BR102016011756B1

BR102016011756B1 - Process for producing specialty coffees using lactic acid cultures during post-harvest processing

Info

Publication number: BR102016011756B1
Application number: BR102016011756-9A
Authority: BR
Inventors: Carlos Ricardo Soccol; Gilberto Vinícius De Melo Pereira; Adriane Bianchi Pedroni Medeiros; Dão Pedro De Carvalho Neto
Original assignee: Universidade Federal Do Paraná
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2016-05-24
Publication date: 2022-05-03
Also published as: BR102016011756A2

Abstract

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE CAFÉS ESPECIAIS ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DE CULTURAS LÁTICAS DURANTE O PROCESSAMENTO PÓS- COLHEITA Esta invenção descreve um processo para promover fermentação lática de sementes de café durante o processamento pós-colheita e produção de bebidas especiais. O processo em questão consiste na introdução de culturas láticas previamente selecionadas e altamente ativas durante a etapa de despolpamento de café pelos processamentos via úmida ou via seca. Isso acarreta em eficiente uso dos açúcares presentes na mucilagem do café, diminuindo o tempo do processamento em até 50%. Além disso, a fermentação por culturas láticas gera metabólitos que auxiliam na formação de aromas à bebida e padronização do processo, além de evitar a formação de odores indesejáveis. Associada à colheita de frutos maduros, o café produzido pelo proposto processo tem maior potencial para atingir características para classificação como café especial.PROCESS FOR PRODUCTION OF SPECIALTY COFFEES THROUGH THE USE OF DAIRY CROPS DURING POST-HARVEST PROCESSING This invention describes a process for promoting lactic fermentation of coffee seeds during post-harvest processing and production of specialty beverages. The process in question consists of the introduction of previously selected and highly active lactic cultures during the coffee pulping step by wet or dry processing. This leads to an efficient use of the sugars present in the coffee mucilage, reducing processing time by up to 50%. In addition, fermentation by lactic cultures generates metabolites that help in the formation of aromas to the beverage and standardization of the process, in addition to preventing the formation of undesirable odors. Associated with the harvest of ripe fruits, the coffee produced by the proposed process has greater potential to achieve characteristics for classification as special coffee.

Description

Field of Invention

[0001]. A invenção aqui descrita estabelece um método para produção de cafés especiais através de um novo processo biotecnológico durante a etapa de pós-colheita. Em específico, este processo propõe o uso de culturas láticas para promover uma efetiva fermentação dos açúcares contidos na mucilagem dos grãos de café e aceleração do processo de acidificação. Através deste novo processo é possível alcançar uma diminuição do tempo de processamento em até 50% e produzir bebidas classificadas como especiais.[0001]. The invention described herein establishes a method for producing specialty coffees through a new biotechnological process during the post-harvest stage. Specifically, this process proposes the use of lactic acid cultures to promote an effective fermentation of the sugars contained in the mucilage of coffee beans and acceleration of the acidification process. Through this new process it is possible to achieve a reduction in processing time by up to 50% and produce beverages classified as special.

History of the Invention

[0002]. O café é a bebida não-alcoolica mais apreciada e consumida em todo o mundo, com uma produção global superior a 8 milhões de toneladas na safra 2014/15 (International Coffee Organization, www.ico.org). Uma consequência direta da crescente aceitabilidade do produto é uma maior exigência do consumidor em certos aspectos organolépticos como o flavor, acidez e adstringência da bebida. O aroma do café torrado é uma mistura rica e complexa que contém mais de 800 compostos voláteis que apresentam contribuições tanto da composição química dos grãos quanto dos metabólitos produzidos pelos microrganismos associados aos processamentos pós-colheita (Oestreich-Janzen, Chemistry of coffee em: L. Mander & H.-B. Liu (Eds.), Comprehensive natural products II, p. 1085-1117, 2013; Evangelista et al., Food Microbiology, v. 44, p. 87-95, 2014).[0002]. Coffee is the most appreciated and consumed non-alcoholic beverage worldwide, with a global production of over 8 million tons in the 2014/15 harvest (International Coffee Organization, www.ico.org). A direct consequence of the increasing acceptability of the product is a greater demand from the consumer in certain organoleptic aspects such as the flavor, acidity and astringency of the beverage. The aroma of roasted coffee is a rich and complex mixture that contains more than 800 volatile compounds that present contributions from both the chemical composition of the beans and the metabolites produced by microorganisms associated with post-harvest processing (Oestreich-Janzen, Chemistry of coffee in: L Mander & H.-B. Liu (Eds.), Comprehensive natural products II, p. 1085-1117, 2013; Evangelista et al., Food Microbiology, v. 44, p. 87-95, 2014).

[0003]. O café pertence à família Rubicaceae, que compreende mais de 600 gêneros e 10.000 espécies de árvores e arbustos tropicais (Bremer e Eriksson, International Journal of Plant Sciences, v. 170(6), p. 766-793, 2009). A sua origem pode ser traçada dos planaltos etíopes, onde ainda são observados o crescimento de variedades selvagens de plantas de café. Até o século XV a produção e comércio do café eram restritos à Arábia, mais precisamente ao Iêmen, onde os grãos possuíam uma grande importância econômico-social para os produtores e vendedores da região. Foi somente em 1615 que as primeiras sacas alcançaram o “mundo” não-Islâmico e, em pouco tempo, as plantações de café conquistaram as colônias europeias nas Américas Central e Sul (Eccardi e Sandalj, Coffee - A celebration of diversity, Trieste - Itália, 2002; Grigg, GeoJournal, v. 57, p. 283-294, 2002; Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015). Atualmente este fruto é cultivado em todos continentes da região geográfica entre as latitudes 30° N e 30° S, também conhecido como o “cinturão do café” (Oestreich-Janzen, Chemestry of coffee em: L. Mander & H.-B. Liu (Eds.), Comprehensive natural products II, p. 1085-1117, 2013; Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015).[0003]. Coffee belongs to the Rubicaceae family, which comprises more than 600 genera and 10,000 species of tropical trees and shrubs (Bremer and Eriksson, International Journal of Plant Sciences, v. 170(6), p. 766-793, 2009). Its origin can be traced to the Ethiopian highlands, where wild varieties of coffee plants are still observed to grow. Until the 15th century, coffee production and trade were restricted to Arabia, more precisely to Yemen, where the beans had great economic and social importance for producers and sellers in the region. It was only in 1615 that the first sacks reached the non-Islamic “world” and, in a short time, coffee plantations conquered European colonies in Central and South America (Eccardi and Sandalj, Coffee - A celebration of diversity, Trieste - Italy , 2002; Grigg, GeoJournal, v. 57, p. 283-294, 2002; Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015). Currently this fruit is grown on all continents in the geographical region between latitudes 30° N and 30° S, also known as the “coffee belt” (Oestreich-Janzen, Chemestry of coffee in: L. Mander & H.-B. Liu (Eds.), Comprehensive natural products II, p. 1085-1117, 2013; Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015).

[0004]. Entre as mais 100 espécies descritas do gênero Coffea, apenas duas apresentam valor comercial: Coffea arabica L. e Coffea canephora, conhecidas como arábica e robusta, respectivamente. O Brasil lidera o ranking da produção mundial de café, respondendo por mais de um terço de toda a produção, seguido pelo Vietnã e Colômbia (MONTEIRO et al., Revista Ceres, v. 57, p. 145-150, 2010). No Brasil, os principais estados produtores são, em ordem, Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo, Bahia e Paraná, segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (http://www.agricultura.gov.br).[0004]. Among the more than 100 described species of the genus Coffea, only two have commercial value: Coffea arabica L. and Coffea canephora, known as arabica and robusta, respectively. Brazil leads the ranking of world coffee production, accounting for more than a third of all production, followed by Vietnam and Colombia (MONTEIRO et al., Revista Ceres, v. 57, p. 145-150, 2010). In Brazil, the main producing states are, in order, Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo, Bahia and Paraná, according to the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (http://www.agricultura.gov.br).

[0005]. Os grãos de café (endosperma) são envoltos por uma camada fibrosa e cinza (pergaminho) seguido por uma camada intermediária gelatinosa e doce, a qual é dividida em mesocarpo interno (mucilagem) e externo (polpa), e uma casca de cor avermelhada (exocarpo). O exocarpo (casca) é a parte mais externa, sua consistência varia de acordo com a espécie e a coloração de verde (clorofila) ao vermelho (antocianos) de acordo com o estágio de maturação. O endocarpo (polpa) é o primeiro produto que se obtém do processamento do fruto de café e representa, em base seca, cerca de 29% do peso do fruto integral. A camada mucilaginosa dos grãos possui uma constituição polissacarídica de 30% de substâncias pécticas, 8% de celulose e 18% de polissacarídeos não-celulósicos (AVALLONE et al., Journal of Food Science and Technology, v. 65(8), p. 1308-1311, 2000). As características físico-químicas da mucilagem são essenciais para um entendimento da fermentação do café.[0005]. Coffee beans (endosperm) are surrounded by a fibrous gray layer (parchment) followed by a gelatinous and sweet intermediate layer, which is divided into inner (mucilage) and outer (pulp) mesocarp, and a reddish colored husk ( exocarp). The exocarp (bark) is the outermost part, its consistency varies according to the species and the color from green (chlorophyll) to red (anthocyanins) according to the stage of maturation. The endocarp (pulp) is the first product obtained from the processing of the coffee fruit and represents, on a dry basis, about 29% of the weight of the whole fruit. The mucilaginous layer of the grains has a polysaccharide constitution of 30% pectic substances, 8% cellulose and 18% non-cellulosic polysaccharides (AVALLONE et al., Journal of Food Science and Technology, v. 65(8), p. 1308-1311, 2000). The physicochemical characteristics of mucilage are essential for an understanding of coffee fermentation.

[0006]. Embora o café seja a segunda commodity com maior valor de mercado no mundo, a etapa de processamento ainda é realizada de forma rudimentar pelos produtores que utilizam fermentações espontâneas para seu processamento. O uso da fermentação espontânea nos processamentos de grãos de café possui grandes desvantagens devido à sua imprevisibilidade e a falta de controle sobre a qualidade final da bebida gerada.[0006]. Although coffee is the second commodity with the highest market value in the world, the processing step is still carried out in a rudimentary way by producers who use spontaneous fermentations for its processing. The use of spontaneous fermentation in coffee bean processing has major disadvantages due to its unpredictability and lack of control over the final quality of the generated beverage.

[0007]. Os grãos de café, quando colhidos, possuem um teor de umidade de 65%, sendo necessário reduzi-lo para 10 ~12% de forma que estejam apropriados para as condições ótimas de armazenamento e transporte. Acrescido a esse fato, a redução de umidade evita fermentações espontâneas e não-controláveis da mucilagem, as quais podem gerar metabólitos que favoreçam a prevalência de sabores indesejáveis na bebida final. Três métodos distintos são atualmente utilizados para o processamento de café: o processamento por via seca, via úmida e semisseca. As diferenças entre os mesmos ocorrem tanto na desempenho do método quanto nos produtos finais gerados (ipresença ou ausência de mucilagem nos grãos, grãos completamente envoltos pelo pericarpo e a qualidade da bebida final) (Hunch e Franz, Em: Advances in fermented foods and beverages, p. 501-513, 2015).[0007]. Coffee beans, when harvested, have a moisture content of 65%, which needs to be reduced to 10~12% so that they are suitable for optimal storage and transport conditions. Added to this fact, the reduction of humidity prevents spontaneous and uncontrollable fermentations of the mucilage, which can generate metabolites that favor the prevalence of undesirable flavors in the final beverage. Three distinct methods are currently used for coffee processing: dry, wet and semi-dry processing. The differences between them occur both in the performance of the method and in the final products generated (presence or absence of mucilage in the grains, grains completely surrounded by the pericarp and the quality of the final beverage) (Hunch and Franz, In: Advances in fermented foods and beverages , p. 501-513, 2015).

[0008]. O processo via seca é o método de processamento pós- colheita mais antigo e de fácil emprego, sendo normalmente utilizado para a variedade Robusta (Silva et al., International Journal of Food Microbiology, v. 60, p. 251-260, 2000). Nele os frutos são secos ao sol posteriormente à colheita, sendo espalhados homogeneamente durante o dia e revolvidos durante a noite, perdurando até que a umidade dos grãos alcance um teor de 10 a 12%. Esse processo simultâneo de fermentação e secagem dura entre 10 a 25 dias e, durante esse período, uma fermentação espontânea promove a quebra dos mesocarpos interno e externo (Sakwari et al., Annals of Occupational Hygiene, v. 57, p. 173-183, 2013; Hunch e Franz, Em: Advances in fermented foods and beverages, p. 501-513, 2015). O processamento via seca é comumente utilizado em países onde existem longos períodos de luz do sol e chuvas escassas (Brasil e Etiópia), criando uma condição ideal para a secagem das bagas de café (Silva et al., International Journal of Food Microbiology, v. 60, p. 251-260, 2000). Este método é utilizado para a produção de marcas mais baratas, dando origem ao café denominado coco, de terreiro ou natural.[0008]. The dry process is the oldest and easiest post-harvest processing method, being normally used for the Robusta variety (Silva et al., International Journal of Food Microbiology, v. 60, p. 251-260, 2000) . In it, the fruits are dried in the sun after the harvest, being spread evenly during the day and turned during the night, lasting until the moisture of the grains reaches a content of 10 to 12%. This simultaneous fermentation and drying process lasts between 10 and 25 days and, during this period, spontaneous fermentation promotes the breakdown of the inner and outer mesocarps (Sakwari et al., Annals of Occupational Hygiene, v. 57, p. 173-183). , 2013; Hunch and Franz, In: Advances in fermented foods and beverages, p. 501-513, 2015). Dry processing is commonly used in countries where there are long periods of sunlight and scarce rainfall (Brazil and Ethiopia), creating an ideal condition for drying coffee berries (Silva et al., International Journal of Food Microbiology, v. 60, pp. 251-260, 2000). This method is used for the production of cheaper brands, giving rise to the coffee called coconut, from terreiro or natural.

[0009]. No processamento por via úmida os grãos são mecanicamente depulpados (remoção total e parcial do exocarpo e mesocarpo, respectivamente). Consecutivamente, os frutos são submersos em um tanque de água e submetidos à fermentação microbiana por 16 a 48 horas onde a mucilagem remanescente é degradada. Em seguida, eles são secados ao sol durante 5 a 10 dias para alcançar o teor de umidade padrão. O período de fermentação precisa ser controlado para evitar fermentação excessiva, fato que pode diminuir a qualidade dos grãos e, consequentemente, da bebida (Batista et al., Food Control, v. 20, p. 784-790). Esse método promove uma redução no tempo e área requeridos para a secagem dos frutos em comparação com o processamento por via seca. Os grãos gerados a partir desse método são conhecidos como café “lavado”.[0009]. In wet processing, the grains are mechanically pulped (total and partial removal of the exocarp and mesocarp, respectively). Consecutively, the fruits are submerged in a water tank and subjected to microbial fermentation for 16 to 48 hours where the remaining mucilage is degraded. Then they are dried in the sun for 5 to 10 days to reach the standard moisture content. The fermentation period needs to be controlled to avoid excessive fermentation, a fact that can decrease the quality of the grains and, consequently, of the beverage (Batista et al., Food Control, v. 20, p. 784-790). This method promotes a reduction in the time and area required for drying the fruits compared to dry processing. The beans generated from this method are known as “washed” coffee.

[0010]. O terceiro método de processamento (semisseco) mescla as técnicas descritas nos dois procedimentos listados previamente. As cerejas de café são selecionadas (apenas os frutos maduros) e mecanicamente depulpados, seguidos pela secagem ao sol em plataformas de concreto enquanto os frutos ainda possuem uma camada de mesocarpo aderida ao pergaminho (Duarte et al., Food Chemestry, v. 118, p. 851-855, 2010; Vilela et al., Food Microbiology, v. 27, p. 1128-1135, 2010). Esse processamento só pode ser empregado em países onde a umidade é baixa de forma que a camada de mucilagem pode ser rapidamente degradada sem a ação de uma fermentação indesejada (Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015). O Brasil foi pioneiro na implementação desta técnica no início da década de 1990 e se tornou famoso devido à alta qualidade das cerejas de café geradas, sendo conhecidos como café “pulpado natural” (Teixeira et al., em: A. Illy & R. Vianni (Eds.), Espresso coffee: The science of quality, Itália: Elsevier Academic Press, p. 91-95 1995).[0010]. The third processing method (semi-dry) merges the techniques described in the two previously listed procedures. The coffee cherries are selected (ripe fruits only) and mechanically pulped, followed by sun drying on concrete platforms while the fruits still have a layer of mesocarp adhered to the parchment (Duarte et al., Food Chemestry, v. 118, p. 851-855, 2010; Vilela et al., Food Microbiology, v. 27, p. 1128-1135, 2010). This processing can only be used in countries where the humidity is low so that the mucilage layer can be quickly degraded without the action of an unwanted fermentation (Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015). Brazil pioneered the implementation of this technique in the early 1990s and became famous due to the high quality of the coffee cherries generated, being known as “natural pulp” coffee (Teixeira et al., in: A. Illy & R. Vianni (Eds.), Espresso coffee: The science of quality, Italy: Elsevier Academic Press, p. 91-95 1995).

[0011]. O sabor e a qualidade da bebida são influenciados por inúmeros fatores, tais como a variedade da planta de café, a região geográfica na qual esta foi plantada, clima, presença de grãos danificados (danificados por insetos ou grãos verdes) e o método de processamento pós-colheita empregado (Oliveira et al., LWT - Food Science and Technology, v. 39, p. 235-239, 2006; Sunarharum, Williams e Smyth, Food Research International, v. 62, p. 315-325, 2014). Por exemplo, cafés lavados exibem notas frutadas e são menos encorpados se comparados ao café “natural” (Selmar, Bytof e Knopp, em: Proceedings of the international congress of ASIC, Paris - Trieste, p. 14-18, 2002; Arruda et al., Química Nova, v. 35(10), p. 2044-2051, 2012). No entanto, pouca atenção é direcionada para essa inter-relação entre a qualidade da bebida final gerada e a fermentação associada ao método de processamento pós-colheita selecionado, uma vez que o propósito desta é exclusivamente a remoção da mucilagem remanescente nos frutos.[0011]. The flavor and quality of the beverage are influenced by numerous factors, such as the variety of the coffee plant, the geographic region in which it was planted, climate, the presence of damaged beans (damaged by insects or green beans) and the processing method. post-harvest employed (Oliveira et al., LWT - Food Science and Technology, v. 39, p. 235-239, 2006; Sunarharum, Williams and Smyth, Food Research International, v. 62, p. 315-325, 2014 ). For example, washed coffees exhibit fruity notes and are less full-bodied compared to “natural” coffee (Selmar, Bytof and Knopp, in: Proceedings of the international congress of ASIC, Paris - Trieste, p. 14-18, 2002; Arruda et al. al., Química Nova, v. 35(10), p. 2044-2051, 2012). However, little attention is directed to this interrelationship between the quality of the final beverage generated and the fermentation associated with the selected post-harvest processing method, since the purpose of this is exclusively the removal of mucilage remaining in the fruits.

[0012]. Associada à colheita de frutos maduros, o preparo do café por via úmida confere maior potencial para o aprimoramento da qualidade, sendo predominante nos principais países produtores de café arábica da América Central, África e Indonésia. Atualmente, vem crescendo no Brasil o número de produtores que estão empregando o processo por via úmida. A exigência de maquinário específico (despolpador ou desmucilador) e o requerimento de grandes volumes de água torna o processamento via úmida mais caro, no entanto, origina bebida de melhor qualidade. Além disso, entre as vantagens do café processado via úmida podem ser citadas a diminuição da área necessária para a secagem, a redução do volume em 60% e a redução do tempo da secagem, não só por ser um café uniforme, mas também por apresentar um teor de umidade mais baixo, aproximadamente 50% (BORÉM, Pós-colheita do café. Lavras: UFLA, v.1, 127 p. 2004).[0012]. Associated with the harvesting of ripe fruits, the wet preparation of coffee provides greater potential for quality improvement, being predominant in the main Arabica coffee producing countries in Central America, Africa and Indonesia. Currently, the number of producers in Brazil that are using the wet process has been growing. The requirement for specific machinery (pulper or demucilator) and the requirement for large volumes of water make wet processing more expensive, however, it produces a better quality beverage. In addition, among the advantages of wet processed coffee can be mentioned the reduction of the area needed for drying, the volume reduction by 60% and the reduction of drying time, not only for being a uniform coffee, but also for presenting a lower moisture content, approximately 50% (BORÉM, Post-harvest coffee. Lavras: UFLA, v.1, 127 p. 2004).

[0013]. Diversos estudos foram realizados no último século acerca da microbiologia e dos processos associados à fermentação do café (degradação pectinolítica da camada mucilaginosa, produção de ácidos orgânicos e componentes aromáticos) em países produtores do grão a fim de elucidar o papel desempenhado pela microbiota nativa do café. A presença e prevalência de certas espécies de microrganismos durante a fermentação são dependentes de fatores relacionados à variedade da planta, fatores ambientais e o método de processamento aplicado (Huch e Franz, em: Advances in fermented foods and beverages, p. 501-513, 2015).[0013]. Several studies have been carried out in the last century on the microbiology and processes associated with coffee fermentation (pectinolytic degradation of the mucilaginous layer, production of organic acids and aromatic components) in coffee producing countries in order to elucidate the role played by the native coffee microbiota. . The presence and prevalence of certain species of microorganisms during fermentation are dependent on factors related to plant variety, environmental factors, and the processing method applied (Huch and Franz, in: Advances in fermented foods and beverages, p. 501-513, 2015).

[0014]. A formação de alcoóis (especialmente etanol) e de ácidos orgânicos é o principal resultado do crescimento de leveduras durante a fermentação de café. Os ácidos que são produtos do excesso de fermentação tais como ácidos butírico, acético e propiônico, podem prejudicar a qualidade final da bebida, conferindo sabor adstringente quando presentes em concentrações superiores a 1 mg/ml (SILVA et al., World Journal of Microbiology Biotechnology, v. 29, p. 235-472012, 2012). Por outro lado, os ácidos cítrico, lático e málico, em concentrações entre 1 e 4 mg/ml, conferem uma acidez desejável para o produto (JHAM et al., Phytochem Anal, v. 13, p. 99-104, 2002). Metabólitos secundários são sintetizados quando o crescimento microbiano está na fase estacionária. Vários compostos voláteis produzidos durante o crescimento estacionário microbiano são importantes na formação dos aromas de alimentos fermentados, tais como: acetaldeído, acetato de etila, de isoamila, de propila, de isopropila, de isobutila, etanol, butirato de etila, entre outros. O acetato de isoamila e o acetato de etila são os principais compostos produzidos durante fermentação, sendo responsáveis pela formação de aromas de frutas ou de flores (pêssego, abacaxi, banana, cítrico e rosa) (PASTORE; UENOJO, Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.26, p. 509-515, 2006). Durante a fermentação de café, a produção de compostos aromáticos pode ser detectada no aroma e sabor da bebida se os mesmos difundirem para o interior das sementes de café e permanecerem após a torrefação (SILVA et al., World Journal of Microbiology Biotechnology v. 29, p. 23547, 2012).[0014]. The formation of alcohols (especially ethanol) and organic acids is the main result of yeast growth during coffee fermentation. Acids that are products of excess fermentation, such as butyric, acetic and propionic acids, can impair the final quality of the beverage, providing an astringent taste when present in concentrations greater than 1 mg/ml (SILVA et al., World Journal of Microbiology Biotechnology , v. 29, p. 235-472012, 2012). On the other hand, citric, lactic and malic acids, in concentrations between 1 and 4 mg/ml, provide a desirable acidity for the product (JHAM et al., Phytochem Anal, v. 13, p. 99-104, 2002) . Secondary metabolites are synthesized when microbial growth is in the stationary phase. Several volatile compounds produced during stationary microbial growth are important in the formation of aromas of fermented foods, such as: acetaldehyde, ethyl acetate, isoamyl, propyl, isopropyl, isobutyl, ethanol, ethyl butyrate, among others. Isoamyl acetate and ethyl acetate are the main compounds produced during fermentation, being responsible for the formation of fruit or flower aromas (peach, pineapple, banana, citrus and rose) (PASTORE; UENOJO, Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.26, p.509-515, 2006). During coffee fermentation, the production of aromatic compounds can be detected in the aroma and flavor of the beverage if they diffuse into the coffee seeds and remain after roasting (SILVA et al., World Journal of Microbiology Biotechnology v. 29 , p. 23547, 2012).

State of art

[0015]. As culturas microbianas têm sido utilizadas há muitos anos na produção de alimentos e bebidas fermentadas, tais como iogurte, carne, vinho e cerveja. Em muitos casos, a tecnologia evoluiu a partir de uma fermentação tradicional para um processo industrializado, com base na utilização de estirpes microbianas - definidos como culturas iniciadoras - para a realização da fermentação. Culturas iniciadoras são definidas como microrganismos que são inoculados diretamente na matéria-prima para que possam predominar sobre a microbiota existente e provoquem alterações desejáveis no produto final (Leroy e De Vuyst, Trends in Food Science and Technology, v. 15, p. 67-78, 2004). As bactérias ácidas láticas são amplamente empregadas como culturas iniciadoras para produção de diversos alimentos, tais como queijos e iogurtes.[0015]. Microbial cultures have been used for many years in the production of fermented foods and beverages, such as yogurt, meat, wine and beer. In many cases, the technology has evolved from a traditional fermentation to an industrialized process, based on the use of microbial strains - defined as starter cultures - to carry out the fermentation. Starter cultures are defined as microorganisms that are inoculated directly into the raw material so that they can predominate over the existing microbiota and cause desirable changes in the final product (Leroy and De Vuyst, Trends in Food Science and Technology, v. 15, p. 67- 78, 2004). Lactic acid bacteria are widely used as starter cultures for the production of various foods, such as cheeses and yogurts.

[0016]. A fermentação do café se baseia na sucessão de um consórcio de microrganismos constituídos de bactérias, leveduras e fungos filamentosos que já se encontram nos frutos do café (Silva et al., Food Microbiology, v. 25, p. 951-957, 2008). Espécies de bactérias láticas são prevalentes nos primeiros estágios de fermentação, expressando cerca de 80% do total da microbiota presente (Silva et al., Food Microbiology, v. 25, p. 951-957, 2008). Estas bactérias são responsáveis pela conversão inicial dos açúcares redutores em diversos metabólitos tais como ácido lático, acetaldeído e etanol. Espécies de Leuconostoc spp. (L. mesenteroides, L. pseudomesenteroides, L. citreum, L. holzapfelli), Weissela spp. (W. cibaria, W. confused, W. thailandensis) e Lactobacillus spp. (L. brevis L. plantarum, L. lactis subsp. lactis) são predominantes em diversos estudos com o enfoque no isolamento da microbiota das cerejas de café e de diferentes tipos de processamento (Avallone et al., Current Microbiology, v.42, p. 252-256, 2001; De Bruyne et al., International Jouranl of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 57, p. 2952-2959, 2007; Schillinger et al., FEMS Microbiology Letters, v. 286, p. 222-226, 2008; Vilela et al., Food Microbiology, v. 27, p. 1128-1135, 2010; Velmourougane, Proceedings of National Academy of Sciences, v. 83(2), p. 233-239, 2013; Leong et al., Current Microbiology, v. 68, p. 440447, 2014).[0016]. Coffee fermentation is based on the succession of a consortium of microorganisms consisting of bacteria, yeasts and filamentous fungi that are already found in coffee fruits (Silva et al., Food Microbiology, v. 25, p. 951-957, 2008) . Lactic acid bacteria species are prevalent in the early stages of fermentation, expressing about 80% of the total microbiota present (Silva et al., Food Microbiology, v. 25, p. 951-957, 2008). These bacteria are responsible for the initial conversion of reducing sugars into various metabolites such as lactic acid, acetaldehyde and ethanol. Leuconostoc spp. (L. mesenteroides, L. pseudomesenteroides, L. citreum, L. holzapfelli), Weissela spp. (W. cibaria, W. confused, W. thailandensis) and Lactobacillus spp. (L. brevis L. plantarum, L. lactis subsp. lactis) are predominant in several studies focusing on the isolation of the microbiota of coffee cherries and different types of processing (Avallone et al., Current Microbiology, v.42, pp 252-256, 2001; De Bruyne et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 57, pp. 2952-2959, 2007; Schillinger et al., FEMS Microbiology Letters, v. 286, p. 222 -226, 2008; Vilela et al., Food Microbiology, v. 27, p. 1128-1135, 2010; Velmourougane, Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 83(2), p. 233-239, 2013; Leong et al., Current Microbiology, v. 68, p. 440447, 2014).

[0017]. Embora encontradas em quantidades significativas (acima de 104 CFU.g-1), o papel desempenhado pelas bactérias ácido láticas ainda é desconhecido. As funções associadas a esses organismos na fermentação do café estão propostas às suas atividades antifúngicas, capacidade de reduzir o pH da massa fermentada através da produção de ácidos orgânicos, prevenção do crescimento bactérias oportunistas e promover um ambiente seletivo e propício para o crescimento de leveduras (Huch e Franz, In: Advances in fermented foods and beverages, p. 501-513, 2015; Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1-48, 2015).[0017]. Although found in significant amounts (above 104 CFU.g-1), the role played by lactic acid bacteria is still unknown. The functions associated with these organisms in coffee fermentation are proposed by their antifungal activities, ability to reduce the pH of the fermented mass through the production of organic acids, preventing the growth of opportunistic bacteria and promoting a selective and favorable environment for the growth of yeasts ( Huch and Franz, In: Advances in fermented foods and beverages, p. 501-513, 2015; Pereira et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1-48, 2015).

[0018]. Durante o processamento de café, a etapa de fermentação é realizada naturalmente por microrganismos presentes na matéria-prima (cerejas de café) e equipamentos utilizados. Alguns estudos têm sido realizados para a seleção de uma cultura iniciadora para o processamento de café, onde o principal objetivo é desenvolver um processo fermentativo mais rápido através da utilização de microrganismos produtores de enzimas pectinolíticas e do enriquecimento do perfil sensorial do café com o uso de microrganismos aromáticos. O principal grupo de microorganismo testado são leveduras (Soccol et al., 2013, Patente número BR1020130318493; Soccol, et al., 2013, Patente número BR10201302954; Pereira et al., International Journal of Food Microbiology, v.188, p. 60-66, 2014; Evangelista et al., Food Research International, v. 61, p. 183-195, 2014; Evangelista et al., Food Microbiology, v. 44, p. 87-95, 2014).[0018]. During coffee processing, the fermentation step is carried out naturally by microorganisms present in the raw material (coffee cherries) and equipment used. Some studies have been carried out for the selection of a starter culture for coffee processing, where the main objective is to develop a faster fermentation process through the use of microorganisms that produce pectinolytic enzymes and the enrichment of the coffee sensory profile with the use of aromatic microorganisms. The main group of microorganisms tested are yeasts (Soccol et al., 2013, Patent number BR1020130318493; Soccol, et al., 2013, Patent number BR10201302954; Pereira et al., International Journal of Food Microbiology, v.188, p. 60 -66, 2014; Evangelista et al., Food Research International, v. 61, p. 183-195, 2014; Evangelista et al., Food Microbiology, v. 44, p. 87-95, 2014).

[0019]. Processos que propõem o uso de bactérias láticas como culturas iniciadoras também vêm sendo explorados na literatura. Por exemplo, o documento patentário PI0611411-3 relata um método de fermentação de café conduzido com a adição de bactérias láticas para a inibição do crescimento de bactérias acéticas e prevenção da formação de ácido acético no processo fermentativo. As documentações PI0609316-7 e PI0414617-4 descrevem o uso de Lactobacillus para a elevação do perfil sensorial da bebida produzida final, bem como o uso de meios nutritivos sintéticos ou naturais (sucos de frutas, açúcares e caldo de cana) para a complementação nutricional e estimulação do metabolismo microbiano. No entanto, nossa invenção trata-se de um processo específico de redução do tempo de fermentação de café durante o processamento pós-colheita e produção de cafés especiais através do uso de uma cepa específica de bactéria do ácido lático, Lactobacillus plantarum R01. O processo inclui o despolpamento inicial das cerejas de café, seguido da adição da L. plantarum R01 e água, proporcionando um resultado surpreendente na diminuição do tempo necessário para fermentação para 6 a 12 horas (processo tradicional 24-48 horas), além da produção de cafés especiais com notas sensoriais distintas associadas ao metabolismo da cepa selecionada.[0019]. Processes that propose the use of lactic acid bacteria as starter cultures have also been explored in the literature. For example, patent document PI0611411-3 reports a method of fermenting coffee conducted with the addition of lactic acid bacteria for inhibiting the growth of acetic bacteria and preventing the formation of acetic acid in the fermentation process. Documents PI0609316-7 and PI0414617-4 describe the use of Lactobacillus to increase the sensory profile of the final produced beverage, as well as the use of synthetic or natural nutritive media (fruit juices, sugars and cane juice) for nutritional complementation. and stimulation of microbial metabolism. However, our invention is about a specific process of reducing coffee fermentation time during post-harvest processing and production of specialty coffees through the use of a specific strain of lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum R01. The process includes the initial pulping of the coffee cherries, followed by the addition of L. plantarum R01 and water, providing a surprising result in reducing the time required for fermentation to 6 to 12 hours (traditional process 24-48 hours), in addition to the production of specialty coffees with distinct sensory notes associated with the metabolism of the selected strain.

Brief Description of the Invention

[0020]. A presente invenção fornece um processo para utilização de culturas láticas durante o processamento pós-colheita do café. Este processo é constituído pelas seguintes etapas: 1 - colheita de frutos; 2 - descascamento (rompimento da casca e/ou pergaminho para liberação dos grãos); 3 - transferência dos grãos para tanques de fermentação; 4 - adição de culturas láticas; 5 - lavagem dos grãos para remoção dos resíduos de mucilagem; 6 - secagem das sementes; e 7 - produção da bebida. Culturas láticas de diversos gêneros podem ser utilizadas, tais como Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella.[0020]. The present invention provides a process for using lactic acid cultures during post-harvest processing of coffee. This process consists of the following steps: 1 - fruit harvest; 2 - peeling (breaking of the husk and/or parchment to release the grains); 3 - transfer of grains to fermentation tanks; 4 - addition of lactic cultures; 5 - washing the grains to remove mucilage residues; 6 - drying the seeds; and 7 - beverage production. Lactic cultures of different genera can be used, such as Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus and Weissella.

[0021]. Além disso, culturas láticas previamente selecionadas e altamente ativas são também recomendadas (Lactobacillus plantarum R01 e/ou Lactobacillus paracasei spp. paracasei L07). O uso preferencial destas estirpes promove a otimização do processo fermentativo, reduzindo o tempo necessário para a fermentação de 24 a 48 horas para 6 a 12 horas, além da formação de compostos voláteis específicos (acetato de etila e propionato de etila) que conferem notas sensoriais distintas e desejadas à bebida final.[0021]. In addition, previously selected and highly active lactic acid cultures are also recommended (Lactobacillus plantarum R01 and/or Lactobacillus paracasei spp. paracasei L07). The preferential use of these strains promotes the optimization of the fermentation process, reducing the time required for fermentation from 24 to 48 hours to 6 to 12 hours, in addition to the formation of specific volatile compounds (ethyl acetate and ethyl propionate) that provide sensory notes. distinct and desired to the final drink.

Citation of Figures

[0022]. A Figura 1 esquematiza o processo de processamento dos grãos de café utilizando bactérias do ácido lático como culturas iniciadoras.[0022]. Figure 1 outlines the coffee bean processing process using lactic acid bacteria as starter cultures.

[0023]. A Figura 2 ilustra o perfil de crescimento de bactérias ácido láticas, leveduras e a evolução da redução do pH durante um período de 24 h em fermentações com a estirpe Lactobacillus plantarum R01.[0023]. Figure 2 illustrates the growth profile of lactic acid bacteria, yeasts and the evolution of pH reduction over a period of 24 h in fermentations with strain Lactobacillus plantarum R01.

[0024]. A Figura 3 ilustra a avaliação final seguindo o protocolo da Specialty Coffee Association of America (SCAA) averiguando as características de aroma, flavor, acidez, corpo, acabamento, equilíbrio, uniformidade, diferenciação dos sabores e doçura da bebida final produzida pela fermentação com a inoculação da estirpe de Lactobacillus plantarum R01 e espontânea do café.[0024]. Figure 3 illustrates the final evaluation following the Specialty Coffee Association of America (SCAA) protocol, verifying the characteristics of aroma, flavor, acidity, body, finish, balance, uniformity, differentiation of flavors and sweetness of the final beverage produced by fermentation with the inoculation of Lactobacillus plantarum strain R01 and spontaneous coffee.

Detailed Description of the Invention EXAMPLE I. Inoculation of lactic cultures during coffee processing and production of specialty beverages

[0025]. O processamento proposto nesta invenção dispõe de um conjunto de operações ilustradas na Figura 1. Inicialmente os frutos maduros de café devem ser despolpados (BDSV-4 Pinhalense) para obter grãos com a mucilagem exposta. As fermentações devem ser conduzidas em tanques de alvenaria, aço inoxidável, madeira, polipropileno e/ou vidro por um período de 6 a 12 horas. Culturas liofilizadas de bactérias do ácido lático (Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella) devem ser reidratadas pela adição de água a 37 - 40° C. Essa solução final deve ser depositada nos tanques de fermentação para uma concentração entre 106 à 1010 células/ml.[0025]. The processing proposed in this invention has a set of operations illustrated in Figure 1. Initially, the ripe coffee fruits must be pulped (BDSV-4 Pinhalense) to obtain beans with exposed mucilage. Fermentations must be carried out in masonry, stainless steel, wood, polypropylene and/or glass tanks for a period of 6 to 12 hours. Lyophilized cultures of lactic acid bacteria (Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus and Weissella) should be rehydrated by adding water at 37 - 40°C. be deposited in fermentation tanks at a concentration between 106 to 1010 cells/ml.

[0026]. Os frutos fermentados devem ser secos ao sol ou mecanicamente até que alcancem a umidade padrão de estocagem (10 - 12%). As bebidas devem ser preparadas e avaliadas seguindo os protocolos estipulados pela Specialty Coffee Association of America (SCAA,“http://www.scaa.org/?page=resources&d=cupping-protocols”).[0026]. Fermented fruits should be dried in the sun or mechanically until they reach standard storage humidity (10 - 12%). Beverages must be prepared and evaluated following protocols stipulated by the Specialty Coffee Association of America (SCAA, “http://www.scaa.org/?page=resources&d=cupping-protocols”).

EXAMPLE II - Methodology for selection of lactic acid bacteria producing aromatic compounds and organic acids for coffee processing

[0027]. Com o uso de um meio de cultura formulado a base de polpa de café foi possível avaliar a produção de compostos aromáticos e ácidos orgânicos de 13 (treze) estirpes de bactérias ácido láticas previamente isoladas de frutas (Pereira et al., Letters in Applied Microbiology, v. 62, p. 96-101, 2016). O meio empregado apresentava de 50 a 80% de extrato de polpa de café, 2 a 10% de pectina, 1,5 a 5% de frutose,1,5 a 5% de glicose, 5 a 10% de extrato de levedura e 5 a 10% peptona de soja.[0027]. Using a culture medium formulated with coffee pulp, it was possible to evaluate the production of aromatic compounds and organic acids of 13 (thirteen) strains of lactic acid bacteria previously isolated from fruits (Pereira et al., Letters in Applied Microbiology , v. 62, p. 96-101, 2016). The medium used had 50 to 80% of coffee pulp extract, 2 to 10% of pectin, 1.5 to 5% of fructose, 1.5 to 5% of glucose, 5 to 10% of yeast extract and 5 to 10% soy peptone.

[0028]. Os isolados foram reativados em tubos de ensaio contendo 10 mL de meio MRS líquido a 30°C e 120 rpm. Posteriormente as suspensões microbianas foram transferidas para erlenmeyers de 250 mL contendo 90 mL de meio MRS líquido, incubados a 30°C por 48 horas e 120 rpm, para acúmulo de biomassa. Após este período, absorbância da suspensão a 495 nm foi mensurada e ajustada por meio de diluições para 0,6 de absorbância para inoculação no meio formulado. Os compostos aromáticos voláteis e ácidos orgânicos produzidos após 24 horas de fermentação no headspace dos erlenmeyers foram analisados por cromatografia gasosa utilizando um cromatógrafo a gás da marca Shimadzu, modelo GC17A e equipado com coluna HP-DB 5 (30 m x 0,32 mm), detector de ionização de chama e uma fibra SPME de 75 μm do tipo dimetilsiloxano da marca Spelco Co. As amostras foram preparadas realizando uma diluição de 2 ml em um proporção de 1:1 com água destilada acrescida de NaCl 5% (m/v). Estas foram armazenadas em frascos de 20 ml hermeticamente fechados e aquecidas por 10 minutos à temperatura de 60° C para que se fosse possível alcançar o equilíbrio do headspace da amostra. As temperaturas do injetor e detector foram mantidas a 230 °C. A temperatura do forno foi programada inicialmente para 40°C durante 5 minutos, sendo aumentada a uma taxa de 20°C/min até a temperatura final de 150 °C, que foi mantida durante 4 minutos. Como gás de arraste foi utilizado nitrogênio a uma vazão de 1,5 ml/min, e uma taxa de split de 1:5. Os compostos voláteis foram identificados através da comparação dos picos identificados nos tempos de retenção com padrões adquiridos da empresa Sigma. Para a quantificação, soluções de etanol foram preparadas em diferentes níveis de concentrações (1, 10, 20, 50, 100 e 1000 μmol/L) e utilizadas para a construção da curva padrão. As concentrações dos compostos voláteis foram expressas em μL/L de headspace, como equivalentes de etanol. Foram avaliadas as produções dos ésteres acetato de etila e propionato de etila. A concentração de ácidos orgânicos (ácidos lático, acético e propiônico) presentes nas amostras do meio formulado de café foram determinadas por cromatografia líquida de alta-precisão (HPLC). As amostras foram centrifugadas a 6000 g e filtradas em um filtro com porosidade de 0,22 μm (Milipore Corp). As amostras filtradas (10 a 50 μL) foram então injetadas no HPLC, o qual é equipado com uma coluna Aminex HPX 87 H (300 x 7,8 mm; Bio-Rad Laboratories) conectada a um detector de índice refrativo (Hewlett-Packard Company). A coluna foi eluída com uma fase móvel desgaseificada contendo H2SO4 (5 mM) a 60° C e um fluxo de 0,5 ml/min.[0028]. The isolates were reactivated in test tubes containing 10 mL of liquid MRS medium at 30°C and 120 rpm. Subsequently, the microbial suspensions were transferred to 250 mL erlenmeyers containing 90 mL of liquid MRS medium, incubated at 30°C for 48 hours and 120 rpm, for biomass accumulation. After this period, absorbance of the suspension at 495 nm was measured and adjusted by means of dilutions to 0.6 absorbance for inoculation in the formulated medium. The volatile aromatic compounds and organic acids produced after 24 hours of fermentation in the headspace of the erlenmeyers were analyzed by gas chromatography using a Shimadzu gas chromatograph, model GC17A and equipped with an HP-DB 5 column (30 m x 0.32 mm), flame ionization detector and a 75 μm dimethylsiloxane type SPME fiber from Spelco Co. The samples were prepared by performing a 2 ml dilution in a 1:1 ratio with distilled water plus 5% NaCl (m/v). These were stored in 20 ml hermetically sealed flasks and heated for 10 minutes at a temperature of 60°C so that it was possible to reach equilibrium in the headspace of the sample. Injector and detector temperatures were maintained at 230 °C. The oven temperature was initially programmed to 40°C for 5 minutes, being increased at a rate of 20°C/min until the final temperature of 150°C, which was maintained for 4 minutes. Nitrogen was used as carrier gas at a flow rate of 1.5 ml/min, and a split rate of 1:5. Volatile compounds were identified by comparing the identified peaks in retention times with standards purchased from Sigma. For quantification, ethanol solutions were prepared at different concentration levels (1, 10, 20, 50, 100 and 1000 μmol/L) and used to construct the standard curve. The concentrations of volatile compounds were expressed in μL/L headspace, as ethanol equivalents. The productions of ethyl acetate and ethyl propionate esters were evaluated. The concentration of organic acids (lactic, acetic and propionic acids) present in the formulated coffee medium samples were determined by high-precision liquid chromatography (HPLC). The samples were centrifuged at 6000 g and filtered through a filter with a porosity of 0.22 μm (Milipore Corp). The filtered samples (10 to 50 μL) were then injected into the HPLC, which is equipped with an Aminex HPX 87 H column (300 x 7.8 mm; Bio-Rad Laboratories) connected to a refractive index detector (Hewlett-Packard Company). The column was eluted with a degassed mobile phase containing H 2 SO 4 (5 mM) at 60°C and a flow rate of 0.5 ml/min.

[0029]. Os ácidos orgânicos produzidos durante a etapa de processamento de grãos de café podem influenciar diretamente a qualidade da bebida final de diferentes formas. Os ácidos provenientes de uma fermentação prolongada (tais como os ácidos butírico, propiônico e acético), podem danificar a qualidade final da bebida por atribuírem um gosto adstringente quando presentes em concentrações superiores à 1mg/ml (Silva et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 29, p. 235-247, 2013). No entanto, a produção de ácido lático é desejada, pois ela pode auxiliar a acidificação da massa de polpa fermentada sem interferir diretamente na qualidade final do produto. Baseando-se em tais fatores, a elevada produção de ácido lático e baixas produções de ácidos acético e propiônico avaliadas no meio formulado de café foi utilizada como uma seleção primária para determinar a estirpe de bactéria ácido lática mais apropriada para a condução do processo de fermentação das cerejas de café em fazenda. Dentre as treze bactérias ácido láticas avaliadas, as estirpes de Lactobacillus sp. R07, L. plantarum L01, L. plantarum R01 e L. paracasei L07 foram pré-selecionadas e prospectadas de acordo com a sua produção de compostos aromáticos voláteis. Neste screening secundário, a estirpe de L. plantarum R01 produziu uma concentração significativamente superior (p < 0,05) de ésteres aromáticos (acetato de etila e propionato de etila). A produção destes metabólitos que conferem notas sensoriais de aromas frutado, os quais participam da complexidade aromática do café, acrescido à elevada produção de ácido lático (17,05 g/L) e baixas concentrações de ácidos propiônico e acético (0,4 e 0,5 g/L, respectivamente) tornaram a estirpe L. plantarum R01 atrativa para melhorar o valor aromático dos grãos de café e avaliar o seu comportamento em condições de campo.[0029]. The organic acids produced during the coffee bean processing step can directly influence the quality of the final beverage in different ways. Acids from prolonged fermentation (such as butyric, propionic and acetic acids) can damage the final quality of the beverage by giving an astringent taste when present in concentrations greater than 1mg/ml (Silva et al., World Journal of Microbiology). and Biotechnology, v. 29, p. 235-247, 2013). However, the production of lactic acid is desired, as it can help the acidification of the fermented pulp mass without directly interfering with the final quality of the product. Based on such factors, the high production of lactic acid and low production of acetic and propionic acids evaluated in the formulated coffee medium was used as a primary selection to determine the most appropriate lactic acid bacteria strain to conduct the fermentation process. of coffee cherries on farm. Among the thirteen lactic acid bacteria evaluated, the strains of Lactobacillus sp. R07, L. plantarum L01, L. plantarum R01 and L. paracasei L07 were pre-selected and prospected according to their production of volatile aromatic compounds. In this secondary screening, L. plantarum strain R01 produced a significantly higher concentration (p < 0.05) of aromatic esters (ethyl acetate and ethyl propionate). The production of these metabolites that provide sensory notes of fruity aromas, which participate in the aromatic complexity of coffee, added to the high production of lactic acid (17.05 g/L) and low concentrations of propionic and acetic acids (0.4 and 0 .5 g/L, respectively) made the strain L. plantarum R01 attractive to improve the aromatic value of coffee beans and evaluate their behavior under field conditions.

EXAMPLE III. Method for inoculation of selected strains during coffee processing

[0030]. Para a avaliação do desempenho da estirpe quando submetida a condições de campo, fermentações experimentais foram realizadas. Grãos recém-colhidos de Coffea arabica var. Catuí foram despolpados utilizando um despolpador modelo BDSV-4 Pinhalense para obter grãos com a mucilagem exposta, apropriados para o processamento via úmida. As fermentações foram conduzidas em tanques de cimento (1 a 5 m3) contendo 20 a 60 kg de café despolpado e de 300 a 2000 L de água fresca em concordância com o método de processamento úmido empregado no local. Para a produção de biomassa, pré-culturas foram preparadas através da inoculação de 1 a 10 ml de cultura estoque em 100 ml de meio MRS líquido (Himedia) e incubados por 48 h sob agitação de 120 rpm a 30° C. Em seguida, o pré-inóculo foi transferido para volumes maiores (1 e 4 L de meio MRS líquido) e submetidos a crescimento durante 24 h sob as condições de 30° C e 120 rpm para a obtenção de uma quantidade significativa de biomassa. O inóculo foi centrifugado a 4500 g durante 15 min e a temperatura de 4° C, lavado com água destilada e novamente centrifugado. A cultura liofilizada foi preparada pela ressuspensão do pellet em leite UHT desnatado, rapidamente congelado em uma mistura de etanol-gelo seco e secado a frio em um liofilizador Modulyod 230 (Thermo Electron Corporation) sob pressão negativa de 50 mBar e -45° C. A cultura iniciadora foi reidratada pela adição de água à 25 a 40° C até que alcançasse a concentração de 2 a 20 g/L e delicadamente agitada durante 5 min para garantir uma homogeneização completa. Essa solução final foi depositada nos tanques de fermentação para que se fosse possível alcançar uma concentração de 102 a 1012 células/ml. As fermentações inoculadas foram conduzidas em triplicatas e fermentações espontâneas foram utilizadas como controle para as análises subsequentes.[0030]. To evaluate the strain's performance when submitted to field conditions, experimental fermentations were carried out. Freshly harvested beans of Coffea arabica var. Catuí were pulped using a pulper model BDSV-4 Pinhalense to obtain grains with exposed mucilage, suitable for wet processing. Fermentations were carried out in cement tanks (1 to 5 m3) containing 20 to 60 kg of pulped coffee and 300 to 2000 L of fresh water in accordance with the wet processing method employed at the site. For biomass production, pre-cultures were prepared by inoculating 1 to 10 ml of stock culture in 100 ml of liquid MRS medium (Himedia) and incubated for 48 h under agitation at 120 rpm at 30°C. the pre-inoculum was transferred to larger volumes (1 and 4 L of liquid MRS medium) and subjected to growth for 24 h under conditions of 30°C and 120 rpm to obtain a significant amount of biomass. The inoculum was centrifuged at 4500 g for 15 min and at 4°C, washed with distilled water and centrifuged again. The lyophilized culture was prepared by resuspension of the pellet in UHT skimmed milk, quickly frozen in an ethanol-dry ice mixture and freeze-dried in a Modulyod 230 lyophilizer (Thermo Electron Corporation) under negative pressure of 50 mBar and -45°C. The starter culture was rehydrated by adding water at 25 to 40°C until it reached a concentration of 2 to 20 g/L and gently shaken for 5 min to ensure complete homogenization. This final solution was deposited in the fermentation tanks so that it was possible to reach a concentration of 102 to 1012 cells/ml. The inoculated fermentations were carried out in triplicates and spontaneous fermentations were used as controls for subsequent analyses.

[0031]. Os frutos depulpados foram fermentados por um período de 0 a 24 h e, em seguida, secos ao sol até que alcançassem a umidade padrão (10 - 12%) de estocagem. As amostras (fração líquida + grãos) foram coletadas em diferentes tempos para a contagem microbiana de células viáveis e análises dos metabólitos de interesse. O pH do fermentado foi mensurado em cada período de coleta utilizado um pHmêtro portátil modelo AK90 (AKSO). A concentração dos açúcares redutores (glicose e frutose) e de ácidos orgânicos (ácidos lático, acético, cítrico, fumárico, succínico e málico) presentes nas amostras da massa de polpa e grãos fermentada foram determinadas por cromatografia líquida de alta-precisão (HPLC). A análise dos compostos aromáticos produzidos foram verificados por cromatografia gasosa utilizando como padrões para verificação dos pontos de retenção 11 álcoois (etanol, 1-hexanol, 1-heptanol, 1-octanol, 1- decanol, 2-hexanol, 2-octanol, 2-metil-1-butanol, n-butanol e 3-metil-1- butanol), 12 ésteres (acetato de etila, acetato de propila, laurato de etila, propionato de etila, isobutirato de etla, hexanoato de etila, octanoato de etila, succinato de dietila, acetato de isoamila, acetato de isoamila, acetato de isobutila, acetato de n-butila e acetato de hexila), 5 cetonas (2,3-butanediona, 2-pentanona, 2-hexanona, 2- octanona e 2-heptanona) e 3 aldeídos (acetaldeído, benzaldeído e 3- metil-butanal). Para a contagem do total de microrganismos, amostras (10 ml) do fermentado foram homogeneizadas em 90 ml de água salina peptonada (0,1% [v/v] de peptona bacteriológica, 0,8% [v/v] de NaCl) e submetidas a diluição seriada. Os meios ágar de Rosa Bengala (RBCA) contendo 0,01% (m/v) de cloramfenicol e ágar MRS (Himedia) contendo 0,1% (m/v) de natamicinaforam utilizados para a contagem do total de leveduras e bactérias ácido láticas, respectivamente. As placas foram encubadas em estufa a 30° C durante 48 h. A qualidade da bebida foi avaliada por quatro especialistas que apresentam Certificados Q- Gradrer para o café. As bebidas (80 ml) foram preparadas e servidas em taças de 240 ml com 8 cm de diâmetro, o que permitia a dispersão de compostos para a percepção olfatória. As apurações foram realizadas quando a temperatura da bebida alcançou 65° C (para a avaliação olfatória) e 45° C (para a avaliação degustatória). Cada bebida foi avaliada nos atributos de (i) aroma, (ii) flavor, (iii) acidez, (iv) encorpo, (v) acabamento, (vi) equilíbrio, (vii) uniformidade, (viii) distinção dos sabores, (ix) doçura e (x) qualidade geral seguindo os protocolos estipulados pela Specialty Coffee Association of America (SCAA, “http://www.scaa.org/?page=resources&d=cupping-protocols”).[0031]. The pulped fruits were fermented for a period of 0 to 24 h and then dried in the sun until they reached the standard humidity (10 - 12%) for storage. The samples (liquid fraction + grains) were collected at different times for the microbial count of viable cells and analysis of the metabolites of interest. The pH of the fermented was measured in each collection period using a portable pH meter model AK90 (AKSO). The concentration of reducing sugars (glucose and fructose) and organic acids (lactic, acetic, citric, fumaric, succinic and malic acids) present in the fermented pulp and grain samples were determined by high-precision liquid chromatography (HPLC) . The analysis of the aromatic compounds produced were verified by gas chromatography using as standards for verification of retention points 11 alcohols (ethanol, 1-hexanol, 1-heptanol, 1-octanol, 1-decanol, 2-hexanol, 2-octanol, 2 -methyl-1-butanol, n-butanol and 3-methyl-1-butanol), 12 esters (ethyl acetate, propyl acetate, ethyl laurate, ethyl propionate, ethyl isobutyrate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate , diethyl succinate, isoamyl acetate, isoamyl acetate, isobutyl acetate, n-butyl acetate and hexyl acetate), 5 ketones (2,3-butanedione, 2-pentanone, 2-hexanone, 2-octanone and 2 -heptanone) and 3 aldehydes (acetaldehyde, benzaldehyde and 3-methyl-butanal). To count the total microorganisms, samples (10 ml) of the fermented were homogenized in 90 ml of peptone saline water (0.1% [v/v] bacteriological peptone, 0.8% [v/v] NaCl) and subjected to serial dilution. Rose Bengal agar (RBCA) containing 0.01% (w/v) of chloramphenicol and MRS agar (Himedia) containing 0.1% (w/v) of natamycin were used to count the total yeast and acid bacteria. lactic acid, respectively. The plates were incubated in an oven at 30°C for 48 h. The quality of the beverage was evaluated by four experts who present Q-Gradrer Certificates for the coffee. The drinks (80 ml) were prepared and served in 240 ml glasses with 8 cm in diameter, which allowed the dispersion of compounds for the olfactory perception. The determinations were carried out when the temperature of the drink reached 65° C (for the olfactory assessment) and 45° C (for the tasting assessment). Each beverage was evaluated on the attributes of (i) aroma, (ii) flavor, (iii) acidity, (iv) fullness, (v) finish, (vi) balance, (vii) uniformity, (viii) distinctive flavors, ( ix) sweetness and (x) overall quality following protocols stipulated by the Specialty Coffee Association of America (SCAA, “http://www.scaa.org/?page=resources&d=cupping-protocols”).

[0032]. Como observado na Figura 2, a estirpe de L. plantarum R01 foi capaz de estabelecer uma intensa fermentação ácido lática, resultando em um processo de acidificação acelerado da polpa do café, alcançando a estabilização do pH em 4,3 logo nas primeiras 12 h de fermentação, demonstrando ser uma potencial via alternativa para reduzir o tempo de fermentação para 12 h. Este dado está de acordo com a quantidade de bactérias ácido láticas totais observada ao final da fermentação (10,92 log UFC/ml), o que indicou que a estirpe de L. plantarum R01 é competitiva e pode crescer sob os estresses impostos nas condições ambientais associadas à fermentação dos grãos de café. A redução do pH a níveis inferiores a 4,5 é um método amplamente utilizado pelos produtores de café para determinar o final da fermentação das cerejas de café durante o processamento via úmida (Jackels e Jackels, Journal of Food Science, v. 70, p. 321-325).[0032]. As seen in Figure 2, the strain of L. plantarum R01 was able to establish an intense lactic acid fermentation, resulting in an accelerated acidification process of the coffee pulp, reaching pH stabilization at 4.3 in the first 12 h of fermentation. fermentation, demonstrating to be a potential alternative way to reduce the fermentation time to 12 h. This data is in agreement with the amount of total lactic acid bacteria observed at the end of fermentation (10.92 log CFU/ml), which indicated that the strain of L. plantarum R01 is competitive and can grow under the stresses imposed in the conditions environmental factors associated with the fermentation of coffee beans. Reducing the pH to levels below 4.5 is a method widely used by coffee producers to determine the end of fermentation of coffee cherries during wet processing (Jackels and Jackels, Journal of Food Science, v. 70, p. . 321-325).

[0033]. A inoculação de L. plantarum R01 demonstrou não influenciar significativamente o crescimento das leveduras durante o período de fermentação, quando comparada com as fermentações espontâneas utilizadas como controle. Este resultado reafirma a potencialidade do uso inovador dessa estirpe no processamento do café, uma vez que recentes estudos têm demonstrado que as leveduras desempenham funções importantes, participando diretamente na produção de enzimas pectinolíticas, reduzindo o crescimento de fungos filamentosos produtores de Ocratoxina A e na produção de compostos que impactam o sabor e aroma da bebida final (Masoud et al., Yeast, v. 22, p. 1133-1142, 2005; Evangelista et al., Food Microbiology, v. 44, p. 8795, 2014; Pereira et al., International Journal of Food Microbiology, v. 188, p. 60-66, 2014). A inoculação dessa estirpe também aumentou significativamente (p < 0,05) a produção de compostos aromáticos voláteis durante o processo de fermentação, tais como acetato de butila, acetato de etila, 1-octanol, acetato de isoamila, hexanoato de etila, succinato de etila e octanoato de etila. Estudos recentes evidenciaram que esses ésteres podem difundir para o interior dos grãos e implementar notas sensoriais distintas à bebida, embora a cinética dessa reação ainda não esteja claramente descrita (Silva et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 29, p. 235-247, 2013; Pereira et al., International Journal of Food Microbiology, v. 188, p. 60-66, 2014).[0033]. Inoculation of L. plantarum R01 did not significantly influence yeast growth during the fermentation period, when compared to spontaneous fermentations used as controls. This result reaffirms the potential for the innovative use of this strain in coffee processing, since recent studies have shown that yeasts play important roles, participating directly in the production of pectinolytic enzymes, reducing the growth of filamentous fungi producing Ochratoxin A and in the production of of compounds that impact the taste and aroma of the final beverage (Masoud et al., Yeast, v. 22, p. 1133-1142, 2005; Evangelista et al., Food Microbiology, v. 44, p. 8795, 2014; Pereira et al., International Journal of Food Microbiology, v. 188, p. 60-66, 2014). Inoculation of this strain also significantly increased (p < 0.05) the production of volatile aromatic compounds during the fermentation process, such as butyl acetate, ethyl acetate, 1-octanol, isoamyl acetate, ethyl hexanoate, ethyl and ethyl octanoate. Recent studies have shown that these esters can diffuse into the grains and introduce distinct sensory notes to the beverage, although the kinetics of this reaction are not yet clearly described (Silva et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 29, p. 235-247, 2013; Pereira et al., International Journal of Food Microbiology, v. 188, p. 60-66, 2014).

[0034]. Como demonstrado na Figura 3, a análise sensorial das bebidas produzidas a partir dos grãos torrados das fermentações inoculada e controle (fermentação espontânea) receberam diferentes notas para diversos atributos sensoriais importantes. O aroma, flavour, acidez, encorpo, equilíbrio e a qualidade geral alcançaram os maiores valores (p < 0,05) no tratamento inoculado quando comparado com o controle, enquanto a doçura, distinção de sabores e uniformidade foram estatisticamente similares entre si. A bebida gerada a partir da fermentação inoculada apresentou uma nota geral de 88,3 pontos SCAA, o que indica um café de alta qualidade de acordo com a Specialty Coffee Association of America Cupping Protocol. No segundo caso, o café gerado pelo processo convencional apresentou uma qualidade sensorial inferior alcançando um total de 80,3 pontos SCAA.[0034]. As shown in Figure 3, the sensory analysis of beverages produced from roasted beans from inoculated and control fermentations (spontaneous fermentation) received different scores for several important sensory attributes. The aroma, flavor, acidity, body, balance and general quality reached the highest values (p < 0.05) in the inoculated treatment when compared to the control, while the sweetness, distinct flavors and uniformity were statistically similar to each other. The beverage generated from the inoculated fermentation presented an overall score of 88.3 SCAA points, which indicates a high quality coffee according to the Specialty Coffee Association of America Cupping Protocol. In the second case, the coffee generated by the conventional process showed a lower sensory quality, reaching a total of 80.3 SCAA points.

[0035]. O café do tratamento controle produziu uma bebida com um perfil sensorial básico: as notas cítricas, caramelo e de banana foram as dominantes. Já o café oriundo do tratamento inoculado com a estirpe Lactobacillus plantarum R01 resultou em uma bebida complexa com notas perceptíveis de frutas frescas como banana, laranja e abacaxi além de apresentar uma sensação suave devido à presença do ácido lático. Esses resultados podem ser relacionados com a intensa produção de ésteres aromáticos e ácido lático pela estirpe de bactéria ácido lática selecionada, o que sugere a difusão destes metabólitos para o interior do grão durante a etapa de fermentação.[0035]. The control treatment coffee produced a beverage with a basic sensory profile: citrus, caramel and banana notes were the dominant ones. The coffee from the treatment inoculated with the strain Lactobacillus plantarum R01 resulted in a complex drink with noticeable notes of fresh fruits such as banana, orange and pineapple, in addition to presenting a smooth sensation due to the presence of lactic acid. These results can be related to the intense production of aromatic esters and lactic acid by the selected lactic acid bacteria strain, which suggests the diffusion of these metabolites into the grain during the fermentation step.

Claims

1. SPECIAL COFFEE PRODUCTION PROCESS THROUGH THE USE OF LACTIC CROPS DURING THE POST-HARVEST PROCESSING, characterized by conducting the fermentation process in tanks containing coffee beans and water, in a proportion of 30 to 60 kg of coffee for 300 to 2000 L of water, where lactic cultures will be inoculated at an initial concentration of 106 to 1010 cells/mL for a period of 6 to 12 hours.

2. PROCESS FOR PRODUCTION OF SPECIAL COFFEE THROUGH THE USE OF LACTIC CROPS DURING POST-HARVEST PROCESSING, according to Claim 1, characterized by the use of husked and/or demucilated and/or pulped coffees.

3. PROCESS FOR PRODUCTION OF SPECIAL COFFEE THROUGH THE USE OF LACTIC CULTURES DURING POST-HARVEST PROCESSING, according to Claim 1, characterized by the addition of lactic acid culture in dehydrated, lyophilized or paste form.

4. PROCESS FOR PRODUCTION OF SPECIAL COFFEE THROUGH THE USE OF LACTIC CULTURES DURING POST-HARVEST PROCESSING, according to Claim 1, characterized by preferential inoculation at concentrations of 107 and 108 cells/mL.

5. PROCESS FOR PRODUCTION OF SPECIAL COFFEE THROUGH THE USE OF LACTIC CROPS DURING POST-HARVEST PROCESSING, according to Claim 1, characterized by the fermentation process carried out in masonry, stainless steel, wood, polypropylene or glass tanks without the control of temperature.

6. PROCESS FOR PRODUCTION OF SPECIAL COFFEE THROUGH THE USE OF LACTIC CULTURES DURING POST-HARVEST PROCESSING, according to Claim 1, characterized by the fermentation process with the addition of lactic acid bacteria species of the following genera: Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus and Weissella.

7. PROCESS FOR PRODUCTION OF SPECIAL COFFEE THROUGH THE USE OF LACTIC CULTURES DURING POST-HARVEST PROCESSING, according to claims 1 and 8, characterized by the preferential use of selected strains Lactobacillus plantarum R01 and Lactobacillus paracasei spp. paracasei L07.