BR102016015220A2 - Utilização de metabólitos de origem bacteriana como microbiocida no processo de produção de etanol de diversas fontes - Google Patents

Abstract

utilização de metabólitos secundários de pseudomonas aeruginosa como microbiocida para controle de contaminantes bacterianos no processo de fermentação alcoólica de fontes amiláceas e / ou outros açúcares fermentescíveis de cana-de-açúcar, milho, sorgo, trigo, cevada, batata, mandioca, arroz, malte, uvas, sucos e de frutas diversas, podendo ainda ser utilizadas fontes lignocelulósicas, tais como folhas, madeiras, bagaços, farelos, capim, cascas, sementes, após tratamento químico e/ou enzimático, para obtenção de etanol combustível de 1a e 2a gerações. a utilização de metabólitos secundários de pseudomonas aeruginosa como microbiocida para controle de contaminantes bacterianos no processo de fermentação alcoólica, ora proposta, aplica-se também a processos de fermentação para produção de etanol destinado ao consumo humano, tais como álcool de cereais e de milho, além de bebidas fermentadas e/ou destiladas como cerveja, vinho e cachaça.

Description

(54) Título: UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES (51) Int. Cl.: C12P 7/06; A01P 1/00 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA (72) Inventor(es): GALDINO ANDRADE FILHO; ADMILTON GONÇALVES DE OLIVEIRA JUNIOR; ANE STÉFANO SIMIONATO; MIGUEL OCTAVIO PÉREZ NAVARRO; ANDRÉ RIEDI BARAZETTI; GLENDA CAVALARI SIMÕES; IGOR MATHEUS OLIVEIRA DOS SANTOS; JANAINA EMILIANO (57) Resumo: Utilização de metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa como microbiocida para controle de contaminantes bacterianos no processo de fermentação alcoólica de fontes amiláceas e / ou outros açúcares fermentescíveis de cana-de-açúcar, milho, sorgo, trigo, cevada, batata, mandioca, arroz, malte, uvas, sucos e de frutas diversas, podendo ainda ser utilizadas fontes lignocelulósicas, tais como folhas, madeiras, bagaços, farelos, capim, cascas, sementes, após tratamento químico e/ou enzimático, para obtenção de etanol combustível de la e 2a gerações. A utilização de metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa como microbiocida para controle de contaminantes bacterianos no processo de fermentação alcoólica, ora proposta, aplica-se também a processos de fermentação para produção de etanol destinado ao consumo humano, tais como álcool de cereais e de milho, além de bebidas fermentadas e/ou destiladas como cerveja, vinho e cachaça.

7/7 [025] Alguns ensaios laboratoriais e semi-industriais foram feitos para demonstrar a eficácia destes microbiocidas de origem no metabolismo secundário de Pseudomonas aeruginosa (Góis, 2012; Góis et al., 2013; Beranger, 2013; Simionato, 2016). Os resultados demonstraram uma rápida diminuição na população bacteriana, dentre os efeitos, podemos destacar que frações obtidas nos processos de purificação, apresentaram atividade antimicrobiana frente a Lactobacillus spp., Bacillus spp. e Leuconostoc spp. (Góis, 2012; Beranger, 2013; Góis et al., 2013; Simionato, 2016). A concentração inibitória mínima de algumas frações e ou composições foram entre 15 a 125 pg mL¹ e não foi observado nenhum efeito deletério para a levedura fermentadora (Simionato, 2016). Moléculas isoladas com atividade inibitória contra o Lactobacillus spp. entre 0,12 a 500 pg mL¹ (Simionato, 2016).

[026] Nas avaliações por MEV de Lactobacillus fermentum, é possível observar células controles com morfologia intactas (Figura 1A e 1B). Quando tratadas com uma fração semi-purificada dos metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa, apresentaram um efeito na diminuição do número de células bacterianas, formação de pólipos e afundamentos nas células após 4 horas de tratamento (Figuras 1C e 1D).

Legenda das Figuras

Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura do Lactobacillus fermentum CCT 1629. (A) e (B): bactérias controle sem tratamentos com microbiocidas. (C) e (D): bactérias tratadas com uma fração semi-purificada dos metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa após 4 horas do tratamento.

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UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES

Campo da Invenção [001] O presente relatório de Patente de Invenção se refere à utilização de microbiocida natural no processo de produção de etanol de diversas fontes, e, mais especificamente, ser metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa, que auxiliam no controle bacteriano no processo de fermentação alcoólica de fontes amiláceas e/ou outros açúcares, como cana-de-açúcar, milho, sorgo, trigo, cevada, batata, mandioca, arroz, malte, uvas, sucos e de frutas diversas, podendo ainda ser utilizadas fontes lignocelulósicas, tais como folhas, madeiras, bagaços, farelos, capim, cascas, sementes, após tratamento químico e/ou enzimático, para obtenção de etanol combustível de 1^a e 2^a geração aplicando-se também a processos de fermentação para produção de etanol destinado ao consumo humano, tais como álcool de cereais e de milho, além de bebidas fermentadas e/ou destiladas como cerveja, vinho e cachaça.

Antecedentes da Invenção [002] A fermentação alcoólica é um processo realizado por diversos organismos, entre os quais podemos destacar: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces chevalieri, Cândida krusei, Cândida guilliermondii, Cândida tropicalis, Cândida diddensiae, Cândida fabianii, Cândida intermédia, Cândida maltosa, Cândida santamaríae, Cândida colliculosa, Pichia membranaefaciens, Cryptococcus kuetzingii, Hansenula polymorpha, Kloeckera corticis, Rhodotorula pallida, Rhodotorula rubra, Rhodotorula minuta, Torulopsis norvegica e Trichosporon cutaneum.

[003] O processo fermentativo ocorre de forma não asséptica, e, portanto, muito susceptível às contaminações microbianas. O mosto possui nutrientes (sacarose, glicose, aminoácidos, minerais, vitaminas, ácido fólico, etc.) e condições favoráveis (temperatura, pH, quantidade de oxigênio) ao

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2/7 desenvolvimento destes contaminantes. As contaminações bacterianas de 10⁸ a 10⁹ células/mL podem causar quedas de 14% a 90% no rendimento da fermentação alcoólica.

[004] As bactérias contaminantes, normalmente Gram-positivas, acidificam o meio, por meio de fermentação láctica, butílica, acética principalmente e outras que podem ocorrer isoladamente ou de forma concomitante, e inibem a ação da levedura, através dos produtos de seu metabolismo, ou pela diminuição drástica da quantidade de nutrientes, afetando assim a qualidade e o rendimento do etanol produzido. Portanto, é necessário controlar tal crescimento, sem interferir no processo de fabricação de etanol ou em seus produtos.

[005] As principais estratégias para controlar a contaminação microbiana na produção de etanol combustível são feitas com a adição de ácido sulfúrico no final de cada ciclo fermentativo, dióxido de enxofre, antimicrobianos químicos convencionais e/ou de origem naturais, como o extrato de lúpulo, e tratamentos térmicos, mas a maioria afeta a levedura fermentadora ou são fortes contaminantes ambientais. Além disso, a maioria destes compostos pode deixar resíduos nos subprodutos que são usados para alimentação animal, humano ou usados como fertilizantes nas plantações, que é um subproduto com alto valor agregado.

[006] O principal subproduto da indústria sucroalcoleira (cana) é a levedura. A restrição do uso de antibióticos é válida, pois essas leveduras secas, extratos de levedura, e outros produtos provenientes da levedura são utilizados em alimentação animal e em alguns casos humana. Já na produção de etanol a partir de amido é um resíduo sólido que é bastante utilizado para alimentação animal, portanto também necessita ser livre de antibióticos.

[007] Com isso, as intervenções com alternativas de produtos naturais de origem principalmente microbianas, são fundamentais para tornar o setor mais competitivo com redução do custo e menor impacto ambiental. Outra vantagem do mirobiocida natural em relação aos antibióticos sintéticos é o potencial de rápida degradação no ambiente, não acumulando na cadeia trófica.

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3/7 [008] O pedido de patente WO 2014078920 A1, de 2012, reivindica a utilização de um microbiocida natural no processo de produção de etanol de diversas fontes. A presente invenção difere da WO 2014078920 A1, citada anteriormente, pois considera o uso de produtos naturais de origem no metabolismo secundário de Pseudomonas aeruginosa.

[009] O pedido de patente americano, WO 2011116042 A2, de 2011, reivindica a utilização de peptídeos antibacterianos policíclicos. Os métodos podem proporcionar melhorias, tais como aumento da produção de etanol com transição mínima de biocida em coprodutos dos processos. O pedido de patente brasileiro, também depositado no exterior, WO 2009010836 A2, de 2009, reivindica um método de produção de um produto à base de fermentação compreendendo a fermentação de um meio contendo açúcar com levedura na presença de um biocida orgânico e um composto de amónio quaternário, em quantidades suficientes para reduzir ou controlar uma população bacteriana no meio contendo açúcar. A presente invenção se difere da WO 2011116042 A2 e da WO 2009010836 A2, pois considera o uso de produtos naturais de origem no metabolismo secundário de Pseudomonas aeruginosa.

[010] Por fim, o pedido de patente americano, WO 2010111639 A1, de 2010, reivindica a utilização de um aparelho para a aplicação de biocida para, pelo menos, um processo de condicionamento, processo de propagação e ou processo de fermentação do etanol. A presente invenção se difere da WO 2010111639 A1, pois considera o uso de produtos naturais de origem no metabolismo secundário de Pseudomonas aeruginosa.

Sumário da Invenção [011] O objetivo do microbiocida apresentado na presente invenção é controlar a proliferação de bactérias prejudiciais ao processo fermentativo, tanto de cana-de-açúcar, amido e outros açúcares. O microbiocida é composto na sua maioria de metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa sendo composto ou composições de moléculas polares, de média polaridade, apoiares, de baixo peso molecular, de médio peso molecular, de auto peso molecular. Sendo extrato bruto, semipurificados, moléculas puras ou

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4/7 composições em diferentes concentrações destas moléculas, dependendo do processo a ser controlado e / ou dos tipos de contaminantes bacterianos. O microbiocida tem ação principal contra bactérias Gram positivas, mas também atua em Gram negativas. O microbiocida é resistente ao ácido (pH 2,0) e aquecimento (121 °C), pois no processo de fermentação esses parâmetros são essenciais.

[012] Em usinas de produção de etanol a partir de cana-de-açúcar, os pontos idéias de coleta de amostra e as doses esperadas para o microbiocida em questão são:

1. na água da moenda (1 a 1000 ppm em relação ao volume de agua);

2. no tanque de decantação (1 a 1000 ppm em relação ao caldo);

3. no fermentador - dorna de fermentação (1 a 1000 ppm em relação ao caldo), e

4. na cuba de tratamento do fermento antes da fermentação (1 a 1000 ppm em relação ao volume total da dorna).

[013] O microbiocida pode ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2 ou 3 ou 4) ou combinados nos pontos (1 e 2; 1 e 3; 1 e 4; 2 e 3; 2 e 4; 3 e 4; 1, 2 e 3; 1, 2 e 4; 1, 3 e 4; 2, 3 e 4; 1,2, 3 e 4), com doses menores ao longo da fermentação (1 a 100 ppm) para manter a contaminação baixa.

[014] No processo de fermentação a partir de fontes amiláceas (milho, sorgo, trigo, cevada batata, mandioca, arroz, malte, uvas, sucos e frutas diversas), os pontos idéias de coleta de amostra e as doses esperadas para o microbiocida em questão são:

1. na liquefação (1 a 1000 ppm), e

2. no mosto na dorna de fermentação (1 a 1000 ppm), com doses menores ao longo da fermentação (1 a 100 ppm) para manter a contaminação baixa.

[015] O microbiocida pode ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2) ou combinados nos pontos (1 e 2).

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6/7 produção e obtenção dos metabólitos de interesse, a cepa é cultivada em caldo nutriente (CN), acrescido de cerca de 5 a 150 mg/L de CuCb 2 H2O, por cerca de 2 a 15 dias, temperatura de cerca de 24 a 34 °C, em aeração esterilizada ou em fermentadores ou em incubadoras giratórias. Após o cultivo as células são peletizadas em centrífuga (9000 rpm, 4 °C, 15 mim) e descartadas. O sobrenadante proveniente da centrifugação é concentrado em cerca de 1 a 10 vezes seu volume inicial.

- Extração dos compostos de baixo peso molecular e de característica polar [023] A extração dos compostos do metabolismo secundário de Pseudomonas aeruginosa de interesse e realizada por partição líquido-líquido ou líquidosólido com solvente orgânico apoiar ou de média polaridade. A fração orgânica obtida (extrato bruto) é concentrada e posteriormente liofilizada.

- Purificação dos compostos do metabolismo de Pseudomonas aeruginosa [024] As frações e moléculas puras são obtidas através de processos cromatográficos com o extrato bruto em sílica gel 60 e / ou C18 e / ou C8 em coluna. Como fases móveis são utilizados solventes orgânicos em polaridade crescente. As proporções podem variar entre (v/v) cerca de 0:100 a cerca de 100:0 de hexano/diclorometano e / ou diclorometano/acetato de etila e / ou acetato de etila/metano e / ou metanol/agua e / ou acetonitrila/agua. O sistema pode ser com vácuo ou pressão. Podendo ser utilizado equipamento automatizado de purificação ou sistema manuais. As frações e moléculas puras são concentradas em evaporador rotativo a uma temperatura de cerca de 40 a 70 °C, o solvente é recuperado e reutilizado e as amostras são submetidas a liofilização. As frações e ou moléculas puras são submetidas a testes de atividade antimicrobiana contra os contaminantes bacterianos da fermentação alcoólica.

- Resultados

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5/7 [016] No processo de fermentação de fontes lignocelulósicas o microbiocida pode ser dosado e encontrado nas concentrações de:

1. durante a hidrólise da celulose, hemicelulose, lignina (1 a 1000 ppm),

2. durante a fermentação (5 a 1000 ppm).

[017] O microbiocida pode ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2) ou combinados nos pontos (1 e 2), quando ocorrer o processo de sacarificação e fermentação simultânea.

[018] Para produção de cerveja o microbiocida pode ser dosado e estar nas concentrações de:

1. na mostura (1 a 1000 ppm);

2. na fermentação (1 a 1000 ppm), e

3. na maturação (1 a 1000 ppm).

[019] O microbiocida pode ser dosado nos pontos isolados (1, 2 ou 3) ou combinados nos pontos (1,2 e 3; 1 e 3; 2 e 3).

[020] Na produção de cachaça, as etapas são similares as da fermentação de caldo de cana. Os pontos de dosagem são:

1. na água da moenda;

2. no tanque de decantação, e

3. na dorna de fermentação.

[021] O microbiocida pode ser dosado nos pontos isolados (1, 2 ou 3) ou combinados nos pontos (1, 2 e 3; 1 e 3; 2 e 3).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

- Micro-organismo produtor e biossíntese dos metabólitos secundários [022] O micro-organismo produtor Pseudomonas aeruginosa é ativado em ágar nutriente (AN) acrescido de cerca de 5 a 150 mg/L de CuCI₂ 2 H₂O. Para a

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5. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, em usinas que utilizam como matéria-prima cana-de-açúcar, o microbiocida poder ser dosado: (1) na água da moenda (1 a 1000 ppm em relação ao volume de agua); (2) no tanque de decantação (1 a 1000 ppm em relação ao caldo); (3) no fermentador— dorna de fermentação (1 a 1000 ppm em relação ao caldo), e (4) na cuba de tratamento do fermento antes da fermentação (1 a 1000 ppm em relação ao volume total da dorna)

6. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no processo de fermentação de fontes amiláceas, o microbiocida poder ser dosado: (1) na liquefação (1 a 1000 ppm), e (2) no mosto na dorna de fermentação (1 a 1000 ppm), com doses menores ao longo da fermentação (1 a 100 ppm) para manter a contaminação baixa

7. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microbiocida, no processo de fermentação de fontes lignocelulosicas, poder ser dosado: (1) durante a hidrólise da celulose, hemicelulose, lignina (1 a 1000 ppm), e (2) durante a fermentação (5 a 1000 ppm)

8. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na produção de cerveja, o microbiocida poder ser dosado: (1) na mostura (1 a 1000 ppm); (2) na fermentação (1 a 1000 ppm), e (3) na maturação (1 a 1000 PPm)

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DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na produção de cachaça, o microbiocida poder ser dosado: (1) na agua da moenda; (2) no tanque de decantação, e (3) na dorna de fermentação

10. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o microbiocida poder ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2 ou 3 ou 4) ou combinados nos pontos (1 e 2; 1 e 3; 1 e 4; 2 e 3; 2 e 4; 3 e 4; 1,2 e 3; 1,2 e 4; 1, 3 e 4; 2, 3 e 4; 1, 2, 3 e 4), com doses menores ao longo da fermentação (1 a 100 ppm) para manter a contaminação baixa

11. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o microbiocida poder ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2) ou combinados nos pontos (1 e 2)

12. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o microbiocida poder ser dosado nos pontos isolados (1 ou 2) ou combinados nos pontos (1 e 2), quando ocorrer o processo de sacarificação e fermentação simultânea

13. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o microbiocida poder ser dosado nos pontos isolados (1, 2 ou 3) ou combinados nos pontos (1,2 e 3; 1 e 3; 2 e 3)

14. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE

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Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES para controle da proliferação de microrganismos prejudiciais ao processo fermentativo de cana-de-açúcar, amido, milho, sorgo, trigo, cevada, batata, mandioca, arroz, malte, uvas, sucos e de frutas diversas, podendo ainda ser utilizadas fontes lignocelulósicas, tais como folhas, madeiras, bagaços, farelos, capim, cascas e sementes, caracterizado por o microbiocida ser metabólitos secundários de Pseudomonas aeruginosa sendo composto ou composições de moléculas polares, de média polaridade, apoiares, de baixo peso molecular, de médio peso molecular, de alto peso molecular, sendo extrato bruto, semipurificados, moléculas puras ou composições em diferentes concentrações destas moléculas, dependendo do processo a ser controlado e / ou dos tipos de contaminantes bacterianos
2. 2. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o biocida ter ação principal contra bactérias Gram positivas
3. 3. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microbiocida poder atuar também contra bactérias Gram negativas
4. 4. UTILIZAÇÃO DE METABÓLITOS DE ORIGEM BACTERIANA COMO MICROBIOCIDA NO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL DE DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microbiocida ser resistente ao meio ácido (pH 2,0) e ao aquecimento (até 121 °C)

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   DIVERSAS FONTES, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o microbiocida poder ser dosado nos pontos isolados (1, 2 ou 3) ou combinados nos pontos (1,2 e 3; 1 e 3; 2 e 3)

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   DESENHO