELECTROCHEMICAL SENSOR BASED ON THE METAL-ORGANIC NETWORK CU3BTC2 FOR DETECTION OF REDUCED GLUTATION IN BIOLOGICAL SAMPLES (51) Int. Cl .: G01N 27/30; G01N 33/48 (73) Holder (s): FEDERAL UNIVERSITY OF PERNAMBUCO, STATE UNIVERSITY OF PARAÍBA, RURAL FEDERAL UNIVERSITY OF PERNAMBUCO (72) Inventor (s): SEVERINO ALVES JUNIOR; NADJA VANESSA DE ALMEIDA FERRAZ; MANOEL ADRIÃO GOMES FILHO; RAILDA SHELSEA TAVEIRA ROCHA DO NASCIMENTO; GIVALDO GENTIL DA SILVA; WELLYTON SILVA VASCONCELOS; ANA PAULA SILVEIRA PAIM; MADALENA CARNEIRO DA CUNHA AREIAS (57) Abstract: DEVELOPMENT OF AN ELECTROCHEMICAL SENSOR BASED ON THE METAL-ORGANIC NETWORK Cu3BTC2 FOR DETECTION OF REDUCED GLUTATION IN BIOLOGICAL SAMPLES. The invention relates to the method of preparing an electrochemical sensor based on the metal-organic copper (II) network? benzene -1, 3, 5? tricarboxylate (Cu3BTC2) and its application in the detection of reduced glutathione, using the voltammetric method. The method of preparing the sensor is characterized by comprising the following steps: (A) preparation of polymeric resin from Cu-BTC; (B) Immobilization of the CuBTC polymeric film on the surface of a solid gold electrode, obtaining a chemically modified electrode called CuBTCEAu. Glutathione is catalytically oxidized by the CuBTC-EAu Sensor in phosphate buffer solution (pH 3.0), with a low detection limit (0.05 μΜ) and a linear working range of 0.052μΜ, in addition to good stability and reproducibility. The potential applicability of the sensor was demonstrated by its use in the analytical determination of the glutathione concentration in biological samples.

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DESENVOLVIMENTO DE UM SENSOR ELETROQUÍMICO BASEADO NA REDEDEVELOPMENT OF A NETWORK-BASED ELECTROCHEMICAL SENSOR

METAL-ORGÂNICA Cu₃BTC₂ PARA DETECÇÃO DA GLUTATIONA REDUZIDA EMORGANIC METAL Cu ₃ BTC ₂ FOR DETECTION OF REDUCED GLUTATION IN

AMOSTRAS BIOLÓGICASBIOLOGICAL SAMPLES

01. A presente invenção está inserida no campo da eletroquímica e de sensores para marcadores biológicos. Mais particularmente, esta invenção · refere-se ao desenvolvimento de um sensor eletroquímico nano estruturado e seu método de preparação baseado na rede meta l-orgâ nica cobre (II) - benzeno - 1, 3, 5 tricarboxilato (CU3BTC2) e a aplicação do mesmo na detecção da glutationa reduzida em amostras biológicas. A presente invenção aplica-se na área da medicina humana para diagnóstico de várias condições clínicas e avaliação do estresse oxidativo.01. The present invention is inserted in the field of electrochemistry and sensors for biological markers. More particularly, this invention · relates to the development of a nano structured electrochemical sensor and its preparation method based on the meta l-organic copper (II) - benzene - 1, 3, 5 tricarboxylate (CU3BTC2) network and the application of even in the detection of reduced glutathione in biological samples. The present invention is applied in the field of human medicine for diagnosis of various clinical conditions and assessment of oxidative stress.

02. A glutationa consiste em um. tripeptídeo formado por (1) ácido glutâmico, (2) cisteína e (3) glicina (FIGURA.1), ligados peptidicamente. Trata-se de um composto tiólico, existente no organismo em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG).02. Glutathione consists of one. tripeptide formed by (1) glutamic acid, (2) cysteine and (3) glycine (FIGURE 1), peptidically linked. It is a thiolic compound, existing in the body in its reduced (GSH) and oxidized (GSSG) forms.

03. As propriedades antioxidantes da glutationa estão direta ou indiretamente relacionadas a processos biológicos importantes, tais como participação no processo de desintoxicação de xenobióticos, metabolismo de numerosos compostos celulares, síntese de proteínas e DNA, transporte de aminoácidos, atividade enzimática e proteção celular (Pacsial-Ong, E. J. et al. Anal. Chem. 2006, 78, 7577).03. The antioxidant properties of glutathione are directly or indirectly related to important biological processes, such as participation in the detoxification process of xenobiotics, metabolism of numerous cellular compounds, protein and DNA synthesis, amino acid transport, enzymatic activity and cell protection (Pacsial -Ong, EJ et al. Anal. Chem. 2006, 78, 7577).

04. Tipicamente, a glutationa pode ser encontrada em fluidos fisiológicos, tais como o plasma e urina, onde os níveis observados estão, normalmente, dentro dos intervalos de 2.0-12 mM (Kleinman, W. A.; Richie, J. P., Jr. Biochem. Pharmacol. 2000, 60, 19-29; Toyo’oka, T. J. Chromatogr. 2009, 877, 3318-3330).04. Typically, glutathione can be found in physiological fluids, such as plasma and urine, where the observed levels are normally within the ranges of 2.0-12 mM (Kleinman, WA; Richie, JP, Jr. Biochem. Pharmacol 2000, 60, 19-29; Toyo'oka, TJ Chromatogr. 2009, 877, 3318-3330).

05. Em particular, problemas na síntese e metabolismo da glutationa estão associados a vários processos patológicos. De forma que, os níveis deste antioxidante no organismo tem se apresentado cada vez mais importantes nos estudos clínicos. Relatos mostraram que quantidades reduzidas podem ter implicações para doenças como câncer (Di ílio, C. et al. Câncer Lett. 1995, 91, 19-23; Saydam, N. et al. Câncer Lett. 1997, 119, 13-19; White, P. C. etal. Electroanalysis 2002, 14, 89-98; Harfiel, D. J.05. In particular, problems in the synthesis and metabolism of glutathione are associated with several pathological processes. So, the levels of this antioxidant in the body have been increasingly important in clinical studies. Reports have shown that reduced amounts may have implications for diseases such as cancer (Di ílio, C. et al. Cancer Lett. 1995, 91, 19-23; Saydam, N. et al. Cancer Lett. 1997, 119, 13-19; White, PC etal Electroanalysis 2002, 14, 89-98; Harfiel, DJ

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C.; Batchelor-Mcauley, C.; Compton, R. G. Analyst 2012, 137, 2285-2296). Além disso, alterações na concentração da glutationa a nível celular têm sido medidas e associadas a doenças tais como arteriosclerose pré-matura, leucemia, diabetes, Síndrome da imuno-deficiência adquirida (SIDA) e doenças de Alzheimer e Parkinson (Seymour, E.Ç.; Batchelor-Mcauley, C .; Compton, R. G. Analyst 2012, 137, 2285-2296). In addition, changes in the concentration of glutathione at the cellular level have been measured and associated with diseases such as preterm arteriosclerosis, leukemia, diabetes, acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and Alzheimer's and Parkinson's diseases (Seymour, E.

H. et al. Anal. Lett. 2002, 35, 1387).H. et al. Anal. Lett. 2002, 35, 1387).

rr

06. Neste contexto, o interesse na detecção eficaz e precoce deste biomarcador tem aumentado na última década, onde o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis, baratos e robustos torna-se crucial para o auxílio no diagnóstico e tratamento clínico de várias doenças (Harfield, J. C.; Batchelor-Mcauley, C.; R. G. Compton, R. G. Analyst 2012, 137, 2285).06. In this context, the interest in the effective and early detection of this biomarker has increased in the last decade, where the development of fast, sensitive, cheap and robust methods has become crucial to help in the diagnosis and clinical treatment of various diseases (Harfield, JC; Batchelor-Mcauley, C .; RG Compton, RG Analyst 2012, 137, 2285).

07. Várias técnicas têm sido descritas na literatura para a determinação de GSH. Entre elas podemos encontrar: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), espectrofluorimetria, espectrofotometria, potenciometria, entre outros. Atualmente, a utilização da CLAE é a mais popular quando comparada com os outros métodos referidos, devido à sua elevada sensibilidade e seletividade (Pastore, A. et aí. Clin. Chim. Acta 2003, 333, 19). Contudo, a súa utilização em ambientes de cuidados de saúde está limitada, uma vez que se trata de um método que necessita de cuidada preparação de amostras, tempos de análise longos e pessoal especializado para o manuseamento do equipamento. Para este tipo de método, a análise de custo-eficácia fica aquém do desejável, na medida em que as técnicas envolvidas são geralmente caras e complexas tanto em funcionamento como em processamento, pelo que é desejável recorrer a estratégias mais simples e robustas para estudos biológicos e clínicos deste analito (Toyo’oka, T. J. Chromatogr. 2009, 877, 3318-3330).07. Various techniques have been described in the literature for the determination of GSH. Among them we can find: high performance liquid chromatography (HPLC), spectrofluorimetry, spectrophotometry, potentiometry, among others. Currently, the use of HPLC is the most popular when compared to the other methods mentioned, due to its high sensitivity and selectivity (Pastore, A. et al. Clin. Chim. Acta 2003, 333, 19). However, its use in healthcare environments is limited, since it is a method that requires careful sample preparation, long analysis times and specialized personnel for handling the equipment. For this type of method, the cost-effectiveness analysis falls short of what is desirable, as the techniques involved are generally expensive and complex both in operation and in processing, so it is desirable to use simpler and more robust strategies for biological studies. and clinicians of this analyte (Toyo'oka, TJ Chromatogr. 2009, 877, 3318-3330).

08. De forma particular, as técnicas eletroquímicas apresentam-se apropriadas para determinação de compostos tiólicos, dado a flexibilidade da química redox que caracteriza a maioria dos compostos orgânicos de enxofre. Portanto, o desenvolvimento de medições eletroquímicas diretas, na forma de sensores eletroquímicos, para detecção de glutationa em amostras não tratadas seriam preferidas devido a sua simplicidade e uso prático em amostras reais (Seymour, Ε. H.08. In particular, electrochemical techniques are suitable for the determination of thiolic compounds, given the flexibility of the redox chemistry that characterizes most organic sulfur compounds. Therefore, the development of direct electrochemical measurements, in the form of electrochemical sensors, for detecting glutathione in untreated samples would be preferred due to its simplicity and practical use in real samples (Seymour, Ε. H.

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3/12 et aí. Anaí. Lett. 2002, 35, 1387).3/12 et al. Anaí. Lett. 2002, 35, 1387).

09. Os sensores eletroquímicos são conhecidos por serem valiosos na análise de amostras em aplicações biõmédicas e ambiental, Nos últimos anos, tornaram-se mais atraentes por causa das vantagens que eles oferecem em tamanho, baixo custo, quantidade de amostra, e requerimento de energia (Wang, J, Analyst 2005, 130, 42).09. Electrochemical sensors are known to be valuable in analyzing samples in biomedical and environmental applications. In recent years, they have become more attractive because of the advantages they offer in size, low cost, amount of sample, and energy requirement (Wang, J, Analyst 2005, 130, 42).

10. Métodos eletroanalíticos para determinação de glutationa baseados na oxidaçao direta do grupo tiol em eletrodos sólidos como carbono vítreo, grafite pirolítico e ouro, são amplamente explorados. Entretanto, estes eletrodos são geralmente utilizados acoplados a técnicas de separação, devido à falta de seletividade dos mesmos, sendo necessário o uso extensivo de pré-tratamentos das amostras ou adição de reagentes para aumentar a seletividade e/ou evitar a interferência de outros tióis na medição (Moore, R. R.; Banks, G. É.; Compton, R. G. Analyst, 2004, 129, 755758; ToyoOka, T. J. Chromatogr. 2009, 877, 3318-3330; Carvalho, F. D. et al. Biomed. Chromatogr. 2005, 8, 134-136; Salehzadeh, H.; Mokhtari, B.; Nematollahi, D. Electrochim. Acta 2014, 123, 353-361; Scámpicchio, M. etal. Electroanalysis 2007, 19, 2437-2443). ' ·10. Electroanalytical methods for the determination of glutathione based on the direct oxidation of the thiol group on solid electrodes such as glassy carbon, pyrolytic graphite and gold, are widely explored. However, these electrodes are generally used coupled with separation techniques, due to their lack of selectivity, requiring extensive use of sample pre-treatments or addition of reagents to increase selectivity and / or avoid interference from other thiols in the measurement (Moore, RR; Banks, G. É .; Compton, RG Analyst, 2004, 129, 755758; ToyoOka, TJ Chromatogr. 2009, 877, 3318-3330; Carvalho, FD et al. Biomed. Chromatogr. 2005, 8 , 134-136; Salehzadeh, H .; Mokhtari, B .; Nematollahi, D. Electrochim. Acta 2014, 123, 353-361; Scámpicchio, M. etal. Electroanalysis 2007, 19, 2437-2443). '·

11. Aiém disso, os eletrodos sólidos geralmente apresentam um alto potencial de oxidação para a glutationa, e devido a isto, modificações químicas nas superfícies destes eletrodos vêm sendo investigadas, com o objetivo de diminuir o alto potencial de oxidação, obtendo-se, em muitos casos, uma melhor resposta eletroquímica (eletrocatálise), alta sensibilidade e eliminação de interferentes para análise em amostras complexas (Marzal, P. C. Desenvolvimento de um eletrodo Amperométrico para a determinação de Glutationa em eritrócitos. Tese de Doutorado. UNCAMP. Campinas - SP. Agosto, 2005).11. Furthermore, solid electrodes generally have a high oxidation potential for glutathione, and because of this, chemical modifications to the surfaces of these electrodes have been investigated, with the objective of decreasing the high oxidation potential, obtaining, in many cases, a better electrochemical response (electrocatalysis), high sensitivity and elimination of interferences for analysis in complex samples (Marzal, PC Development of an Amperometric electrode for the determination of Glutathione in erythrocytes. Doctoral Thesis. UNCAMP. Campinas - SP. August , 2005).

12. A denominação eletrodo quimicamente modificado (EQM) foi inicialmente utilizada na eletroquímica por Murray e colaboradores, na década de 70, para designar eletrodos com espécies quimicamente ativas convenientemente imobilizadas na superfície desses dispositivos (Moses, P. R.; Wier, P; Murray, R. W. Anal. Chem., 1975, 47, 1882). O principal objetivo dessa modificação é pré-estabelecer e controlar a '12. The name chemically modified electrode (NDE) was initially used in electrochemistry by Murray and collaborators, in the 70s, to designate electrodes with chemically active species conveniently immobilized on the surface of these devices (Moses, PR; Wier, P; Murray, RW Anal, Chem., 1975, 47, 1882). The main purpose of this modification is to pre-establish and control the

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4/12 natureza físico-química da interface eletrodo-solução como uma forma de alterar a reatividade e seletividade do sensor base, favorecendo assim, o desenvolvimento de eletrodos para vários fins e aplicações, desde a catalise de reações orgânicas e inorgânicas até a transferência de elétrons em moléculas de interesse (Katz, E. et al. J.4/12 physical-chemical nature of the electrode-solution interface as a way to change the reactivity and selectivity of the base sensor, thus favoring the development of electrodes for various purposes and applications, from the catalysis of organic and inorganic reactions to the transfer of electrons in molecules of interest (Katz, E. et al. J.

Electroanal. Chem. 1994, 347, 189.; Person, B. J. Electroanal. Chem, 1990, 287, 61).Electroanal. Chem. 1994, 347, 189 .; Person, B. J. Electroanal. Chem, 1990, 287, 61).

13. Um EQM consiste de duas partes, isto é, um eletrodo base e uma camada do modificador químico. A forma de preparação é determinada pelas características analíticas desejadas para o sensor, de forma a aperfeiçoar seu desempenho. Em termos analíticos, a modificação do eletrodo deve realizar-se de tal forma que o sensor obtenha sensibilidade, seletividade, estabilidade, reprodutibilidade e aplicabilidade superiores àquelas de um eletrodo base sem prévia modificação, para que seu emprego seja justificado (Li, Y. X.; Lin, X. Q. Sensor. Actuator. 2006, 15, 134-139; H.R. ZARE, H. R. et Al. J. Electroanal. Chem., 589 (2006) 60-69).13. An NDE consists of two parts, that is, a base electrode and a chemical modifier layer. The form of preparation is determined by the analytical characteristics desired for the sensor, in order to improve its performance. In analytical terms, the electrode modification must be carried out in such a way that the sensor obtains sensitivity, selectivity, stability, reproducibility and applicability superior to those of a base electrode without previous modification, so that its use is justified (Li, YX; Lin , XQ Sensor, Actuator, 2006, 15, 134-139; HR ZARE, HR et Al. J. Electroanal. Chem., 589 (2006) 60-69).

14. Alguns dos métodos populares de imobilização do material modificador no eletrodo incluem a ligação covalente, adsorção e filmes poliméricos. A modificação dos .eletrodos com filmes poliméricos eletroativos é frequentemente preferida sobre os outros métodos por causa das vantagens de fácil aplicação da técnica e controle sobre espessura do filme (Zhu. L. et al. Biosens. Bioelectron. 2007, 23, 528).14. Some of the popular methods of immobilizing the modifying material on the electrode include covalent bonding, adsorption and polymeric films. Modification of electrodes with electroactive polymeric films is often preferred over other methods because of the advantages of easy application of the technique and control over film thickness (Zhu. L. et al. Biosens. Bioelectron. 2007, 23, 528).

15. Nos últimos 30 anos, os filmes poliméricos ganharam popularidade por serem estáveis e apresentarem amplificação do sinal, o qual é a característica mais importante em aplicações de sensores analíticos. Além' disso, muitos estudos tem focado na incorporação de filmes poliméricos porosos a superfície do eletrodo criando assim um eletrodo de compósito. Essa aplicação tem resultado no aumento do sinal de densidade da corrente, obtendo-se uma maior sensibilidade para a detecção de analitos alvos (Lee, P. T. et al. Electroanalysis 2014; Kang, N. K. et al. Sens. Actuators B, Chem. 2010, 147, 55).15. In the last 30 years, polymeric films have gained popularity because they are stable and have signal amplification, which is the most important feature in analytical sensor applications. In addition, many studies have focused on the incorporation of porous polymeric films on the electrode surface, thus creating a composite electrode. This application has resulted in an increase in the current density signal, obtaining a greater sensitivity for the detection of target analytes (Lee, PT et al. Electroanalysis 2014; Kang, NK et al. Sens. Actuators B, Chem. 2010, 147, 55).

16. A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um sistema utilizando como alternativa de modificador de eletrodo uma rede metal-orgânica (do inglês Metal Organic Framework - MOF), Redes Metal-Orgânicas consistem em uma nova classe16. The present invention relates to the development of a system using as an alternative electrode modifier a metal-organic network (from the English Metal Organic Framework - MOF), Metal-Organic Networks consist of a new class

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5/12 de materiais porosos cristalinos, introduzidos pela primeira vez por Yaghi e colaboradores. São constituídos por íons metálicos ligados por ligantes orgânicos politópicos que permitem combinar as propriedades de ambos os materiais orgânicos e inorgânicos. Pesquisas envolvendo estes compostos estão expandindo muito rapidamente devido às suas propriedades únicas, tais como micro poros idade, área de superfície elevada, adaptabilidade estrutural, flexibilidade e química de caráter sustentável (Yaghi, O.M.; Li, H. Journal of the American Chemical Society 1995, 117, 10401; Férey, G. Chemical Society Reviews 2008, 37, 191; Farha, O. K.; Hupp, J. T. Accounts of Chemical Research 2010, 43, 1166; Phan, A. et al. Accounts of Chemical Research 2010, 43,58).5/12 of porous crystalline materials, first introduced by Yaghi and colleagues. They are made up of metal ions linked by polytopic organic binders that allow combining the properties of both organic and inorganic materials. Research involving these compounds is expanding very rapidly due to their unique properties, such as micro-pores, high surface area, structural adaptability, flexibility and sustainable chemistry (Yaghi, OM; Li, H. Journal of the American Chemical Society 1995 , 117, 10401; Férey, G. Chemical Society Reviews 2008, 37, 191; Farha, OK; Hupp, JT Accounts of Chemical Research 2010, 43, 1166; Phan, A. et al. Accounts of Chemical Research 2010, 43, 58).

17. Embora os estudos iniciais sobre estes materiais tenham sido impulsionados principalmente para aplicações como materiais para armazenamento de gás (CH₄, H2 e CO2), uma gama de outras aplicações potenciais, também foram propostas e demonstradas, incluindo adsorção seletiva de gás, catálise e liberação controlada de drogas (Li, J. R.; Sculley, J.; Zhou, H. C. Chem. Rev. 2012, 112, 869; Ma, L.; Abney, C.; Lin, W. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 1248; Horcajada, P. et al. Chem. Rev. 2012, 112, 1232; Bétard.A.; Fischer, R. A. Chem. Rev. 2012, 112, 1055).17. Although initial studies on these materials were mainly driven for applications as gas storage materials (CH ₄ , H2 and CO2), a range of other potential applications have also been proposed and demonstrated, including selective gas adsorption, catalysis and controlled drug release (Li, JR; Sculley, J .; Zhou, HC Chem. Rev. 2012, 112, 869; Ma, L .; Abney, C .; Lin, W. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 1248; Horcajada, P. et al. Chem. Rev. 2012, 112, 1232; Bétard.A .; Fischer, RA Chem. Rev. 2012, 112, 1055).

18. Na presente invenção, o complexo de Cobre-benzeno-1,3,5-tricarboxilato (Cu-BTC) foi utilizado como modificador de eletrodo. Também conhecido como MF-199 ou HKUST-1 é uma das redes metal-orgânicas mais estudadas. Trata-se de um sólido microporoso com dois tipos de poros, o qual pode ser sintetizado utilizando uma variedade de métodos, incluindo síntese convencional solvotérmica, assistida por micro-ondas, síntese à temperatura ambiente, síntese por ultrassom, por precipitação, eletroquímica, entres outras (Zhuang etal. Adv. Func.Mater. 2011,21,1442-1447).18. In the present invention, the Copper-benzene-1,3,5-tricarboxylate complex (Cu-BTC) was used as an electrode modifier. Also known as MF-199 or HKUST-1 is one of the most studied metal-organic networks. It is a microporous solid with two types of pores, which can be synthesized using a variety of methods, including conventional solvothermal synthesis, assisted by microwave, synthesis at room temperature, ultrasound synthesis, by precipitation, electrochemistry, entres others (Zhuang etal. Adv. Func.Mater. 2011,21,1442-1447).

19. A capacidade de manipular a superfície do eletrodo tem promovido um avanço tecnológico na área dos eletrodos quimicamente modificados. Isso tem conduzido ao desenvolvimento de processos alternativos de determinação de substratos de interesse clínico, importantes para diagnóstico e análise de condições clínicas, onde sensores com rápida detecção, alta sensibilidade e especificidade são19. The ability to manipulate the electrode surface has promoted technological advances in the area of chemically modified electrodes. This has led to the development of alternative processes for determining substrates of clinical interest, important for diagnosis and analysis of clinical conditions, where sensors with rapid detection, high sensitivity and specificity are

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6/12 cada vez mais requeridos.6/12 increasingly required.

20. Neste invento' foi utilizada a rede metal-orgânica CU3BTC2 no desenvolvimento de um sensor para a determinação de GSH. As vantagens de usar essa matriz como alternativa de modificador de eletrodo para utilização em voltametria cíclica está em suas propriedades eletrocatalíticas e na sua grande área superficial, alto volume de poros e alta estabilidade química. Além disso, no organismo, a glutationa se liga naturalmente a íons metálicos endógenos tais como cobre, via reações não enzimáticas. Assim, a rede metal-orgânica escolhida foi à base de cobre, de forma a mimetizar essa afinidade.20. In this invention 'the metal-organic network CU3BTC2 was used in the development of a sensor for the determination of GSH. The advantages of using this matrix as an alternative electrode modifier for use in cyclic voltammetry are in its electrocatalytic properties and in its large surface area, high pore volume and high chemical stability. In addition, in the body, glutathione naturally binds to endogenous metal ions such as copper, via non-enzymatic reactions. Thus, the chosen metal-organic network was based on copper, in order to mimic this affinity.

21. A presente invenção ainda apresenta a vantagem de ser um método analítico econômico, que conduz a resultados mais rápidos, exatos e reprodutíveis, com manipulações de pequenas quantidades de amostra, que podem ser aplicáveis a medidas iç vitro” e substituir as metodologias tradicionalmente usadas nesta área.21. The present invention still has the advantage of being an economical analytical method, which leads to faster, more accurate and reproducible results, with manipulations of small amounts of sample, which can be applicable to IVET measurements ”and replace the traditionally used methodologies in this area.

22. Um outro aspecto da invenção refere-se a ser um sensor de fácil construção, que requer procedimentos simples de manuseio, sem necessidade de grandes processos de preparação, cuja análise pode ser realizada até mesmo com equipamentos portáteis.22. Another aspect of the invention relates to being a sensor of easy construction, which requires simple handling procedures, without the need for major preparation processes, whose analysis can be carried out even with portable equipment.

23. Em um aspecto particular, o sensor desenvolvido mostrou resposta catalítica para a oxidação de GSH em tampão fosfato pH 3,0, com um potencial de oxidação de 0,5V vs. Ag/AgCl, 0 qual foi menor quando comparado com outros eletrodos metálicos na literatura, onde 0 potencial de oxidação é geralmente de 1,1 V.23. In a particular aspect, the developed sensor showed a catalytic response to the oxidation of GSH in phosphate buffer pH 3.0, with an oxidation potential of 0.5V vs. Ag / AgCl, which was lower when compared to other metallic electrodes in the literature, where the oxidation potential is generally 1.1 V.

24. Até a presente data, poucos dados estão disponíveis sobre as propriedades eletroquímicas das redes metal-orgãnicas, e 0 estudo de sua aplicação na eletroquímica ainda está engatinhando. Entretanto, combinando suas características de porosidade, alta área superficial, bem como as propriedades eletrocatalíticas dos seus íons metais, um novo método para a modificação da superfície de eletrodos, produzindo EQMs, pode ser promissor no desenvolvimento de novos sensores eletroquímicos e biossensores com propriedades analíticas e eletroquímicas24. To date, little data is available on the electrochemical properties of metal-organic networks, and the study of its application in electrochemistry is still in its infancy. However, combining its porosity characteristics, high surface area, as well as the electrocatalytic properties of its metal ions, a new method for modifying the surface of electrodes, producing NDEs, can be promising in the development of new electrochemical sensors and biosensors with analytical properties and electrochemical

21/34 τιη favoráveis.21/34 favorable τιη.

25. Para fins analíticos, raros sensores eletroquímicos para glutationa foram desenvolvidos até o momento, e nenhum deles utilizava como material de reconhecimento químico uma rede metal-orgânica catalítica imobilizada sobre um eletrodo base. Este invento é o primeiro a utilizar a rede metal-orgânica CU3BTC2 para obtenção de um sensor com propriedades analíticas e eletroquímicas favoráveis, tais como sensibilidade, range analítico, e estabilidade. Estas características devem-se ao elevado número de locais ativos que este tipo de material possui, a forte aderência, bem como outras propriedades complementares.25. For analytical purposes, rare electrochemical sensors for glutathione have been developed so far, and none of them used a catalytic metal-organic network immobilized on a base electrode as chemical recognition material. This invention is the first to use the metal-organic network CU3BTC2 to obtain a sensor with favorable analytical and electrochemical properties, such as sensitivity, analytical range, and stability. These characteristics are due to the high number of active sites that this type of material has, the strong adhesion, as well as other complementary properties.

26. Apenas dois artigos foram encontrados na literatura (Hosseini, H. et al. Biosensors and Bioelectronics 2013, 42, 426-429; Hosseini, H. et al. Electrochímica Acta 2013, 88, 301-309) utilizando a rede metal-orgânica Cu₃BTC₂ como modificador de eletrodo. Entretanto, os sensores construídos com este material foram utilizados para detecção de outros analitos alvos, respectivamente, cisteína e a hidrazina. Além disso, os autores não conseguiram uma resposta catalítica ótima que justificasse o uso apenas da rede metal-orgânica como modificador. As características de porosidade e alta área superficial da rede foram combinadas com as propriedades de nanopartículas de ouro para obter a resposta eletrocatalítica desejada, aumentando os custos dos sensores eletroquímicos desenhados, o que, em muitos casos, não seria viável economicamente para análises clínicas rotineiras.26. Only two articles were found in the literature (Hosseini, H. et al. Biosensors and Bioelectronics 2013, 42, 426-429; Hosseini, H. et al. Electrochímica Acta 2013, 88, 301-309) using the metal- organic Cu ₃ BTC ₂ as an electrode modifier. However, the sensors constructed with this material were used to detect other target analytes, respectively, cysteine and hydrazine. In addition, the authors did not achieve an optimal catalytic response that justified the use of only the metal-organic network as a modifier. The porosity and high surface area characteristics of the network were combined with the properties of gold nanoparticles to obtain the desired electrocatalytic response, increasing the costs of the designed electrochemical sensors, which, in many cases, would not be economically viable for routine clinical analyzes.

27. Apenas uma patente brasileira foi encontrada na área deste invento. Trata-se de um sensor amperométrico para determinação da atividade da enzima Glutationa Redutase em amostras de hemolisado de hemácias (Carta Patente n° Pl 0202893-0, 2015). Neste invento, o sensor desenvolvido teve como objetivo detectar não a presença e/ou quantidade da Glutationa como biomarcador, mas a atividade de uma das enzimas envolvidas no metabolismo desta biomolécula, o que diferencia do invento aqui apresentado.27. Only one Brazilian patent was found in the area of this invention. It is an amperometric sensor for determining the activity of the enzyme Glutathione Reductase in samples of red blood cells (Patent Letter No. 0202893-0, 2015). In this invention, the developed sensor aimed to detect not the presence and / or quantity of Glutathione as a biomarker, but the activity of one of the enzymes involved in the metabolism of this biomolecule, which differs from the invention presented here.

28. No sistema desenvolvido, as partículas de CuBTC (4) foram imobilizadas na superfície de um eletrodo de disco de ouro com diâmetro de 1,7 mm (5), apresentando28. In the developed system, CuBTC particles (4) were immobilized on the surface of a 1.7 mm diameter gold disc electrode (5), presenting

22/3422/34

8/12 contato elétrico de fio de ouro (6) embutido em haste de grafite de 6,50 mm x 750 mm de altura (7) e um anel Viton foi utilizado para fixar o eletrodo no orifício da tampa da célula eletroquímica (8) (FIGURA 2).8/12 gold wire electrical contact (6) embedded in 6.50 mm x 750 mm high graphite rod (7) and a Viton ring was used to fix the electrode in the hole in the electrochemical cell cover (8) (FIGURE 2).

29. Uma resina poliméria foi preparada a partir da mistura copolimérica de 2g de acrilamida e acrilato de sódio em 30 mL de solução alcóolica. Em seguida, 100mg de CuBTC em sua forma comercial (Basolite C300) fabricada pela Sigma Aldrich, foi adicionada e sonicada por 2 horas para completa homogenização da solução, formando a resina poliméria Cu-BTC. Para preparação do eletrodo modificado, uma alíquota (2pL) da resina polimérica foi depositada em um eletrodo de disco de ouro miniaturizado. Após secagem, um filme fino da Rede Metal-Orgânica cobre (II) benzeno - 1, 3, 5 - tricarboxilato foi formado na superfície do eletrodo de Ouro e identificado pela sigla CuBTC-EAu.29. A polymeric resin was prepared from the copolymeric mixture of 2 g of acrylamide and sodium acrylate in 30 mL of alcoholic solution. Then, 100mg of CuBTC in its commercial form (Basolite C300) manufactured by Sigma Aldrich, was added and sonicated for 2 hours for complete homogenization of the solution, forming the Cu-BTC polymeric resin. To prepare the modified electrode, an aliquot (2pL) of the polymeric resin was deposited on a miniaturized gold disc electrode. After drying, a thin film of the Metal-Organic Network copper (II) benzene - 1, 3, 5 - tricarboxylate was formed on the surface of the Gold electrode and identified by the acronym CuBTC-EAu.

30. Antes de ser utilizado como sensor, as propriedades eletroquímicas do eletrodo, quimicamente modificado foram estudadas por voltametria cíclica (VC) numa solução de 0, 1 mol L¹ de tampão fosfato em pH 3,0, utilizada como eletrólito de suporte.30. Before being used as a sensor, the electrochemical properties of the chemically modified electrode were studied by cyclic voltammetry (VC) in a solution of 0.1 mol L ¹ of phosphate buffer at pH 3.0, used as a supporting electrolyte.

31. Todas as medidas eletroquímicas foram realizadas em temperatura ambiente, com auxílio de um potenciostato/Galvanostato da Autolab PGSTAT 10, interfaciado a um microcorpputador com software NOVA 1.8 para controle do potencial, aquisição e tratamento de dados.31. All electrochemical measurements were performed at room temperature, with the aid of a potentiostat / Galvanostat from Autolab PGSTAT 10, interfaced to a microcorpputer with NOVA 1.8 software for potential control, acquisition and data treatment.

32. O sistema utilizado foi constituído de uma célula eletroquímica de 30 mL de capacidade volumétrica (9), fechada com uma tampa de teflon com três orifícios (10), utilizando-se um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata saturado com 3M de cloreto de potássio como eletrólito (Ag/AgCI(KCIsat))(11), um eletrodo auxiliar de fio de platina (12) e como eletrodo de trabalho o sensor desenvolvido (13) (FIGURA 3).32. The system used consisted of an electrochemical cell of 30 mL of volumetric capacity (9), closed with a Teflon cap with three holes (10), using a 3M silver / silver chloride reference electrode of potassium chloride as an electrolyte (Ag / AgCI (KCIsat)) (11), an auxiliary platinum wire electrode (12) and as the working electrode the developed sensor (13) (FIGURE 3).

33. Após otimização das condições operacionais do sensor - 10mL de Tampão Fosfato 0,1 mol L'¹, utilizado como eletrólito de suporte; pH 3.0; potencial aplicado= 0,4 a 1V; taxa de varredura 50,0 mVs‘¹; tempo de resposta =15 minutos - os resultados33. After optimizing the operational conditions of the sensor - 10mL of 0.1 mol L ' ¹ Phosphate Buffer, used as a support electrolyte; pH 3.0; applied potential = 0.4 to 1V; scan rate 50.0 mVs'¹; response time = 15 minutes - the results

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9/12 mostraram que com a adição da glutationa no meio de reação há o aparecimento de um novo pico de oxidação, no potencial de 0.5V, o qual é devido a interação do metal do eletrodo modificado com o grupamento -SH da glutationa, formando um novo complexo (FIGURA 4). Este sinal, portanto, é utilizado para detectar a presença e a quantidade de glutationa em uma amostra, levando em consideração respectivamente o potencial da curva de oxidação e a intensidade da corrente.9/12 showed that with the addition of glutathione in the reaction medium there is the appearance of a new oxidation peak, at the 0.5V potential, which is due to the interaction of the modified electrode metal with the -SH group of the glutathione, forming a new complex (FIGURE 4). This signal, therefore, is used to detect the presence and amount of glutathione in a sample, taking into account respectively the potential of the oxidation curve and the intensity of the current.

34. Nas condições aqui apresentadas, com o aumento da concentração de glutationa na solução há um aumento proporcional do valor de corrente. A glutationa é oxidada cataliticamente pelo CuBTC-EAu gerando um sinal elétrico, e uma equação de regressão linear, Ip (μΑ) = 0.5 [GSH] (μΜ) + 0.40, foi estabelecida de acordo com a mudança de corrente e a concentração de glutationa na solução, com um coeficiente de correlação (r²) de 0,9965 (FIGURA 5). Onde Ip é a densidade de corrente de pico anódica em μΑ e [GSH] é a concentração da GSH em μΜ.34. Under the conditions presented here, with the increase in the concentration of glutathione in the solution there is a proportional increase in the current value. Glutathione is catalytically oxidized by CuBTC-EAu generating an electrical signal, and a linear regression equation, Ip (μΑ) = 0.5 [GSH] (μΜ) + 0.40, was established according to the current change and the glutathione concentration in the solution, with a correlation coefficient (r ² ) of 0.9965 (FIGURE 5). Where Ip is the anodic peak current density in μΑ and [GSH] is the concentration of GSH in μΜ.

35. O sensor desenvolvido apresenta, portanto, uma boa atividade eletrocatalítica para a oxidação da glutationa, com baixo limite de detecção (0.05 μΜ) e35. The developed sensor therefore has good electrocatalytic activity for the oxidation of glutathione, with a low detection limit (0.05 μΜ) and

I uma faixa linear de resposta de 0.05-2μΜ, além de boa estabilidade e reprodutibiíidade. A aplicabilidade potencial do sensor foi demonstrada pelo seu uso na determinação analítica da concentração de glutationa em amostras biológicas (FIGURA 6).I a linear response range of 0.05-2μΜ, in addition to good stability and reproducibility. The potential applicability of the sensor was demonstrated by its use in the analytical determination of the glutathione concentration in biological samples (FIGURE 6).

36. Para os testes em amostras reais, foram coletadas amostras sanguíneas (5 mL) de indivíduos saudáveis, através de punção da veia intermédia do braço, por um profissional qualificado. Tal procedimento teve liberação do comitê de ética em pesquisa sob o número de protocolo 041512/2014.36. For tests on real samples, blood samples (5 mL) were collected from healthy individuals, through puncture of the intermediate arm vein, by a qualified professional. This procedure was approved by the Research Ethics Committee under protocol number 041512/2014.

37. As amostras de sangue foram coletadas em tubos contendo solução anticoágulante (EDTA- ácido etiíenodiamino tetra-acético) e centrifugadas a 1000 x g por 10 minutos, extraindo-se o sobrenadante. Após centrifugação,, estes foram armazenados em tubos criogênicos a -80°C, devidamente identificados, para posterior análise.37. Blood samples were collected in tubes containing anticoagulant solution (EDTA - ethylenediamine tetraacetic acid) and centrifuged at 1000 x g for 10 minutes, extracting the supernatant. After centrifugation, they were stored in cryogenic tubes at -80 ° C, duly identified, for further analysis.

38. Nos estudos voltamétricos, uma alíquota de 500 pLfoi diluída em 9,5 mL de38. In voltammetric studies, a 500 pL aliquot was diluted in 9.5 mL of

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10/12 solução tampão fosfato de sódio 0,1 mol L'¹ em pH 3,0 (1:20, W) e submetida a análise por voltametria cíclica (VC) nas mesmas condições anteriormente otimizadas para o sensor desenvolvido.10/12 0.1 mol L ' ¹ sodium phosphate buffer solution at pH 3.0 (1:20, W) and subjected to cyclic voltammetry (VC) analysis under the same conditions previously optimized for the developed sensor.

39. Como pode ser dbervado na FIGURA 6, a qual mostra o voltamograma de uma amostra de soro, a oxidação ocorre praticamnte no mesmo potencial encontrado para as amostras padrão de glutationa, o que demonstra a sensibilidade e efetividade do sensor para a detecção deste analito em amostras complexas, sem que ocorram interferências de outras espécies. Além disso, as medidas em triplicatas demonstram a reprodutibilidade do método, uma vez que a intensidade da corrente (l(A)) de eletrooxidação da glutationa ocorrem em valores muito próximos e dentro da faixa linear de detecção obtida.39. As can be seen in FIGURE 6, which shows the voltammogram of a serum sample, oxidation occurs practically at the same potential found for standard glutathione samples, which demonstrates the sensitivity and effectiveness of the sensor for the detection of this analyte in complex samples, without interference from other species. In addition, measurements in triplicates demonstrate the reproducibility of the method, since the intensity of the current (l (A)) of electrooxidation of glutathione occurs in very close values and within the linear range of detection obtained.

40. A concentração de Glutationa nas amostras de soro analisadas pelo método de voltametria cíclica utilizando o Sensor eletroquímico CuBTC-EAu foi de aproximadamente 1,69 ± 0,04 μΜ, o que corrobora com os dados da literatura (Frei, B.; Crit. Rev, Food Sei. Nutr. 1995, 35, 83; Halliwell, B.; Gutteridge, J. M. C.; Free Radical in Biology and Medicine, 3^rd ed., University Press: Oxford, 2007; Navarro, J et al. Free Radical Biol. Med. 1999, 26, 410-418) quanto aos valores de referência deste antioxidante em sangue humano (TABELA 1).40. The concentration of Glutathione in the serum samples analyzed by the cyclic voltammetry method using the CuBTC-EAu Electrochemical Sensor was approximately 1.69 ± 0.04 μΜ, which corroborates with the literature data (Frei, B .; Crit Rev, Food Sei. Nutr. 1995, 35, 83; Halliwell, B .; Gutteridge, JMC; Free Radical in Biology and Medicine, 3 ^rd ed., University Press: Oxford, 2007; Navarro, J et al. Free Radical Biol. Med. 1999, 26, 410-418) regarding the reference values of this antioxidant in human blood (TABLE 1).

Tabela 1. Valores de referência para Glutationa em sangue humano Table 1. Reference values for blood glutathione human Antioxidades Antioxities Valores de referência Reference values Glutationa - GSH (Plasma) Glutathione - GSH (Plasma) 1-3 μΜ 1-3 μΜ Glutationa - GSH (Soro) Glutathione - GSH (Serum) 1-3 μΜ 1-3 μΜ

Fonte: Adapatadâ de Frei (1995), Halliwell e Gutteridge (2007) e Navarro (1999).Source: Adapatadâ de Frei (1995), Halliwell and Gutteridge (2007) and Navarro (1999).

41. Breve descrição das Figuras. As características e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes na descrição detalhada das características e resultados preferidos da invenção, com referência às figuras anexas.41. Brief description of the Figures. The features and advantages of the present invention will become apparent in the detailed description of the preferred features and results of the invention, with reference to the accompanying figures.

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11/1212/11

42. Figura 1 - Estrutura Química da Glutationa.42. Figure 1 - Chemical structure of Glutathione.

43. Figura 2 - Eletrodo química mente modificado CuBTC-EAu.43. Figure 2 - Chemically modified CuBTC-EAu electrode.

44. Figura 3 - Sistema Eletroquímico.44. Figure 3 - Electrochemical System.

45. Figura 4 - Voltamogramas do CuBTC-EAu em 0,1 mol L‘¹ de Solução Tampão Fosfato pH 3.0 após 15 min. de contato (linha azul) e na presença de 0,8mM de Glutationa (linha vermelha).45. Figure 4 - CuBTC-EAu voltamograms in 0.1 mol L ' ¹ of Phosphate Buffer Solution pH 3.0 after 15 min. contact (blue line) and in the presence of 0.8mM Glutathione (red line).

46. Figura 5 - Voltamogramas do CuBTC-EAu em soluções com concentrações progressivas de Glutationa (GSH) em 0,1 mol L'¹ de Solução Tampão Fosfato pH 3.0 após 15 min, de contato. Curva de calibração obtida.46. Figure 5 - CuBTC-EAu voltamograms in solutions with progressive concentrations of Glutathione (GSH) in 0.1 mol L ' ¹ of Phosphate Buffer Solution pH 3.0 after 15 min of contact. Calibration curve obtained.

47. Figura 6 - Voltamogramas do CuBTC-EAu em soro sanguíneo diluído em 0,1 mol L‘¹ de Solução Tampão Fosfato pH 3.Ό após 15 min, de contato, realizado em triplicata.'47. Figure 6 - CuBTC-EAu voltamograms in blood serum diluted in 0.1 mol L ' ¹ of Phosphate Buffer Solution pH 3.Ό after 15 min of contact, performed in triplicate.'

48. A.invenção é aplicada para determinação de Glutationa reduzida em matrizes complexas, como é o caso de fluídos biológicos como sangue e urina, com elevada sensibilidade e baixos níveis de interferência, associados com a rapidez que análises rotineiras relacionadas ao diagnóstico clínico exigem.48. The invention is applied to determine reduced Glutathione in complex matrices, as is the case with biological fluids such as blood and urine, with high sensitivity and low levels of interference, associated with the speed that routine analyzes related to clinical diagnosis require.

49. O método desenvolvido pode ter aplicabilidade visando o diagnóstico clínico de vários processos patológicos que estão associados ao estresse oxidativo, como câncer, diabetes, Síndrome da imuno-deficiência adquirida (SIDA) e doenças de Alzheimer e Parkinson. Em especial nos caso de câncer, onde a produção excessiva de radicais livres e espécies reativas de oxigênio está 'associada à geração de danos como apoptose e mutações.49. The method developed may be applicable for the clinical diagnosis of various pathological processes that are associated with oxidative stress, such as cancer, diabetes, acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and Alzheimer's and Parkinson's diseases. Especially in the case of cancer, where the excessive production of free radicals and reactive oxygen species is associated with the generation of damage such as apoptosis and mutations.

50. Indivíduos com neoplasia possuem concentrações elevadas de marcadores oxidantes e concentrações reduzidas de substâncias antioxidantes. Além disso, pacientes submétidos ao tratamento por quimioterapia ou radioterapia tem conduzido a uma diminuição da capacidade antioxidante total devida à diminuição significativa dos50. Individuals with neoplasia have high concentrations of oxidizing markers and low concentrations of antioxidant substances. In addition, patients undergoing chemotherapy or radiation therapy have led to a decrease in total antioxidant capacity due to a significant decrease in

26/3426/34

12/12 níveis de gluíationa.-Esta capacidade anti-oxidante vem ainda mais afetada com o estádio da doença e consequentemente com a gravidade da mesma, uma vez que os marcadores antioxidantes são encontrados em níveis significativamente mais baixos.12/12 levels of gluíathione.- This anti-oxidant capacity is even more affected with the stage of the disease and consequently with its severity, since the antioxidant markers are found at significantly lower levels.

Assim a presente invenção ap!ica-se também ao acompanhamento da resposta terapêutica.Thus, the present invention also applies to monitoring the therapeutic response.

27/3427/34

1/21/2

Claims

Λ

1. Electrochemical sensor based on the metal-organic network CU3BTC2 for detection of reduced glutathione in biological samples, characterized by addressing a three-electrode system, being a platinum wire counter electrode, a silver / silver chloride reference electrode (Ag / AgCl (KCl _sat )) and a gold working electrode chemically modified with the copper-benzene-1,3,5-tricarboxylate metal-organic structure (CuBTC), in reaction medium containing 0.1 mol L phosphate buffer ^{- 1} at pH 3, for the detection of reduced glutathione.

2. Electrochemical sensor based on the metal-organic network Cu ₃ BTC ₂ for detection of reduced glutathione in biological samples, according to Claim 1, characterized by addressing the cyclic voltammetry method for catalytic electro-oxidation of glutathione at low potentials.

3. Method of preparation of chemically modified electrodes, characterized by using catalytic metal-organic networks immobilized on a base electrode as a chemical recognition material.

4. Method of preparation of the electrochemical sensor based on the metal-organic network Cu3BTC2, according to Claim 1, characterized in that it comprises the preparation of a polymeric resin consisting of the sodium acrylamide-acrylate copolymer and the metal-organic structure CuBTC, forming a polymeric film, which is deposited on the surface of a miniaturized gold disc electrode.

5. Method for detecting reduced glutathione in biological samples, characterized by using the electrochemical sensor described in Claim 1, for the analysis of oxidative stress in the areas of human or veterinary medicine.

Petition 870160071353, of 11/29/2016, p. 4/5

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6. Method for detecting reduced glutathione in biological samples, characterized by using the electrochemical sensor as defined in Claim 1, for the determination and quantification of reduced glutathione in blood serum samples from individuals for the clinical diagnosis of various pathological processes that are associated with oxidative stress, such as cancer, arteriosclerosis, leukemia, diabetes, AIDS and Alzheimer's and Parkinson's disease.

7. Method for detecting reduced glutathione in biological samples, characterized by using the electrochemical sensor as defined in Claim 1, for the determination and quantification of reduced glutathione in blood serum samples from cancer patients undergoing treatment by chemotherapy or radiation therapy. to monitor the therapeutic response.

8. Method for detecting reduced glutathione in biological samples, characterized by using the electrochemical sensor as defined in Claim 1, for the determination and quantification of reduced glutathione in blood samples from athletes, to assess oxidative stress induced by physical training.

Petition 870160071353, of 11/29/2016, p. 5/5

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FIGURES

FIGURE 1

I

FIGURE 2

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2/4

FIGURE 3

- · 13

FIGURE 4 j i i i i i i i i i i i i i i L

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

-1.0

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-2.0

-2.5

-3.0

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

E (V) vs Ag / AgCl, KCI (sat.)

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FIGURE 5

1.5 (10® 1.0 (10® 5.0 (10 0.0 -5.0 (10 ⁷ -1.0 (10® -1.5 (10® -20 (10® -25 (10® -3.0 (10® -3.5 (10® -4.0 ( 10th

- \ GQO5Ú \ / IG6HCLB1OEA - \ € Q1 il / IGEHCLBTOEAi - \ GQ3ú \ / IG6HCLB1OEAi --XGQõúVIGEHCLBIOEAi - \ GQ7Ú \ / IG6HCLB1OB \ = \ € 1 μΜΟΕΗΟΒΙΌΕΑι - \ ΗΟΒ22μΜΟ5

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

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4/4

FIGURE 6

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1/1