BR102016016548A2 - Composições farmacêuticas à base de extrato de remijia ferruginea e uso como cicatrizante em feridas cutâneas - Google Patents

Abstract

composições farmacêuticas à base de extrato de remijia ferruginea e uso como cicatrizante em feridas cutâneas. a presente invenção refere-se a composições à base de extrato hidroalcoólico das partes aéreas de remijia ferruginea para o tratamento de feridas cutâneas e que poderão ser usadas pela indústria farmacêutica na produção de medicamentos e ou de fitoterápicos, podendo ser manipulado em diferentes formas galênicas, como pomadas, gel transdérmico, loções e cremes.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS À BASE DE EXTRATO DE REMIJIA FERRUGINEA E USO COMO CICATRIZANTE EM FERIDAS CUTÂNEAS (51) Int. Cl.: A61K 36/74; A61P 17/02 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA (72) Inventor(es): MARISA ALVES NOGUEIRA DIAZ; TANIA TOLEDO DE OLIVEIRA; VÍRGINIA RAMOS PIZZIOLO; SÉRGIO LUIS PINTO DA MATTA; LEANDRO JOSÉ GUSMÃO (57) Resumo: COMPOSIÇÕES

FARMACÊUTICAS À BASE DE EXTRATO DE Remijia ferruginea E USO COMO CICATRIZANTE EM FERIDAS CUTÂNEAS. A presente invenção refere-se a composições à base de extrato hidroalcoólico das partes aéreas de Remijia ferruginea para o tratamento de feridas cutâneas e que poderão ser usadas pela indústria farmacêutica na produção de medicamentos e ou de fitoterápicos, podendo ser manipulado em diferentes formas galênicas, como pomadas, gel transdérmico, loções e cremes.

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COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS À BASE DE EXTRATO DE Remijia ferruginea E USO COMO CICATRIZANTE EM FERIDAS CUTÂNEAS [1] A presente invenção refere-se às composições ativas para o tratamento de feridas cutâneas e que poderão ser usadas pela indústria farmacêutica na produção de medicamentos e ou de fitoterápicos para tratamento de pessoas com esse tipo de patologia já que as feridas ainda são um problema de saúde humana e animal devido à complexidade do tratamento e complicações recorrentes, gerando custos elevados.

ESTADO DA TÉCNICA [2] Denomina-se ferida toda e qualquer ruptura da continuidade do tecido, desde pele, músculos e ossos decorrente da lesão por agentes mecânicos, térmicos, químicos ou bacterianos (COLTRO, O.S.; FERREIRA, M.C.; BATISTA, B.P.S.N.; NAKAMOTO, H.A.; MILCHESKI, D.A.; TUMA, J.R.P. Atuação da cirurgia plástica no tratamento de feridas complexas. Rev Col Bras Cir, v.38, n.6, p.381-6, 2011). As feridas são classificadas quanto à causa, conteúdo microbiano, tipo de cicatrização, grau de abertura e tempo de duração. Tais classificações são uteis para determinar qual melhor tratamento para uma determinada ferida (PAVLETC, M.M. Atlas of small animal wound management and reconstructive surgery.3.ed. lowa: Wiley-Blackwell, 2010).

[3] As feridas podem ser cirúrgicas, traumáticas ou ulcerativas. Feridas cirúrgicas são provocadas intencionalmente por: incisão, quando não ha perda de tecido e são geralmente fechadas por sutura; excisão quando há remoção de tecido e punção quando resultam de procedimentos terapêuticos diagnósticos. Feridas traumáticas podem ser provocadas acidentalmente por agentes mecânicos (perfuração, corte ou contenção); químicos (iodo, cosméticos) e físicos como: calor, frio e radiação (MANTOVANI, M. & FONTELLES, M. J. Feridas traumáticas. In: Jorge, A. S.; Dantas S. R. P. E. Abordagem multiprofissional do tratamento de feridas. São Paulo: Atheneu, 2003). As feridas ulcerativas são resultantes de traumatismo ou doenças relacionadas com impedimento do suprimento de sangue. As úlceras de pele podem ser por pressão, por estase venosa, arteriais e diabéticas (SANTOS, J.B., Avaliação e tratamento de feridas:

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2/16 orientações ao profissional de saúde. Porto alegre: Hospital das Clinicas de Porto Alegre, 2011).

[4] De acordo com o conteúdo microbiano, as feridas podem ser limpas, limpas contaminadas, contaminadas ou infectadas. As feridas limpas são lesões que ocorrem em condições assépticas. As feridas limpas contaminadas são aquelas com evolução inferior a 6 horas entre o trauma e o atendimento, sem contaminação significativa. Já as feridas contaminadas são aquelas com mais de 6 horas de evolução entre o trauma e o atendimento, apresentando sinais de infecção. As feridas consideradas infectadas apresentam agente infeccioso no local, com evidencia de reação inflamatória, necrose e secreção purulenta (SANTOS, J.B., Avaliação e tratamento de feridas: orientações ao profissional de saúde. Porto alegre: Hospital das Clinicas de Porto Alegre, 2011).

[5] Quanto ao tipo de cicatrização as feridas podem ser de primeira intenção, quando há aproximação direta das bordas sem perda de tecido e geralmente fechadas por sutura; segunda Intenção, quando há perda de tecido, as bordas ficam distantes, sendo o processo de cicatrização mais lento e terceira Intenção, quando são corrigidas cirurgicamente, afim de que apresentem melhores resultados funcionais e estéticos. Quanto ao grau de abertura, as feridas podem ser abertas quando as bordas estão afastadas ou fechadas quando as bordas estão justapostas. Quanto ao tempo as feridas podem ser agudas, originadas por cirurgia ou trauma, em que a reparação ocorre em tempo adequado, sem complicações, e crônicas são aquelas em que o período de cicatrização é maior que o esperado devido a sua etiologia (ETHRIDGE, R. T.; LEONG, M.; PHILLIPS, Μ. T. Cicatrização deferidas. In: TOWNSEND, M. C. et al. Tratado de Cirurgia. Rio de Janeiro: Elsevier, 2010).

[6] A cicatrização consiste em uma perfeita e coordenada cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a reconstituição do tecido. Tal evento é um processo dinâmico que envolve fenômenos bioquímicos e fisiológicos de forma seqüencial, a fim de garantir a restauração tissular (MANDELBAUM, S.H.; Dl SANTIS, E.P.; MANDELBAUM, M.H.S. Cicatrização: conceitos atuais e recursos auxiliares-Partel. An Bras Dermatol, v.78, n.4, p.393-410, 2003).

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3/16 [7] A reparação cutânea é um processo complexo, que envolve inflamação, reepitelização, angiogênese, formação de tecido de granulação e deposição de matriz intersticial, eventos realizados por diferentes tipos de células como, fibroblastos, células inflamatórias e pela matriz intersticial e fatores de crescimento, de modo a reparar os tecidos danificados (TENIUS, F.P.; BIONDOSIMÕES, M.L.P.; IOSHII, S.O. Efeitos do uso crônico da dexametasona na cicatrização de feridas cutâneas em ratos. Anais Brasileiros de Dermatologia, v.82, p.141-149, 2007).

[8] Uma sequência de eventos acontece após o ferimento e, portanto, existem diferentes classificações didáticas para facilitar o entendimento do processo. Convenientemente, o processo de cicatrização tem sido dividido em três fases que se sobrepõem de forma continua e temporal: inflamatória, proliferativa e remodelagem ou maturação (PAVLETC, M.M. Atlas of small animal wound management and reconstructive surgery.3.ed. lowa: Wiley-Blackwell, 2010; SCHEREMI, S.; SZEIMIES, R.M.; KARRER, S.; HEINLIN, J.; LANDTHALER, M.; BABILAS, P. The impact of the PH value on skin integrity and cutaneous wound healing. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, v.24, n.4, p.373-378, 2010). Existem autores que consideram mais detalhadamente estas três fases em cinco estágios principais: coagulação, inflamação, proliferação, contração e remodelação da ferida (MANDELBAUM, S.H.; Dl SANTIS, E.P.; MANDELBAUM, M.H.S. Cicatrização: conceitos atuais e recursos auxiliares-Partel. An Bras Dermatol, v.78, n.4, p.393-410, 2003). As fases da cicatrização são processos entrelaçados e é possível haver um agente terapêutico que acelere uma fase, mas cause inibição de outra (FAHIE, M.A.; SHETTKO, D. Evidence-based wound management: a systematic review of therapeutic agents to enhance granulation and epithelization. Veterinary Clinics of North Amerca small Animal Practice, v.37, n.3, p.559-577, 2007).

[9] A possibilidade de acelerar a cicatrização e o fechamento de lesões cutâneas, através de recursos químico-medicamentoso ou físico, tem sido objeto de estudo de diversos pesquisadores. O entendimento dos processos de cicatrização é essencial para uma abordagem ponderada ao tratamento de feridas (BEHEREGARAY, W.K.; GIANOTTI, G.C.; LEAL, J.S.; GARCEZ, T.; CONTESINI,

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E.A. Eletroetimulação na cicatrização de feridas cutâneas experimentais em coelhos. Ciência Rural, v.44, n.5, p.878-883, 2014).

[10] A terapia tópica de feridas é fundamentada em estudos científicos sobre a fisiologia de reparação tecidual, e é norteada pelos seguintes princípios: remover tecidos necróticos e corpos estranhos no leito da ferida, eliminar processos infecciosos, absorver o excesso de exudato, manter úmido o leito da ferida, promover isolamento térmico e proteger a ferida de traumas e contaminação bacteriana (BLANES, L. Tratamento de feridas: Cirurgia vascular, Guia Ilustrado. São Paulo: 2004).

[11] A escolha dos agentes tópicos pode variar de acordo com a dinâmica das feridas (GODOY, J.M.P.; PRADO, P.A. Ácidos graxos essenciais enriquecidos com vitamina A, E e ácido linoléico como pensos em feridas crônicas. Revista Portuguesa de Clinica Geral, v.21, n.2, p. 193-5, 2005). Os medicamentos utilizados para melhorar na cicatrização utilizam uma variedade de mecanismos diferentes. Estes incluem a manutenção de ambiente úmido (hidrocoloides, hidrogel, alginatos); fornecimento de energia local (maltodextrina, mel, açúcar); redução do edema da ferida (alginatos, mel, açúcar, acemanann); aumento do nível de fatores de crescimento (complexo tripeptideo-cobre); o fornecimento de substância ativa (colágeno, membranas biológicas); o aumento da resposta inflamatória; o controle da infecção; auxilio no debridamento ( enzimas tópicas); e o aumento no fluxo sanguíneo como o laser, radiação ultravioleta e estimulação elétrica (KRAHWINKEL, D.J.; BOOTHE, H.W. Tropical and systemic medications for wounds. Vet. Clin. Small. Anim, v.36, n.4, p.739-757, 2006).

[12] Apesar da variedade de medicamentos tópicos utilizados para o tratamento de feridas e o desenvolvimento de novos fármacos, tanto pela química sintética como na biotecnologia, os produtos naturais, com plantas medicinais, continuam sendo uma grande fonte de medicamentos para este fim e para o tratamento de várias condições patológicas, tendo sua origem na medicina popular (OLIVEIRA, S.T.; LEME, M.C.; PIPPI, N.L.;RAISER, A.G.; MANFRON, M.P. Formulações de confrei na cicatrização de feridas cutâneas de ratos. Rev FZVA, v.7/8, n.1, p.6474, 2000; GONÇALVES, R.V.; SARANDY, M.M.; MATTA,

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S.L.P.; NOVAES, R.D.; PINTO, M.V.M. Comparative study of the effects of laser photobiomodulation and extract of Brassica oleracea on skin wounds in wistar rats: A histomorphometric study. Pathology- Research and Practice, v.209, n.10, p.648-543, 2013).

[13] E m busca realizada nos bancos de patentes nacionais e internacionais não foram encontrados documentos de patentes que apresentem tecnologias similares utilizando extrato da planta Remijia ferruginea (A. St.-Hil) D.C para uso como cicatrizante, entretanto foram encontrados relatos do uso dessa planta como componente do fitoterápico Lerobina®, comercializado no mercado nacional há 67 anos, indicado para o tratamento de dispepsias é constituído pelos extratos fluídos de três espécies de plantas nativas incluindo a espécie em estudo, Remijia ferruginea.

[14] Foram encontrados relatos também do uso dessa planta como em preparações galênicas utilizando cascas do caule como tônico, amargo, estimulante digestivo e do apetite, além da ação febrícula, contra a fadiga e malária (ANDRADE-NETO, V.F.; BRANDÃO, M.G.L.; STEHMANN, J.R.; OLIVEIRA, L.A. & KRETTLI, A.V. Antimalarial activity of Chinchona-like plantas esed to treat fiver and malaria in Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v.87, p.253-256, 2003; Braga, F.C., Valadares, Y.M., Costa, M.A., Lombardi, J.A., Oliveira, A.B. de Estudo fitoquímico de Erythraea centaurium, Jacaranda caroba, Remijia ferruginea e Solanum paniculatum visando identificar marcadores químicos para o fitoterápico lerobina®. Rev. Bras. Farmacogn., v. 13 supl 2, p. 28-31,2003).

[15] Foi encontrada uma tese de doutorado onde a autora relata os testes biológicos feitos com a casca do caule para absorção de lipídeos. (Ydia Mariele Valadares. Remijia ferruginea D.C., Jacaranda caroba D.C. e Solanum paniculatum L: fitoquímica, atividades biológicas e síntese de derivados dos ácidos ursólico e oleanólico. UFMG, 2009).

[16] O documento de patente JP8053360 refere-se a uma composição farmacêutica, cosmética e alimentar composta dos extratos de Jambosa vulgaris, Piper aduncum e Remijia ferruginea como agente anti-inflamatórios e antialérgicos, inibidores da liberação de histamina.

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6/16 [17] Remijia ferruginea (A. St.-Hil) D.C., pertencente à família das Rubiáceas, é uma espécie arbustiva, com registros nos estados de Minas Gerais, Mato Grosso, Espírito Santo, São Paulo, Rio de Janeiro, Pará, Amazonas, Acre, Roraima, Amapá, Rondônia, Tocantins é uma planta nativa, porém não é endêmica do Brasil. Ocorre principalmente em campo rupestre (http://reflora.jbrj. gov.br/jabot/FichaPublicaTaxonUC/FichaPublicaTaxonUC.do?id= FB128482). Conhecida popularmente como quina mineira, quina da serra ou quina de remijo, a parte mais usada é sua casca que é amarga, adstringente e indicada como febrícula (SAINT-HILAIRE, A. Plantas usuais dos brasileiros. Tradução de Cleonice Paes Barreto Mourão e Consuelo Fortes Santiago Belo Horizonte, Código de Comunicações, 2009. 392p.il) [18] 0 estímulo para patentear a presente invenção vem através do Ministério da Saúde Brasileiro que nos últimos anos, busca estimular a inserção das práticas complementares de cuidados no sistema oficial de saúde. Destacase a implementação da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) e a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) (BRASIL. Ministério da Saúde. Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Brasília: Ministério da Saúde, 2006a. 60p), que visam estimular o acesso à praticas complementares e às plantas medicinais, para o cuidado em saúde, de forma eficaz e segura [19] A composição farmacêutica contendo extrato de partes aéreas de Remijia ferruginea, objeto do atual pedido de patente promoveu a cicatrização da ferida, sendo eficaz na fase proliferativa da cicatrização, apresentando melhor índice de contração. Os parâmetros histomorfométricos indicam que essa composição modulou o processo inflamatório e aumentou a proliferação de fibroblastos. Além apresentar atividade proliferativa para fibroblastos humanos NIH3T3 cultivados in vitro.

[20] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas baseadas em extrato partes aéreas de Remijia ferruginea, a serem utilizadas como agentes terapêuticos no tratamento de feridas cutâneas. O extrato da planta poderá ser manipulado em diferentes formas galênicas, tais como pomadas, gel transdérmico, loções e cremes.

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DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [21] Figura 1 Efeito da pomada a 1% de R. ferrugínea na proliferação de fibroblastos NIH3T3. A porcentagem de viabilidade celular foi calculada com base no valor de referência do controle positivo (5 e 10% SFB). Letras diferentes indicam p<0,05 em comparação ao controle positivo para os valores de absorbância encontrados no teste MTT.

[22] Figura 2 Representação fotográfica da evolução macroscópica das feridas controles e experimental. Grupo tratado com solução fisiológica (G1SF0,9%), pomada veículo (G2-Veículo), pomada Fitoscar® (G3-FIT), Pomada R. ferrugínea 1% durante os dias zero, três, sete, 14 e 21 dias.

[23] Figura 3 Imagens histológicas de cortes transversais do tecido cicatricial comparativas dos grupos G1-SF (tratados com solução fisiológica), G2veículo (tratados com pomada veiculo), G3-FIT (tratados com Fitoscar®), G4Pomada R. ferrugínea. Coloração: Hematoxilina-eosina. Aumento: 20X.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [24] O extrato de Remijia ferrugínea foi preparado através do método de maceração. Para a produção do extrato bruto foi utilizados uma concentração de 1:2 p/v de parte aérea da planta em relação ao solvente álcool etílico/água, preferencialmente 1:1 (v/v), sendo acondicionado ao abrigo da luz por um período de 72 a 144h. O macerado assim obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo à baixa pressão, entre 55° e 85°C, até a retirada total do solvente, sendo após liofilizado e armazenado a 4°C até os testes in vitro e in vivo e a formulação da pomada.

[25] A pomada, creme ou gel transdérmico podem ser formuladas com o extrato de Remijia ferrugínea com concentração entre 0,1% e 10%, utilizando-se propilenoglicol (1 a 10%) e de 80 a 98 % de veículo, como por exemplo vaselina no caso de pomada, que constituem a base para a obtenção da formulação farmacêutica descritas.

[26] A pomada Fitoscar® foi escolhida como referência (controle positivo grupo G3-FIT), pois já é encontrada no mercado, possui registro no Ministério da

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Saúde, possui eficácia comprovada, é segura para o uso e por ser um produto Fitoterápico, similar ao utilizado no estudo.

EXPERIMENTOS DE DEMONSTRAÇÃO

Teste preliminar de proliferação celular in vitro em culturas celulares de fibroblastos humanos [27] 0 teste de estimulação da proliferação foi adaptado de (PONNUSAMY, Y.; CHEAR, N. J.; RAMANATHAN, S.; LAI, C. S. Polyphenols rich fraction of Dicranopteris linearis promotes fibroblast cell migration and proliferation in vitro. Journal of Ethnopharmacology, v. 168, p. 305-14, 2015). O meio de cultura utilizado para cultivo e manutenção das células foi o RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado (SFB, 10%), penicilina (100 Ul/ml) e estreptomicina (100 pg/mL). Os fibroblastos humanos (NIH3T3) foram mantidos em estufa, a 37° C, num ambiente enriquecido por CO2 a 5%.

[28] As células estoque, em crescimento sub confluente, foram centrifugadas e ressuspendidas em uma garrafa de cultivo contendo meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Uma alíquota da suspensão de células foi retirada para contagem em câmara de Neubauer e definição do volume de inóculo.

[29] As células foram inoculadas a uma concentração de 5000 células por poço em uma placa de 96 poços. A placa foi incubada por aproximadamente 24 h, em estufa a 37° C, 5% CO2, permitindo que as células se aderissem e se espalhassem nos poços. O meio de cultura anteriormente adicionado (RPMI, 10% SFB) foi então substituído por meio novo acrescido do extrato de Remijia ferruginea.

[30] Após a adição do meio novo acrescido das diferentes concentrações dos extratos e de SFB, a placa foi então incubada nas mesmas condições por mais 48h. A seguir, foram adicionados 10 pL de solução contendo o indicador MTT na concentração de 5 mg/mL e as placas foram incubadas por mais 4h. As placas tiveram seu conteúdo esgotado em descarte adequado e, aos poços, foram adicionados 200pL de DMSO. O DMSO permitiu a lise celular e, consequentemente, a liberação do indicador colorimétrico derivado do MTT. A quantificação do indicador foi realizada em leitor ELISA em λ= 540 nm. Foi

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9/16 construído um gráfico para indicar o efeito produzido pelas diferentes concentrações dos estímulos em relação ao padrão (% de viabilidade celular). A comparação entre os valores de absorbância adquiridos após o MTT foi utilizada para comparação estatística entre os tratamentos (teste-T) com a=5%.

Animais [31] Foram utilizados 144 ratos albinos adultos, da espécie Rattus Norvegicus, linhagem Wistar, com idade media de 120 dias, saudáveis, com massa corporal entre 250g e 350g, provenientes do Biotério Central da UFV.

[32] O tamanho da amostra foi baseado na Resolução RE n° 90, de 16 de março de 2004 da ANVISA, que tem por objetivo indicar métodos padronizados para estudos de toxicologia pré-clínica no Brasil que visam no futuro, o registro e renovação de fitoterápicos. O item três do anexo desta resolução determina o número mínimo de seis animais por grupo experimental, o que dispensa neste caso, a necessidade do uso de fórmulas estatísticas para obtenção do número da amostra.

[33] Antes de iniciar o estudo, os animais ficaram durante 30 dias em período de adaptação na área experimental do Laboratório de Biofarmácos da UFV. Durante o experimento os animais foram mantidos em gaiolas individuais cobertas com maravalha, temperatura controlada na faixa de 20°C a 25°C, fotoperíodo de 12h, com água e ração específica para roedores ad libitum.

Procedimento cirúrgico [34] O procedimento anestésico e a indução das feridas foram realizado sob a supervisão de um médico veterinário. Os animais foram sedados e anestesiados usando xilazina 2% (Anasedan®), 10mg/Kg e cloridrato de quetamina (Dopalen®), 50mg/Kg, adicionados na mesma seringa e administrado por via intraperitoneal. A obtenção da anestesia foi observada pela ausência de reflexo palpebral e redução da frequência cardíaca e respiratória. Uma vez anestesiados, foi realizado a tricotomia do dorso dos animais com auxilio de lâmina de barbear.

[35] Após a tricotomia realizou-se a assepsia com solução de álcool etílico 70% na região tricotomizada. Para padronizar o tamanho da ferida, utilizou-se um

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10/16 tubo de ensaio de 10ml_ para coletar sangue, devidamente desinfetado, que quando pressionado contra a pele, delimitou uma área aproximada de 1cm². Os cortes foram seccionados utilizando lamina de bisturi N° 11, tesoura curva e pinça anatômica tipo dente de rato, até a exposição da fáscia muscular (Figura 1).

Organização dos grupos experimentais e tratamento tópico das lesões [36] Os 144 animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos, entre grupos controles e experimentais. Após a indução das feridas nos ratos, todos os dias, os animais receberam, diariamente o equivalente a 1g da solução de acordo com tratamento do seu grupo experimental, utilizando técnica asséptica. Os curativos foram realizados em intervalo de 24h, utilizando a mesma técnica e no mesmo horário até o 21° dia de pós-operatório (PO). Todos os procedimentos pós-operatórios foram realizados pelo mesmo investigador com ajuda de estudantes, previamente treinados, do curso de Bioquímica e Biologia da UFV.

Eutanásia dos animais [37] Aos 3, 7, 14 e 21 dias de tratamento, seis animais de cada grupo foram eutanasiados com a administração do triplo da dose anestésica padronizada, seguido de exsanguinação por punção cardíaca para obter amostras de sangue e a eutanásia ser realizada por choque hipovolêmico.

Análise Macroscópica das feridas [38] As feridas foram avaliadas pelo índice de Contração (IC), mensurado no 3°, 7°, 14° e 21° dias após a execussão das feridas, com uso de paquímetro manual, em duas direções, segundo (BORGES, E.L.; SAAR, S.R.C.; MAGALHÃES, M.B.B.; GOMES, F.S.L.; LIMA, V.L.A.N. Feridas: como tratar. 2 ed. Belo Horizonte/MG: Coopmed, 2010) (Figura 2).

Análise Histológica [39] As feridas foram retiradas com margem de 1 cm de pele íntegra ao redor da lesão com profundidade até a fáscia muscular. As amostras de pele foram imediatamente fixadas em solução de formol 10% por 24h e posteriormente

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11/16 inseridas em frascos com álcool 70% até a confecção das preparações histológicas. As lâminas foram coradas rotineiramente em Hematoxilina-Eosina (HE) para a avaliação de fibroblastos, vasos sanguíneos e células inflamatórias. Os parâmetros histomorfométricos foram calculados utilizando as médias de fibroblastos, vasos sanguíneos e células inflamatórias (GONÇALVES, R.V.; SARANDY, M.M.; MATTA, S.L.P.; NOVAES, R.D.; PINTO, M.V.M. Comparative study of the effects of laser photobiomodulation and extract of Brassica oleracea on skin wounds in wistar rats: A histomorphometric study. Pathology-Research and Practice, v.209, n.10, p.648-543, 2013). A análise histomorfométrica foi realizada utilizando o software ImageJ (Aplicativo Java para processamentos de imagens científicas).

Análise dos resultados da proliferação de fibroblastos in vitro tratados com extrato de Remijia Ferruginea.

[40] O extrato de Remijia ferruginea, apresentou atividade proliferativa de fibroblastos maior que o controle positivo (Soro Fetal Bovino (SFB) 5% e 10%) em todas as concentrações utilizadas no ensaio (Figura 1).

Avaliação clínica dos animais e ferida [41] Neste estudo foi escolhido o tempo experimental de 21 dias, com quatro tempos de coleta das amostras para o estudo (3°, 7°, 14° e 21° dias). Segundo (SHIMIZU, B.J.; EURIDES, D.; BELETTI, M.E.; FREITAS, P.M.C.; CHANG, R. Extrato de Barbatimão a 5% em gel de hidroxietilcelulose aplicado em feridas cutâneas, produzidas experimentalmente em camundongos. Vet. Not., Uberlândia, v.15, n.1, p.21-27, 2009) e (TRINDADE, L.C.T.; et al. Avaliação do uso tópico do metronidazol no processo de cicatrização de feridas: um estudo experimental. Rev. Col. Bras. Cir. v.37, p.358-363, 2010), estes são os dias mais significativos para o estudo do processo de reparação tecidual da pele.

[42] Durante todo o estudo, nenhuma das feridas apresentou sinais de infecção e os animais apresentaram sinais clínicos gerais dentro da normalidade (hígidos, alertas e sem perda de apetite). A partir do terceiro dia de tratamento, houve formação de uma crosta nas feridas em todos os grupos avaliados. As feridas do grupo G3-FIT (tratados com Fitoscar®) apresentaram uma crosta mais

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12/16 espessa e de coloração mais escura até o 7° dia do tratamento. Segundo HERNANDES etal. (HERNANDES, L.; PEREIRA, L.M.S.; PALLAZO, F.; MELLO, J.C.P. wound-healing evaluation of ointment from (barbatimão) in rat skin. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v.46, n.3, p.431-436, 2010), a presença de crosta na ferida pode dificultar a migração celular para o leito da ferida, podendo atrasar o início da fase proliferativa.

[43] A figura 2 representa o aspecto clínico macroscópico das feridas nos dias zero, terceiro, sétimo, décimo quarto e vigésimo primeiro de pós- operatório.

[44] A tabela 1 apresenta os valores do índice de contração (expressa em %) das feridas cirúrgicas produzidas em ratos tratados com a pomada de R. ferrugínea. O índice de contração da ferida é considerado um indicativo do potencial de cicatrização, ou seja, quanto melhor o processo de cicatrização de uma ferida, maior é a percentagem de contração da mesma (BRITO, N.M.B.; SILVA, G.C.F.; CASELHA, S.F.M.; SAMPAIO, A.R.S.; CARVALHO, R.A. Avaliação macroscópica de feridas cutâneas aberta, em ratos, tratadas com óleo de andiroba. Rev. Med., v.15, n.2, p.17-22, 2001).

[45] Tabela 1 índice de Contração da Ferida (%) Dados expressos em media e desvio padrão (σ). Na mesma coluna, letras diferentes indicam diferença (P < 0.05) pelo teste de Tukey.

	Dia 3	Dia 7	Dia 14	Dia 21
Tratamento	Média	Média	Média	Média
G1-SF	30.73 ±11.87 a	40.66 ± 16.84 b	84.54 ± 6.17 ab	83.71 ± 10.86 a
G2-veiculo	12.44 ±7.34 ab	71.39 ±8.59 a	78.45 ± 3.93 b	76.61 ±5.23 a
G3-FIT	28.77 ±9.15 a	52.52 ±9.17 ab	75.47 ± 8.34 b	70.37 ± 18.13 a
G4-PRF	19.49 ± 15.41 ab	65.26 ± 11.85 a	79.62 ± 5.93 ab	80.80 ± 6.55 a

P = pomada; Percentual médio de contração em relação ao tamanho original das feridas dos grupos tratados som solução fisiológica (G1-SF0,9%), pomada veiculo (G2-Veículo), pomada Fitoscar® (G3-FIT), pomada R. ferrugínea (G4-PRF) nos 3°, 7°, 14° e 21° dia de pós-operatório.

[46] No 3°, 7°, 14° e 21°dias, os grupos de animais tratados com a pomada RF tiveram índice de contração maior quando comparados com os grupos controle G1-SF (40,66%) e G3-FIT (52,52%).

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13/16 [47] Os resultados mostram que o índice de contração apresentado no grupo tratado com a pomada de R. ferruginea foram satisfatórios e semelhantes a outros estudos discutidos na literatura (COELHO, J.M.; ANTONIOLLI, A.B.; SILVA, DN.; CARVALHO, T.M.M.B.; PONTES, E.R.J.C.; DASHIRO, AN. O efeito da sulfadiazina de prata, extrato de ipê-roxo e extrato de barbatimão na cicatrização cutâneas em ratos. Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões, v.37, n.1, p.045-051, 2010; DORVIGNY, B.M.; PEREIRA, L.M.S.; AGUIRRE, S.D.; GOUCOHEA, C.B.; REGALADO, A.I.; MEDINA, A.E.; MACHADO, E.C. Efecto cicatrizante de lapasta de cloropila-caroteno de Pinus caribaea sobre heridas abiertas assépticas. Revista Cubana de Plantas Medicinais, v.16, n.1, p.24-33,

2011). A Figura 3 apresenta fotomicrografias do tecido cicatricial de feridas, com presença de neovasos, fibroblastos e células inflamatórias coradas com hematoxilina-eosina [48] As tabelas 2, 3, 4 e 5 apresentam os resultados histomorfométricos de vasos sanguíneos, fibroblastos e células inflamatórias, no 3°, 7°, 14° e 21° dias de tratamento.

[49] Tabela 2 Resultados histomorfométrico de vasos sanguíneos (v), fibroblastos (Fb) e células inflamatórias (Ci) para feridas em ratos tratadas com solução fisiológica(GI-SF), pomada veículo (G2-veículo), pomada fitoscar®(G3FIT), pomada R. ferruginea (G4-PRF), após 3 dias de tratamento.

Histomorfometria da Ferida (3° dia)
	Vv	Fib	Ci
Tratamento	Média	Média	Média
G1-SF	2.39 ±0.74 a	24.19 ± 4.64 b	20.97 ±6.85 a
G2-veiculo	1.89 ± 1.05 a	25.64 ± 5.55 b	18.17 ±4.33 ab
G3-FIT	1.50 ±0.39 a	28.81 ±1.18 b	17.69 ± 1.47 ab
G4-PRF	2.64 ±0.76 a	41.25 ±3.74 a	10.31 ± 2.20 c

P = pomada; Na mesma coluna, letras diferentes indicam diferença (P < 0.05) pelo teste de Tukey.

[50] Na contagem de células inflamatórias, verificou-se que o grupo tratado com a pomada 1% de R. ferruginea, apresentou redução significativa no volume de células inflamatórias quando comparados com todos os grupos controles do tratamento, sugerindo um potencial anti-inflamatório do extrato. No processo de cicatrização, a

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14/16 reação inflamatória será nociva se for intensa, pois assim compromete a microcirculação e a proliferação de fibroblastos na região da ferida (BRITO, N.M.B.; SILVA, G.C.F.; CASELHA, S.F.M.; SAMPAIO, A.R.S.; CARVALHO, R.A. Avaliação macroscópica de feridas cutâneas aberta, em ratos, tratadas com óleo de andiroba. Rev. Med., v.15, n.2, p.17-22, 2001).

[51] Tabela 3 Resultados histomorfométrico de vasos sanguíneos (v), fibroblastos (Fb) e células inflamatórias (Ci) para feridas em ratos tratadas com solução fisiológica(GI-SF), pomada veículo (G2-veículo), pomada fitoscar®(G3-FIT), pomada R. ferruginea (G4-PRF), após 7 dias de tratamento.

Histomorfometria da Ferida (7°dia)
	Vv	Fib	Ci
Tratamento	Média	Média	Média
G1-SF	2.69 ± 1.96 a	45.75 ± 10.04 c	15.00 ±3.44 a
G2-veiculo	1.75 ±0.99 a	51.78 ±3.91 bc	12.36 ± 1.85 ab
G3-FIT	1.63 ±0.63 a	56.90 ± 9.46 abc	14.43 ±2.00 ab
G4 PRF	1.47 ±0.78 a	62.50 ± 9.16 ab	11.03 ± 1.30 ab

P = pomada; Na mesma coluna, letras diferentes indicam diferença (P < 0.05) pelo teste de Tukey.

[52] No 7° dia de tratamento, o grupo tratado com a pomada de R. ferruginea apresentou valores maiores de fibroblastos. Estudos afirmam que os fibroblastos atingem seu maior número no 7° dia, e que o colágeno, proteína mais abundante do tecido conjuntivo, é sintetizado pelos fibroblastos (SILVA, T.F.; PENNA, A.L.B. Colágeno: características químicas e propriedades fundamentais. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.71, n.3, p.530-9, 2012). Segundo (TAZIMA, M.F.G.S.; VICENTE, Y.A.M.V.A.; MORLYA, T. Biologia da ferida e cicatrização. Medicina, Ribeirão Preto, Simpósio, v.41, n.3, p.25964, 2008), após encerrar o processo inflamatório, inicia-se a fase proliferativa que é caracterizada pelo aumento no número de fibroblastos. A predominância de fibroblastos em análise histológica de feridas, nos leva a entender que a fase inflamatória foi superada sem dificuldades (ISAAC. C.; LADEIRA, P.R.S.; RÊGO, P.F.M.; ALDUNATE, J.C.B.; FERREIRA, M.C. Processo de cura das feridas: cicatrização fisiológica. Ver Med, São Paulo, v.89, n.3/4, p.125-31, 2010).

[53] Os resultados histomorfométricos relativos ao 14° dia de tratamento demonstram que o número de fibroblastos dos grupos tratados com pomada de R. ferruginea tiveram redução em comparação aos grupos controles, sugerindo que os

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15/16 grupos tratados com a pomada de R. ferruginea iniciaram a fase de maturação da ferida primeiro, tendo como característica a diminuição progressiva da vascularização e de fibroblastos, aumento da força tênsil e reorganização das fibras colágenas (PEERSCHKE, E.I.; YIN, W.; GHEBREHIWET, B. Platelet mediated complete activation. Adv. Exper. Med. Biol., v.632, n.1, p.81-91, 2008).

[54] Tabela 4 Resultados histomorfométrico de vasos sanguíneos (v), fibroblastos (Fb) e células inflamatórias (Ci) para feridas em ratos tratadas com solução fisiológica(GI-SF), pomada veículo (G2-veículo), pomada fitoscar®(G3-FIT), pomada R. ferruginea (G4-PRF), após 14 dias de tratamento.

Histomorfometria da Ferida (14°dia)
	Vv	Fib	Ci
Tratamento	Média	Média	Média
G1-SF	0.67 ± 0.26 a	52.93 ± 12.87 ab	4.67 ± 1.25 ab
G2-veiculo	1.56 ±0.70 a	42.94 ± 3.13 ab	5.36 ± 1.10a
G3-FIT	1.47 ±0.81 a	54.75 ±6.41 a	3.44 ± 1.19 b
G5 PRF	1.39 ± 1.22 a	40.25 ±7.08 b	2.92 ± 0.83 b

P = pomada; Na mesma coluna, letras diferentes indicam diferença (P < 0.05) pelo teste de Tukey.

[55] Tabela 5 Resultados histomorfométrico de vasos sanguíneos (v), fibroblastos (Fb) e células inflamatórias (Ci) para feridas em ratos tratadas com solução fisiológica(GI-SF), pomada veículo (G2-veículo), pomada fitoscar® (G3-FIT), pomada R. ferruginea (G4-PRF), após 21 dias de tratamento.

Histomorfometria da Ferida (21°dia)

	Vv	Fib	Ci
Tratamento	Média	Média	Média
G1-SF	0.37 ± 0.53 b	41.77 ±7.48 a	4.10 ±0.86 a
G2-veiculo	0.97 ±0.19 ab	33.83 ± 3.67 b	3.67 ±1.24 ab
G3-FIT	0.78 ± 0.42 ab	42.97 ± 7.57 ab	2.03 ± 0.19 c
G4-PRF	1.25 ±0.31 a	51.75 ±8.48 a	2.44 ± 0.56 bc

P = pomada; Na mesma coluna, letras diferentes indicam diferença (P < 0.05) pelo teste de Tukey.

[56] No 21° de tratamento, o número de vasos sanguíneos diminuiu para os grupos tratados com a pomada de R. ferruginea e grupos controles. Na contagem de fibroblastos no último dia do experimento 21° dia, os grupos tratados com a pomada de

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R. ferruginea apresentaram maior quantidade de fibroblastos quando comparados com todos os grupos controles. Estes resultados sugerem que a pomada de Remijia ferruginea estimulou a proliferação de fibroblastos nas feridas induzidas em ratos, confirmando os resultados obtidos no teste in vitro. Na análise do volume das células inflamatórias neste período, o grupo tratado com solução fisiológica manteve um volume significativo maior destas células em relação a todos os outros grupos tratados e controles.

CONCLUSÃO [57] Evidencia-se o efeito cicatrizante da pomada obtida a partir do extrato hidroalcoólico de Remijia ferruginea e seu potencial uso como medicamento fitoterápico.

[58] A pomada obtida a partir do extrato hidroalcoólico de Remijia ferruginea apresenta atividade proliferativa para fibroblastos humanos NIH3T3 cultivados in vitro.

[59] A pomada obtida a partir do extrato de Remijia ferruginea promoveu a cicatrização da ferida, sendo eficaz na fase proliferativa da cicatrização, apresentando melhor índice de contração.

[60] Os parâmetros histomorfométricos indicam que a pomada obtida a partir do extrato hidroalcoólico de Remijia ferruginea modulou o processo inflamatório e aumentou a proliferação de fibroblastos.

[61] A pomada obtida a partir do extrato hidroalcoólico da planta se comportou como a pomada fitoterápica comercial (Fitoscar®) usada como controle, corroborando com o uso extrato de Remijia ferruginea para a atividade cicatrizante.

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Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1) Composições Farmacêuticas à Base de Extrato de Remijia ferruginea caracterizadas por compreenderem extrato hidroalcoólico de Remijia ferruginea associado a excipientes farmaceuticamente aceitáveis na forma tópica.
2. 2) Composições Farmacêuticas à Base de Extrato de Remijia ferruginea, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender de 0,1 a 10% de extrato hidroalcoólico de Remijia ferruginea, 1 a 10% de propilenoglicol e 80 a 98% de vaselina.
3. 3) Uso do extrato de Remijia ferruginea, definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para produzir agentes farmacêuticos para o tratamento e profilaxia de feridas cutâneas.
4. 4) Uso das composições farmacêuticas à base de extratos de Remijia ferruginea caracterizado por ser para tratamento, prevenção e controle de feridas cutâneas.

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   1/2

   500

   250

   125

   62,5

   31,2

   10% □ 5%

   Concentrações (pg/mL)