BR102016004353B1

BR102016004353B1 - development of a flavivirus diagnostic system using gold nanobuses

Info

Publication number: BR102016004353B1
Application number: BR102016004353-0A
Authority: BR
Inventors: Breno De Mello Silva; Flávio Guimarães Da Fonseca; Cristiano Fantini Leite; Luiz Orlando Ladeira; Erica Milena De Castro Ribeiro; Cyntia Ferreira; Anderson Caires De Jesus
Original assignee: Universidade Federal De Ouro Preto; Universidade Federal De Minas Gerais
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2021-02-23
Also published as: BR102016004353A2

Abstract

O modelo descreve o desenvolvimento de metodologias de funcionalização de nanobastões de ouro (AuNRs) com anticorpos monoclonais específicos para a proteína estrutural “E” (proteína do envelope) viral e seu uso para detecção direta de vírus de Dengue virus (DENV) e demais Flavívirus, como, Zika virus e Febre amarela virus, em solução. Estas nanopartículas podem ser ajustadas para a detecção de biomoléculas como proteínas e anticorpos ligados às AuNRs a partir da leitura do seu espectro de absorção. Neste modelo, as imunoglobulinas anti-DENV ou anti-Flavivirus são ligadas aos nanobastões previamente funcionalizados à polietilenoimina e então incubadas com amostras contendo vírus. A detecção de partículas virais na solução é obtida através análise de alteração do perfil de ressonância plasmônica da solução utilizando um espectrômetro de varredura UV-Vis. Este método de diagnóstico possui sensibilidade e especificidade de detecção, baixo custo de produção, não necessita de profissional qualificado e pode ser mais rápido, preciso e prático que as técnicas já existentes de diagnostico direto de Dengue, Zika e Febre Amarela.The model describes the development of functionalization methodologies for gold nanorods (AuNRs) with specific monoclonal antibodies for the structural protein “E” (envelope protein) and its use for direct detection of Dengue virus (DENV) and other Flaviviruses , such as, Zika virus and Yellow fever virus, in solution. These nanoparticles can be adjusted to detect biomolecules such as proteins and antibodies linked to AuNRs by reading their absorption spectrum. In this model, anti-DENV or anti-Flavivirus immunoglobulins are linked to nanobonds previously functionalized with polyethyleneimine and then incubated with samples containing viruses. The detection of viral particles in the solution is obtained by analyzing the change in the plasmon resonance profile of the solution using a UV-Vis scanning spectrometer. This diagnostic method has sensitivity and specificity of detection, low cost of production, does not need a qualified professional and can be faster, more accurate and practical than the existing techniques of direct diagnosis of Dengue, Zika and Yellow Fever.

Description

Field of invention

[001] A invenção propõe desenvolvimento de um sistema de diagnóstico de dengue, zika e febre amarela utilizando nanobastões de ouro para aplicação na indústria de kits de diagnóstico.[001] The invention proposes the development of a diagnostic system for dengue, zika and yellow fever using gold nanobods for application in the diagnostic kit industry.

State of the art

[002] A nanotecnologia tem sido amplamente utilizada na biotecnologia principalmente devido ao fato de que as nanopartículas se assemelham em tamanho a várias biomoléculas comuns e este tamanho é controlado com precisão durante a síntese das mesmas. Além disso, é possível controlar a forma das partículas, como nanoesferas, nanocristais, nanoconchas e nanobastões, e fazer modificações na camada superficial para atingir uma melhor solubilidade aquosa bem como biocompatibilidade (WEST, J. L. e HALAS, N. J. 2000. Applications of nanotechnology to biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, v.11, p.215-217). A nanobiotecnologia poderia então, ser amplamente utilizada na medicina, produtos farmacêuticos, diagnóstico e processos industriais e agricultura (HULLMANN, A. 2007. Measuring and assessing the development of nanotechnology. Scientometrics, v.70, p.739-758).[002] Nanotechnology has been widely used in biotechnology mainly due to the fact that nanoparticles resemble in size to several common biomolecules and this size is precisely controlled during their synthesis. In addition, it is possible to control the shape of the particles, such as nanospheres, nanocrystals, nanoblocks and nanobonds, and make changes to the surface layer to achieve better aqueous solubility as well as biocompatibility (WEST, JL and HALAS, NJ 2000. Applications of nanotechnology to biotechnology Current Opinion in Biotechnology, v.11, p.215-217). Nanobiotechnology could then be widely used in medicine, pharmaceuticals, diagnostics and industrial processes and agriculture (HULLMANN, A. 2007. Measuring and assessing the development of nanotechnology. Scientometrics, v.70, p.739-758).

[003] Nanopartículas de ouro (AuNRs) são as nanopartículas metálicas mais estáveis que se tem conhecimento (DANIEL, M.C.; ASTRUC, D. 2004. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chemical reviews, v.104, p.293-346.) e possuem propriedades, incluindo propriedades ópticas, magnéticas, eletrônicas e estruturais, que propiciam sua utilização em muitas aplicações biológicas. (PISSUWAN, D.; VALENZUELA, S. e CORTIE, M. B. 2008. Prospects for gold nanorod particles in diagnostic and therapeutic applications. Biotechnology & genetic engineering reviews, v.25, p.93-112). A utilização destas nanopartículas poderia facilmente tornar-se a próxima geração de ferramentas de diagnóstico, uma vez que elas mostram grande sensibilidade e especificidade que podem substituir os métodos moleculares convencionais, tais como PCR (LIZ-MARZÁN, L. M. 2006.Tailoring Surface Plasmons Through the Morphology and Assembly of Metal Nanoparticles. Langmuir, v. 22, n. 1, p. 32-41).[003] Gold nanoparticles (AuNRs) are the most stable metallic nanoparticles known (DANIEL, MC; ASTRUC, D. 2004. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chemical reviews, v.104, p.293-346.) and have properties, including optical, magnetic, electronic and structural properties, which allow their use in many biological applications. (PISSUWAN, D .; VALENZUELA, S. and CORTIE, M. B. 2008. Prospects for gold nanorod particles in diagnostic and therapeutic applications. Biotechnology & genetic engineering reviews, v.25, p.93-112). The use of these nanoparticles could easily become the next generation of diagnostic tools, as they show great sensitivity and specificity that can replace conventional molecular methods, such as PCR (LIZ-MARZÁN, LM 2006.Tailoring Surface Plasmons Through the Morphology and Assembly of Metal Nanoparticles (Langmuir, v. 22, n. 1, p. 32-41).

[004] Existem vários métodos para síntese de AuNRs com estruturas diferentes e apesar do material original ser de alto custo, é geralmente utilizado em concentrações muito baixas e se tornam econômicos. (WILSON, R. 2008. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection. Chemical Society reviews, v.37, p.2028-2045). As partículas com forma esférica (nanoesferas) e em forma de bastão (nanobastões, AuNRs ou “nanorods”) são as mais estudadas para aplicações biológicas. Existem duas abordagens gerais para a síntese de nanobastões - mediadas por semente e crescimento sem sementes. O primeiro relato de nanobastões sintetizados com qualidade utilizou uma abordagem eletroquímica que foi precursora do processo mediado por sementes, inicialmente descrito por Murphy e colaboradores. em 2001 (VIGDERMAN, L.; KHANAL, B. P. e ZUBAREV, E. R. 2012. Functional gold nanorods: synthesis, self-assembly, and sensing applications. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla., v.24, p.4811-41).[004] There are several methods for the synthesis of AuNRs with different structures and although the original material is expensive, it is generally used in very low concentrations and become economical. (WILSON, R. 2008. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection. Chemical Society reviews, v.37, p.2028-2045). Particles with a spherical shape (nanospheres) and a rod shape (nanobods, AuNRs or “nanorods”) are the most studied for biological applications. There are two general approaches to the synthesis of nanobands - mediated by seed and seedless growth. The first report of nanobonds synthesized with quality used an electrochemical approach that was a precursor to the process mediated by seeds, initially described by Murphy and collaborators. in 2001 (VIGDERMAN, L .; KHANAL, BP and ZUBAREV, ER 2012. Functional gold nanorods: synthesis, self-assembly, and sensing applications. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla., v.24, p.4811-41) .

[005] As nanopartículas são estáveis por longos períodos e podem ser funcionalizadas com vários tipos de moléculas e biomoléculas e serem redissolvidas em solventes orgânicos comuns sem sofrerem agregação irreversível (DANIEL, M.C.; ASTRUC, D. 2004. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantumsize-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chemical reviews, v.104, p.293-346). E depois, podem ser utilizadas em uma gama de aplicações biológicas e biomédicas, dentre elas biosensoriamento, entrega de genes e drogas, diagnósticos e terapia fototérmica (HUANG, X.; NERETINA, S.; EL-SAYED, M. A. 2009. Gold nanorods: from synthesis and properties to biological and biomedical applications. Advanced Materials, v.21, p.4880-4910).[005] Nanoparticles are stable for long periods and can be functionalized with various types of molecules and biomolecules and be redissolved in common organic solvents without suffering irreversible aggregation (DANIEL, MC; ASTRUC, D. 2004. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry , quantumsize-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chemical reviews, v.104, p.293-346). And then, they can be used in a range of biological and biomedical applications, including biosensing, gene and drug delivery, diagnostics and photothermal therapy (HUANG, X .; NERETINA, S .; EL-SAYED, MA 2009. Gold nanorods: from synthesis and properties to biological and biomedical applications. Advanced Materials, v.21, p.4880-4910).

[006] Segundo El-Sayed e colaboradores em 2009, a funcionalização de biomoléculas em nanobastões de ouro pode ser realizada por quatro diferentes métodos. São eles: adsorção eletrostática, interação direta de ligante, revestimento de superfície e o uso de um ligante biofuncional (HUANG, X.; NERETINA, S.; EL-SAYED, M. A. 2009. Gold nanorods: from synthesis and properties to biological and biomedical applications. Advanced Materials, v.21, p.4880-4910). Na adsorção eletrostática, proteínas, por exemplo, são carregadas negativamente e colocadas em um pH abaixo de seu ponto isoelétrico, assim ocorre uma atração eletrostática entre a superfície do ouro e a proteína e então, a consequente adsorção. Esta é uma abordagem simples, pois não requer reação química. Já na interação direta de ligante, parte do CTAB é retirada e moléculas se ligam diretamente ao ouro. Uma forma para que isso aconteça é adicionar um grupo tiol (-SH) em uma extremidade destas moléculas (Lipídeos e DNA), uma vez que a ligação metal- enxofre é muito forte (AUBIN-TAM, M-E; HAMAD-SCHIFFERLI, K.2008. Structure and function of nanoparticle-protein conjugates. Biomedical materials (Bristol, England), v. 3, p.034001).[006] According to El-Sayed and collaborators in 2009, the functionalization of biomolecules in gold nanobonds can be carried out by four different methods. They are: electrostatic adsorption, direct ligand interaction, surface coating and the use of a biofunctional ligand (HUANG, X .; NERETINA, S .; EL-SAYED, MA 2009. Gold nanorods: from synthesis and properties to biological and biomedical Advanced Materials, v.21, p.4880-4910). In electrostatic adsorption, proteins, for example, are negatively charged and placed at a pH below their isoelectric point, thus an electrostatic attraction occurs between the gold surface and the protein and then, the consequent adsorption. This is a simple approach as it does not require a chemical reaction. In the direct interaction of ligand, part of the CTAB is removed and molecules bind directly to gold. One way for this to happen is to add a thiol group (-SH) to one end of these molecules (lipids and DNA), since the metal-sulfur bond is very strong (AUBIN-TAM, ME; HAMAD-SCHIFFERLI, K. 2008. Structure and function of nanoparticle-protein conjugates.Biomedical materials (Bristol, England), v. 3, p.034001).

[007] Uma terceira metodologia seria funcionalizar nanobastões com moléculas poliméricas ou não que reagem naturalmente com biomoléculas específicas por adsorção eletrostática. E por último, a utilização de uma molécula biofuncional é realizada principalmente para moléculas, como proteínas e anticorpos, em que não é possível acrescentar um grupo tiol para a ligação direta na nanopartícula. Nesta abordagem há a ligação covalente da biomolécula ao ligante anteriormente ligado à nanopartícula. Várias moléculas podem ser utilizadas como ligantes e devem ser selecionadas de acordo com a biomolécula a ser funcionalizada, uma vez que uma extremidade do ligante se liga a AuNRs, geralmente por um grupo tiol, e a outra à biomolécula. Portanto, a extremidade que não interage com a nanopartícula deve ser compatível com a porção a ser ligada da molécula biológica para que a mesma não perca sua atividade ou especificidade com antígenos, por exemplo (AUBIN-TAM, M-E; HAMAD-SCHIFFERLI, K.2008. Structure and function of nanoparticle-protein conjugates. Biomedical materials (Bristol, England), v. 3, p.034001).[007] A third methodology would be to functionalize nanobonds with polymeric molecules or not that react naturally with specific biomolecules by electrostatic adsorption. And finally, the use of a biofunctional molecule is carried out mainly for molecules, such as proteins and antibodies, in which it is not possible to add a thiol group for the direct bond in the nanoparticle. In this approach, there is the covalent bonding of the biomolecule to the ligand previously bound to the nanoparticle. Several molecules can be used as ligands and must be selected according to the biomolecule to be functionalized, since one end of the ligand binds to AuNRs, usually by a thiol group, and the other to the biomolecule. Therefore, the end that does not interact with the nanoparticle must be compatible with the portion to be attached to the biological molecule so that it does not lose its activity or specificity with antigens, for example (AUBIN-TAM, ME; HAMAD-SCHIFFERLI, K. 2008. Structure and function of nanoparticle-protein conjugates.Biomedical materials (Bristol, England), v. 3, p.034001).

[008] Com a ressonância de plasmon de superfície das nanopartículas é possível monitorar a adsorção de moléculas pequenas (JUNG, L. S.; CAMPBELL, C. T.; CHINOWSKY, T. M.; et al. 1998. Quantitative Interpretation of the Response of Surface Plasmon Resonance Sensors to Adsorbed Films. Langmuir, v.14, p.5636-5648), ligação receptor-ligante, ligação de antígenos a anticorpos, interação DNA-proteína (REY, B. L.; JORDAN, C. E.; KOMGUTH, S.; et al. 1995. Control of the specific adsorption of proteins onto gold surfaces with poly( l-lysine) monolayers. Anal. Chem., v.67, p.44524457) e então, utilizar destas abordagens para o desenvolvimento de sistemas de biosensoramento (HALL, D. 2001. Use of optical biosensors for the study of mechanistically concerted surface adsorption processes. Analytical biochemistry, v.288, p.109-25).[008] With the surface plasmon resonance of the nanoparticles it is possible to monitor the adsorption of small molecules (JUNG, LS; CAMPBELL, CT; CHINOWSKY, TM; et al. 1998. Quantitative Interpretation of the Response of Surface Plasmon Resonance Sensors to Adsorbed Films. Langmuir, v.14, p.5636-5648), receptor-ligand binding, antigen-antibody binding, DNA-protein interaction (REY, BL; JORDAN, CE; KOMGUTH, S .; et al. 1995. Control of the specific adsorption of proteins onto gold surfaces with poly (l-lysine) monolayers. Anal. Chem., v.67, p.44524457) and then use these approaches for the development of biosensor systems (HALL, D. 2001 Use of optical biosensors for the study of mechanistically concerted surface adsorption processes (Analytical biochemistry, v.288, p.109-25).

[009] Técnicas de detecção foram aperfeiçoadas ao longo do tempo devido à necessidade de um diagnostico rápido e que pudesse ser empregado na rotina de laboratório de todo o mundo. Vários métodos de detecção por biosensoriamento já foram desenvolvidos, dentre eles os mais utilizados e que são baseados em marcadores são fluorescência, quimiluminescência e radioatividade. Entretanto, estas metodologias ainda possuem um alto custo e necessitam de treinamento especializado. Por isso, os biossensores livres de marcadores deverão se tornar os mais estudados e utilizados por serem de fácil manipulação, maior sensibilidade e estabilidade e serem passíveis de miniaturização (SANG, S.; WANG, Y.; FENG, Q.; et al. 2015. Progress of new label-free techniques for biosensors: a review. Critical Reviews in Biotechnology, v.00, p.1-17).[009] Detection techniques have been improved over time due to the need for a quick diagnosis that could be used in the laboratory routine around the world. Several biosensor detection methods have already been developed, among them the most used and which are based on markers are fluorescence, chemiluminescence and radioactivity. However, these methodologies still have a high cost and require specialized training. Therefore, marker-free biosensors should become the most studied and used because they are easy to handle, have greater sensitivity and stability and are susceptible to miniaturization (SANG, S .; WANG, Y .; FENG, Q .; et al. 2015. Progress of new label-free techniques for biosensors: a review. Critical Reviews in Biotechnology, v.00, p.1-17).

[010] Um dos principais desafios enfrentados no desenvolvimento de sensores bioanalíticos é melhorar a eficiência e sensibilidade, pelas quais biomoléculas de baixa massa molecular são detectadas em baixas concentrações em um fluido biológico complexo. O sinal do sensor é geralmente proporcional à cobertura da superfície, o que tipicamente é diretamente dependente da afinidade da interação e concentração de grandes quantidades de moléculas alvo. Portanto, é fundamental que os sensores sejam suficientemente sensíveis para detectar a baixa cobertura de biomoléculas alvo adsorvidas (proteínas, peptídeos, DNA e RNA) dentro de um curto prazo e pequenos volumes de amostras (REIMHULT, E. e HOOK, F. 2015. Design of surface modifications for nanoscale sensor applications. Sensors, v.15, p.1635-1675). Uma alternativa para isso seria o desenvolvimento de sensores baseados em propriedades físico-químicas de nanometais.Nanopartículas em formato esférico apresentam uma banda de ressonância de plasmon (SPR) na região do visível muito forte, se comparado com outras formas e materiais (CREIGHTON, J. A.; EADON, D. G. 1991. Ultraviolet-visible absorption spectra of the colloidal metallic elements. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions, v.87, p.3881). Já nas partículas com formato de bastão, devido à anisotropia da forma, a oscilação pode ocorrer em dois sentidos, dependendo da polarização da luz incidente, eixos curtos e eixos longos. O eixo curto induz uma banda de absorção no comprimento de onda semelhante ao das nanoesferas e é denominada como banda transversal (HUANG, X.; EL-SAYED, M. A. 2010. Gold nanoparticles: optical properties and implementations in cancer diagnosis and photothermal therapy. Journal of Advanced Research, v.1, p.13-28).[010] One of the main challenges faced in the development of bioanalytical sensors is to improve efficiency and sensitivity, by which low molecular weight biomolecules are detected in low concentrations in a complex biological fluid. The sensor signal is generally proportional to the surface coverage, which typically is directly dependent on the affinity of the interaction and concentration of large amounts of target molecules. Therefore, it is essential that the sensors are sufficiently sensitive to detect the low coverage of adsorbed target biomolecules (proteins, peptides, DNA and RNA) within a short term and small sample volumes (REIMHULT, E. and HOOK, F. 2015. Design of surface modifications for nanoscale sensor applications (Sensors, v.15, p.1635-1675). An alternative for this would be the development of sensors based on physicochemical properties of nanometals. Spherical shaped nanoparticles have a very strong plasmon resonance band (SPR) in the visible region, when compared to other forms and materials (CREIGHTON, JA ; EADON, DG 1991. Ultraviolet-visible absorption spectra of the colloidal metallic elements. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions, v.87, p.3881). In stick-shaped particles, due to the anisotropy of the shape, the oscillation can occur in two directions, depending on the polarization of the incident light, short axes and long axes. The short axis induces an absorption band in the wavelength similar to that of the nanospheres and is called the transverse band (HUANG, X .; EL-SAYED, MA 2010. Gold nanoparticles: optical properties and implementations in cancer diagnosis and photothermal therapy. Journal of Advanced Research, v.1, p.13-28).

[011] A SPR é considerada uma das ferramentas mais importantes de biosensoriamento, uma vez que com ela é possível transformar a informação de reconhecimento biológico em sinais de deslocamento de comprimento de onda de forma precisa, sensível e em tempo real (ZHAO, Q.; DUAN, R.; YUAN, J.; et al. 2014 A reusable localized surface plasmon resonance biosensor for quantitative detection of serum squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer patients based on silver nanoparticles array. International journal of nanomedicine, v.9, p.1097-104). Um estudo realizado em 2014 demonstrou que o método de biosensoriamento por SPR é melhor que outros sensores ópticos. Isso porque nele é possível analisar a interação das moléculas funcionalizadas no ouro com moléculas em solução sem que seja necessário qualquer tipo de marcação molecular, além de reduzir tempo de análise e preparo das amostras (OLARU, A.; BALA, C.; JAFFREZIC-RENAULT, N.; et al. 2015. Surface plasmon resonance (spr) biosensors in pharmaceutical analysis. Critical Reviews in Analytical Chemistry, n. February 2015, p. 00-00, 2015).[011] SPR is considered one of the most important biosensing tools, since it is possible to transform biological recognition information into wavelength shift signals in a precise, sensitive and real-time manner (ZHAO, Q. ; DUAN, R .; YUAN, J .; et al. 2014 A reusable localized surface plasmon resonance biosensor for quantitative detection of serum squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer patients based on silver nanoparticles array. International journal of nanomedicine, v.9, p.1097-104). A study carried out in 2014 showed that the SPR biosensor method is better than other optical sensors. This is because it is possible to analyze the interaction of molecules functionalized in gold with molecules in solution without the need for any type of molecular marking, in addition to reducing analysis time and sample preparation (OLARU, A .; BALA, C .; JAFFREZIC- RENAULT, N .; et al. 2015. Surface plasmon resonance (spr) biosensors in pharmaceutical analysis. Critical Reviews in Analytical Chemistry, n. February 2015, p. 00-00, 2015).

[012] Uma importante propriedade única do ouro é a forte ressonância de plasmon, com isso as nanopartículas de ouro se tornam excelente alternativa para o biosensoriamento (ZHAO, Q.; DUAN, R.; YUAN, J.; et al. 2014 A reusable localized surface plasmon resonance biosensor for quantitative detection of serum squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer patients based on silver nanoparticles array. International journal of nanomedicine, v.9, p.1097-104). Além disso, as nanopartículas são facilmente funcionalizadas com moléculas de reconhecimento (como anticorpos, antígenos, oligonucleotídeos, etc.) por métodos que levam a conjugados altamente estáveis (WILSON, R. 2008. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection. Chemical Society reviews, v.37, p.2028-2045). Uma das várias aplicações de biossensores é baseada na alteração do comprimento de onda devido a mudanças nas propriedades dielétricas das partículas (SPR) resultante da ligação de moléculas biológicas, tais como anticorpos, à nanopartículas de ouro (NATH, N. E CHILKOTI, A. 2004. Label free colorimetric biosensing using nanoparticles. Journal of Fluorescence, v.14, p.377-389).[012] An important unique property of gold is the strong resonance of plasmon, thus gold nanoparticles become an excellent alternative for biosensing (ZHAO, Q .; DUAN, R .; YUAN, J .; et al. 2014 A reusable localized surface plasmon resonance biosensor for quantitative detection of serum squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer patients based on silver nanoparticles array. International journal of nanomedicine, v.9, p.1097-104). In addition, nanoparticles are easily functionalized with recognition molecules (such as antibodies, antigens, oligonucleotides, etc.) by methods that lead to highly stable conjugates (WILSON, R. 2008. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection. Chemical Society reviews, v.37, p.2028-2045). One of several applications of biosensors is based on the change in wavelength due to changes in the dielectric properties of particles (SPR) resulting from the attachment of biological molecules, such as antibodies, to gold nanoparticles (NATH, N. AND CHILKOTI, A. 2004. Label free colorimetric biosensing using nanoparticles. Journal of Fluorescence, v.14, p.377-389).

[013] Muitos biossensores baseados em SPR já foram estudados e desenvolvidos para a detecção de várias doenças, como por exemplo, a detecção da Síndrome da mancha branca em crustáceos utilizando DNA funcionalizado às AuNRs e até mesmo de detecção de DENV através da ligação de DNAzyme às AuNRs (CARTER, J. R.; BALARAMAN, V.; KUCHARKI, C. A; FRASER, T. S. E FRASER, M. J. 2013. A novel dengue virus detection method that couples DNAzyme and gold nanoparticle approaches. Virology journal, v. 10, p. 201). Em 2011 um estudo desenvolveu um imunossensor promissor capaz de detectar o antígeno carcinoembrionário que é biomarcador de câncer (ALTINTAS, Z.; ULUDAG, Y.; GURBUZ, Y. E TOTHILL, E. I. 2011. Surface plasmon resonance based immunosensor for the detection of the cancer biomarker carcinoembryonic antigen. Talanta, v. 86, p. 377-83).[013] Many SPR-based biosensors have already been studied and developed for the detection of various diseases, such as the detection of white spot syndrome in crustaceans using DNA functionalized to AuNRs and even the detection of DENV through DNAzyme binding to AuNRs (CARTER, JR; BALARAMAN, V .; KUCHARKI, C. A; FRASER, TS AND FRASER, MJ 2013. A novel dengue virus detection method that couples DNAzyme and gold nanoparticle approaches. Virology journal, v. 10, p. 201). In 2011 a study developed a promising immunosensor capable of detecting the carcinoembryonic antigen that is a cancer biomarker (ALTINTAS, Z .; ULUDAG, Y .; GURBUZ, Y. E TOTHILL, EI 2011. Surface plasmon resonance based immunosensor for the detection of the cancer biomarker carcinoembryonic antigen (Talanta, v. 86, pp. 377-83).

[014] Os imunossensores são baseados em anticorpos policlonais ou monoclonais, que são geralmente utilizados em ensaios imunológicos, pois são capazes de identificar e até quantificar proteínas específicas em soluções repletas de outras proteínas, componentes celulares, entre outros. A partir disso, também podem ser utilizados na identificação de doenças (CRUZ, H. J.; ROSA, C. C.; OLIVA, A. G. 2002. Immunosensors for diagnostic applications. Parasitology Research, v.88, p.4-7) como biossensores baseados na detecção da interação especifica de anticorpos com antígenos (HAMMOCK, M.P. M.; GEE, S.; BRUCE, D. 1995. Immunochemical techniques for environmental analysis. Trends in analytical chemistry, v.14, p.341-350). E o principal motivo de se utilizar imunorreações é pelo fato de serem altamente sensíveis e seletivas (PRICE, C P. 1998. Progress in immunoassay technology. Clinical chemistry and laboratory medicine : CCLM / FESCC, v.36, p.341-347).[014] Immunosensors are based on polyclonal or monoclonal antibodies, which are generally used in immunological assays, as they are able to identify and even quantify specific proteins in solutions filled with other proteins, cellular components, among others. From this, they can also be used in the identification of diseases (CRUZ, HJ; ROSA, CC; OLIVA, AG 2002. Immunosensors for diagnostic applications. Parasitology Research, v.88, p.4-7) as biosensors based on the detection of specific interaction of antibodies with antigens (HAMMOCK, MPM; GEE, S .; BRUCE, D. 1995. Immunochemical techniques for environmental analysis. Trends in analytical chemistry, v.14, p.341-350). And the main reason for using immunoreactions is because they are highly sensitive and selective (PRICE, C P. 1998. Progress in immunoassay technology. Clinical chemistry and laboratory medicine: CCLM / FESCC, v.36, p.341-347) .

[015] Portanto, uma tecnologia de biossensor acoplada com o uso de nanopartículas metálicas oferece benefícios comparados aos métodos tradicionais com relação ao tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação. A partir disso, este trabalho propõe desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de nanopartículas de ouro com anticorpos específicos anti-DENV e anti-flavivirus (Zika virus e Febra amarela virus) e a ligação dos mesmos aos antígenos.[015] Therefore, a biosensor technology coupled with the use of metallic nanoparticles offers benefits compared to traditional methods in terms of analysis time, sensitivity and simplicity of handling. Based on this, this work proposes to develop and analyze the effectiveness of functionalization methodologies for gold nanoparticles with specific anti-DENV and anti-flavivirus antibodies (Zika virus and yellow Febra virus) and their binding to antigens.

[016] Apesar de algumas técnicas apresentadas até o momento fazerem uso de ouro, não implica que se trata do mesmo processo, pois, o ouro ha muito tempo é utilizado em reações colorimétricas em teste de ELISA lateral, como por exemplo, o teste de gravidez, em que partículas de ouro ligadas a antígenos e anticorpos são depositadas em uma matriz, tal como nitrocelulose, e se deslocar junto com um fluxo liquido (cromatografia) até se posicionares junto a marcadores onde ocorre uma aglomeração destas partículas gerando uma alteração visual.[016] Although some techniques presented so far make use of gold, it does not imply that it is the same process, since gold has long been used in colorimetric reactions in a lateral ELISA test, such as, for example, the pregnancy, in which gold particles linked to antigens and antibodies are deposited in a matrix, such as nitrocellulose, and move along with a liquid flow (chromatography) until they are positioned next to markers where an agglomeration of these particles occurs causing a visual change.

[017] Além disso, alguns trabalhos já patenteados (Método de detecção precoce de uma infecção flaviviral, Kit de diagnóstico precoce, processo de purificação da proteína NS1 de um Flavivirus composiçãoimunogenese, utilização da proteína NS1, de pelo menos um anticorpo monoclonal anti-NS1, e, processo de expressão de um polinucleotídeo codificado para a proteína NS1 de uma vírus da Dengue - PI0011369-7A; Vírus, cDNA do vírus, polipeptídeo recombinante do vírus, anticorpo monoclonal, vetor de expressão, vacina, método e kit de diagnóstico dengue - PI 0300962-9A; Use of recombinant envelope proteins for diagnosing the Dengue vírus - PCT/FR98/01537; Methods and materials for the detection of Dengue vírus infection - US 2013/0164734 A1; Nanobastões de ouro funcionalizados, uso e Kit para imunodiagnóstico de Dengue) visam a identificação da proteína NS1, genoma viral e até mesmo de anticorpos (IgG e IgM) produzidos pelo hospedeiro em uma resposta imune contra o DENV e demais Flavivirus. Entretanto, neste trabalho propusemos a detecção direta de partículas virais íntegras e não de componentes da partícula viral solúveis como ácido nucleico (genoma viral), proteínas não estruturais (como a NS1) ou de anticorpos gerados contra os vírus.[017] In addition, some patented works (Method of early detection of a flaviviral infection, Early diagnosis kit, purification process of the NS1 protein from a Flavivirus composition, immunogenesis, use of the NS1 protein, of at least one anti-NS1 monoclonal antibody , and, expression process of a polynucleotide encoded for the NS1 protein of a Dengue virus - PI0011369-7A; Viruses, virus cDNA, recombinant virus polypeptide, monoclonal antibody, expression vector, vaccine, method and dengue diagnostic kit - PI 0300962-9A; Use of recombinant envelope proteins for diagnosing the Dengue virus - PCT / FR98 / 01537; Methods and materials for the detection of Dengue virus infection - US 2013/0164734 A1; Functionalized gold nanobonds, use and Kit for immunodiagnosis de Dengue) aim at the identification of NS1 protein, viral genome and even antibodies (IgG and IgM) produced by the host in an immune response against DENV and other Flavivirus. However, in this work we proposed the direct detection of intact viral particles and not of soluble viral particle components such as nucleic acid (viral genome), non-structural proteins (such as NS1) or antibodies generated against viruses.

[018] No método proposto, portanto, utilizamos nanopartículas de ouro funcionalizadas com anticorpos monoclonais específicos para DENV e para demais Flavivirus para avaliar o perfil de ressonância plasmônica em uma solução contendo nanopartículas em suspensão e não depositadas em uma matriz. Dessa forma, esta proposta, em comparação com os métodos de diagnostico para tais vírus já disponíveis no mercado, possui vantagens por ser mais rápido, sensível e específico para a detecção direta de DENV e de Flavivirus.[018] In the proposed method, therefore, we use gold nanoparticles functionalized with specific monoclonal antibodies for DENV and other Flavivirus to evaluate the plasmon resonance profile in a solution containing suspended nanoparticles and not deposited in a matrix. Thus, this proposal, in comparison with the diagnostic methods for such viruses already available on the market, has advantages for being faster, sensitive and specific for the direct detection of DENV and Flavivirus.

Solution of the problem

[019] A dengue, causada pelo Dengue virus (DENV) do gênero Flavívirus, bem como enferrmidades causadas por outros vírus também do gênero Flavivirus a saber, Zika virus e Febre amarela virus, são conhecidas como as arboviroses mais importante da atualidade, colocando aproximadamente metade da população mundial em áreas de risco iminente de transmissão. Além disso, a transmissão dos diferentes sorotipos do DENV dificulta o desenvolvimento de vacinas e pode ocasionar manifestações clínicas que variam de infecção assintomática até casos graves e potencialmente fatais. Uma forma de evitar a morbidade e mortalidade causadas seria o controle do vetor e diagnóstico precoce e específico, que se tornam ainda mais necessários devido a transmissão de Dengue, Zika, Febre amarela e ainda, Febre Chikungunia ocorrer pelo mosquito vetor e serem doenças de sintomatologia semelhante.[019] Dengue, caused by the Dengue virus (DENV) of the genus Flavivirus, as well as diseases caused by other viruses also of the genus Flavivirus namely, Zika virus and Yellow fever virus, are known as the most important arboviruses today, placing approximately half the world population in areas of imminent risk of transmission. In addition, the transmission of different DENV serotypes hinders the development of vaccines and can cause clinical manifestations ranging from asymptomatic infection to severe and potentially fatal cases. One way to avoid the morbidity and mortality caused would be the vector control and early and specific diagnosis, which become even more necessary due to the transmission of Dengue, Zika, Yellow fever and also, Chikungunia fever occurring by the vector mosquito and being symptomatic diseases. similar.

[020] O diagnóstico definitivo da infecção por Flavivirus depende do isolamento viral, da detecção de antígenos virais ou RNA em soro ou tecidos, ou da detecção de anticorpos específicos no soro dos pacientes. Destes, os métodos imunoenzimáticos frequentes na rotina clínica para se confirmar uma infecção recente pelo DENV, Zika virus e Febre amarela virus, principalmente em razão de sua alta sensibilidade e rapidez. Porém, métodos sorológicos apresentam limitações: dependem do fim do período da resposta imunológica para que o diagnóstico seja concluído e apresentam sensibilidade diminuída em relação à possibilidade de identificação do sorotipo infectante, já que ocorrem reações cruzadas entre os diferentes sorotipos do DENV e mesmo entre flavivirus diferentes. Além disso, para amostras de mosquitos a detecção viral é possível apenas com biologia molecular, isolamento de vírus em cultura e testes em validação baseados em cromatografia ou ELISA lateral.[020] The definitive diagnosis of Flavivirus infection depends on viral isolation, detection of viral antigens or RNA in serum or tissues, or detection of specific antibodies in patients' serum. Of these, frequent immunoenzymatic methods in the clinical routine to confirm a recent infection by DENV, Zika virus and Yellow fever virus, mainly due to their high sensitivity and speed. However, serological methods have limitations: they depend on the end of the period of the immune response for the diagnosis to be concluded and have reduced sensitivity in relation to the possibility of identifying the infecting serotype, since there are cross reactions between the different serotypes of DENV and even between flavivirus many different. In addition, for mosquito samples, viral detection is possible only with molecular biology, isolation of viruses in culture and validation tests based on chromatography or lateral ELISA.

[021] Portanto, uma tecnologia de biossensor acoplada com o uso de nanopartículas metálicas oferece benefícios comparados aos métodos tradicionais com relação ao tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação. A partir disso, este trabalho desenvolveu e analisou a eficácia de metodologias de funcionalização de nanobastões de ouro com anticorpos específicos anti-DENV e anti-flavivirus e a ligação dos mesmos aos antígenos. Logo, poderá ser implementado um novo método de diagnóstico de baixo custo de produção e ser ainda mais rápido, preciso e prático que as técnicas já existentes. E ainda contribuir para estudos de vigilância da virologia em mosquitos.[021] Therefore, a biosensor technology coupled with the use of metallic nanoparticles offers benefits compared to traditional methods in terms of analysis time, sensitivity and simplicity of handling. Based on that, this work developed and analyzed the effectiveness of methodologies for the functionalization of gold nanobonds with specific anti-DENV and anti-flavivirus antibodies and their binding to antigens. Therefore, a new low cost production diagnostic method can be implemented and be even faster, more accurate and practical than the existing techniques. And also contribute to surveillance studies of virology in mosquitoes.

Summary of the Invention

[022] O pedido de patente propõe detecção direta de partículas virais de Dengue vírus, Zika virus e Febre amarela virus (e não o RNA, NS1 ou de anticorpos), com utilização de nanopartículas de ouro funcionalizadas com anticorpos monoclonais específicos anti-denv e anti-flavivirus.[022] The patent application proposes direct detection of viral particles of Dengue virus, Zika virus and Yellow fever virus (and not RNA, NS1 or antibodies), using gold nanoparticles functionalized with specific anti-denv monoclonal antibodies and anti-flavivirus.

Detailed description of the invention

[023] Os nanobastões de ouro foram sintetizados por método mediado por semente. Nesta síntese foi utilizado ácido cloroáurico (HAuCl4) 0,1mM e brometo de cetil-trimetil- amônio (CTAB) sob agitação por 1 hora em banho térmico a 40°C para a formação das primeiras partículas. Então, foi adicionada uma solução de crescimento, contendo 0,2M de ácido cloroáurico e CTAB, e 0,2M de ácido ascórbico até que houvesse a mudança de cor da solução de dourado para transparente. Após, uma solução de nitrato de prata (AgNO3) em banho térmico a 30°C por até 48 horas, controlando assim o tamanho de crescimento dos nanobastões. Por fim, os nanobastões foram purificados, retirando o excesso de CTAB por centrifugação a 5600 g por 15 minutos, e caracterizados por microscopia.[023] Gold nanobonds were synthesized by a seed-mediated method. In this synthesis, chlorineuric acid (HAuCl4) 0.1 mM and cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) were used under stirring for 1 hour in a thermal bath at 40 ° C for the formation of the first particles. Then, a growth solution was added, containing 0.2M of chlorouric acid and CTAB, and 0.2M of ascorbic acid until the color of the solution changed from golden to transparent. Then, a solution of silver nitrate (AgNO3) in a thermal bath at 30 ° C for up to 48 hours, thus controlling the growth size of the nanobonds. Finally, the nanobonds were purified, removing excess CTAB by centrifugation at 5600 g for 15 minutes, and characterized by microscopy.

[024] Biomoléculas foram funcionalizadas em nanopartículas de ouro por intermédio de reagentes ligantes como polietilenoimina. Isso deve ser realizado para que o grupo amina (-NH2) da extremidade livre do ligante se ligue covalentemente ao grupo carboxila (-COOH) da porção C-terminal do anticorpo. Para que ocorra a ligação dos radicais carboxilas com os aminas é necessário uma reação de amidação por diimida. Por isso, é utilizado cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida (EDAC) como agente acoplante e N-hidroxisuccinimida (NHS) como agente estabilizante, o qual converte os ácidos carboxílicos em ésteres ativos, que em seguida interagem com os grupos amina dos reagentes ligantes.[024] Biomolecules were functionalized in gold nanoparticles using binding reagents such as polyethyleneimine. This must be done so that the amine group (-NH2) at the free end of the linker covalently bonds to the carboxyl group (-COOH) at the C-terminal portion of the antibody. In order for carboxyl radicals to bond with amines, a diimide amidation reaction is required. Therefore, N-ethyl-N '- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDAC) is used as a coupling agent and N-hydroxysuccinimide (NHS) as a stabilizing agent, which converts carboxylic acids into active esters, which then they interact with the amine groups of the binding reagents.

[025] Para que fosse possível a funcionalização dos anticorpos foi realizada a ligação de polietilenoimina ((C2H5N)n), o qual é capaz de mediar a ligação eletrostática nanobastão-anticorpo devido aos vários grupos amina reativos (ZAPP, E.; WESTPHAL, E.; GALLARDO, H.; et al. 2014. Liquid crystal and gold nanoparticles applied to electrochemical immunosensor for cardiac biomarker. Biosensors & bioelectronics, v.59, p.127-33.). Para isso, foi previamente definido a concentração de 0,3% de PEI a ser utilizada (FIGURA 1) e então, 250 μL de solução de nanopartículas foram centrifugados a 4000g por 10 minutos e ressuspendidos em 250 μL de polietilenoimina e incubados a temperatura ambiente por ultrasonicação por 30 minutos, para desestabilização do CTAB presente na superfície das nanopartículas. Após, a solução foi novamente centrifugada a 4000g por 10 minutos e ressuspendidas em 250 μL de anticorpo previamente preparado.[025] Polyethyleneimine ((C2H5N) n) binding was performed to make the antibodies functional, which is capable of mediating the electrostatic nanobasin-antibody bond due to the various reactive amine groups (ZAPP, E .; WESTPHAL, E .; GALLARDO, H .; et al. 2014. Liquid crystal and gold nanoparticles applied to electrochemical immunosensor for cardiac biomarker. Biosensors & bioelectronics, v.59, p.127-33.). For this, the 0.3% PEI concentration to be used was previously defined (FIGURE 1) and then, 250 μL of nanoparticle solution were centrifuged at 4000g for 10 minutes and resuspended in 250 μL of polyethyleneimine and incubated at room temperature by ultrasonication for 30 minutes, to destabilize the CTAB present on the surface of the nanoparticles. Afterwards, the solution was again centrifuged at 4000g for 10 minutes and resuspended in 250 μL of previously prepared antibody.

[026] As imunoglobulinas anti-favivirus foram purificadas (FIGURA 2) e depois de identificada a melhor concentração (0,4 μg/mL) a ser utilizada (FIGURA 3) foi preparada de modo que foi adicionado 30mM de EDAC/NHS (0,4M:0,1M) e Tampão fosfato (PBS1X, pH 7,4, NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 em água ultra pura) para um volume final de 250 μL. E então, incubada por 30 minutos a 4°C. Por fim, a reação de nanopartículas funcionalizadas com polietilenoimina e anticorpos foi realizada por uma hora a temperatura ambiente em banho ultrassónico. Ao final deste tempo foram novamente centrifugadas a 4000 g por 10 minutos e ressuspendidos em 100μl de PBS e 100μl de solução com vírus. Tabela 1 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para a diferentes concentrações de anti-flavivirus.

[026] Anti-favivirus immunoglobulins were purified (FIGURE 2) and after identifying the best concentration (0.4 μg / mL) to be used (FIGURE 3) was prepared so that 30mM EDAC / NHS (0 , 4M: 0.1M) and Phosphate buffer (PBS1X, pH 7.4, NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 in ultra pure water) to a final volume of 250 μL. Then, incubated for 30 minutes at 4 ° C. Finally, the reaction of functionalized nanoparticles with polyethyleneimine and antibodies was carried out for one hour at room temperature in an ultrasonic bath. At the end of this time, they were again centrifuged at 4000 g for 10 minutes and resuspended in 100μl of PBS and 100μl of virus solution. Table 1 Variation in displacement of plasmon resonance bands for different concentrations of anti-flavivirus.

[027] Para analisar a sensibilidade de detecção uma diluição com diferentes valores de Unidades formadoras de placas (UFP) de DENV-1 foi realizada em PBS para um volume final de 100 μL e depois adicionada à concentração definida (0,4 μg/mL) de anticorpo ligada às nanopartículas. Foi analisado o tempo necessário de incubação para a detecção do vírus (FIGURA 4) de modo que, 30 minutos foi considerado um tempo suficientemente satisfatório, uma vez que apresentou apenas 8 nm de diferença no deslocamento se comparado com a leitura de 60 minutos (TABELA 2). Tabela 2 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para a análise de tempo de detecção de Dengue vírus.

[027] To analyze the detection sensitivity a dilution with different values of DENV-1 plaque forming units (UFP) was performed in PBS for a final volume of 100 μL and then added to the defined concentration (0.4 μg / mL ) of antibody bound to the nanoparticles. The necessary incubation time for the detection of the virus was analyzed (FIGURE 4) so that, 30 minutes was considered a sufficiently satisfactory time, since it presented only 8 nm difference in displacement compared to the 60-minute reading (TABLE) two). Table 2 Variation in the displacement of plasmon resonance bands for the analysis of the time of detection of Dengue virus.

[028] Um biossensor sensível tem que ser capaz de detectar pequenas quantidades de moléculas. Por isso, foi feito um ensaio em que várias concentrações de vírus, expressas em Unidades Formadoras de Placa (UFP), foram incubadas às AuNRs funcionalizadas a 0,3% de PEI e 0,4μg/ml de anti-flavivirus (FIGURA 6). Como pode ser observado na tabela 3, com 50 UFP/ml (10 UFP) um pequeno deslocamento de 4 nm ocorreu, mas se torna mais evidente com 500 UFP/ml (100 UFP), apresentando um deslocamento de 18 nm. Mais evidente ainda com as maiores concentrações de 5000 UFP/ml e 50000 UFP/ml, como era esperado. O deslocamento em baixas concentrações de vírus, mesmo que pequeno, pode indicar que o método é sensível para a detecção de DENV1.[028] A sensitive biosensor has to be able to detect small amounts of molecules. Therefore, an assay was made in which various concentrations of viruses, expressed in Plaque Forming Units (UFP), were incubated to AuNRs functionalized to 0.3% PEI and 0.4μg / ml anti-flavivirus (FIGURE 6) . As can be seen in table 3, with 50 UFP / ml (10 UFP) a small displacement of 4 nm occurred, but it becomes more evident with 500 UFP / ml (100 UFP), with an displacement of 18 nm. Even more evident with the highest concentrations of 5000 UFP / ml and 50 000 UFP / ml, as expected. The shift in low virus concentrations, even if small, may indicate that the method is sensitive for the detection of DENV1.

[029] Foi realizado também um ensaio em que as AuNRs funcionalizadas com PEI e anticorpo anti-flavivirus foram incubadas com diferentes concentrações de Mayaro vírus (MV), um vírus do gênero Alphavirus e família Togaviridae (TESH, R. B,; WATTS, D, M,; RUSSELL, K, L,; et al. 1999. Mayaro virus disease: an emerging mosquito-borne zoonosis in tropical South America. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, v.28, p.67-73.). Uma vez que o anticorpo utilizado é específico para o gênero Flavivirus a ausência de deslocamento após a incubação com vírus de outro gênero, como MV sugere a especificidade do biossensor. A figura 7 e a tabela 4 mostram este resultado, nas quais se observa que não houve detecção do MV em quatro das cinco concentrações testadas, já que não ocorreu deslocamento em relação ao controle. Um deslocamento de 14 nm ocorreu apenas na presença de alta concentração (500000 UFP/ml) de MV, a qual, entretanto, não é encontrada em amostra biológica natural. Tabela 3 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para análise de sensibilidade de detecção de Dengue vírus.

Tabela 4 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para análise de sensibilidade de detecção de Dengue vírus.

[029] An assay was also performed in which AuNRs functionalized with PEI and anti-flavivirus antibody were incubated with different concentrations of Mayaro virus (MV), a virus of the Alphavirus genus and Togaviridae family (TESH, R. B ,; WATTS, D, M ,; RUSSELL, K, L ,; et al. 1999. Mayaro virus disease: an emerging mosquito-borne zoonosis in tropical South America. , p.67-73.). Since the antibody used is specific to the genus Flavivirus, the absence of displacement after incubation with viruses of another genus, as MV suggests the specificity of the biosensor. Figure 7 and Table 4 show this result, in which it is observed that there was no detection of the MV in four of the five concentrations tested, since there was no displacement in relation to the control. A displacement of 14 nm occurred only in the presence of a high concentration (500000 UFP / ml) of MV, which, however, is not found in a natural biological sample. Table 3 Variation in displacement of plasmon resonance bands for sensitivity analysis for detection of Dengue virus.

Table 4 Variation in displacement of plasmon resonance bands for sensitivity analysis for detection of Dengue virus.

[030] Para a análise das reações, os espectros foram medidos em espectrômetro UV- Vis, no qual é possível detectar as alterações dos elétrons de superfície resultantes da ligação anticorpos-antígenos, por deslocamento do espectro gerado. Os dados resultantes da leitura em espectrômetro UV-Vis foram normalizados utilizando PeakFit v4 e os gráficos foram gerados em GraphPad Prism.[030] For the analysis of the reactions, the spectra were measured in a UV-Vis spectrometer, in which it is possible to detect changes in the surface electrons resulting from the antibody-antigen bond, by displacing the generated spectrum. The data resulting from reading on a UV-Vis spectrometer were normalized using PeakFit v4 and the graphs were generated in GraphPad Prism.

[031] Se comparado a técnicas já existentes, as quais geralmente requerem um maior tempo de detecção, o ensaio neste trabalho mostrou-se eficiente com um resultado em curto prazo. Portanto, no que refere ao tempo necessário para realização do teste, este sistema apresenta bons atributos para uma detecção rápida para Dengue, Zika e Febre amarela.[031] When compared to existing techniques, which generally require a longer detection time, the test in this work proved to be efficient with a short-term result. Therefore, with regard to the time required to perform the test, this system has good attributes for rapid detection for Dengue, Zika and Yellow Fever.

[032] Os resultados obtidos neste trabalho podem ainda ser utilizados como base para outras aplicações. Ensaios de aglomeração podem ser realizados de modo que nanobastões e principalmente nanoesferas se aglomerem na presença do antígeno, podendo resultar no alargamento do pico de ressonância ou mesmo na mudança de cor da solução (NIETZOLD, C. e LISDAT, F. 2012. Fast protein detection using absorption properties of gold nanoparticles. The Analyst. v. 137, p. 2821-2816). Além disso, técnicas como microfluidica (HAN, K. N.; LI, C. A. e SEONG, G. H. 2013. Microfluidic chips for immunoassays. Annual review of analytical chemistry. v.6, p. 119-141) e SERS (STUART, D. A., HAES, A. J., YONZON, C. R. et al., 2005. Biological applications of localised surface plasmonic phenomenae. IEE proceedings. Nanobiotechnology. v. 152. p 13-32) poderiam ser associadas a ressonância de plasmon para facilitar e tornar a detecção ainda mais eficiente.[032] The results obtained in this work can still be used as a basis for other applications. Agglomeration tests can be performed in such a way that nanobands and mainly nanospheres agglomerate in the presence of the antigen, which may result in the widening of the resonance peak or even in the color change of the solution (NIETZOLD, C. and LISDAT, F. 2012. Fast protein detection using absorption properties of gold nanoparticles (The Analyst. v. 137, p. 2821-2816). In addition, techniques such as microfluidics (HAN, KN; LI, CA and SEONG, GH 2013. Microfluidic chips for immunoassays. Annual review of analytical chemistry. V.6, p. 119-141) and SERS (STUART, DA, HAES, AJ, YONZON, CR et al., 2005. Biological applications of localized surface plasmonic phenomenae. IEE proceedings. Nanobiotechnology. V. 152. p 13-32) could be associated with plasmon resonance to facilitate and make detection even more efficient.

Description of the figures

[033] Figura 1 Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de polietilenoimina. (A) Espectro resultante da ligação de 0,05% de PEI às AuNPs com um deslocamento de 90 nm. (B) Ligação de 0,1% com 90 nm de deslocamento. (C) Ligação de 0,2% com 62 nm de deslocamento. (D) Ligação de 0,3% com 32 nm de deslocamento. Linha contínua (AuNPs): nanopartículas puras. Linha pontilhada: diferentes concentrações de polietilenoimina ligadas às nanopartículas.[033] Figure 1 UV-Vis spectroscopy of the polyethyleneimine concentration analysis. (A) Spectrum resulting from the attachment of 0.05% PEI to AuNPs with a displacement of 90 nm. (B) 0.1% binding with 90 nm displacement. (C) 0.2% connection with 62 nm displacement. (D) 0.3% connection with 32 nm displacement. Continuous line (AuNPs): pure nanoparticles. Dotted line: different concentrations of polyethyleneimine bound to the nanoparticles.

[034] Figura 2. SDS-PAGE 12% de imunoglobulinas purificadas em coluna de afinidade: Amostras de sobrenadante de célula foram purificadas em coluna de afinidade. As bandas em destaque representam as cadeias pesada (50KDa) e leve (25KDa) dos anticorpos, sob condição desnaturante. (A) Anticorpo anti-flavivirus (AF) e (B) anti-denv2 (AD2). PMM: padrão de massa molecular.[034] Figure 2. SDS-PAGE 12% immunoglobulins purified on affinity column: Samples of cell supernatant were purified on affinity column. The highlighted bands represent the heavy (50KDa) and light (25KDa) chains of the antibodies, under denaturing condition. (A) Anti-flavivirus (AF) and (B) anti-denv2 (AD2) antibody. PMM: molecular weight standard.

[035] Figura 3 Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de anti- flavivirus na presença de polietilenoimina. (A) Espectro de AuNPs puras (Linha contínua) e ligação de 0,3% de polietilenoimina às AuNPs (Linha tracejada) com um deslocamento de 32 nm. (B) Ligação de 0,08 μg/mL. (C) Ligação de 0,4 μg/mL. (D) Ligação de 2 μg/mL. (E) Ligação de 10 μg/mL. (F) Ligação de 50 μg./mL. Linha tracejada (Controle): AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina. Linha pontilhada: diferentes concentrações de anticorpos.[035] Figure 3 UV-Vis spectroscopy of the analysis of anti-flavivirus concentration in the presence of polyethyleneimine. (A) Spectrum of pure AuNPs (Continuous line) and 0.3% polyethyleneimine binding to AuNPs (Dashed line) with a displacement of 32 nm. (B) 0.08 μg / mL binding. (C) 0.4 μg / mL binding. (D) 2 μg / mL connection. (E) 10 μg / mL connection. (F) 50 μg / mL connection. Dashed line (Control): AuNPs functionalized with 0.3% polyethyleneimine. Dotted line: different concentrations of antibodies.

[036] Figura 4 Espectroscopia de UV-Vis da análise de tempo de detecção do Dengue vírus (Flavivirus). (A) Espectro de detecção de vírus nos diferentes tempos testados: 2 em 2 minutos até 10 minutos e de 5 em 5 minutos até 1 hora. (B) Espectro da detecção do vírus nos quatro principais tempos (0, 15, 30 e 60 minutos). Linha tracejada (Controle): AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina e 0,4 μg/mL de anti- flavivirus. Tempo 0: leitura imediatamente após a adição do vírus. Linha pontilhada: diferentes tempos de incubação. Para cada amostra foi adicionado 5000UFP/ml do DENV1.[036] Figure 4 UV-Vis spectroscopy of the Dengue virus (Flavivirus) detection time analysis. (A) Spectrum of virus detection at the different times tested: every 2 minutes up to 10 minutes and every 5 minutes up to 1 hour. (B) Spectrum of virus detection in the four main times (0, 15, 30 and 60 minutes). Dashed line (Control): AuNPs functionalized with 0.3% polyethyleneimine and 0.4 μg / mL anti-flavivirus. Time 0: reading immediately after adding the virus. Dotted line: different incubation times. 5000UFP / ml of DENV1 was added to each sample.

[037] Figura 5. Análise da variação de deslocamento para diferentes tempos de detecção de Dengue vírus (Flavivirus): Tempo de detecção de vírus nos diferentes tempos testados: 2 em 2 minutos até 10 minutos e de 5 em 5 minutos até 30 minutos e 10 em 10 até 1 hora. Tempo 0: leitura imediatamente após a adição do vírus. Para cada amostra foi adicionado 5000UFP/ml do DENV1.[037] Figure 5. Displacement variation analysis for different detection times of Dengue virus (Flavivirus): Virus detection time at the different times tested: every 2 minutes up to 10 minutes and every 5 minutes up to 30 minutes and Every 10 to 1 hour. Time 0: reading immediately after adding the virus. 5000UFP / ml of DENV1 was added to each sample.

[038] Figura 6 Espectroscopia de UV-Vis da análise da sensibilidade de detecção do Dengue vírus (Flavivirus). Espectro de detecção de DENV 1 nas diferentes concentrações. (A) 10 UFP (50 UFP/mL). (B) 100 UFP (500 UFP/mL). (C) 1000 UFP (5000 UFP/mL) e (D) 10000 UFP (50000 UFP/mL). Linha tracejada (Controle): AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina e 0,4μg/mL de anti-flavivirus. Linha pontilhada: diferentes concentrações de vírus.[038] Figure 6 UV-Vis spectroscopy for the analysis of the detection sensitivity of the Dengue virus (Flavivirus). Detection spectrum of DENV 1 at different concentrations. (A) 10 UFP (50 UFP / ml). (B) 100 UFP (500 UFP / ml). (C) 1000 UFP (5000 UFP / mL) and (D) 10,000 UFP (50000 UFP / mL). Dashed line (Control): AuNPs functionalized with 0.3% polyethyleneimine and 0.4μg / mL anti-flavivirus. Dotted line: different concentrations of viruses.

[039] Figura 7 Espectroscopia de UV-Vis da análise da sensibilidade de detecção do Mayaro vírus (Alphavirus). Espectro de detecção de Mayaro virus nas diferentes concentrações (A) 10 UFP (50 UFP/mL). (B) 100 UFP (500 UFP/mL). (C) 1000 UFP (5000 UFP/mL), (D) 10000 UFP (50000 UFP/mL) e (E) 100000 (500000 UFP/mL). Linha tracejada (Controle): AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina e 0,4 μg/mL de anti-flavivirus. Linha pontilhada: diferentes concentrações de vírus.[039] Figure 7 UV-Vis spectroscopy of the analysis of the detection sensitivity of the Mayaro virus (Alphavirus). Detection spectrum of Mayaro virus at different concentrations (A) 10 UFP (50 UFP / mL). (B) 100 UFP (500 UFP / ml). (C) 1000 UFP (5000 UFP / mL), (D) 10,000 UFP (50000 UFP / mL) and (E) 100000 (500000 UFP / mL). Dashed line (Control): AuNPs functionalized with 0.3% polyethyleneimine and 0.4 μg / mL of anti-flavivirus. Dotted line: different concentrations of viruses.

Claims

1. Gold nanobots characterized by functionalization with a specific monoclonal antibody for Dengue virus, and specific monoclonal antibody for other viruses belonging to the genus Flavivirus (Zika virus and Yellow fever virus).

2. Gold nanobots according to claim 1, characterized in that the functionalization is mediated by polyethyleneimine.

3. Use of gold nanobods, according to claims 1 and 2, characterized by being in the direct diagnosis of Dengue virus, and other Flavivirus (Zika virus and Yellow fever virus), through platonic resonance.