BR102016002452B1 - MICROORGANISM WITH CAPACITY FOR SIMULTANEOUS CO-FERMENTATION OF MIXED SUGARS AND BUTANOL PRODUCTION METHOD USING THE SAME - Google Patents

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Abstract

MICRORGANISMO COM CAPACIDADE PARA CO-FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEA DE AÇÚCARES MISTURADOS E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE BUTANOL USANDO O MESMO. As modalidades da invenção proporcionam um microrganismo com capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico e que tem tolerância contra substâncias inibidoras do crescimento de microrganismos no hidrolisado lignocelulósico e possuindo adicionalmente produtividade de butanol. Além disso, as modalidades da invenção proporcionam um microrganismo recombinante no qual uma via de conversão da butiril-CoA em butanol ou uma via de conversão de butirato em butiril-CoA é promovida e a produtividade de butanol é aumentada. Além disso, um método para produzir os microrganismos usando butanol é proporcionado.MICROORGANISM WITH CAPACITY FOR SIMULTANEOUS CO-FERMENTATION OF MIXED SUGARS AND BUTANOL PRODUCTION METHOD USING THE SAME. Embodiments of the invention provide a microorganism capable of simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate and which has tolerance against substances inhibiting the growth of microorganisms in the lignocellulosic hydrolyzate and additionally having butanol productivity. Furthermore, embodiments of the invention provide a recombinant microorganism in which a butyryl-CoA to butanol conversion pathway or a butyrate to butyryl-CoA conversion pathway is promoted and butanol productivity is increased. Furthermore, a method for producing the microorganisms using butanol is provided.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION Campo TécnicoTechnical Field

[001] A presente invenção se refere a um microrganismo com capacidade para co-fermentação simultânea de açúcares misturados e método de produção de butanol usando o mesmo.[001] The present invention relates to a microorganism capable of simultaneous co-fermentation of mixed sugars and a method of producing butanol using the same.

[002] Descrição do estado da técnica relacionado[002] Description of the related prior art

[003] O butanol é um intermediário químico com uma ampla gama de aplicações, tais como, biocombustíveis, e é ainda considerado um produto químico muito útil.[003] Butanol is a chemical intermediate with a wide range of applications, such as biofuels, and is still considered a very useful chemical product.

[004] No estado da técnica relacionado, um método de produção de butanol, acetona e etanol por açúcares fermentáveis usando cepas de Clostridium foi utilizado no início dos anos 1900. Como o preço do petróleo declinou e o butanol podia ser produzido com um baixo custo por um processo oxo, os métodos biológicos para a produção do butanol foram substituídos por um método de produção de butanol em uma via petroquímica. Entretanto, devido a diversos problemas ambientais, incluindo o aquecimento global, e semelhantes, originados pelo mesmo uso de fontes de petróleo, vem havendo um aumento da necessidade de um método ambientalmente amigável para a produção de butanol através de fermentação microbiológica de fontes renováveis.[004] In the related prior art, a method of producing butanol, acetone and ethanol by fermentable sugars using strains of Clostridium was used in the early 1900s. As the price of oil declined and butanol could be produced at a low cost by an oxo process, biological methods for producing butanol were replaced by a method of producing butanol in a petrochemical route. However, due to various environmental problems, including global warming, and the like, caused by the same use of petroleum sources, there has been an increasing need for an environmentally friendly method for producing butanol through microbiological fermentation from renewable sources.

[005] No entanto, a fim de produzir butanol em uma escala industrial usando microrganismos, é necessário que o custo da biomassa a ser usada como matéria-prima dos microrganismos seja muito barata e a biomassa seja de um recurso não alimentar. Na prática, no caso de produção de butanol usando os tradicionais recursos à base de amido, é sabido que os custos dessa matéria-prima representam 60 % dos custos de produção. Isso decorre do aumento dos preços das safras e do baixo rendimento da fermentação das cepas. Consequentemente, a fim de produzir bioetanol de forma economicamente viável à escala industrial, recursos renováveis, baratos e não alimentares podem ser considerados como biomassa. É evidente que a biomassa celulósica é o recurso que satisfaz estas condições.[005] However, in order to produce butanol on an industrial scale using microorganisms, it is necessary that the cost of the biomass to be used as the feedstock for the microorganisms is very cheap and the biomass is from a non-food resource. In practice, in the case of butanol production using traditional starch-based resources, it is known that the costs of this raw material represent 60% of production costs. This is due to the increase in crop prices and the low fermentation yield of the strains. Consequently, in order to produce bioethanol in an economically viable way on an industrial scale, renewable, cheap and non-food resources can be considered as biomass. It is clear that cellulosic biomass is the resource that meets these conditions.

[006] Biomassa celulósica é composta de celulose com unidades de glicose β-1,4 ligadas e hemiceluloses (arabinoxilano, galactomanana e xiloglicano) compostas de várias pentoses e hexoses. Quando a biomassa celulósica é hidrolisada, hexoses tais como glicose, manose, galactose, pentose, tais como xilose, arabinose, e semelhantes, e dissacarídeos, tais como celobiose são produzidos. Entre eles, a xilose é conhecida como o segundo sacarídeo mais abundante depois da glicose presente na biomassa celulósica. No entanto, no caso de microrganismos, especificamente Clostridium acetobutylicum ATCC824, é sabido que o metabolismo de outros tipos de açúcares é reprimido quando a glicose e outros tipos de açúcares estão presentes simultaneamente, o que é referido como repressão catabólica (CCR) Ounine K, Petitdemange H, Raval G, Gay R. 1985. Appl Environ Microbiol 49:874-8). Tal fenômeno de CCR inibe a fermentação completa de açúcares misturados em um hidrolisado lignocelulósico e, assim, reduz o rendimento da fermentação, reduzindo assim a capacidade de fermentação da cepa. Por exemplo, apesar de Clostridium sp. AH-1 (FERM-P 6093 ATCC39045) poder utilizar arabinose e xilose, este utiliza preferencialmente a glicose, e, em seguida, arabinose e xilose. Portanto, a glicose é consumida em primeiro lugar, e, em seguida, arabinose e xilose são utilizadas depois de expressar genes necessários para o uso de arabinose e xilose. Assim sendo, no caso da fermentação contínua de açúcares misturados usando Clostridium sp. AH-1 (FERM P-6093 ATCC39045), existem problemas em que não somente a arabinose e xilose são acumuladas na solução de cultivo, mas também leva várias horas para expressar genes necessários para o seu uso. Portanto, existe uma necessidade de microrganismos capazes de produzir butanol através da fermentação de açúcares misturados simultaneamente em um hidrolisado lignocelulósico sem CCR.[006] Cellulosic biomass is composed of cellulose with β-1,4 linked glucose units and hemicelluloses (arabinoxylan, galactomannan and xyloglycan) composed of various pentoses and hexoses. When cellulosic biomass is hydrolyzed, hexoses such as glucose, mannose, galactose, pentose such as xylose, arabinose, and the like, and disaccharides such as cellobiose are produced. Among them, xylose is known as the second most abundant saccharide after glucose present in cellulosic biomass. However, in the case of microorganisms, specifically Clostridium acetobutylicum ATCC824, it is known that the metabolism of other types of sugars is repressed when glucose and other types of sugars are present simultaneously, which is referred to as catabolic repression (CCR) Ounine K, Petitdemange H, Raval G, Gay R. 1985. Appl Environ Microbiol 49:874-8). Such a CCR phenomenon inhibits the complete fermentation of sugars mixed into a lignocellulosic hydrolyzate and thus reduces the fermentation yield, thereby reducing the fermentation capacity of the strain. For example, although Clostridium sp. AH-1 (FERM-P 6093 ATCC39045) can use arabinose and xylose, it preferentially uses glucose, and then arabinose and xylose. Therefore, glucose is consumed first, and then arabinose and xylose are utilized after expressing genes required for the use of arabinose and xylose. Therefore, in the case of continuous fermentation of mixed sugars using Clostridium sp. AH-1 (FERM P-6093 ATCC39045), there are problems in which not only arabinose and xylose are accumulated in the culture solution, but it also takes several hours to express genes necessary for their use. Therefore, there is a need for microorganisms capable of producing butanol through the fermentation of sugars mixed simultaneously in a CCR-free lignocellulosic hydrolyzate.

[007] Com o desenvolvimento recente da tecnologia de engenharia metabólica e o sequenciamento completo do genoma de Clostridium acetobutylicum, esforços contínuos têm sido focados na produção mais eficaz de butanol. Além disso, estudos relativos à engenharia de vias metabólicas têm sido desempenhados ativamente. Por exemplo, os relatórios dizem que, quando um gene da proteína A de controle catabólico (ccpA) de Clostridium acetobutylicum é excluído, o fenômeno CCR é atenuado, permitindo assim a co-fermentação simultânea de glicose e xilose (Ren C, Gu Y, Hu S, Wu Y, Wang P, et al. 2010. Metabolic Engineering 12:446-54). No entanto, neste caso, o grau de co-fermentação da glicose e xilose é insignificante e os recursos da cepa não são suficientes em termos de aplicabilidade a uma escala industrial. Além disso, os relatórios dizem que, quando um gene que codifica a enzima II do sistema glicose-D dependente da fosfoenolpiruvato fosfotransferase (PTS) do Clostridium acetobutylicum é suprimido e a xilose transferase, xilose-isomerase e xilulose 5-fosfatase (xilose quinase) são expressas, a CCR é atenuada, permitindo assim a co-fermentação simultânea de glicose e xilose para produzir butanol (Xiao H, Gu Y, Ning Y, Yang Y, Mitchell WJ, et al. 2011. Appl Environ Microbiol 77:7886-95). No entanto, este processo também tem limites em termos de aplicabilidade comercial uma vez que apenas cerca de 5 g/L de xilose podem ser simultaneamente co- fermentados (ou seja, a co-fermentação simultânea de xilose é baixa), e a produtividade (0,31 g/L/h) e o rendimento (16 % (p/p)) são muito baixos.[007] With the recent development of metabolic engineering technology and the complete sequencing of the Clostridium acetobutylicum genome, continued efforts have been focused on more effective butanol production. Furthermore, studies related to the engineering of metabolic pathways have been actively carried out. For example, reports say that when a catabolic control protein A (ccpA) gene from Clostridium acetobutylicum is deleted, the CCR phenomenon is attenuated, thus allowing simultaneous co-fermentation of glucose and xylose (Ren C, Gu Y, Hu S, Wu Y, Wang P, et al. 2010. Metabolic Engineering 12:446-54). However, in this case, the degree of co-fermentation of glucose and xylose is insignificant and the strain's resources are not sufficient in terms of applicability on an industrial scale. Furthermore, reports say that when a gene encoding enzyme II of the phosphoenolpyruvate phosphotransferase (PTS)-dependent glucose-D system of Clostridium acetobutylicum is suppressed and xylose transferase, xylose isomerase and xylulose 5-phosphatase (xylose kinase) are expressed, CCR is attenuated, thus allowing simultaneous co-fermentation of glucose and xylose to produce butanol (Xiao H, Gu Y, Ning Y, Yang Y, Mitchell WJ, et al. 2011. Appl Environ Microbiol 77:7886- 95). However, this process also has limits in terms of commercial applicability since only about 5 g/L of xylose can be simultaneously co-fermented (i.e. simultaneous co-fermentation of xylose is low), and productivity ( 0.31 g/L/h) and the yield (16% (w/w)) are very low.

[008] Além disso, um hidrolisado lignocelulósico produzido pelo pré- tratamento da biomassa celulósica incluindo biomassa lenhosa ou biomassa herbácea , tal como madeira, bagaço de fruta (EFB), hastes do milho, palha de arroz e similares (adiante designado por “biomassa lignocelulósica”) contém substâncias desconhecidas que podem causar reações secundárias durante o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica por ácidos ou bases durante a sacarificação, inibindo assim o crescimento de microrganismos. Consequentemente, a fim de eficazmente fermentar simultaneamente açúcares misturados, a engenharia genética para co-fermentação simultânea de açúcares misturados, bem como os microrganismos que apresentam tolerância contra substâncias inibidoras devem ser desenvolvidos ao mesmo tempo. No entanto, os microrganismos que apresentam tolerância contra substâncias inibidoras e simultaneamente capazes de co-fermentação de açúcares misturados em uma escala comercialmente aplicável não foram ainda desenvolvidos.[008] Furthermore, a lignocellulosic hydrolyzate produced by pre-treatment of cellulosic biomass including woody biomass or herbaceous biomass, such as wood, fruit pomace (EFB), corn stalks, rice straw and the like (hereinafter referred to as “biomass lignocellulosic biomass”) contains unknown substances that may cause secondary reactions during the pretreatment of lignocellulosic biomass by acids or bases during saccharification, thus inhibiting the growth of microorganisms. Consequently, in order to effectively simultaneously ferment mixed sugars, genetic engineering for simultaneous co-fermentation of mixed sugars as well as microorganisms that exhibit tolerance against inhibitory substances must be developed at the same time. However, microorganisms that exhibit tolerance against inhibitory substances and simultaneously capable of co-fermentation of mixed sugars on a commercially applicable scale have not yet been developed.

DESCRIÇÃO SUMÁRIASUMMARY DESCRIPTION

[009] É um aspecto da presente invenção proporcionar uma cepa produtora de butanol que tem a tolerância contra um hidrolisado lignocelulósico e capacidade para co-fermentação simultânea da açúcares misturados.[009] It is an aspect of the present invention to provide a butanol-producing strain that has tolerance against a lignocellulosic hydrolyzate and the capacity for simultaneous co-fermentation of mixed sugars.

[010] De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um microrganismo capaz de simultaneamente co-fermentar dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico e que tem produtividade para butanol.[010] According to one aspect of the present invention, there is provided a microorganism capable of simultaneously co-fermenting two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate and having butanol productivity.

[011] O microrganismo de acordo com a presente invenção pode produzir butanol com uma seletividade elevada por co-fermentação simultânea de açúcares misturados no hidrolisado de biomassa lignocelulósica.[011] The microorganism according to the present invention can produce butanol with high selectivity by simultaneous co-fermentation of sugars mixed in lignocellulosic biomass hydrolyzate.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[012] Os acima e outros aspectos, características, e vantagens da presente invenção se tornam evidentes a partir da descrição detalhada das modalidades a seguir, em conjunto com os desenhos anexos, nos quais:[012] The above and other aspects, characteristics, and advantages of the present invention become evident from the detailed description of the following embodiments, together with the attached drawings, in which:

[013] Fig. 1 mostra a produtividade de butanol de TM1-1 a TM1-20 que são cepas tolerantes ao hidrolisado lignocelulósico;[013] Fig. 1 shows the butanol productivity of TM1-1 to TM1-20 which are strains tolerant to lignocellulosic hydrolyzate;

[014] Fig. 2 mostra a cepa TM1-3 em comparação com um grupo controle após o cultivo por 2 dias em CGM sólido preparado substituindo glicose por um hidrolisado lignocelulósico;[014] Fig. 2 shows strain TM1-3 compared to a control group after cultivation for 2 days in solid CGM prepared by replacing glucose with a lignocellulosic hydrolyzate;

[015] Fig. 3 mostra a produtividade do butanol de TM2-1 a TM2-20 que são cepas de co-fermentação simultânea de xilose-glicose;[015] Fig. 3 shows the butanol productivity of TM2-1 to TM2-20 which are simultaneous xylose-glucose co-fermentation strains;

[016] Fig. 4 a-e mostra a co-fermentação simultânea de glicose e xilose por TM2-1, TM2-16 e TM2-19;[016] Fig. 4 a-e shows the simultaneous co-fermentation of glucose and xylose by TM2-1, TM2-16 and TM2-19;

[017] Fig. 5 mostra a co-fermentação simultânea de TM2-1 em um meio contendo tem 40 % de xilose;[017] Fig. 5 shows the simultaneous co-fermentation of TM2-1 in a medium containing 40% xylose;

[018] Fig. 6 mostra um plasmídeo pGS1-AdhE1;[018] Fig. 6 shows a pGS1-AdhE1 plasmid;

[019] Fig. 7 mostra um plasmídeo pGS1-CtfAB;[019] Fig. 7 shows a pGS1-CtfAB plasmid;

[020] Fig. 8 mostra um plasmídeo pGS1-E1AB; e[020] Fig. 8 shows a plasmid pGS1-E1AB; It is

[021] Fig. 9 mostra um perfil de açúcar em um meio ao longo do tempo de fermentação mediante fermentação contínua de um hidrolisado lignocelulósico incluindo açúcares misturados durante 162,5 horas por TM2-1-C (pGS1-E1AB). DESCRIÇÃO DETALHADA[021] Fig. 9 shows a sugar profile in a medium over fermentation time upon continuous fermentation of a lignocellulosic hydrolyzate including sugars mixed for 162.5 hours by TM2-1-C (pGS1-E1AB). DETAILED DESCRIPTION

[022] A presente invenção se refere a um microrganismo capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico hidrolisado e que tem produtividade para o butanol.[022] The present invention refers to a microorganism capable of simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a hydrolyzed lignocellulosic hydrolyzate and which has butanol productivity.

[023] Além disso, a presente invenção se refere a um método para a produção de butanol, incluindo: preparação de um meio incluindo dois ou mais açúcares; inoculação do meio com um microrganismo; e cultivo do microrganismo.[023] Furthermore, the present invention relates to a method for producing butanol, including: preparing a medium including two or more sugars; inoculating the medium with a microorganism; and cultivation of the microorganism.

[024] Além disso, a presente invenção se refere a um microrganismo recombinante com capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico e que tem produtividade de butanol, em que uma via de conversão da butiril-CoA em butanol ou uma via de conversão do butirato em butiril-CoA é promovida, e a produtividade de butanol é aumentada.[024] Furthermore, the present invention relates to a recombinant microorganism with the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate and which has butanol productivity, in which a pathway for converting butyryl-CoA into butanol or a conversion pathway from butyrate to butyryl-CoA is promoted, and butanol productivity is increased.

[025] Além disso, a presente invenção se refere a um método para a produção de butanol, incluindo: preparação de um meio incluindo dois ou mais açúcares; inoculação do meio com um microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção; e o cultivo do microrganismo recombinante.[025] Furthermore, the present invention relates to a method for producing butanol, including: preparing a medium including two or more sugars; inoculating the medium with a recombinant microorganism according to the present invention; and the cultivation of the recombinant microorganism.

[026] Daqui em diante, a presente invenção irá ser descrita em detalhe.[026] Hereinafter, the present invention will be described in detail.

[027] Microrganismo com capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares, no hidrolisado de uma biomassa lignocelulósica e que tem produtividade de butanol.[027] Microorganism with the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars, in the hydrolyzate of a lignocellulosic biomass and which has butanol productivity.

[028] A presente invenção se refere a um microrganismo capaz da co- fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico e que tem produtividade de butanol. O microrganismo tem tolerância contra um hidrolisado lignocelulósico, mais preferencialmente tolerância contra substâncias inibidoras do crescimento de microrganismos em um hidrolisado lignocelulósico. Além disso, o microrganismo tem capacidade de co-fermentação simultânea de glicose e xilose.[028] The present invention refers to a microorganism capable of the simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate and which has butanol productivity. The microorganism has tolerance against a lignocellulosic hydrolyzate, more preferably tolerance against substances inhibiting the growth of microorganisms in a lignocellulosic hydrolyzate. Furthermore, the microorganism has the capacity for simultaneous co-fermentation of glucose and xylose.

[029] O microrganismo é, de preferência Clostridium acetobutylicum, mais preferencialmente Clostridium acetobutylicum mutante, ainda mais preferencialmente Clostridium acetobutylicum mutante ATCC824 △pta △buk. Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta △buk é um microrganismo recombinante no qual um gene pta expressando fosfotransacetilase e um gene buk expressando butirato quinase em Clostridium acetobutylicum ATCC824 estão deletados ao mesmo tempo.[029] The microorganism is preferably Clostridium acetobutylicum, more preferably Clostridium acetobutylicum mutant, even more preferably Clostridium acetobutylicum mutant ATCC824 △pta △buk. Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta △buk is a recombinant microorganism in which a pta gene expressing phosphotransacetylase and a buk gene expressing butyrate kinase in Clostridium acetobutylicum ATCC824 are deleted at the same time.

[030] De um modo preferido, o microrganismo é Clostridium acetobutylicum TM2-1-C (número de acesso KCTC 12604BP).[030] Preferably, the microorganism is Clostridium acetobutylicum TM2-1-C (accession number KCTC 12604BP).

[031] Hidrolisado lignocelulósico[031] Lignocellulosic hydrolyzate

[032] O microrganismo de acordo com a presente invenção tem uma tolerância contra um hidrolisado lignocelulósico e tem capacidade de co- fermentação simultânea de dois ou mais açúcares no hidrolisado lignocelulósico. O hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado obtido por hidrólise de matérias-primas lignocelulósicas (por exemplo, madeira, EFB (bagaço de fruta), hastes de milho, hastes de cana-de-acúcar, palha de arroz, e semelhantes), de preferência hidrolisados obtidos pela hidrólise de materiais lignocelulósicos e a remoção de lignina. O hidrolisado lignocelulósico contém açúcares misturados compreendendo dois ou mais açúcares. De preferência, o hidrolisado contém pentoses, hexoses e dissacarídeos, tais como glicose, xilose, manose, galactose, arabinose, celobiose, e semelhantes, e particularmente tem alto teor de glicose e xilose.[032] The microorganism according to the present invention has a tolerance against a lignocellulosic hydrolyzate and has the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars in the lignocellulosic hydrolyzate. Lignocellulosic hydrolyzate is a hydrolyzate obtained by hydrolysis of lignocellulosic raw materials (e.g. wood, EFB (fruit pomace), corn stalks, sugarcane stalks, rice straw, and the like), preferably hydrolyzed obtained by the hydrolysis of lignocellulosic materials and the removal of lignin. Lignocellulosic hydrolyzate contains mixed sugars comprising two or more sugars. Preferably, the hydrolyzate contains pentoses, hexoses and disaccharides, such as glucose, xylose, mannose, galactose, arabinose, cellobiose, and the like, and particularly has a high content of glucose and xylose.

[033] Tolerância contra um hidrolisado lignocelulósico[033] Tolerance against a lignocellulosic hydrolyzate

[034] O microrganismo de acordo com a presente invenção tem uma tolerância contra o hidrolisado lignocelulósico. A tolerância contra o hidrolisado lignocelulósico significa que o microrganismo é capaz de crescer em um meio incluindo o hidrolisado, e inibição do crescimento do microrganismo, devido a substância a não ocorrer.[034] The microorganism according to the present invention has a tolerance against lignocellulosic hydrolyzate. Tolerance against lignocellulosic hydrolyzate means that the microorganism is capable of growing in a medium including the hydrolyzate, and inhibition of the growth of the microorganism due to the substance does not occur.

[035] Capacidade de co-fermentação simultânea[035] Simultaneous co-fermentation capacity

[036] O microrganismo de acordo com a presente invenção tem capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico. O termo “capacidade de co-fermentação simultânea” significa que a fermentação de um açúcar não é preferida sobre a fermentação de outros açúcares. Uma vez que o microrganismo de acordo com a presente invenção tem capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares, um fenômeno em que o metabolismo de um açúcar é suprimido pelo metabolismo do outro açúcar é impedido entre os açúcares a ser simultaneamente co-fermentados.[036] The microorganism according to the present invention has the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate. The term “simultaneous co-fermentation capability” means that the fermentation of one sugar is not preferred over the fermentation of other sugars. Since the microorganism according to the present invention has the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars, a phenomenon in which the metabolism of one sugar is suppressed by the metabolism of the other sugar is prevented between the sugars being simultaneously co-fermented. fermented.

[037] Microrganismo recombinante[037] Recombinant microorganism

[038] A presente invenção se refere a um microrganismo recombinante com capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares no hidrolisado lignocelulósico e que tem produtividade de butanol, em que uma via de conversão de butiril-CoA em butanol ou uma via de conversão de butirato em butiril-CoA é promovida, e a produtividade do butanol é aumentada.[038] The present invention refers to a recombinant microorganism with the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars in the lignocellulosic hydrolyzate and which has butanol productivity, in which a pathway for converting butyryl-CoA into butanol or a pathway for conversion of butyrate to butyryl-CoA is promoted, and butanol productivity is increased.

[039] O microrganismo recombinante pode ter um aumento de atividade da CoA transferase, o que leva a uma via acelerada de conversão do butirato em butiril-CoA redutase ou um aumento de atividade da aldeído/álcool desidrogenase converque tem butiril-CoA em butanol. O microrganismo recombinante tem capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares no hidrolisado lignocelulósico, por meio do qual produz ABE (acetona, butanol e etanol) com produtividade particularmente elevada e seletividade de butanol.[039] The recombinant microorganism may have an increased activity of CoA transferase, which leads to an accelerated pathway for converting butyrate to butyryl-CoA reductase or an increased activity of aldehyde/alcohol dehydrogenase that converts butyryl-CoA to butanol. The recombinant microorganism has the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars in the lignocellulosic hydrolyzate, whereby it produces ABE (acetone, butanol and ethanol) with particularly high productivity and butanol selectivity.

[040] Aceleração da via de conversão de butiril-CoA em butanol[040] Acceleration of the butyryl-CoA to butanol conversion pathway

[041] Butiril-CoA redutase pode ser convertia em butanol via butanal na via de produção de butanol. A via pode ser acelerada através da promoção da etapa de conversão da butiril-CoA em butanal ou a etapa de conversão de butanal em butanol. Cada etapa pode ser acelerada através do uso de um método conhecido, tal como o aumento da atividade enzimática.[041] Butyryl-CoA reductase can be converted to butanol via butanal in the butanol production pathway. The pathway can be accelerated by promoting the butyryl-CoA to butanal conversion step or the butanal to butanol conversion step. Each step can be accelerated through the use of a known method, such as increasing enzyme activity.

[042] Por exemplo, a aldeído/álcool desidrogenase regula a conversão de butiril-CoA em butanal e a conversão de butanal em butanol. A via de conversão de butiril-CoA em butanol pode ser acelerada pelo aumento da atividade da aldeído/álcool desidrogenase. O aumento da atividade da aldeído/álcool desidrogenase pode ser realizado pelo aumento da expressão e atividade da enzima aldeído/álcool desidrogenase, e semelhantes. Por exemplo, uma pessoa especialista na técnica pode aumentar a atividade da aldeído/álcool desidrogenase escolhendo um método apropriado, tal como introdução, amplificação, rearranjo do gene adhE que codifica a aldeído/álcool desidrogenase, ou regulação da expressão do gene no decurso da transcrição ou da tradução, e similares.[042] For example, aldehyde/alcohol dehydrogenase regulates the conversion of butyryl-CoA to butanal and the conversion of butanal to butanol. The conversion pathway of butyryl-CoA to butanol can be accelerated by increasing the activity of aldehyde/alcohol dehydrogenase. Increasing the activity of aldehyde/alcohol dehydrogenase can be accomplished by increasing the expression and activity of the enzyme aldehyde/alcohol dehydrogenase, and the like. For example, a person skilled in the art can increase the activity of aldehyde/alcohol dehydrogenase by choosing an appropriate method, such as introducing, amplifying, rearranging the adhE gene encoding aldehyde/alcohol dehydrogenase, or regulating expression of the gene in the course of transcription. or translation, and the like.

[043] Aceleração da via de conversão do butirato em butiril-CoA[043] Acceleration of the butyrate conversion pathway into butyryl-CoA

[044] A CoA transferase regula a conversão de butirato em butiril-CoA na via de produção de butanol. A via de conversão do butirato em butiril-CoA- redutase pode ser acelerada pelo aumento da atividade da CoA-transferase. Aumento da atividade de CoA-transferase pode ser realizado através do aumento da expressão e atividade da enzima CoA-transferase, e semelhantes. Por exemplo, uma pessoa com conhecimento comum da técnica pode aumentar a atividade de transferase CoA escolhendo um método apropriado, tal como introdução, amplificação, rearranjo dos genes cftA ou ctfB (a seguir referido como “ctfAB”) de codificação da CoA-transferase, ou regulação da expressão do gene no decurso da transcrição ou tradução, e semelhantes.[044] CoA transferase regulates the conversion of butyrate to butyryl-CoA in the butanol production pathway. The butyrate conversion pathway into butyryl-CoA reductase can be accelerated by increasing CoA transferase activity. Increasing CoA-transferase activity can be accomplished by increasing the expression and activity of the CoA-transferase enzyme, and the like. For example, a person of ordinary skill in the art can increase CoA transferase activity by choosing an appropriate method, such as introduction, amplification, rearrangement of the cftA or ctfB (hereinafter referred to as “ctfAB”) encoding CoA-transferase genes, or regulation of gene expression in the course of transcription or translation, and the like.

[045] Co-fermentação simultânea pelo microrganismo recombinante[045] Simultaneous co-fermentation by recombinant microorganism

[046] O microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção tem capacidade de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico. Preferivelmente, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção tem capacidade de co-fermentação simultânea de glicose e pelo menos um açúcar selecionado de entre o grupo que consiste em xilose, arabinose e celobiose. Mais preferencialmente, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção tem capacidade de co-fermentação simultânea de xilose a uma proporção de 90 % ou mais, de preferência 95 % ou mais. Ainda mais preferencialmente, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção tem capacidade de co-fermentação simultânea de arabinose a uma proporção de 90 % ou mais, de preferência 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 98 % ou mais. Mais preferencialmente, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção tem capacidade de co-fermentação simultânea de celobiose, na proporção de 85 % ou mais, de preferência 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 92 % ou mais. A proporção de co-fermentação simultânea se refere a um valor obtido pela divisão da diferença entre a quantidade de açúcares no hidrolisado fornecido a um meio e a quantidade de açúcares restantes após a fermentação contínua.[046] The recombinant microorganism according to the present invention has the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate. Preferably, the recombinant microorganism according to the present invention has the capacity for simultaneous co-fermentation of glucose and at least one sugar selected from the group consisting of xylose, arabinose and cellobiose. More preferably, the recombinant microorganism according to the present invention has the capacity for simultaneous co-fermentation of xylose at a rate of 90% or more, preferably 95% or more. Even more preferably, the recombinant microorganism according to the present invention has the capacity for simultaneous co-fermentation of arabinose at a rate of 90% or more, preferably 95% or more, even more preferably 98% or more. More preferably, the recombinant microorganism according to the present invention has the capacity for simultaneous co-fermentation of cellobiose, in the proportion of 85% or more, preferably 90% or more, even more preferably 92% or more. The simultaneous co-fermentation ratio refers to a value obtained by dividing the difference between the amount of sugars in the hydrolyzate supplied to a medium and the amount of sugars remaining after continuous fermentation.

[047] Razão de co-fermentação simultânea (%) = {(Total de açúcares introduzidos (g) - quantidade de açúcares restante após a fermentação (g))/total de açúcares introduzidas (g)} x 100[047] Simultaneous co-fermentation ratio (%) = {(Total sugars introduced (g) - amount of sugars remaining after fermentation (g))/total sugars introduced (g)} x 100

[048] Ex) Razão da co-fermentação simultânea da xilose (%)[048] Ex) Ratio of simultaneous co-fermentation of xylose (%)

[049] Razão da co-fermentação simultânea da xilose = {(total de xilose introduzida (g) - quantidade de açúcares restantes após a fermentação (g))/(total de xilose introduzida (g))} x 100[049] Ratio of simultaneous co-fermentation of xylose = {(total xylose introduced (g) - amount of sugars remaining after fermentation (g))/(total xylose introduced (g))} x 100

[050] Produtividade de butanol pelo microrganismo recombinante[050] Butanol productivity by recombinant microorganism

[051] O microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção fermenta dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico, produzindo, assim ABE, particularmente com alta produtividade de butanol.[051] The recombinant microorganism according to the present invention ferments two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate, thus producing ABE, particularly with high butanol productivity.

[052] O microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção exibe seletividade ao butanol de 70 % ou mais, de preferência 75 % ou mais, com base no cultivo em batelada alimentada. Além disso, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção exibe seletividade à acetona menor que 20 %, de preferência menor que 15 %, mais preferencialmente menor que 13 %, com base no cultivo em batelada alimentada. Além disso, o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção exibe seletividade ao etanol menor que 20 %, de preferência menor que 15 %, mais preferencialmente menor que 13 %, com base no cultivo em batelada alimentada.[052] The recombinant microorganism according to the present invention exhibits butanol selectivity of 70% or more, preferably 75% or more, based on fed-batch cultivation. Furthermore, the recombinant microorganism according to the present invention exhibits acetone selectivity of less than 20%, preferably less than 15%, more preferably less than 13%, based on fed-batch cultivation. Furthermore, the recombinant microorganism according to the present invention exhibits ethanol selectivity of less than 20%, preferably less than 15%, more preferably less than 13%, based on fed-batch cultivation.

[053] O microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção exibe produtividade de butanol de 0,5 g/L/h ou mais, ou 0,8 g/L/h ou mais, ou 1,0 g/L/h ou mais, ou 1,5 g/L/h ou mais, ou 1,8 g/L/h ou mais, ou 2,0 g/L/h ou mais, com base na fase exponencial das cepas em cultura em batelada alimentada.[053] The recombinant microorganism according to the present invention exhibits butanol productivity of 0.5 g/L/h or more, or 0.8 g/L/h or more, or 1.0 g/L/h or more, or 1.5 g/L/h or more, or 1.8 g/L/h or more, or 2.0 g/L/h or more, based on the exponential phase of the strains in fed-batch culture .

[054] Método para a produção de butanol usando microrganismo recombinante[054] Method for producing butanol using recombinant microorganism

[055] A presente invenção se refere a um método para a produção de butanol por co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico usando o microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção. Além disso, a presente invenção se refere a um método para a produção de butanol incluindo: preparação de um meio incluindo dois ou mais açúcares; inoculação do meio com um microrganismo recombinante de acordo com a presente invenção; e o cultivo do microrganismo recombinante. Os dois ou mais açúcares incluem glicose e pelo menos um açúcar selecionado de entre o grupo que consiste em xilose, arabinose e celobiose. O meio inclui preferencialmente um hidrolisado lignocelulósico.[055] The present invention relates to a method for producing butanol by simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate using the recombinant microorganism according to the present invention. Furthermore, the present invention relates to a method for producing butanol including: preparing a medium including two or more sugars; inoculating the medium with a recombinant microorganism according to the present invention; and the cultivation of the recombinant microorganism. The two or more sugars include glucose and at least one sugar selected from the group consisting of xylose, arabinose and cellobiose. The medium preferably includes a lignocellulosic hydrolyzate.

[056] Os acima e outros aspectos, características, e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada das seguintes modalidades, em conjunto com os desenhos anexos. No entanto, deve estar de acordo que a presente invenção não está limitada às seguintes modalidades e pode ser realizada de diferentes maneiras, e que as modalidades são fornecidas para descrição completa e compreensão aprofundada da invenção pelos especialistas na técnica. O âmbito da presente invenção só deve ser definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.[056] The above and other aspects, characteristics, and advantages of the present invention will become evident from the detailed description of the following embodiments, together with the attached drawings. However, it should be agreed that the present invention is not limited to the following embodiments and can be carried out in different ways, and that the embodiments are provided for full description and in-depth understanding of the invention by those skilled in the art. The scope of the present invention should only be defined by the appended claims and their equivalents.

[057] Materiais e métodos[057] Materials and methods

[058] Cepa tipo selvagem de Clostridium acetobutylicum ATCC824 foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC).[058] Wild-type strain of Clostridium acetobutylicum ATCC824 was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).

[059] Uma cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC824 com gene △pta △buk deletado (a seguir referida como “ABKO”) foi preparada usando Clostridium acetobutylicum ATCC824 de acordo com o método descrito em WO2011/037415. O mutante ABKO é uma cepa com produtividade de butanol.[059] A strain of Clostridium acetobutylicum ATCC824 with deleted △pta △buk gene (hereinafter referred to as “ABKO”) was prepared using Clostridium acetobutylicum ATCC824 according to the method described in WO2011/037415. The ABKO mutant is a butanol-productive strain.

[060] Metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (MNTG) para ser usado como um agente mutagênico causando mutação genética aleatória de genes foi adquirido junto da TCI (Tokyo Chemical Industry, Japão).[060] Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNTG) to be used as a mutagenic agent causing random genetic mutation of genes was purchased from TCI (Tokyo Chemical Industry, Japan).

[061] Na avaliação da produtividade de biobutanol da cepa de C. acetobutylicum, seletividade para o produto específico (proporção de um produto específico nos produtos misturados produzidos (ABE: acetona, butanol, etanol)), produtividade e rendimento do butanol foram calculados como abaixo:[061] In evaluating the biobutanol productivity of the C. acetobutylicum strain, selectivity for the specific product (proportion of a specific product in the mixed products produced (ABE: acetone, butanol, ethanol)), productivity and butanol yield were calculated as below:

[062] - Seletividade ao Butanol (%): (quantidade produzida de butanol (g)/quantidade produzida de ABE (g)) x 100[062] - Selectivity to Butanol (%): (amount of butanol produced (g)/amount of ABE produced (g)) x 100

[063] - Seletividade ao etanol (%): (quantidade produzida de etanol (g)/quantidade produzida de ABE (g)) x 100[063] - Ethanol selectivity (%): (amount of ethanol produced (g)/amount of ABE produced (g)) x 100

[064] - Seletividade à acetona (%): (quantidade produzida de acetona (g)/quantidade produzida de ABE (g)) x 100[064] - Acetone selectivity (%): (amount of acetone produced (g)/amount of ABE produced (g)) x 100

[065] - Produtividade de butanol (g/L/h): Quantidade de butanol produzido por hora por unidade de volume[065] - Butanol productivity (g/L/h): Amount of butanol produced per hour per unit volume

[066] (Produtividade de butanol em cultura em batelada e método de cultura em batelada alimentada é baseado na fase exponencial de produção do solvente. Em cultura contínua, produtividade de butanol é baseada na quantidade cumulativa de ABE produzido na fase total.)[066] (Butanol productivity in batch culture and fed-batch culture method is based on the exponential phase of solvent production. In continuous culture, butanol productivity is based on the cumulative amount of ABE produced in the total phase.)

[067] - Rendimento (%): (quantidade de ABE produzida (g)/fonte de carbono (g)) x 100[067] - Yield (%): (amount of ABE produced (g)/carbon source (g)) x 100

[068] - Produtividade de ABE (g/L/h): Quantidade de ABE produzida por hora por unidade de volume[068] - ABE productivity (g/L/h): Amount of ABE produced per hour per unit volume

[069] Os hidrolisados usados nos Exemplos Experimentais foram preparados pelo seguinte método.[069] The hydrolysates used in the Experimental Examples were prepared by the following method.

[070] A um reator contendo ácido sulfúrico a 70 %, resíduos cortados de madeira foram adicionados e reagidos a cerca de 100 °C durante 30 minutos durante agitação, efetuando assim o pré-tratamento. À lama pré-tratada, uma quantidade adequada de água foi adicionada para realizar a hidrólise. Na solução hidrolisada, vários açúcares tais como a glicose, xilose, e semelhantes derivados da celulose e hemicelulose estão presentes sob a forma de misturas (daqui em diante, a açúcares misturados é referido como “açúcares misturados”). A solução hidrolisada foi prensada usando uma prensa de filtro, a uma pressão de cerca de 3 bar, de modo a que os açúcares misturados podem ser contidos no filtrado enquanto que a lignina pode ser separada como um sólido dentro do filtro. Após a remoção de lignina a partir da solução hidrolisada, ácido sulfúrico foi separado a partir da solução restante (contendo tem açúcares misturados) usando uma resina de troca aniônica, sendo assim obtido um hidrolisado que tem uma concentração de cerca de 100 g/L dos açúcares misturados. O hidrolisado produzido foi concentrado novamente até que a concentração de açúcares misturados atingiu cerca de 200 g/L, e foi usada como uma solução de alimentação para o cultivo contínuo.[070] To a reactor containing 70% sulfuric acid, chopped wood residues were added and reacted at around 100 °C for 30 minutes while stirring, thus carrying out the pre-treatment. To the pretreated sludge, an appropriate amount of water was added to carry out hydrolysis. In the hydrolyzed solution, various sugars such as glucose, xylose, and similar cellulose and hemicellulose derivatives are present in the form of mixtures (hereinafter, mixed sugars are referred to as “mixed sugars”). The hydrolyzed solution was pressed using a filter press at a pressure of about 3 bar, so that the mixed sugars could be contained in the filtrate whilst the lignin could be separated as a solid within the filter. After removing lignin from the hydrolyzed solution, sulfuric acid was separated from the remaining solution (containing mixed sugars) using an anion exchange resin, thus obtaining a hydrolyzate having a concentration of about 100 g/L of the mixed sugars. The produced hydrolyzate was concentrated again until the concentration of mixed sugars reached about 200 g/L, and was used as a feed solution for continuous cultivation.

[071] <Exemplo Experimental 1> Construção de cepas com tolerância contra o hidrolisado lignocelulósico[071] <Experimental Example 1> Construction of strains with tolerance against lignocellulosic hydrolyzate

[072] <1-1> mutagênese aleatória[072] <1-1> random mutagenesis

[073] Cepas ABKO foram cultivadas em 60 ml de líquido CGM ( Meio de Crescimento de Clostridium) (0,75 g/L de K2HPO4, 0,75 g/L de KH2PO4, 0,7 g/L, MgSO4 7H2O, 0,017 g/L de MnSO4 5H2O, 0,01 g/L, FeSO4 7H2O, 2 g/L de (NH4) 2SO2, 1 g/L de NaCl, 2 g/L de asparagina, 0,004 g/L de ácido p- aminobenzóico, 5 g/L de extrato de levedura, 4,08 g/L CH3COONa 3H2O, e 80 g /L de glicose) a 37 °C sob condições anaeróbicas, até a absorbância a 600 nm atingir 0,5 (ou seja, OD600 = 0,5). A solução de cultivo foi centrifugada a 7000 g durante 10 minutos a 4 °C. Os sedimentos celulares foram lavados com líquidos CGM três vezes, e, em seguida, ressuspenso em 50 ml de CGM líquido. Metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (MNTG) foi tratada para ter uma concentração final de 50 μg/ml, e, em seguida, deixada a 37 °C durante 20 minutos para preparar as bibliotecas de mutantes com uma taxa de sobrevivência de cerca de 2,5 %.[073] ABKO strains were grown in 60 ml of CGM liquid (Clostridium Growth Medium) (0.75 g/L K2HPO4, 0.75 g/L KH2PO4, 0.7 g/L, MgSO4 7H2O, 0.017 g/L of MnSO4 5H2O, 0.01 g/L, FeSO4 7H2O, 2 g/L of (NH4)2SO2, 1 g/L of NaCl, 2 g/L of asparagine, 0.004 g/L of p-aminobenzoic acid , 5 g/L yeast extract, 4.08 g/L CH3COONa 3H2O, and 80 g/L glucose) at 37 °C under anaerobic conditions, until the absorbance at 600 nm reaches 0.5 (i.e., OD600 = 0.5). The culture solution was centrifuged at 7000 g for 10 minutes at 4 °C. The cell pellets were washed with CGM liquids three times, and then resuspended in 50 ml of CGM liquid. Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNTG) was treated to have a final concentration of 50 μg/ml, and then left at 37 °C for 20 minutes to prepare mutant libraries with a survival rate of around 2.5%.

[074] <1-2> Seleção de cepas possuindo tolerância contra o hidrolisado lignocelulósico[074] <1-2> Selection of strains having tolerance against lignocellulosic hydrolyzate

[075] Cepas preparadas no exemplo <1-1> acima por mutação aleatória foram diluídas. As cepas diluídas foram semeadas em CGMS 2000 sólidos (ou seja, 2000x) preparados por substituição da glicose pelo hidrolisado lignocelulósico para formar cerca de 100 colônias. As cepas mutantes aleatórias formadas nos meios sólidos listrados foram cultivadas sob as mesmas condições que no <1-1> durante cerca de 2 dias, e 20 colônias que sobreviveram com tolerância foram selecionadas.[075] Strains prepared in example <1-1> above by random mutation were diluted. The diluted strains were plated on solid CGMS 2000 (i.e., 2000x) prepared by replacing glucose with lignocellulosic hydrolyzate to form about 100 colonies. Random mutant strains formed on the striped solid media were grown under the same conditions as in <1-1> for about 2 days, and 20 colonies that survived tolerably were selected.

[076] <1-3> Avaliação da produtividade de butanol de cepas possuindo tolerância contra o hidrolisado lignocelulósico[076] <1-3> Assessment of butanol productivity of strains having tolerance against lignocellulosic hydrolyzate

[077] Uma vez que as 20 cepas mutantes aleatórias selecionadas em <12> podem perder a produtividade de butanol durante a mutagênese, os mutantes que mantêm a produtividade de butanol foram selecionados por meio do cultivo líquido.[077] Since the 20 random mutant strains selected in <12> can lose butanol productivity during mutagenesis, mutants that maintain butanol productivity were selected through liquid cultivation.

[078] Tubos de ensaio descartáveis (Falcon, US), incluindo 40 ml de CGM e 5 g/L de CaCO3 foram inoculados com 20 cepas com tolerância contra o hidrolisado lignocelulósico selecionado em <1-2>, e, em seguida, cultivadas a 37 °C sob condições anaeróbicas estabelecidas em <1-1> por 36 horas, para identificar a produtividade do butanol. Análise do butanol foi realizada por cromatografia em fase gasosa (Agilent, EUA). As condições de análise estão apresentadas na Tabela 1.[078] Disposable test tubes (Falcon, US) including 40 ml of CGM and 5 g/L of CaCO3 were inoculated with 20 strains with tolerance against the lignocellulosic hydrolyzate selected in <1-2>, and then cultured at 37 °C under anaerobic conditions set at <1-1> for 36 hours, to identify butanol productivity. Butanol analysis was performed by gas chromatography (Agilent, USA). The analysis conditions are presented in Table 1.

[079] Além disso, a análise dos açúcares foi realizada por cromatografia líquida, em que solução 0,01N de H2SO4 foi usada como fase móvel e Aminex87H (Bio-Rad, EUA) foi usada como coluna. [079] Furthermore, the analysis of sugars was carried out by liquid chromatography, in which 0.01N H2SO4 solution was used as the mobile phase and Aminex87H (Bio-Rad, USA) was used as the column.

[080] Os resultados da análise são mostrados na Fig. 1, em que o grupo de controle é a cepa ABKO. 20 cepas mutantes aleatórias que tem tolerância contra substâncias inibidoras do crescimento de microrganismos em um hidrolisado lignocelulósico foram selecionadas e designadas como TM1-1 a TM1-20 (Fig. 1). Entre elas, a cepa mutante TM1-3 que tem a mais alta produtividade de butanol foi usada em experiências subsequentes.[080] The results of the analysis are shown in Fig. 1, in which the control group is the ABKO strain. 20 random mutant strains that have tolerance against substances inhibiting the growth of microorganisms in a lignocellulosic hydrolyzate were selected and designated as TM1-1 to TM1-20 (Fig. 1). Among them, the mutant strain TM1-3 which has the highest butanol productivity was used in subsequent experiments.

[081] Fig. 2 mostra TM1-3 em comparação com um grupo de controle após cultivo durante 2 dias em CGM sólido preparado pela substituição da glicose pelo hidrolisado lignocelulósico, em que o grupo de controle é ABKO. Pode ser visto na Fig. 2 que o grupo controle no cultivo durante 2 dias mostrou nenhum crescimento pelo hidrolisado lignocelulósico, especificamente as substâncias inibidoras do crescimento de microrganismos em um hidrolisado lignocelulósico, enquanto TM1-3 cresceram normalmente.[081] Fig. 2 shows TM1-3 compared to a control group after cultivation for 2 days in solid CGM prepared by replacing glucose with lignocellulosic hydrolyzate, where the control group is ABKO. It can be seen from Fig. 2 that the control group in cultivation for 2 days showed no growth by lignocellulosic hydrolyzate, specifically the growth-inhibiting substances of microorganisms in a lignocellulosic hydrolyzate, while TM1-3 grew normally.

[082] <Exemplo Experimental 2> Seleção de cepas capazes de co- fermentação simultânea de xilose por cultivo em batelada[082] <Experimental Example 2> Selection of strains capable of simultaneous co-fermentation of xylose by batch cultivation

[083] <2-1> mutagênese aleatória[083] <2-1> random mutagenesis

[084] Entre as cepas mutantes preparadas no <Exemplo Experimental 1>, TM1-3 que tem a mais alta produtividade de butanol foi empregada na mutagênese aleatória, construindo assim uma biblioteca de mutantes. O método para a construção da biblioteca de mutantes foi a mesma que a descrita em <1-1>.[084] Among the mutant strains prepared in <Experimental Example 1>, TM1-3 which has the highest butanol productivity was used in random mutagenesis, thus constructing a library of mutants. The method for constructing the mutant library was the same as that described in <1-1>.

[085] <2-2> Seleção de cepas capazes de co-fermentação simultânea da xilose e glicose[085] <2-2> Selection of strains capable of simultaneous co-fermentation of xylose and glucose

[086] Cepas mutantes aleatoriamente preparadas em <2-1> foram diluídas. As cepas diluídas foram riscadas em CGM sólido preparado usando 3 g/L de glicose e 3 g/L de xilose para formar aproximadamente 100 colônias. As cepas mutantes aleatórias formadas nos meios sólidos riscados foram cultivadas sob as mesmas condições que em <1-2> durante cerca de 2 dias. 20 colônias que cresceram rapidamente foram selecionadas e designadas como TM2-1 a TM2-20.[086] Randomly prepared mutant strains at <2-1> were diluted. The diluted strains were streaked onto solid CGM prepared using 3 g/L glucose and 3 g/L xylose to form approximately 100 colonies. The random mutant strains formed on the streaked solid media were grown under the same conditions as in <1-2> for about 2 days. 20 rapidly growing colonies were selected and designated as TM2-1 to TM2-20.

[087] <2-3> Avaliação da produtividade de butanol das cepas capazes da co-fermentação simultânea de xilose e glicose[087] <2-3> Assessment of butanol productivity of strains capable of simultaneous co-fermentation of xylose and glucose

[088] Um vez que as 20 cepas mutantes aleatórias selecionadas em <1-2> poderiam perder a produtividade de butanol durante a mutagênese, mutantes manque tem a produtividade de butanol foram selecionados por meio do cultivo líquido. Um método detalhado para a seleção é como se segue.[088] Since the 20 random mutant strains selected in <1-2> could lose butanol productivity during mutagenesis, mutants lacking butanol productivity were selected through liquid cultivation. A detailed method for selection is as follows.

[089] Tubos descartáveis (Falcon, EUA), incluindo 40 ml de CGM e 5 g/L de CaCO3 foram inoculados com 20 cepas (TM2-1 a TM2-20) preparadas em <2-2>, e em seguida, cultivadas a 37 °C em condições anaeróbicas estabelecidas em <1-1> por 36 horas, para identificar a produtividade do butanol. Análise do butanol foi realizada usando cromatografia em fase gasosa (Agilent, EUA).[089] Disposable tubes (Falcon, USA) including 40 ml of CGM and 5 g/L of CaCO3 were inoculated with 20 strains (TM2-1 to TM2-20) prepared in <2-2>, and then cultured at 37 °C under anaerobic conditions set at <1-1> for 36 hours, to identify butanol productivity. Butanol analysis was performed using gas chromatography (Agilent, USA).

[090] Como resultado, pode ser visto que as cepas mutantes TM2-1, TM2- 16 e TM2-19 mostraram produtividade de butanol semelhante ao do grupo controle TM1-3 (Fig. 3).[090] As a result, it can be seen that the mutant strains TM2-1, TM2-16 and TM2-19 showed butanol productivity similar to that of the control group TM1-3 (Fig. 3).

[091] <2-4> Avaliação da co-fermentação simultânea de glicose e xilose[091] <2-4> Evaluation of simultaneous co-fermentation of glucose and xylose

[092] Entre as cepas tolerantes consideradas como que tem produtividade de butanol semelhante ao do grupo controle em <2-3>, a avaliação da co- fermentação simultânea de glicose e xilose foi realizada para as cepas TM2-1, TM2-16 e TM2-19 por fermentação em batelada. Um meio contendo tem CGM líquido e açúcares misturados (45 g/L de glicose, 20 g/L de xilose; proporção de xilose de cerca de 30 % em peso) foi usado como o meio de fermentação. Análise dos açúcares foi realizada usando cromatografia líquida.[092] Among the tolerant strains considered to have butanol productivity similar to that of the control group at <2-3>, the evaluation of the simultaneous co-fermentation of glucose and xylose was carried out for strains TM2-1, TM2-16 and TM2-19 by batch fermentation. A medium containing liquid CGM and mixed sugars (45 g/L glucose, 20 g/L xylose; xylose proportion of about 30 wt%) was used as the fermentation medium. Sugar analysis was performed using liquid chromatography.

[093] Os resultados são mostrados na Fig. 4 a-e. Entre as cepas, foi determinado que a cepa TM2-1 foi excelente em termos de co-fermentação simultânea de glicose e xilose.[093] The results are shown in Fig. 4 a-e. Among the strains, it was determined that strain TM2-1 was excellent in terms of simultaneous co-fermentation of glucose and xylose.

[094] A produtividade de butanol e co-fermentação simultânea da cepa TM2-1 foram avaliadas usando açúcares misturados contendo tem 40 %, em peso, de xilose (28 g/L de xilose/42 g/L de glicose).[094] The butanol productivity and simultaneous co-fermentation of strain TM2-1 were evaluated using mixed sugars containing 40% by weight of xylose (28 g/L xylose/42 g/L glucose).

[095] Os resultados são mostrados na Fig. 5. Pode ser encontrado que a cepa TM2-1 mostrou proporção muito elevada de metabolismo da xilose atingindo 31 % em Total de açúcares metabolizados (40,9 g/L de glicose, 19,0 g/L de xilose), mesmo quando os açúcares misturados contendo tem uma alta concentração de xilose foi usado durante 21 horas. Nomeadamente, cerca de 68 % da xilose introduzida durante 21 horas (28 g/L) foi convertida em ABE por co-fermentação simultânea.[095] The results are shown in Fig. 5. It can be found that strain TM2-1 showed a very high proportion of xylose metabolism reaching 31% in Total metabolized sugars (40.9 g/L glucose, 19.0 g/L of xylose), even when the mixed sugars containing has a high concentration of xylose was used for 21 hours. Namely, about 68% of the xylose introduced during 21 hours (28 g/L) was converted into ABE by simultaneous co-fermentation.

[096] A cepa TM2-1 foi depositada em 9 de Junho de 2014, com o Organismo Internacional Depositário de Patentes, Coleção Coreana para Tipos de Cultura (KCTC) com um número de depósito KCTC 12604BP e um nome designado “TM-2-1C”. Daqui em diante, as experiências de co-fermentação simultânea de açúcares misturados foram realizadas usando a cepa TM2-1-C.[096] Strain TM2-1 was deposited on June 9, 2014, with the International Patent Depository Office, Korean Collection for Culture Types (KCTC) with a filing number KCTC 12604BP and a name designated “TM-2- 1C”. Hereafter, simultaneous co-fermentation experiments of mixed sugars were carried out using strain TM2-1-C.

[097] <Exemplo Experimental 3> Preparação da cepa TM2-1-C (E1AB)[097] <Experimental Example 3> Preparation of strain TM2-1-C (E1AB)

[098] Com base na descrição dos pedidos internacionais de patente PCT/KR2013/001951 e PCT/KR2013/001954, foi preparado o pGS1-E1 AB.[098] Based on the description of international patent applications PCT/KR2013/001951 and PCT/KR2013/001954, pGS1-E1 AB was prepared.

[099] De acordo com estas publicações, quando gene adhE1 (aldeído álcool desidrogenase) e gene ctfAB (Co-A transferase) foram sobre expressos na cepa ABKO (Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta △buk), foi relatado que a produtividade do etanol foi reduzida enquanto a produtividade do butanol foi aumentada. Consequentemente, a co-fermentação simultânea de açúcares misturados no hidrolisado lignocelulósico, e a produtividade do butanol, acetona e etanol foram avaliadas pela sobre expressão dos genes adhE1 e gene ctfAB na cepa TM2-1-C.[099] According to these publications, when adhE1 gene (aldehyde alcohol dehydrogenase) and ctfAB gene (Co-A transferase) were overexpressed in the ABKO strain (Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta △buk), it was reported that ethanol productivity was reduced while butanol productivity was increased. Consequently, the simultaneous co-fermentation of sugars mixed in the lignocellulosic hydrolyzate, and the productivity of butanol, acetone and ethanol were evaluated by overexpression of the adhE1 genes and ctfAB gene in the TM2-1-C strain.

[100] <3-1> Preparação do plasmídeo pGS1-E1AB[100] <3-1> Preparation of plasmid pGS1-E1AB

[101] Clostridium acetobutylicum ATCC 824 foi riscado em RCM sólido, seguido por cultivo anaeróbico, durante 24 horas. Uma colônia selecionada a partir do meio sólido riscado foi cultivada em 3 ml de um meio de cultura líquido, durante 18 horas, seguida por centrifugação da solução de cultivo para obter as células. As células foram lavadas com 10 ml de tampão Tris, seguido por purificação usando um kit de purificação de ADN Wizard Genomic (fabricado pela Promega Corp., EUA) para isolar os cromossomos da cepa.[101] Clostridium acetobutylicum ATCC 824 was streaked onto solid RCM, followed by anaerobic cultivation for 24 hours. A colony selected from the streaked solid medium was cultivated in 3 ml of a liquid culture medium for 18 hours, followed by centrifugation of the culture solution to obtain the cells. Cells were washed with 10 ml of Tris buffer, followed by purification using a Wizard Genomic DNA purification kit (manufactured by Promega Corp., USA) to isolate the strain chromosomes.

[102] O gene adhE1 (SEQ ID NO: 1) foi amplificado usando iniciadores AdhE1-UP-PstI (SEQ ID NO: 2) e AdhE1-DN-XhoI (SEQ ID NO: 3) e usando o cromossomo isolado como um molde (Tabela 2). 100 μl da mistura reacional de PCR foi preparado através da adição de dNTP 250 μM, 20 pmol de cada iniciador, 1,5 mM de MgCl2, 10 μl de tampão 10, 100 ng de molde de ADN, e 1 unidade de polimerase Pfu. Na reação de PCR, a reação foi repetida 30 ciclos consistidos de desnaturação inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguido por desnaturação a 95 °C durante um minuto, emparelhamento a 50 °C durante um minuto e, em seguida, a polimerização a 72 °C durante um minuto. O gene amplificado foi purificado em um gel de agarose a 1 % e, em seguida digerido com enzimas de restrição PstI e Xhol para clivar um fragmento de ADN. O fragmento de ADN digerido foi ligado ao pGS1-MCS (PCT/KR2013/001951 e PCT/KR2013/001954) digerido com as mesmas enzimas de restrição, para a construção do pGS1-AdhE1 (Fig. 6).[102] The adhE1 gene (SEQ ID NO: 1) was amplified using primers AdhE1-UP-PstI (SEQ ID NO: 2) and AdhE1-DN-XhoI (SEQ ID NO: 3) and using the isolated chromosome as a template (Table 2). 100 μl of the PCR reaction mixture was prepared by adding 250 μM dNTP, 20 pmol of each primer, 1.5 mM MgCl2, 10 μl of buffer 10, 100 ng of DNA template, and 1 unit of Pfu polymerase. In the PCR reaction, the reaction was repeated 30 cycles consisting of initial denaturation at 95°C for 5 minutes, followed by denaturation at 95°C for one minute, annealing at 50°C for one minute, and then polymerization at 72°C for one minute. The amplified gene was purified on a 1% agarose gel and then digested with PstI and XhoI restriction enzymes to cleave a DNA fragment. The digested DNA fragment was ligated to pGS1-MCS (PCT/KR2013/001951 and PCT/KR2013/001954) digested with the same restriction enzymes, to construct pGS1-AdhE1 (Fig. 6).

[103] TABELA 2 [103] TABLE 2

[104] Por outro lado, pGS1-CtfAB foi preparado através da introdução do gene ctfAB no vetor pGS1-MCS (BglII), o qual está descrito em PCT/KR2013/001951 e PCT/KR2013/001954. Inicialmente, o gene ctfAB (SEQ ID NO: 4) foi amplificado usando iniciadores CtfAB-UP-BglII (SEQ ID NO: 5) e CtfAB-DN-EcoRI (SEQ ID NO: 6) e usando o cromossomo isolado de Clostridium acetobutylicum ATCC824 como um molde, e clonado em pGS1- MCS para preparar o pGS1-CtfAB (Tabela 3, Fig. 7).[104] On the other hand, pGS1-CtfAB was prepared by introducing the ctfAB gene into the vector pGS1-MCS (BglII), which is described in PCT/KR2013/001951 and PCT/KR2013/001954. Initially, the ctfAB gene (SEQ ID NO: 4) was amplified using primers CtfAB-UP-BglII (SEQ ID NO: 5) and CtfAB-DN-EcoRI (SEQ ID NO: 6) and using the chromosome isolated from Clostridium acetobutylicum ATCC824 as a template, and cloned into pGS1-MCS to prepare pGS1-CtfAB (Table 3, Fig. 7).

[105] Depois disso, o gene ctfAB foi amplificado por PCR usando os iniciadores THL-UP-XhoI (SEQ ID NO: 7) e CtfAB-DN-EcoRI (SEQ ID NO: 6) e usando pGS1-CtfAB como um modelo. O gene ctfAB amplificado foi purificado em um gel de agarose a 1 %, e digerido com as enzimas de restrição Xhol e EcoRI para clivar um fragmento de ADN. O ADN clivado foi o ligado a um vetor pGS1-ATdhE1 digerido com as mesmas enzimas de restrição para preparar pGS1-E1AB (Fig. 8). [105] After that, the ctfAB gene was amplified by PCR using the primers THL-UP-XhoI (SEQ ID NO: 7) and CtfAB-DN-EcoRI (SEQ ID NO: 6) and using pGS1-CtfAB as a template. The amplified ctfAB gene was purified on a 1% agarose gel, and digested with the restriction enzymes XhoI and EcoRI to cleave a DNA fragment. The cleaved DNA was ligated into a pGS1-ATdhE1 vector digested with the same restriction enzymes to prepare pGS1-E1AB (Fig. 8).

[106] <3-2> Preparação da cepa TM2-1-C (pGS1-E1AB)[106] <3-2> Preparation of strain TM2-1-C (pGS1-E1AB)

[107] A cepa TM2-1-C foi cultivada em 60 ml de CGM líquido (Meio de Crescimento de Clostridium) (0,75 g/L de K2HPO4, 0,75 g/L de KH2PO4, 0,7 g/L, MgSO4 7H2O, 0,017 g/L de MnSO4 5H2O, 0,01 g/L, FeSO4 7H2O, 2 g/L de (NH4)2SO2, 1 g/L de NaCl, 2 g/l de asparagina, 0,004 g/L de ácido p- aminobenzóico, 5 g/L de extrato de levedura, 4,08 g/L CH3COONa 3H2O, e 80 g/L de glicose), sob condições anaeróbicas, até a absorbância a 600 nm atingir 0,5 (ou seja, OD600 = 0,5). A solução de cultivo foi deixada em gelo durante 10 minutos e, em seguida, centrifugada a 7000 g durante 10 minutos a 4 °C. Os sedimentos celulares foram lavados com uma solução tampão de eletroporação três vezes, e depois ressuspendidos em 2 ml da mesma solução tampão para a produção de células para a transformação. Para 500 μL das células assim preparadas para transformação, 2,0 μg do plasmídeo pGS1- E1AB preparado em <3-1> foi adicionado seguida por eletroporação (cuveta de 4 mm, 2,5 kV, WQ. 25μF) utilizando um Gene Pulser II fabricado pela Bio-Rad Corporation. Em seguida, as células foram cultivadas anaerobicamente em um meio com antibióticos para obter a cepa transformada TM2-1-C (pGS1-E1AB).[107] Strain TM2-1-C was grown in 60 ml of liquid CGM (Clostridium Growth Medium) (0.75 g/L K2HPO4, 0.75 g/L KH2PO4, 0.7 g/L , MgSO4 7H2O, 0.017 g/L MnSO4 5H2O, 0.01 g/L, FeSO4 7H2O, 2 g/L (NH4)2SO2, 1 g/L NaCl, 2 g/L asparagine, 0.004 g/L of p-aminobenzoic acid, 5 g/L of yeast extract, 4.08 g/L CH3COONa 3H2O, and 80 g/L of glucose), under anaerobic conditions, until the absorbance at 600 nm reaches 0.5 (i.e. , OD600 = 0.5). The culture solution was left on ice for 10 minutes and then centrifuged at 7000 g for 10 minutes at 4 °C. Cell pellets were washed with electroporation buffer three times, and then resuspended in 2 ml of the same buffer solution to produce cells for transformation. To 500 μL of the cells thus prepared for transformation, 2.0 μg of the pGS1-E1AB plasmid prepared in <3-1> was added followed by electroporation (4 mm cuvette, 2.5 kV, WQ. 25μF) using a Gene Pulser II manufactured by Bio-Rad Corporation. Then, the cells were cultured anaerobically in a medium with antibiotics to obtain the transformed strain TM2-1-C (pGS1-E1AB).

[108] Como um experimento controle, o plasmídeo pGS1-E1AB foi adicionado à cepa ABKO, que foi então submetido a eletroporação para preparar ABKO (pGS1-E1AB).[108] As a control experiment, plasmid pGS1-E1AB was added to the ABKO strain, which was then electroporated to prepare ABKO (pGS1-E1AB).

[109] <Exemplo Experimental 4> Produção de biobutanol usando cultivo contínuo[109] <Experimental Example 4> Biobutanol production using continuous cultivation

[110] A cepa TM2-1-C (pGS1-E1AB) produzido em <3-2> foi avaliada para a produtividade de biobutanol usando açúcares misturados. Este experimento te a intenção de identificar a produtividade de butanol da cepa usando açúcares misturados pelo cultivo contínuo da cepa TM2-1-C (E1AB) usando o hidrolisado lignocelulósico incluindo os açúcares misturados.[110] Strain TM2-1-C (pGS1-E1AB) produced in <3-2> was evaluated for biobutanol productivity using mixed sugars. This experiment is intended to identify the butanol productivity of the strain using mixed sugars by continuous cultivation of the TM2-1-C (E1AB) strain using the lignocellulosic hydrolyzate including the mixed sugars.

[111] Uma solução de alimentação para realização da fermentação em batelada alimentada foi preparada como se segue. Inicialmente, para o concentrado de hidrolisado lignocelulósico preparado anteriormente em que a concentração de açúcares misturados é de cerca de 200 g/l, 3 % (p/v) de licor de milho, um meio líquido (MgSO4 7H∑O, 0,017 g/L de MnSO4 5H2O , 0,01 g/L, FeSO4 7H2O, 1 g/L de NaCl) e água foram adicionados de tal modo que concentração final de açúcar foi ajustada a cerca de 150 g/L, preparando desse modo uma solução de alimentação. A solução de alimentação foi injetada em uma incubadora, ajustando a concentração final de glicose a 2 g/L ou menos. As garrafas de vidro, incluindo a solução de alimentação foram ligadas a um fermentador por um tubo de silicone, e em seguida foi proporcionada uma bomba que permite a injeção contínua de glicose. Com um intervalo de tempo de 1-1,5 horas, a concentração de glicose foi medida por HPLC, e, consequentemente, a velocidade de injeção da solução de glicose foi ajustada. Quando a concentração de glicose é mantida a 2 g/L ou menos, a quantidade de açúcares perdidos com o descarte da solução de cultivo durante a fermentação contínua como definido abaixo é minimizada, aumentando deste modo o rendimento. Quando a concentração de açúcares na solução de cultivo é elevada e a concentração de açúcares perdidos com a solução de cultivo descartada é também elevada, a quantidade de açúcares sendo convertidos em butanol é geralmente reduzida, reduzindo deste modo o rendimento. Além disso, quando a concentração de glicose é mantida baixa, a inibição por glicose do metabolismo de outros açúcares misturados (CCR, repressão catabólica de carbono) pode ser atenuada.[111] A feed solution for carrying out fed-batch fermentation was prepared as follows. Initially, for the previously prepared lignocellulosic hydrolyzate concentrate in which the concentration of mixed sugars is about 200 g/l, 3% (w/v) corn liquor, a liquid medium (MgSO4 7H∑O, 0.017 g/ L of MnSO4 5H2O, 0.01 g/L, FeSO4 7H2O, 1 g/L of NaCl) and water were added such that final sugar concentration was adjusted to about 150 g/L, thereby preparing a sugar solution. food. The feed solution was injected into an incubator, adjusting the final glucose concentration to 2 g/L or less. The glass bottles including the feed solution were connected to a fermenter by a silicone tube, and then a pump was provided that allows continuous injection of glucose. With a time interval of 1-1.5 hours, the glucose concentration was measured by HPLC, and consequently the injection rate of the glucose solution was adjusted. When the glucose concentration is maintained at 2 g/L or less, the amount of sugars lost from discarding the culture solution during continuous fermentation as defined below is minimized, thereby increasing yield. When the concentration of sugars in the culture solution is high and the concentration of sugars lost with the discarded culture solution is also high, the amount of sugars being converted to butanol is generally reduced, thereby reducing yield. Furthermore, when the glucose concentration is kept low, glucose inhibition of the metabolism of other mixed sugars (CCR, carbon catabolic repression) can be attenuated.

[112] Além disso, uma incubadora para o processo de cultura contínua foi fabricado em conformidade com o pedido coreano de patente n. 10-20120038770. Inicialmente, nas extremidades superior e inferior de uma coluna de 3 L, um filtro com um tamanho de poro de cerca de 150 μm foi fornecido, a fim de evitar a perda de um adsorvente, seguido de proporcionar um agitador, e, em seguida, 300 g de carga de um agente adsorvente. Duas colunas foram preparadas. Estas colunas foram ligadas à incubadora por um tubo de silicone, seguido pelo fornecimento de uma bomba, permitindo assim que uma solução de cultivo seja circulada entre as colunas. À medida que a entrada e a saída para as colunas, as válvulas de 4 vias foram fornecidas de tal forma que, no decurso da cultura, as colunas podem ser submetidas a desabsorção em tempo real, através da introdução de um solvente para a eluição quando o adsorvente nas colunas foi saturado com butanol e mistura de solventes. No caso em que a primeira coluna foi submetida à desabsorção, a solução de cultivo foi fornecida à segunda coluna de modo a que a solução de cultivo foi circulada continuamente. A solução de cultivo foi circulada a partir do topo para o fundo da coluna, mas a direção não é particularmente limitada. A cepa TM2- 1-C (pGS1-E1AB) foi cultivada no incubador produzido acima.[112] Furthermore, an incubator for the continuous culture process was manufactured in accordance with Korean patent application no. 10-20120038770. Initially, at the upper and lower ends of a 3 L column, a filter with a pore size of about 150 μm was provided in order to prevent the loss of an adsorbent, followed by providing a stirrer, and then 300 g load of an adsorbing agent. Two columns were prepared. These columns were connected to the incubator by a silicone tube, followed by the supply of a pump, thus allowing a culture solution to be circulated between the columns. As the inlet and outlet to the columns, 4-way valves have been provided such that, in the course of culture, the columns can be subjected to desorption in real time, by introducing a solvent for elution when the adsorbent in the columns was saturated with butanol and solvent mixture. In the case where the first column was subjected to desorption, the cultivation solution was supplied to the second column so that the cultivation solution was circulated continuously. The cultivation solution was circulated from the top to the bottom of the column, but the direction is not particularly limited. Strain TM2-1-C (pGS1-E1AB) was grown in the incubator produced above.

[113] Para a incubadora, 2,6 L de um meio contendo tem cerca de 50 g/L de hidrolisado lignocelulósico concentrado foi carregado. O meio contendo tem o hidrolisado lignocelulósico foi inoculado com 600 ml de TM2-1-C (pGS1- E1AB), que foi cultivadas anaerobicamente em CGM líquido, para iniciar o cultivo. Após o início da cultura, a solução de cultivo retirada da incubadora foi transferida para uma primeira coluna, em que a solução de cultivo foi circulada pela passagem através da primeira coluna com uma taxa de fluxo de 100 mL/min através de uma bomba quando a concentração de butanol se tornou cerca de 6 g/L a 8 g/L. À medida que a solução de cultivo passada através da primeira coluna, o adsorvente foi suspenso na solução de cultivo para formar uma fase de suspensão diluída, o que impediu a flocagem da solução de cultivo, passando assim através da coluna. A concentração de butanol foi mantida a 8 g/L ou menos, tomando amostras de solução de cultivo imediatamente antes e após a passagem através da coluna e monitoração da concentração. O cultivo foi realizado por fermentação contínua durante 162,5 horas.[113] To the incubator, 2.6 L of a medium containing about 50 g/L of concentrated lignocellulosic hydrolyzate was charged. The medium containing the lignocellulosic hydrolyzate was inoculated with 600 ml of TM2-1-C (pGS1-E1AB), which was grown anaerobically in liquid CGM, to begin cultivation. After starting the culture, the culture solution taken from the incubator was transferred to a first column, in which the culture solution was circulated by passing through the first column at a flow rate of 100 mL/min through a pump when the Butanol concentration became about 6 g/L to 8 g/L. As the cultivation solution passed through the first column, the adsorbent was suspended in the cultivation solution to form a dilute suspension phase, which prevented the cultivation solution from flocking, thus passing through the column. The butanol concentration was maintained at 8 g/L or less by taking samples of the culture solution immediately before and after passing through the column and monitoring the concentration. Cultivation was carried out by continuous fermentation for 162.5 hours.

[114] Como resultado, entre os açúcares misturados introduzidos como solução de alimentação, a xilose foi adicionada até 957,3 g em que apenas cerca de 31 g de xilose foi mantida em um resto da solução de cultivo, a solução de cultivo descartada e solução solvente de desabsorção, e a outra xilose foi convertida em mistura de solventes (ABE). A partir desta, pode ser visto que a xilose mostrou 97 % de co-fermentação simultânea. Além disso, arabinose que é uma pentose mostrou 100 % de co-fermentação simultânea. A celobiose foi introduzido até 383,2 g, em que cerca de 363.8g de celobiose foi convertida em uma mistura de solventes (ABE) e uma quantidade de cerca de 19,4 g de celobiose é mantida em um resto da solução de cultivo, solução de cultivo descartada e solução de solvente de desabsorção. A partir desta, pode ser visto que a celobiose é capaz de 95 % ou mais de co-fermentação simultânea (Fig. 9, Tabela 4).[114] As a result, among the mixed sugars introduced as feed solution, xylose was added up to 957.3 g in which only about 31 g of xylose was retained in a remainder of the culture solution, the culture solution discarded and desorption solvent solution, and the other xylose was converted into solvent mixture (ABE). From this it can be seen that xylose showed 97% simultaneous co-fermentation. Furthermore, arabinose which is a pentose showed 100% simultaneous co-fermentation. Cellobiose was introduced up to 383.2 g, in which about 363.8 g of cellobiose was converted into a solvent mixture (ABE) and an amount of about 19.4 g of cellobiose is maintained in a remainder of the cultivation solution, discarded cultivation solution and desorption solvent solution. From this it can be seen that cellobiose is capable of 95% or more simultaneous co-fermentation (Fig. 9, Table 4).

[115] Como grupo controle, o mesmo experimento foi realizado usando ABKO (pGS1-E1AB). No entanto, uma vez que ABKO (pGS1-E1AB) não tem tolerância contra substâncias inibidoras de microrganismos no hidrolisado lignocelulósico, o cultivo foi substancialmente impossível. [115] As a control group, the same experiment was performed using ABKO (pGS1-E1AB). However, since ABKO (pGS1-E1AB) has no tolerance against microorganism-inhibiting substances in lignocellulosic hydrolyzate, cultivation was substantially impossible.

[116] Total de açúcares misturados introduzido: açúcares misturados introduzidos como uma solução de alimentação[116] Total mixed sugars introduced: mixed sugars introduced as a feed solution

[117] A quantidade total de açúcares restantes: açúcares presentes em um resto de solução de cultivo, solução de cultivo descartada e o líquido solvente-desabsorção.[117] The total amount of remaining sugars: sugars present in a remaining culture solution, discarded culture solution, and the solvent-desorption liquid.

[118] Razão de co-fermentação simultânea = {(Total de açúcares introduzido (g) - quantidade total de açúcares restantes (g))/Total de açúcares introduzido (g)} x 100[118] Simultaneous co-fermentation ratio = {(Total sugars introduced (g) - total amount of sugars remaining (g))/Total sugars introduced (g)} x 100

[119] Solução de cultivo descartada: líquido fermentado retirado do fermentador em proporção à quantidade da solução de alimentação introduzida durante a co-fermentação contínua[119] Discarded culture solution: fermented liquid removed from the fermenter in proportion to the amount of feed solution introduced during continuous co-fermentation

[120] Líquido solvente de desabsorção: Líquido gerado a partir de desabsorção da coluna através de vapor, quando um adsorvente é saturado por acetona, butanol e etanol (ABE) adsorvente, como produtos de fermentação[120] Solvent desorption liquid: Liquid generated from column desorption through steam when an adsorbent is saturated by acetone, butanol and ethanol (ABE) adsorbent, such as fermentation products

[121] Proporção da açúcares misturados (%) = {(quantidade total de cada açúcar introduzido (g)/Total de açúcares introduzido (g)} X 100[121] Proportion of mixed sugars (%) = {(total amount of each sugar introduced (g)/Total sugar introduced (g)}

[122] Ex) Proporção de xilose na açúcares misturados = {quantidade total de xilose introduzida 957,32 (g)/quantidade total de açúcares introduzido 3.963 (g)} X 100 = 24,16 %[122] Ex) Proportion of xylose in mixed sugars = {total amount of xylose introduced 957.32 (g)/total amount of sugars introduced 3,963 (g)}

[123] Análise dos produtos fermentados adsorvidos para o adsorvente na coluna mostrou que TM2-1-C (pGS1-E1AB) realizou co-fermentação simultânea usando açúcares misturados, como um solvente misto, manque tem a tolerância contra as substâncias inibidoras incluídas na açúcares misturados no hidrolisado lignocelulósico, e, assim, conseguido um rendimento de 33,9 %, produtividade de 2,8 g/L/h, e seletividade de butanol de 79,3 %. A cepa exibiu excelente desempenho em comparação com quaisquer outras cepas capazes de co-fermentação simultânea da açúcares misturados relatados até agora (Tabela 5). [123] Analysis of the fermented products adsorbed to the adsorbent in the column showed that TM2-1-C (pGS1-E1AB) performed simultaneous co-fermentation using mixed sugars, as a mixed solvent, which has tolerance against the inhibitory substances included in the sugars. mixed in the lignocellulosic hydrolyzate, and thus achieved a yield of 33.9%, productivity of 2.8 g/L/h, and butanol selectivity of 79.3%. The strain exhibited excellent performance compared to any other strains capable of simultaneous co-fermentation of mixed sugars reported so far (Table 5).

[124] <Número de depósi to>[124] <Deposit number>

[125] Organismo Internacional Depositário de Patentes: Coleção Coreana de Tipo de Cultura (KCTC)[125] International Patent Depository Body: Korean Crop Type Collection (KCTC)

[126] Número de depósito: 12604 BP KCTC[126] Deposit number: 12604 BP KCTC

[127] Data de depósito: 10/06/2014[127] Deposit date: 06/10/2014

Claims (15)

1. Microrganismo capaz de co-fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico e com capacidade de produzir butanol, caracterizado por o microrganismo ser Clostridium acetobutylicum TM2-1-C (número de acesso KCTC 12604BP).1. Microorganism capable of simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate and capable of producing butanol, characterized by the microorganism being Clostridium acetobutylicum TM2-1-C (accession number KCTC 12604BP). 2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo ter tolerância contra o hidrolisado lignocelulósico.2. Microorganism according to claim 1, characterized in that the microorganism has tolerance against the lignocellulosic hydrolyzate. 3. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo ter capacidade de co-fermentação simultânea de glicose e xilose.3. Microorganism, according to claim 1, characterized in that the microorganism has the capacity for simultaneous co-fermentation of glucose and xylose. 4. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, quando o microrganismo é cultivado sob condições de batelada na presença de glicose e xilose, 30% ou mais do açúcar metabolizado ser xilose e a produtividade de butanol ser de 1,0 g / L / h ou mais.4. Microorganism according to claim 1, characterized in that, when the microorganism is cultivated under batch conditions in the presence of glucose and xylose, 30% or more of the metabolized sugar is xylose and the butanol productivity is 1.0 g / L / h or more. 5. Microrganismo recombinante, que tem uma produtividade melhorada de butanol em comparação ao Clostridium acetobutylicum TM2-1-C, caracterizado por o microrganismo recombinante ser preparado a partir do Clostridium acetobutylicum TM2-1-C, promovendo uma via de conversão de butiril-CoA em butanol ou uma via de conversão de butirato em butiril-CoA, a via que converte butiril-CoA em butanol ser promovida pelo aumento da atividade aldeído / álcool desidrogenase em comparação com Clostridium acetobutylicum TM2-1-C pela introdução de um gene adhE que codifica uma desidrogenase aldeído / álcool, e a via que converte o butirato em butiril-CoA ser promovida pela atividade aumentada da CoA-transferase em comparação com Clostridium acetobutylicum TM2-1-C pela introdução de um gene ctfAB que codifica uma CoA-transferase.5. Recombinant microorganism, which has an improved butanol productivity compared to Clostridium acetobutylicum TM2-1-C, characterized in that the recombinant microorganism is prepared from Clostridium acetobutylicum TM2-1-C, promoting a butyryl-CoA conversion pathway to butanol or a pathway converting butyrate to butyryl-CoA, the pathway that converts butyryl-CoA to butanol be promoted by increased aldehyde/alcohol dehydrogenase activity compared to Clostridium acetobutylicum TM2-1-C by the introduction of an adhE gene that encodes an aldehyde/alcohol dehydrogenase, and the pathway that converts butyrate to butyryl-CoA is promoted by increased CoA-transferase activity compared to Clostridium acetobutylicum TM2-1-C by the introduction of a ctfAB gene encoding a CoA-transferase. 6. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o microrganismo recombinante ter capacidade de co- fermentação simultânea de dois ou mais açúcares em um hidrolisado lignocelulósico.6. Recombinant microorganism, according to claim 5, characterized in that the recombinant microorganism has the capacity for simultaneous co-fermentation of two or more sugars in a lignocellulosic hydrolyzate. 7. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o microrganismo recombinante ter capacidade de co- fermentação simultânea de glicose e pelo menos um açúcar selecionado de entre o grupo que consiste em xilose, arabinose e celobiose.7. Recombinant microorganism according to claim 5, characterized in that the recombinant microorganism is capable of simultaneous co-fermentation of glucose and at least one sugar selected from the group consisting of xylose, arabinose and cellobiose. 8. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a seletividade ao butanol ser de 70 % ou mais com base no cultivo em batelada alimentada.8. Recombinant microorganism according to claim 5, characterized in that the selectivity to butanol is 70% or more based on fed-batch cultivation. 9. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a seletividade à acetona ser menor que 20 % com base no cultivo em batelada alimentada.9. Recombinant microorganism, according to claim 5, characterized in that the selectivity to acetone is less than 20% based on fed-batch cultivation. 10. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a seletividade ao etanol ser menor que 20 % com base no cultivo em batelada alimentada.10. Recombinant microorganism, according to claim 5, characterized in that the selectivity to ethanol is less than 20% based on fed-batch cultivation. 11. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a produtividade de butanol ser de 0,5 g/L/h ou mais com base no cultivo em batelada alimentada.11. Recombinant microorganism according to claim 5, characterized in that the butanol productivity is 0.5 g/L/h or more based on fed-batch cultivation. 12. Método para a produção de butanol, caracterizado por compreender: a preparação de um meio que compreende dois ou mais açúcares; inoculação do meio com o microrganismo de acordo com a reivindicação 1; e cultivo do microrganismo.12. Method for producing butanol, characterized by comprising: preparing a medium comprising two or more sugars; inoculating the medium with the microorganism according to claim 1; and cultivation of the microorganism. 13. Método para a produção de butanol caracterizado por compreender: a preparação de um meio incluindo dois ou mais açúcares; inoculação do meio com o microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 5; e cultivo do microrganismo recombinante.13. Method for producing butanol characterized by comprising: the preparation of a medium including two or more sugars; inoculating the medium with the recombinant microorganism according to claim 5; and cultivation of the recombinant microorganism. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por os dois ou mais açúcares compreenderem glicose e pelo menos um açúcar selecionado de entre o grupo que consiste em xilose, arabinose e celobiose.14. Method according to claim 13, characterized in that the two or more sugars comprise glucose and at least one sugar selected from the group consisting of xylose, arabinose and cellobiose. 15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o meio compreender um hidrolisado lignocelulósico.15. Method according to claim 13, characterized in that the medium comprises a lignocellulosic hydrolyzate.
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