BR102016010984B1

BR102016010984B1 - MICROFLUID DEVICE AND MICROFLUID DEVICE MANUFACTURING PROCESS

Info

Publication number: BR102016010984B1
Application number: BR102016010984-1A
Authority: BR
Inventors: Ronaldo Censi Faria; Carolina Venturini Uliana; André Santiago Afonso
Original assignee: Fundação Universidade Federal De São Carlos
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2023-04-04
Also published as: WO2017193188A1; BR102016010984A2

Abstract

DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO E MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO A presente invenção refere-se a um dispositivo microfluídico composto de 8 eletrodos de trabalho, um eletrodo de referência, um eletrodo auxiliar e uma célula microfluídica conectada a uma bomba de seringa e injetor manual. Os eletrodos são fabricados com materiais poliméricos com auxílio de uma impressora de corte doméstica, software apropriado para desenho e a célula microfluídica com materiais de baixo custo como plástico adesivo ou similar. O uso desses materiais torna o dispositivo flexível, portátil, descartável e robusto, com fácil utilização e fabricação tornando-o adequado para aplicação em locais com falta de recursos. O dispositivo microfluídico foi utilizado na presente invenção para detecção de biomarcadores proteicos visando o diagnóstico do câncer, porém os eletrodos podem ainda ser utilizados como sensores individuais ou biossensores apropriados para análises químicas, diagnóstico clínico e immunossensores que utilizam tanto métodos eletroquímicos quanto eletroquimioluminescência para a detecção.MICROFLUID DEVICE AND METHOD OF MANUFACTURING A MICROFLUID DEVICE The present invention relates to a microfluidic device composed of 8 working electrodes, a reference electrode, an auxiliary electrode and a microfluidic cell connected to a syringe pump and manual injector. The electrodes are manufactured with polymeric materials with the aid of a domestic cutting printer, appropriate software for design and the microfluidic cell with low cost materials such as adhesive plastic or similar. The use of these materials makes the device flexible, portable, disposable and robust, easy to use and manufacture, making it suitable for application in places with a lack of resources. The microfluidic device was used in the present invention for the detection of protein biomarkers for the diagnosis of cancer, but the electrodes can still be used as individual sensors or appropriate biosensors for chemical analysis, clinical diagnosis and immunosensors that use both electrochemical and electrochemiluminescence methods for detection .

Description

Field of Invention

[001] A presente invenção trata de um dispositivo microfluídico para ser utilizado em diagnósticos clínicos e análises químicas. Mais especificamente, a presente invenção trata de um dispositivo microfluídico produzido preferencialmente com materiais poliméricos e composto de 8 eletrodos de trabalho, um eletrodo de referência e um eletrodo auxiliar, no qual estes podem ser sensores químicos individuais ou biossensores utilizados para a detecção de diferentes compostos como proteínas, anticorpos, DNA ou compostos orgânicos e inorgânicos, aplicado na detecção de biomarcadores proteicos visando o diagnóstico do câncer.[001] The present invention deals with a microfluidic device to be used in clinical diagnostics and chemical analysis. More specifically, the present invention deals with a microfluidic device preferably produced with polymeric materials and composed of 8 working electrodes, a reference electrode and an auxiliary electrode, in which these can be individual chemical sensors or biosensors used for the detection of different compounds such as proteins, antibodies, DNA or organic and inorganic compounds, applied in the detection of protein biomarkers aimed at diagnosing cancer.

History of the Invention

[002] Como bem conhecido dos técnicos versados no assunto, o campo da microfluídica pode ser definido como a ciência e a engenharia de sistemas com dimensões micrométricas, em que o comportamento dos fluidos nesta ordem de grandeza pode diferir daquele observado em escala macro.[002] As well known to technicians versed in the subject, the field of microfluidics can be defined as the science and engineering of systems with micrometric dimensions, in which the behavior of fluids in this order of magnitude can differ from that observed on a macro scale.

[003] Existem diversas aplicações para dispositivos microfluídicos, dentre as quais podemos citar: determinação de pH, monitoramento de cinética de reações, interações biomoleculares, separações eletroforéticas, imunoensaios, citometria de fluxo, manipulação de células, além de análises proteômicas, metabolômicas, de DNA e várias outras aplicações.[003] There are several applications for microfluidic devices, among which we can mention: pH determination, reaction kinetics monitoring, biomolecular interactions, electrophoretic separations, immunoassays, flow cytometry, cell manipulation, as well as proteomics, metabolomics, and DNA and various other applications.

[004] Notadamente, tais dispositivos trazem uma série de vantagens, pois possibilitam o diagnóstico “point-of-care” em países em desenvolvimento, onde a disponibilidade de recursos é limitada. Outras vantagens estão voltadas ao baixo custo, facilidade de uso, baixo consumo de reagentes (característica significativamente importante quando é preciso do uso de reagentes caros, ou em situações em que a quantidade de amostra é reduzida), portabilidade e descartabilidade.[004] Notably, such devices bring a number of advantages, as they enable “point-of-care” diagnosis in developing countries, where the availability of resources is limited. Other advantages are related to the low cost, ease of use, low consumption of reagents (significantly important characteristic when it is necessary to use expensive reagents, or in situations where the amount of sample is reduced), portability and disposability.

[005] O documento WO2015038767-A1 descreve um método de construção de um dispositivo microfluídico com substratos de polidimetilsiloxano (PDMS), polidimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato, poliepóxido, polímeros de olefina cíclica, copolímero de olefina cíclica e politereftalato de etileno. Nestes sistemas, um tratamento sobre a superfície de um dos substratos é feito para aumentar a adesão entre os dois substratos que foram fixados com um material polimérico curável adicionado entre eles.[005] WO2015038767-A1 describes a method of constructing a microfluidic device with substrates of polydimethylsiloxane (PDMS), polydimethylmethacrylate (PMMA), polycarbonate, polyepoxide, cyclic olefin polymers, cyclic olefin copolymer and polyethylene terephthalate. In these systems, a treatment on the surface of one of the substrates is done to increase the adhesion between the two substrates that have been fixed with a curable polymeric material added between them.

[006] O documento WO2010088219-A2 descreve a construção de um dispositivo microfluídico com base na moldagem de microcanais em polidimetilsiloxano, o qual é fixado por duas placas de vidro.[006] Document WO2010088219-A2 describes the construction of a microfluidic device based on molding microchannels in polydimethylsiloxane, which is fixed by two glass plates.

[007] Em outro documento BR102012012293-6A2 é descrito um sistema microfluídico, a base de poliéster-toner com o transporte da amostra por capilaridade para detecção de diversas amostras biológicas como glicose, proteínas, colesterol, triglicérides, lactato e ácido úrico.[007] In another document BR102012012293-6A2 is described a microfluidic system, based on polyester-toner with sample transport by capillarity for detection of various biological samples such as glucose, proteins, cholesterol, triglycerides, lactate and uric acid.

[008] Em relação ao primeiro documento podemos ressaltar que este utiliza materiais curáveis e processo para aumentar a adesão entre os substratos, o que resulta em uma construção de alta complexidade. Já em relação ao segundo documento, podemos citar que embora utilize materiais de baixo custo, sua fabricação é baseada no uso de materiais rígidos e moldagem de microcanais, o que atribui ao dispositivo fragilidade e, portanto, facilmente quebrável. O terceiro documento aqui citado, ainda que utilize materiais de baixo custo para a detecção de amostras, esta é apenas semi-quantitativa.[008] Regarding the first document, we can emphasize that this uses curable materials and process to increase adhesion between the substrates, which results in a highly complex construction. Regarding the second document, we can mention that although it uses low-cost materials, its manufacture is based on the use of rigid materials and molding of microchannels, which makes the device fragile and, therefore, easily breakable. The third document cited here, although using low-cost materials for sample detection, is only semi-quantitative.

[009] Podemos citar ainda artigos como: “Design and rapid prototyping of thin- film laminate-based microfluidic devices” (Weigl et al. 2001). “Microfluidic Electrochemical Immunoarray for Ultrasensitive Detection of two Cancer Biomarker Proteins in Serum” (Chikkaveeraiah et al. 2011). Tais artigos descrevem sistemas microfluídicos, porém ainda possuem as desvantagens citadas no parágrafo anterior.[009] We can also cite articles such as: “Design and rapid prototyping of thin-film laminate-based microfluidic devices” (Weigl et al. 2001). “Microfluidic Electrochemical Immunoarray for Ultrasensitive Detection of two Cancer Biomarker Proteins in Serum” (Chikkaveeraiah et al. 2011). Such articles describe microfluidic systems, but still have the disadvantages mentioned in the previous paragraph.

[0010] Portanto, é objetivo da presente invenção prover um dispositivo microfluídico para detecção de compostos, que trazem o emprego de materiais e equipamentos de baixo custo, flexíveis, robustos, descartáveis, contendo um arranjo de sensores para a fácil aplicação na determinação eletroquímica de um ou mais biomarcadores simultaneamente em amostras de interesse clínico voltado para países em desenvolvimento, como o Brasil.[0010] Therefore, it is the objective of the present invention to provide a microfluidic device for detection of compounds, which bring the use of low cost, flexible, robust, disposable materials and equipment, containing an array of sensors for easy application in the electrochemical determination of one or more biomarkers simultaneously in samples of clinical interest aimed at developing countries, such as Brazil.

Brief Description of the Invention

[0011] De acordo com a presente invenção, é provido um dispositivo microfluídico aplicado na determinação eletroquímica de um ou mais biomarcadores simultaneamente em amostras de interesse clínico, dito dispositivo sendo produzido com materiais de baixo custo, tais como: uma impressora de recorte doméstica; folhas de poliéster como substrato e uma folha de poliestireno contendo adesivo dupla face para a construção do microcanal. O dispositivo ainda possui um arranjo de preferencialmente 8 eletrodos, um eletrodo de referência e um eletrodo auxiliar fabricados em materiais poliméricos que são utilizados para a construção de sensores químicos individuais ou biossensores, podendo ser utilizados para a detecção de diferentes tipos de compostos como proteínas, anticorpos, DNA, ou compostos orgânicos e inorgânicos. Nesta invenção, os eletrodos foram aplicados na determinação de biomarcadores proteicos para o diagnóstico de câncer. A configuração dos eletrodos pode ser facilmente modificadas permitindo a construção de eletrodos com diferentes diâmetros ou arranjos contendo diferentes números de eletrodos, não estando limitados a arranjos de apenas 8 eletrodos, podendo ser de 1 a 12 eletrodos.[0011] According to the present invention, a microfluidic device is provided applied in the electrochemical determination of one or more biomarkers simultaneously in samples of clinical interest, said device being produced with low cost materials, such as: a domestic clipping printer; polyester sheets as substrate and a polystyrene sheet containing double-sided adhesive for the construction of the microchannel. The device still has an arrangement of preferably 8 electrodes, a reference electrode and an auxiliary electrode made of polymeric materials that are used for the construction of individual chemical sensors or biosensors, which can be used for the detection of different types of compounds such as proteins, antibodies, DNA, or organic and inorganic compounds. In this invention, the electrodes were applied in the determination of protein biomarkers for the diagnosis of cancer. The configuration of the electrodes can be easily modified, allowing the construction of electrodes with different diameters or arrangements containing different numbers of electrodes, not being limited to arrangements of only 8 electrodes, which can be from 1 to 12 electrodes.

[0012] Como será apreciado, este arranjo torna o custo de produção do dispositivo extremamente baixo conferindo ao mesmo flexibilidade, descartabilidade, robustez, facilidade de uso, portabilidade, simplicidade de construção e, portanto, adequado para produção em larga escala com aplicação voltada para países em desenvolvimento.[0012] As will be appreciated, this arrangement makes the production cost of the device extremely low, giving it flexibility, disposability, robustness, ease of use, portability, simplicity of construction and, therefore, suitable for large-scale production with application aimed at developing countries.

Brief Description of Figures

[0013] O dispositivo microfluídico segundo a presente invenção poderá ser bem compreendido a partir das figuras ilustrativas em anexo, as quais de uma forma esquemática e não limitativa de seu escopo representam: - Figura 1 - Esquema das etapas de construção dos eletrodos; - Figura 2 - Esquema de montagem do dispositivo microfluídico; - Figura 3 - Gráfico referente às respostas de correntes obtidas usando um conjunto de 8 eletrodos não modificados após a injeção de 100 μL de ácido ferrocenomonocarboxílico 1,0 x 10-3 mol L-1 em KCl 0,1 mol L-1 e aplicação de 0,3 V vs. Ag|AgCl. - Figura 4 - Gráfico pertinente aos voltamogramas cíclicos obtidos em solução de ácido ferrocenomonocarboxílico 1,0 x 10-3 mol L-1 em meio de KCl 0,1 mol L-1, com velocidade de varredura de 50 mV s-1. - Figura 5 - Gráfico referente aos voltamogramas cíclicos em solução tampão PBS pH 7,0 contendo cada composto individualmente a concentração de 1,0 x 10-5 mol L-1, sendo a primeira varredura (curva 1), e a segunda varredura (curva 2), com velocidade de varredura de 50 mV s-1. - Figura 6 - Gráfico pertecente aos voltamogramas cíclicos obtidos com eletrodos modificados com PDDA / AuNP-GSH / HRP em solução somente de PBS 0,1 mol L-1 pH 6,5 (1), PBS 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 1,0 x 10-4 mol L-1 de H2O2 (2), PBS 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 1,0 x 10-3 mol L-1 de HQ (3) e PBS 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 1,0 x 10-3 mol L-1 de HQ e 1,0 x 10-4 mol L-1 de H2O2 (4). Parâmetros: Ei= 0,1 V; Ef= -0,45 V, com velocidade de varredura de 20 mV s-1 - Figura 7 - Gráfico correspondente às respostas amperométricas individuais para soluções de ERα em soro de bezerro não diluído em concentrações de a) 0, b) 5,6 fg mL-1, c) 28 fg mL-1 , d) 0,11 pg mL-1, e) 1,1 pg mL-1, f) 2,8 pg mL-1 a -0,2 V vs. Ag|AgCl e Curva analítica para detecção de ERα. - Figura 8 - Gráfico correspondente às respostas amperométricas individuais para soluções de CA 15-3 em soro de bezerro não diluído em concentrações de 1,0 x 10-6 a 1,0 x 10-3 U mL-1 a -0,2 V vs. Ag|AgCl e Curva analítica para detecção de CA 15-3.[0013] The microfluidic device according to the present invention can be well understood from the attached illustrative figures, which represent in a schematic and non-limiting way: - Figure 1 - Scheme of the stages of construction of the electrodes; - Figure 2 - Assembly scheme of the microfluidic device; - Figure 3 - Graph referring to the responses of currents obtained using a set of 8 unmodified electrodes after the injection of 100 μL of ferrocenomonocarboxylic acid 1.0 x 10-3 mol L-1 in KCl 0.1 mol L-1 and application of 0.3V vs. Ag|AgCl. - Figure 4 - Graph pertaining to the cyclic voltammograms obtained in a 1.0 x 10-3 mol L-1 ferrocene monocarboxylic acid solution in 0.1 mol L-1 KCl medium, with a scanning speed of 50 mV s-1. - Figure 5 - Graph referring to cyclic voltammograms in PBS pH 7.0 buffer solution containing each compound individually at a concentration of 1.0 x 10-5 mol L-1, with the first scan (curve 1) and the second scan ( curve 2), with a sweep speed of 50 mV s-1. - Figure 6 - Graph belonging to the cyclic voltammograms obtained with electrodes modified with PDDA / AuNP-GSH / HRP in PBS 0.1 mol L-1 pH 6.5 solution only (1), PBS 0.1 mol L-1 pH 6.5 containing 1.0 x 10-4 mol L-1 H2O2 (2), PBS 0.1 mol L-1 pH 6.5 containing 1.0 x 10-3 mol L-1 HQ (3) and PBS 0.1 mol L-1 pH 6.5 containing 1.0 x 10-3 mol L-1 HQ and 1.0 x 10-4 mol L-1 H2O2 (4). Parameters: Ei= 0.1 V; Ef= -0.45 V, with sweep speed of 20 mV s-1 - Figure 7 - Graph corresponding to individual amperometric responses for ERα solutions in undiluted calf serum at concentrations of a) 0, b) 5.6 fg mL-1, c) 28 fg mL-1 , d) 0.11 pg mL-1, e) 1.1 pg mL-1, f) 2.8 pg mL-1 at -0.2 V vs. Ag|AgCl and analytical curve for ERα detection. - Figure 8 - Graph corresponding to individual amperometric responses to CA 15-3 solutions in undiluted calf serum at concentrations from 1.0 x 10-6 to 1.0 x 10-3 U mL-1 to -0.2 V vs. Ag|AgCl and analytical curve for detection of CA 15-3.

Detailed Description of the Invention

[0014] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um dispositivo microfluídico que compreende oito eletrodos podendo ser utilizados como biossensores ou sensores químicos individuais, tendo a possibilidade de ser aplicado na detecção de diferentes tipos de compostos como proteínas, anticorpos, DNA ou outros compostos orgânicos e inorgânicos. Precisamente, a presente invenção utiliza os eletrodos na determinação de biomarcadores proteicos para o diagnóstico de câncer. A configuração dos eletrodos pode ser facilmente modificada permitindo a construção de eletrodos com diferentes diâmetros ou arranjos contendo diferentes números de eletrodos, não estando limitados a arranjos de apenas 8 eletrodos, podendo ser de 1 a 12 eletrodos.[0014] In a first aspect, the present invention provides a microfluidic device comprising eight electrodes that can be used as biosensors or individual chemical sensors, with the possibility of being applied in the detection of different types of compounds such as proteins, antibodies, DNA or others organic and inorganic compounds. Precisely, the present invention uses the electrodes in the determination of protein biomarkers for the diagnosis of cancer. The configuration of the electrodes can be easily modified, allowing the construction of electrodes with different diameters or arrangements containing different numbers of electrodes, not being limited to arrangements of only 8 electrodes, which can be from 1 to 12 electrodes.

[0015] O conjunto de eletrodos de carbono impresso, composto por oito eletrodos de trabalho, um eletrodo de referência e um eletrodo auxiliar, foi construído de acordo com o seguinte procedimento: Um filme de vinil adesivo é cortado nos formatos dos eletrodos, sendo utilizado para o corte qualquer impressora de corte doméstica e software para desenho compatível. O diâmetro dos eletrodos de trabalhos é preferencialmente de 3 mm, podendo ser entre 1,0 e 5,0 mm. Após o corte do filme de vinil adesivo, as porções indesejadas foram retiradas usando uma pinça, deixando o molde dos eletrodos, como uma máscara negativa. A seguir, o vinil com o molde é transferido para uma folha de poliéster (película de transparência para impressoras a laser) com as dimensões 21,0 cm x 29,7 cm e então a tinta de carbono é aplicada utilizando-se um pequeno rodo, em três etapas: Primeiro, a tinta de carbono foi vertida sobre o topo da superfície da máscara de vinil e arrastada através do molde, tanto para os eletrodos de trabalho como para os eletrodos de referência e auxiliar, resultando em uma camada de ~80 μm de espessura da tinta depositada sobre a folha de poliéster. Após a cura da tinta por 30 minutos a 90 °C, a tinta de Ag/AgCl foi depositada como o eletrodo de referência, seguido de cura por 30 minutos a 60 °C.[0015] The set of printed carbon electrodes, consisting of eight working electrodes, a reference electrode and an auxiliary electrode, was constructed according to the following procedure: An adhesive vinyl film is cut into the shapes of the electrodes, being used for cutting any domestic cutting printer and compatible design software. The diameter of the working electrodes is preferably 3 mm, and can be between 1.0 and 5.0 mm. After cutting the adhesive vinyl film, the unwanted portions were removed using tweezers, leaving the mold of the electrodes, like a negative mask. Next, the vinyl with the mold is transferred to a polyester sheet (transparency film for laser printers) with dimensions 21.0 cm x 29.7 cm and then the carbon ink is applied using a small squeegee , in three steps: First, carbon ink was poured over the top surface of the vinyl mask and drawn through the mold to both the working electrodes and the reference and auxiliary electrodes, resulting in a layer of ~80 μm of ink thickness deposited on the polyester sheet. After curing the ink for 30 minutes at 90 °C, the Ag/AgCl ink was deposited as the reference electrode, followed by curing for 30 minutes at 60 °C.

[0016] Todo o processo é ilustrado na Figura 1, na qual o fluxograma superior ilustra a construção dos eletrodos de trabalho, e o fluxograma inferior ilustra os eletrodos de referência, sendo 1) folha de transparência, 2) vinil adesivo contendo os padrões dos eletrodos são colocados sobre a folha de transparência; 3) deposição da tinta de carbono, seguido por deposição da tinta de Ag|AgCl nos eletrodos referência; 4) a remoção do vinil adesivo.[0016] The entire process is illustrated in Figure 1, in which the upper flowchart illustrates the construction of the working electrodes, and the lower flowchart illustrates the reference electrodes, being 1) transparency sheet, 2) adhesive vinyl containing the patterns of the electrodes are placed on the transparency sheet; 3) carbon ink deposition, followed by Ag|AgCl ink deposition on the reference electrodes; 4) removing the adhesive vinyl.

[0017] Para a obtenção do dispositivo microfluídico, um canal de 200 mm x 3,0 mm por onde a solução é transportada, é cortado um plástico adesivo dupla face de 0,4 mm de espessura usando uma impressora de corte compatível. As dimensões do canal microfluídico podem ser facilmente alteradas, uma vez que as medidas referentes a espessura e largura do canal são escolhidas no momento da concepção e configuração do canal usando o software apropriado. O sistema é montado colando-se a folha contendo o eletrodo de referência sobre um lado do plástico adesivo e outra folha contendo os eletrodos de trabalho e eletrodo auxiliar na outra face do plástico, conforme mostrado na Figura 2. Para entrada e saída de solução foram feitos dois furos nas extremidades do canal.[0017] To obtain the microfluidic device, a 200 mm x 3.0 mm channel through which the solution is transported, a 0.4 mm thick double-sided adhesive plastic is cut using a compatible cutting printer. The dimensions of the microfluidic channel can be easily changed, since the measurements regarding the thickness and width of the channel are chosen at the time of the design and configuration of the channel using the appropriate software. The system is assembled by sticking the sheet containing the reference electrode on one side of the adhesive plastic and another sheet containing the working electrodes and auxiliary electrode on the other side of the plastic, as shown in Figure 2. Drill two holes at the ends of the channel.

[0018] A Figura 2 demonstra o processo do esquema de montagem do dispositivo microfluídico, sendo 5) arranjo contendo oito eletrodos de trabalho e o eletrodo auxiliar; 6) colagem de adesivo dupla face de plástico contendo o canal sobre a transparência contendo eletrodos; 7) dispositivo selado com a transparência contendo o eletrodo de referência; 8) o dispositivo microfluídico pronto para uso.[0018] Figure 2 demonstrates the process of the assembly scheme of the microfluidic device, being 5) arrangement containing eight working electrodes and the auxiliary electrode; 6) bonding of double-sided plastic adhesive containing the channel on the transparency containing electrodes; 7) device sealed with the transparency containing the reference electrode; 8) The ready-to-use microfluidic device.

Experimental procedures

[0019] Com o objetivo de avaliar a performance do arranjo de eletrodos no sistema microfluídico, inicialmente foram feitas medidas por amperometria usando uma solução de ácido ferrocenomonocarboxílico na concentração 1,0 x 10-3 mol L-1 em meio de KCl 0,1 mol L-1. O arranjo contendo oito eletrodos sem modificação foi montado, 100 μL da solução de ácido ferrocenomonocarboxílico foi injetada no sistema e aplicou-se 0,3 V vs. Ag|AgCl.[0019] In order to evaluate the performance of the electrode arrangement in the microfluidic system, measurements were initially made by amperometry using a solution of ferrocenomonocarboxylic acid at a concentration of 1.0 x 10-3 mol L-1 in 0.1 KCl medium mole L-1. The array containing eight electrodes without modification was assembled, 100 μL of ferrocene monocarboxylic acid solution was injected into the system and 0.3 V vs. Ag|AgCl.

[0020] A Figura 3 ilustra em um gráfico as respostas de correntes obtidas usando o conjunto de 8 eletrodos não modificados após a injeção de 100 μL de ácido ferrocenomonocarboxílico 1,0 x 10-3 mol L-1 em KCl 0,1 mol L-1 e aplicação de 0,3 V vs. Ag|AgCl.[0020] Figure 3 illustrates in a graph the current responses obtained using the set of 8 unmodified electrodes after the injection of 100 μL of ferrocenemonocarboxylic acid 1.0 x 10-3 mol L-1 in KCl 0.1 mol L -1 and application of 0.3 V vs. Ag|AgCl.

[0021] As intensidades de correntes obtidas após a injeção de solução de ácido ferrocenomonocarboxílico foram muito semelhantes para os oito eletrodos do dispositivo, com uma média de 2,04 ± 0,01 μA e um desvio padrão relativo de 0,69%, demonstrando uma boa reprodutibilidade das áreas dos eletrodos.[0021] The current intensities obtained after the injection of ferrocenomonocarboxylic acid solution were very similar for the eight electrodes of the device, with a mean of 2.04 ± 0.01 μA and a relative standard deviation of 0.69%, demonstrating good reproducibility of electrode areas.

[0022] Os eletrodos de carbono construídos pelo método descrito podem ser aplicados na detecção de diversas espécies químicas, seja como eletrodo sem modificação ou com a modificação da superfície de forma a se obter resposta seletivas a um determinado analito (espécie que se quer detectar).[0022] The carbon electrodes constructed by the described method can be applied in the detection of various chemical species, either as an electrode without modification or with surface modification in order to obtain selective responses to a particular analyte (species to be detected) .

[0023] Com o intuito de se avaliar as potencialidades dos eletrodos de carbono descartáveis, foram realizadas medidas eletroquímicas de diferentes compostos. As técnicas eletroanalíticas de voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada foram empregadas.[0023] In order to evaluate the potential of disposable carbon electrodes, electrochemical measurements of different compounds were performed. The electroanalytical techniques of cyclic voltammetry and square wave voltammetry were employed.

Experiment A

[0024] Foram feitas medidas em solução de ácido ferrocenomonocarboxílico de 1,0 x 10-3 mol L-1 em meio de KCl 0,1 mol L-1. A Figura 4 evidencia o perfil voltamétrico do ácido ferrocenomonocarboxílico, avaliado por voltametria cíclica usando 8 eletrodos.[0024] Measurements were made in a 1.0 x 10-3 mol L-1 ferrocene monocarboxylic acid solution in 0.1 mol L-1 KCl medium. Figure 4 shows the voltammetric profile of ferrocenomonocarboxylic acid, evaluated by cyclic voltammetry using 8 electrodes.

[0025] Neste estudo observa-se que as intensidades de corrente de oxidação e de redução foram muito similares para os oito eletrodos, apresentando um desvio padrão relativo de 4,0%.[0025] In this study, it was observed that the oxidation and reduction current intensities were very similar for the eight electrodes, with a relative standard deviation of 4.0%.

experiment B

[0026] Medidas eletroquímicas foram feitas utilizando compostos altamente adsortivos, como o corante disperso Red 1 (DR1), o 10-gingerol, o resveratrol e a hesperitina. Todas as soluções foram preparadas na concentração de 1,0 x 10-5 mol L-1 e avaliadas individualmente por voltametria cíclica na região de oxidação.[0026] Electrochemical measurements were made using highly adsorptive compounds, such as the disperse dye Red 1 (DR1), 10-gingerol, resveratrol and hesperitin. All solutions were prepared at a concentration of 1.0 x 10-5 mol L-1 and evaluated individually by cyclic voltammetry in the oxidation region.

[0027] A Figura 5 apresenta os voltamogramas cíclicos obtidos para cada composto.[0027] Figure 5 shows the cyclic voltammograms obtained for each compound.

[0028] Por meio da voltametria cíclica, observa-se na Figura referente ao DR1 a presença de um pico de oxidação em +0.73 V. A intensidade de corrente de pico sofre uma diminuição de aproximadamente 52% durante a segunda varredura, indicando um forte processo de adsorção do corante sobre a superfície eletródica. A Figura referente ao 10-gingerol mostra a presença de um pico de oxidação em +0,31 V, que sofre um decaimento de 80% da intensidade de corrente de pico na segunda varredura. O composto resveratrol apresentou um pico de oxidação no potencial de +0,35 V que pode corresponder à oxidação do grupo 4'-hidroxila do resveratrol. Conforme mostrado na Figura, a intensidade de corrente de pico sofre uma diminuição de 54% após a segunda varredura. A segunda varredura realizada na solução de hesperitina mostra que a intensidade de corrente de pico em +0,45 V sofre uma diminuição de 50% de seu valor inicial, indicando que produtos da oxidação do composto podem causar uma passivação do eletrodo.[0028] By means of cyclic voltammetry, it is observed in the Figure referring to DR1 the presence of an oxidation peak at +0.73 V. The peak current intensity suffers a decrease of approximately 52% during the second sweep, indicating a strong dye adsorption process on the electrode surface. The Figure referring to 10-gingerol shows the presence of an oxidation peak at +0.31 V, which undergoes a decay of 80% of the peak current intensity in the second scan. The compound resveratrol showed an oxidation peak at the potential of +0.35 V which may correspond to the oxidation of the 4'-hydroxyl group of resveratrol. As shown in the Figure, the peak current intensity decreases by 54% after the second sweep. The second scan carried out on the hesperitin solution shows that the peak current intensity at +0.45 V suffers a decrease of 50% from its initial value, indicating that the oxidation products of the compound can cause a passivation of the electrode.

[0029] Os resultados apresentados mostram que o eletrodo de carbono descartável apresenta-se como uma adequada superfície eletródica para estudos eletroquímicos de diferentes compostos. O fato de algumas espécies sofrerem processos de adsorção durante a oxidação não se mostra um problema, visto que não são necessários procedimentos de limpeza ou reativação da superfície do eletrodo, reduzindo o tempo de análise. O eletrodo desenvolvido pode, então, ser aplicado no desenvolvimento de metodologias analíticas para determinação dos compostos de interesse clínico, ambiental, farmacêutico e biológico.[0029] The results presented show that the disposable carbon electrode presents itself as an adequate electrode surface for electrochemical studies of different compounds. The fact that some species undergo adsorption processes during oxidation is not a problem, since cleaning procedures or reactivation of the electrode surface are not necessary, reducing analysis time. The developed electrode can then be applied in the development of analytical methodologies for the determination of compounds of clinical, environmental, pharmaceutical and biological interest.

experiment C

[0030] A imobilização da enzima HRP sobre os eletrodos realizada pela técnica de layer-by-layer. Para a formação do layer-by-layer, primeiramente foi realizada a adsorção uma camada do policátion polidimetildialilamônio (PDDA) a partir de uma solução aquosa de concentração 2,0 mg mL-1 contendo 0,05 mol L-1 de NaCl por 20 minutos. Após enxágue com água, realizou-se a adsorção de uma camada carregada negativamente de partículas de ouro de ~250 nm modificadas com glutationa (AuNP-GSH), por 20 minutos, seguido de enxágue com água. Na sequência, realizou-se a ativação dos grupos carboxilas da glutationa presente nas nanopartículas de ouro com 0,4 mol L-1 de EDC e 0,1 mol L-1 de NHS por 10 minutos, e após enxágue, adicionou-se uma solução de HRP 3,0 mg mL-1 por 3 horas. Posteriormente ao enxágue para retirada das moléculas não imobilizadas, realizou-se a medida eletroquímica em uma solução contendo os substratos enzimáticos H2O2 1,0 x 10-3 mol L-1 e hidroquinona (HQ) 1,0 x 10-4 mol L-1 em PBS pH 6,5 por voltametria cíclica no intervalo de potencial de +0,1 V a -0,45 V, com velocidade de varredura de 20 mV s-1.[0030] The immobilization of the HRP enzyme on the electrodes performed by the layer-by-layer technique. To form the layer-by-layer, a layer of the polydimethyldialylammonium polycation (PDDA) was first adsorbed from an aqueous solution of concentration 2.0 mg mL-1 containing 0.05 mol L-1 of NaCl for 20 minutes. After rinsing with water, a negatively charged layer of ~250 nm gold particles modified with glutathione (AuNP-GSH) was adsorbed for 20 minutes, followed by rinsing with water. Next, the activation of the carboxyl groups of the glutathione present in the gold nanoparticles was carried out with 0.4 mol L-1 of EDC and 0.1 mol L-1 of NHS for 10 minutes, and after rinsing, a HRP solution 3.0 mg mL-1 for 3 hours. After rinsing to remove non-immobilized molecules, the electrochemical measurement was performed in a solution containing the enzymatic substrates H2O2 1.0 x 10-3 mol L-1 and hydroquinone (HQ) 1.0 x 10-4 mol L- 1 in PBS pH 6.5 by cyclic voltammetry in the potential range of +0.1 V to -0.45 V, with a sweep speed of 20 mV s-1.

[0031] A Figura 6 mostra os voltamogramas obtidos com os eletrodos modificados quando em solução somente de PBS, em PBS contendo H2O2, em PBS contendo HQ e em PBS contendo H2O2 e HQ.[0031] Figure 6 shows the voltammograms obtained with the modified electrodes when in PBS solution only, in PBS containing H2O2, in PBS containing HQ and in PBS containing H2O2 and HQ.

[0032] Nota-se a presença de um pico de redução em -0,25 V apenas quando os eletrodos modificados estão na presença dos substratos enzimáticos H2O2 e HQ, indicando que houve a catálise enzimática, confirmando a imobilização da enzima HRP. Desta maneira, a metodologia de imobilização de biomoléculas por layer-by-layer se mostrou adequada para a modificação dos eletrodos na construção dos biossensores.[0032] Note the presence of a reduction peak at -0.25 V only when the modified electrodes are in the presence of enzymatic substrates H2O2 and HQ, indicating that there was enzymatic catalysis, confirming the immobilization of the HRP enzyme. In this way, the methodology of immobilization of biomolecules by layer-by-layer proved to be suitable for modifying the electrodes in the construction of biosensors.

experiment D

[0033] Construção de um biossensor eletroquímico acoplado a um sistema microfluídico para a detecção de ERα, o Receptor de Estrógeno Alfa, um biomarcador usados no diagnóstico de câncer de mama, que regula a expressão de genes e afeta a proliferação celular e diferenciação no tecido alvo. Para a modificação das superfícies eletródicas, as etapas consistiram em: 1- formação de layer-by-layer com PDDA e AuNP modificadas com glutationa; 2- imobilização de NH2-DNA contendo a sequência específica para a interação com ERα. Para a etapa de captura e interação do analito na amostra, utilizou- se partículas magnéticas previamente modificadas com anticorpo monoclonal anti-ERα e com a enzima HRP. Tais partículas magnéticas modificadas após a captura do analito foram injetadas no sistema em fluxo e, ao atingirem o canal contendo os eletrodos modificados, o fluxo foi pausado por 30 min. Após a interação com o analito, medidas amperométricas foram conduzidas a -0,20 V vs. Ag|AgCl, enquanto 100 μL de H2O2 1,0 x 10-4 mol L-1 e hidroquinona 1,0 x 10-3 mol L-1 foram injetados no dispositivo microfluídico.[0033] Construction of an electrochemical biosensor coupled to a microfluidic system for the detection of ERα, the Estrogen Receptor Alpha, a biomarker used in the diagnosis of breast cancer, which regulates gene expression and affects cell proliferation and tissue differentiation target. For the modification of the electrode surfaces, the steps consisted of: 1- layer-by-layer formation with PDDA and AuNP modified with glutathione; 2- immobilization of NH2-DNA containing the specific sequence for interaction with ERα. For the capture and interaction step of the analyte in the sample, magnetic particles previously modified with anti-ERα monoclonal antibody and with the HRP enzyme were used. Such modified magnetic particles after capturing the analyte were injected into the system in flow and, when reaching the channel containing the modified electrodes, the flow was paused for 30 min. After interaction with the analyte, amperometric measurements were conducted at -0.20 V vs. Ag|AgCl, while 100 μL of H2O2 1.0 x 10-4 mol L-1 and hydroquinone 1.0 x 10-3 mol L-1 were injected into the microfluidic device.

[0034] A Figura 7 mostra as respostas amperométricas utilizando o biossensor com as concentrações crescentes de ERα e a relação linear entre a intensidade de corrente obtida e a concentração do analito.[0034] Figure 7 shows the amperometric responses using the biosensor with increasing concentrations of ERα and the linear relationship between the current intensity obtained and the concentration of the analyte.

[0035] Cada concentração na curva analítica foi detectada utilizando um novo arranjo de oito eletrodos, resultando em oito respostas para cada ponto e as pequenas barras de erro indicam uma excelente reprodutibilidade dos eletrodos. A faixa linear é de 5,6 fg mL-1 a 2,8 pg mL-1 com um limite de detecção de 0,27 fg mL-1, mostrando que o biossensor desenvolvido apresentou excelente resposta, com um limite de detecção ultrabaixo e ausência de interferências. O biossensor desenvolvido mostrou-se adequado para a detecção de ERα e pode ser aplicado em amostras de células sem a necessidade de etapas de pré-tratamento da amostra.[0035] Each concentration on the analytical curve was detected using a new arrangement of eight electrodes, resulting in eight responses for each point and the small error bars indicate excellent reproducibility of the electrodes. The linear range is from 5.6 fg mL-1 to 2.8 pg mL-1 with a detection limit of 0.27 fg mL-1, showing that the developed biosensor presented an excellent response, with an ultralow detection limit and absence of interference. The developed biosensor proved to be adequate for the detection of ERα and can be applied to cell samples without the need for sample pre-treatment steps.

experiment and

[0036] Construção de um biossensor eletroquímico acoplado a um sistema microfluídico para a detecção de CA 15-3, um marcador sérico amplamente utilizado em pacientes com câncer de mama. Para a modificação das superfícies eletródicas, as etapas consistiram em: 1- formação de layer-bylayer com PDDA e AuNP modificadas com glutationa; 2- imobilização de anticorpo policlonal anti-CA 15-3. Para a etapa de captura e interação do analito na amostra, utilizou-se partículas magnéticas previamente modificadas com anticorpo monoclonal anti-CA 15-3 e com a enzima HRP. Tais partículas magnéticas modificadas após a captura do analito foram injetadas no sistema em fluxo e, ao atingirem o canal contendo os eletrodos modificados, o fluxo foi pausado por 30 min. Após a interação com o analito, medidas amperométricas foram conduzidas a -0,20 V vs. Ag|AgCl, enquanto 100 μL de H2O2 1,0 x 10-4 mol L-1 e hidroquinona 1,0 x 10-3 mol L-1 foram injetados no dispositivo microfluídico.[0036] Construction of an electrochemical biosensor coupled to a microfluidic system for the detection of CA 15-3, a serum marker widely used in patients with breast cancer. For the modification of the electrode surfaces, the steps consisted of: 1- layer-bylayer formation with PDDA and AuNP modified with glutathione; 2- immobilization of anti-CA 15-3 polyclonal antibody. For the analyte capture and interaction step in the sample, magnetic particles previously modified with anti-CA 15-3 monoclonal antibody and with the HRP enzyme were used. Such modified magnetic particles after capturing the analyte were injected into the system in flow and, when reaching the channel containing the modified electrodes, the flow was paused for 30 min. After interaction with the analyte, amperometric measurements were conducted at -0.20 V vs. Ag|AgCl, while 100 μL of H2O2 1.0 x 10-4 mol L-1 and hydroquinone 1.0 x 10-3 mol L-1 were injected into the microfluidic device.

[0037] A Figura 8 apresenta os sinais amperométricos obtidos para concentrações de CA 15-3 e a relação linear entre a intensidade de corrente obtida e a concentração do analito.[0037] Figure 8 shows the amperometric signals obtained for CA 15-3 concentrations and the linear relationship between the current intensity obtained and the analyte concentration.

[0038] A Figura 8 apresenta os sinais amperométricos obtidos para concentrações de CA 15-3 variando de 1,0 x 10-6 U mL-1 a 1,0 x 10-3 U mL-1 e a relação linear entre o aumento da intensidade de corrente e o aumento da concentração de CA 15-3, com equação de reta de y= -0,04576 -0,00338 log (x), r= 0,9599, observando-se a possibilidade de boa performance do biossensor na detecção do biomarcador CA 15-3.[0038] Figure 8 shows the amperometric signals obtained for CA 15-3 concentrations ranging from 1.0 x 10-6 U mL-1 to 1.0 x 10-3 U mL-1 and the linear relationship between the increase of the current intensity and the increase in the concentration of CA 15-3, with a straight line equation of y= -0.04576 -0.00338 log (x), r= 0.9599, observing the possibility of good performance of the biosensor in the detection of the biomarker CA 15-3.

Claims

1. MICROFLUID DEVICE, characterized by: - Being disposable and portable; - use electrochemical techniques; and - comprise an arrangement of 8 working electrodes made of polymeric material, a reference electrode, an auxiliary electrode and a microfluidic channel(5) containing two holes at the ends for inlet and outlet of solution, connected to a syringe pump and injector manual.

2. MICROFLUID DEVICE, according to claim 1, characterized by the fact that the working electrodes have a diameter of 1.0 to 5.0 mm, preferably 3.0 mm.

3. MICROFLUID DEVICE, according to claim 4, characterized in that said channel is produced in a 0.4 mm thick double-sided adhesive plastic, and has dimensions of 200mm x 3.0mm, which can be changed depending on the diameter used in the construction of working electrodes.

4. MICROFLUID DEVICE, according to claim 1, characterized by the fact that: - the electrodes are used as individual chemical sensors and biosensors; and - the microfluidic device be applied in the detection of proteins, antibodies and DNA in chemical analyzes and clinical diagnoses, be used in the detection of protein biomarkers in the diagnosis of cancer and be applicable in the development of immunosensors that use electrochemical methods and electrochemiluminescence for detection.

5. MICROFLUID DEVICE MANUFACTURING PROCESS according to claim 1, characterized by comprising: - designing electrode designs using compatible software for electrode design; - cut an adhesive vinyl film(2) in the shapes of the electrodes, using a domestic cutting printer; - remove the unwanted portions, with tweezers, leaving the mold of the electrodes as a negative mask; - transfer the vinyl(2) with the template onto a polyester sheet(1) measuring 21.0 cm x 29.7 cm; wherein the polyester sheet (1) is a transparency film for laser printers; - apply the carbon paint(3) using a small squeegee, as follows: - pour the carbon paint(3) over the top surface of the vinyl mask and drag it through the mold, both to the working electrodes and to the the pseudo-reference electrodes, providing a ~80 μm thick layer of ink deposited on the polyester sheet(1); - cure the carbon ink(3) at a temperature of 90°C for 30 minutes; - deposit the Ag/AgCl ink as the reference electrode(3); - curing the Ag/AgCl ink at a temperature of 60°C for 30 minutes; - cut a 200 mm x 3.0 mm channel in a 0.4 mm thick double-sided adhesive plastic, using a cutting printer; - paste the sheet containing the reference electrode on one side of the double-sided adhesive plastic (6); and - paste the other sheet containing the working electrodes and the counter electrode on the other side of the double-sided adhesive plastic(6).