BR102016001728B1

BR102016001728B1 - METHOD OF PRODUCING A SUPERIOR ALCOHOL AND USE OF A REACTION MIXTURE COMPRISING A MIXED CULTURE OF A FIRST AND A SECOND MICRO-ORGANISM

Info

Publication number: BR102016001728B1
Application number: BR102016001728-9A
Authority: BR
Inventors: Thomas Haas; Thomas Bülter; Martin Demler
Original assignee: Evonik Operations Gmbh
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2023-07-04

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ÁLCOOIS SUPERIORES. A presente invenção se refere a uma mistura de reação e a um método de produção de pelo menos um álcool superior, compreendendo uma mistura de reação que compreende uma cultura mista de um primeiro e um segundo microrganismos em um meio aquoso compreendendo gás monóxido de carbono, em que - o primeiro microrganismo é um microrganismo acetogênico capaz de converter uma fonte de carbono em acetato e/ou etanol; e - o segundo microrganismo é selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri e C. carboxidivorans, capazes de converter o acetato e/ou etanol para formar um ácido; em que o primeiro microrganismo é, adicionalmente, capaz de converter o ácido no álcool superior correspondente e o álcool superior compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono. carboxidivorans, capazes de converter o acetato e/ou etanol para formar um ácido; em que o primeiro microrganismo é, adicionalmente, capaz de converter o ácido no álcool superior correspondente e o álcool superior compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono.METHOD FOR THE PRODUCTION OF SUPERIOR ALCOHOL. The present invention relates to a reaction mixture and a method of producing at least one higher alcohol, comprising a reaction mixture comprising a mixed culture of a first and a second microorganism in an aqueous medium comprising carbon monoxide gas, wherein - the first microorganism is an acetogenic microorganism capable of converting a carbon source into acetate and/or ethanol; and - the second microorganism is selected from the group consisting of Clostridium kluyveri and C. carboxidivorans, capable of converting acetate and/or ethanol to form an acid; wherein the first microorganism is additionally capable of converting the acid to the corresponding higher alcohol and the higher alcohol comprises at least 6 carbon atoms. carboxydivorans, capable of converting acetate and/or ethanol to form an acid; wherein the first microorganism is additionally capable of converting the acid to the corresponding higher alcohol and the higher alcohol comprises at least 6 carbon atoms.

Description

FIELD OF THE INVENTION

[001] A presente invenção se refere a um método biotecnológico de produção de álcoois superiores a partir de uma fonte de carbono. Em particular, a mistura e o método se referem a uma produção biotecnológica de pelo menos um álcool superior, na presença de monóxido de carbono.[001] The present invention relates to a biotechnological method of producing higher alcohols from a carbon source. In particular, the mixture and the method relate to a biotechnological production of at least one higher alcohol, in the presence of carbon monoxide.

FUNDAMENTALS OF THE INVENTION

[002] Álcoois superiores têm vários usos, incluindo serem usados como combustível e em perfumes e na indústria de cosméticos. Por exemplo, hexanol é comumente usado na indústria de perfumes.[002] Higher alcohols have many uses, including being used as fuel and in perfumes and the cosmetics industry. For example, hexanol is commonly used in the perfume industry.

[003] O heptanol, por exemplo, é usado em experiências de eletrofisiologia cardíaca, para bloquear junções de hiato e aumentar a resistência axial entre miócitos. O aumento da resistência axial diminuirá a velocidade de condução e aumentará a suscetibilidade do coração à excitação reentrante e arritmias sustentadas. Além disso, 1-heptanol tem um cheiro agradável e é usado em produtos cosméticos devido a sua fragrância.[003] Heptanol, for example, is used in cardiac electrophysiology experiments to block gap junctions and increase axial resistance between myocytes. Increasing axial resistance will decrease conduction velocity and increase the heart's susceptibility to reentrant excitation and sustained arrhythmias. Furthermore, 1-heptanol has a pleasant smell and is used in cosmetic products because of its fragrance.

[004] Estes álcoois superiores também podem ser usados, no futuro, como combustíveis e podem substituir a gasolina no longo prazo. Por estas razões e mais, já existe um mercado potencial existente para álcoois superiores. Álcoois superiores também são usados como solventes industriais.[004] These higher alcohols can also be used in the future as fuels and can replace gasoline in the long term. For these reasons and more, there is already an existing potential market for higher alcohols. Higher alcohols are also used as industrial solvents.

[005] Atualmente, álcoois superiores são fabricados principalmente a partir do petróleo. Estes compostos são obtidos por craqueamento da gasolina ou petróleo, o que é ruim para o meio ambiente. Além disso, uma vez que os custos destes materiais de partida estão ligados ao preço do petróleo, com o aumento esperado nos preços do petróleo no futuro, o preço de álcoois superiores também poderá aumentar relativamente ao aumento dos preços do petróleo.[005] Currently, higher alcohols are manufactured mainly from petroleum. These compounds are obtained by cracking gasoline or petroleum, which is bad for the environment. Furthermore, since the costs of these starting materials are linked to the price of oil, with the expected increase in oil prices in the future, the price of higher alcohols may also increase relative to the increase in oil prices.

[006] O Processo Alfol® para Álcool é um método usado para a produção de álcoois superiores a partir de etileno, usando um catalisador de organo- alumínio. A reação produz álcoois primários lineares de cadeia longa (C2-C28). O processo usa um catalisador de alumínio para oligomerizar o etileno e permitir que o grupo alquila resultante seja oxigenado. No entanto, este método produz um amplo espectro de álcoois e o padrão de distribuição é mantido. Esse padrão constante limita a capacidade do produtor em produzir apenas o intervalo de álcool específico que tem maior demanda, ou que tem o melhor valor econômico. Além disso, os gases necessários à reação têm de ser muito limpos e é necessária uma composição singular de gases para a reação ser realizada com sucesso.[006] The Alfol® Process for Alcohol is a method used for the production of higher alcohols from ethylene, using an organo-aluminum catalyst. The reaction produces long-chain linear primary alcohols (C2-C28). The process uses an aluminum catalyst to oligomerize the ethylene and allow the resulting alkyl group to be oxygenated. However, this method produces a broad spectrum of alcohols and the distribution pattern is maintained. This constant pattern limits the producer's ability to produce only the specific range of alcohol that is in greatest demand, or that has the best economic value. Furthermore, the gases required for the reaction must be very clean and a unique composition of gases is required for the reaction to be carried out successfully.

[007] O documento WO2009100434 também descreve um método indireto de produção de butanol e hexanol a partir de um carboidrato. O método inclui uma fermentação homoacetogênica para produzir um intermediário de ácido acético, que é então convertido quimicamente a etanol. O etanol e a porção restante do ácido acético intermediário são, então, usados como substrato em uma fermentação acidogênica para produzir intermediários de ácido butírico e ácido capróico que são, então, quimicamente convertidos em butanol e hexanol. No entanto, este método usa matéria-prima de carboidratos cara e tem duas etapas adicionais no processo, a formação de ésteres e a hidrogenação química dos ésteres, o que torna o método não só mais longo, mas também resulta na perda de material útil ao longo do caminho.[007] WO2009100434 also describes an indirect method of producing butanol and hexanol from a carbohydrate. The method includes a homoacetogenic fermentation to produce an acetic acid intermediate, which is then chemically converted to ethanol. The ethanol and the remaining portion of the acetic acid intermediate are then used as a substrate in an acidogenic fermentation to produce butyric acid and caproic acid intermediates which are then chemically converted to butanol and hexanol. However, this method uses expensive carbohydrate feedstock and has two additional steps in the process, the formation of esters and the chemical hydrogenation of the esters, which not only makes the method take longer, but also results in the loss of useful material along the way. along the way.

[008] Perez, J.M., 2012, divulga um método de conversão de ácidos carboxílicos de cadeia curta em seus álcoois correspondentes, na presença de gás de síntese, com o uso do Clostridium ljungdahlii. No entanto, os ácidos carboxílicos de cadeia curta têm de ser adicionados como substrato para a conversão ao álcool superior correspondente.[008] Perez, J.M., 2012, discloses a method of converting short-chain carboxylic acids into their corresponding alcohols, in the presence of synthesis gas, using Clostridium ljungdahlii. However, short chain carboxylic acids have to be added as a substrate for conversion to the corresponding higher alcohol.

[009] Portanto, os métodos disponíveis atualmente para a produção de álcoois superiores, têm limitações na transferência de massa dos substratos gasosos para os caldos de fermentação, menor produtividade e menor concentração de produtos finais, resultando em custos de energia mais elevados para a purificação do produto.[009] Therefore, the methods currently available for the production of higher alcohols have limitations in the mass transfer of gaseous substrates to fermentation broths, lower productivity and lower concentration of final products, resulting in higher energy costs for purification of product.

[010] Consequentemente, é desejável encontrar matérias-primas mais sustentáveis, além das fontes puramente a base de petróleo ou de milho, como materiais de partida para a produção de álcoois superiores por via biotecnológica, que também causem menos danos ao meio ambiente. Em particular, existe a necessidade de um método de produção biotecnológica de álcoois superiores em etapa única (one-pot) simples e eficiente, a partir de matérias-primas renováveis.[010] Consequently, it is desirable to find more sustainable raw materials, in addition to pure petroleum or corn-based sources, as starting materials for the production of higher alcohols through biotechnology, which also cause less damage to the environment. In particular, there is a need for a simple and efficient one-pot biotechnological production method of higher alcohols from renewable raw materials.

DESCRIPTION OF THE INVENTION

[011] A presente invenção fornece uma mistura de reação de, pelo menos, dois microrganismos na presença de monóxido de carbono (CO), em que o primeiro microrganismo pode ser capaz de converter CO em acetato e/ou etanol e o segundo microrganismo pode ser capaz de converter o acetato e/ou etanol em pelo menos um ácido, e o primeiro microrganismo pode, então, ser capaz de converter o ácido no álcool superior correspondente, em que todos as etapas podem ser realizadas na presença de CO e o álcool superior compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono ou mais. Em particular, CO está presente na mistura de reação como um substrato gasoso e o CO está presente no substrato gasoso em uma concentração de 2 % e/ou mais.[011] The present invention provides a reaction mixture of at least two microorganisms in the presence of carbon monoxide (CO), in which the first microorganism may be able to convert CO into acetate and/or ethanol and the second microorganism may be able to convert the acetate and/or ethanol to at least one acid, and the first microorganism may then be able to convert the acid to the corresponding higher alcohol, where all steps can be carried out in the presence of CO and the alcohol higher comprises at least 6 carbon atoms or more. In particular, CO is present in the reaction mixture as a gaseous substrate and CO is present in the gaseous substrate in a concentration of 2% and/or more.

[012] Em um aspecto da presente invenção, é proporcionada uma mistura de reação compreendendo uma cultura mista de um primeiro e um segundo microrganismo em um meio aquoso compreendendo o gás monóxido de carbono, em que[012] In one aspect of the present invention, there is provided a reaction mixture comprising a mixed culture of a first and a second microorganism in an aqueous medium comprising carbon monoxide gas, wherein

[013] o primeiro microrganismo é um microrganismo acetogênico capaz de converter uma fonte de carbono em acetato e/ou etanol; e[013] the first microorganism is an acetogenic microorganism capable of converting a carbon source into acetate and/or ethanol; It is

[014] o segundo microrganismo é selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri e C.Carboxidivorans, capazes de converter o acetato e/ou etanol para formar um ácido;[014] the second microorganism is selected from the group consisting of Clostridium kluyveri and C.Carboxidivorans, capable of converting acetate and/or ethanol to form an acid;

[015] em que o primeiro microrganismo é, adicionalmente, capaz de converter o ácido no álcool superior correspondente, em que o álcool superior compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono.[015] wherein the first microorganism is additionally capable of converting the acid to the corresponding higher alcohol, wherein the higher alcohol comprises at least 6 carbon atoms.

[016] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de produção de pelo menos um álcool superior em um meio aquoso compreendendo uma cultura de um primeiro e um segundo microrganismos, em que,[016] According to another aspect of the present invention, there is provided a method of producing at least one higher alcohol in an aqueous medium comprising a culture of a first and a second microorganism, wherein,

[017] o primeiro microrganismo é um microrganismo acetogênico capaz de converter uma fonte de carbono compreendendo monóxido de carbono em acetato e/ou etanol; e[017] the first microorganism is an acetogenic microorganism capable of converting a carbon source comprising carbon monoxide into acetate and/or ethanol; It is

[018] o segundo microrganismo é selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri e C.Carboxidivorans, capazes de converter o acetato e/ou etanol para formar um ácido;[018] the second microorganism is selected from the group consisting of Clostridium kluyveri and C.Carboxidivorans, capable of converting acetate and/or ethanol to form an acid;

[019] em que o primeiro microrganismo é, adicionalmente, capaz de converter o ácido no álcool superior correspondente e o álcool superior compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono.[019] wherein the first microorganism is additionally capable of converting the acid into the corresponding higher alcohol and the higher alcohol comprises at least 6 carbon atoms.

[020] De acordo com outro aspecto da presente invenção, o método de produção de pelo menos um álcool superior em meio aquoso compreende as etapas de:[020] According to another aspect of the present invention, the method of producing at least one higher alcohol in an aqueous medium comprises the steps of:

[021] adicionar um primeiro microrganismo acetogênico, capaz de converter uma fonte de carbono compreendendo monóxido de carbono em acetato e/ou etanol no meio aquoso; e[021] add a first acetogenic microorganism, capable of converting a carbon source comprising carbon monoxide into acetate and/or ethanol in the aqueous medium; It is

[022] adicionar o segundo microrganismo selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri e C.Carboxidivorans, capazes de converter o acetato e/ou etanol para formar um ácido;[022] add the second microorganism selected from the group consisting of Clostridium kluyveri and C.Carboxidivorans, capable of converting acetate and/or ethanol to form an acid;

[023] em que o primeiro microrganismo é, adicionalmente, capaz de converter o ácido no álcool superior correspondente e o álcool superior compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono.[023] wherein the first microorganism is additionally capable of converting the acid into the corresponding higher alcohol and the higher alcohol comprises at least 6 carbon atoms.

[024] Em um exemplo, as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente. Em outro exemplo, as etapas (a) e (b) são realizadas consecutivamente. A concentração do primeiro e segundo microrganismos pode ser constantemente mantida para manter a progressão da reação. Em um exemplo, antes da etapa (b) ser realizada, a concentração de etanol e/ou acetato é medida para assegurar que seja atingida uma concentração ideal para o segundo microrganismo. Em particular, a concentração de acetato e/ou o etanol pode estar em um nível ideal para que haja substrato suficiente no meio aquoso para o segundo organismo formar pelo menos um ácido superior. Um especialista na técnica será capaz de determinar facilmente o tempo adequado para incluir o segundo organismo no meio aquoso.[024] In one example, steps (a) and (b) are performed simultaneously. In another example, steps (a) and (b) are performed consecutively. The concentration of the first and second microorganisms can be constantly maintained to keep the reaction progressing. In one example, before step (b) is carried out, the concentration of ethanol and/or acetate is measured to ensure that an optimal concentration for the second microorganism is achieved. In particular, the acetate and/or ethanol concentration can be at an ideal level so that there is enough substrate in the aqueous medium for the second organism to form at least one higher acid. One skilled in the art will be able to easily determine the proper time to include the second organism in the aqueous medium.

[025] Em outro exemplo, as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente. Neste exemplo, o segundo microrganismo pode não estar ativo (isto é, pode ficar latente) até que uma quantidade suficiente de acetato e/ou etanol seja disponibilizada pela atividade do primeiro microrganismo. A presença de qualquer dos microrganismos no meio aquoso não perturba ou impede a atividade e/ou a eficiência do outro.[025] In another example, steps (a) and (b) are performed simultaneously. In this example, the second microorganism may not be active (i.e., may lie dormant) until a sufficient amount of acetate and/or ethanol is made available by the activity of the first microorganism. The presence of any of the microorganisms in the aqueous medium does not disturb or impede the activity and/or efficiency of the other.

[026] Uma vantagem da presente invenção pode ser que podem ser usadas misturas muito mais favoráveis de CO2/CO de matérias-primas. Estas diversas fontes incluem gás natural, biogás, carvão, petróleo, resíduos vegetais e semelhantes. Outra vantagem do método pode ser o rendimento elevado de carbono. Isto é possível pelo retorno do CO2 formado. Nomeadamente, o CO2 pode ser novamente reagido na primeira etapa para formar ácido acético.[026] An advantage of the present invention may be that much more favorable CO2/CO mixtures of raw materials can be used. These various sources include natural gas, biogas, coal, petroleum, plant residues and the like. Another advantage of the method may be the high carbon yield. This is possible by returning the formed CO2. Namely, CO2 can be reacted again in the first step to form acetic acid.

[027] Outra vantagem pode estar na maior flexibilidade com relação às condições de fermentação usadas, já que qualquer bactéria acetogênica e qualquer microrganismo capaz de realizar a via de fermentação etanol- carboxilato podem ser usados em combinação, para a produção efetiva de álcoois superiores. Outra vantagem da presente invenção pode ser que, visto que o segundo microrganismo pode funcionar e/ou produzir um ácido a partir de acetato e/ou etanol na presença de CO, ambos o primeiro e o segundo microrganismos podem estar presentes em uma mistura homogênea, para a produção de álcoois superiores a partir de uma fonte de carbono compreendendo CO. Esta característica do segundo microrganismo permite que a produção de álcoois superiores a partir de uma fonte de carbono como o CO seja um processo de uma etapa, tornando o processo mais eficiente e o rendimento maior.[027] Another advantage may be the greater flexibility with respect to the fermentation conditions used, since any acetogenic bacteria and any microorganism capable of carrying out the ethanol-carboxylate fermentation pathway can be used in combination, for the effective production of higher alcohols. Another advantage of the present invention may be that, since the second microorganism can function and/or produce an acid from acetate and/or ethanol in the presence of CO, both the first and second microorganism can be present in a homogeneous mixture, for the production of higher alcohols from a carbon source comprising CO. This feature of the second microorganism allows the production of higher alcohols from a carbon source such as CO to be a one-step process, making the process more efficient and the yield higher.

[028] Surpreendentemente, devido a esta vantagem do segundo microrganismo, o procedimento em uma etapa para preparar álcoois superiores pode ser realizado em um único fermentador, sem uma etapa de separação intermediária. Também pode haver um aumento da concentração do produto final usando este procedimento de uma etapa. Isto é surpreendente, já que tanto Baffert C., 2011 e Thauer, RK, 1973 ensinam que hidrogenases são inibidas na presença de CO. Por este motivo e mais, o documento WO2013/167663 compreende uma etapa de separação entre (a) uma etapa de formação de acetato e/ou etanol a partir de CO e/ou CO2 na presença de um organismo acetogênico e (b) uma etapa de formação de um hidrocarboneto compreendendo pelo menos um átomo de oxigênio (p. ex., ácido hexanóico), na presença de um segundo microrganismo. A capacidade para produzir um álcool superior, em particular um que compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono, em uma síntese de etapa única a partir de CO, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção é, portanto, um resultado surpreendente. Em qualquer caso, mesmo que as etapas (a) e (b) sejam realizadas em duas etapas separadas (isto é, dois recipientes separados), pode não haver a necessidade de qualquer método de extração específico para remover todos os vestígios de CO, para que ambos o primeiro e segundo microrganismos funcionem.[028] Surprisingly, because of this advantage of the second microorganism, the one-step procedure for preparing higher alcohols can be performed in a single fermenter, without an intermediate separation step. There can also be an increase in the concentration of the final product using this one-step procedure. This is surprising, as both Baffert C., 2011 and Thauer, RK, 1973 teach that hydrogenases are inhibited in the presence of CO. For this reason and more, document WO2013/167663 comprises a separation step between (a) a step of forming acetate and/or ethanol from CO and/or CO2 in the presence of an acetogenic organism and (b) a step of forming a hydrocarbon comprising at least one oxygen atom (eg hexanoic acid) in the presence of a second microorganism. The ability to produce a higher alcohol, in particular one comprising at least 6 carbon atoms, in a one-step synthesis from CO according to any aspect of the present invention is therefore a surprising result. In any case, even if steps (a) and (b) are carried out in two separate steps (i.e., two separate containers), there may not be a need for any specific extraction method to remove all traces of CO, to that both the first and second microorganisms function.

[029] Como pode ser visto nos exemplos, a presença de CO permite que seja produzido hexanol, no método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, em que a fonte de carbono compreende, pelo menos, CO.[029] As can be seen from the examples, the presence of CO allows hexanol to be produced, in the method according to any aspect of the present invention, wherein the carbon source comprises at least CO.

[030] A fonte de carbono compreendendo CO pode ser convertida em pelo menos um ácido na presença de pelo menos um microrganismo acetogênico e um segundo microrganismo capaz de realizar a via de fermentação etanol- carboxilato. Em particular, o ácido pode compreender 6 ou mais átomos de carbono. Mais em particular, o ácido formado pode ser selecionado do grupo que consiste em ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido octanoico, ácido nonanoico, ácido decanoico e semelhantes. Em particular, a fonte de carbono compreendendo CO, na presença de pelo menos uma bactéria acetogênica, pode resultar na produção de etanol e/ou ácido acético.[030] The carbon source comprising CO can be converted into at least one acid in the presence of at least one acetogenic microorganism and a second microorganism capable of carrying out the ethanol-carboxylate fermentation pathway. In particular, the acid may comprise 6 or more carbon atoms. More particularly, the formed acid may be selected from the group consisting of hexanoic acid, heptanoic acid, octanoic acid, nonanoic acid, decanoic acid and the like. In particular, the carbon source comprising CO, in the presence of at least one acetogenic bacteria, can result in the production of ethanol and/or acetic acid.

[031] O termo "bactérias acetogênicas", conforme utilizado aqui, se refere a um microrganismo que é capaz de realizar a via de Wood-Ljungdahl e, portanto, é capaz de converter CO, CO2 e/ou hidrogênio em acetato. Estes microrganismos incluem microrganismos que, na sua forma de tipo selvagem, não têm a via Wood-Ljungdahl, mas que adquiriram esta característica como resultado de modificação genética. Tais microrganismos incluem, mas não estão limitados a, células de E. coli. Estes microrganismos também podem ser conhecidos como bactérias carboxidotróficas. Atualmente, são conhecidos 21 gêneros diferentes de bactérias acetogênicas no estado da técnica (Drake et al., 2006) e estes também podem incluir alguns clostridia (Drake & Kusel, 2005). Estas bactérias são capazes de utilizar o dióxido ou monóxido de carbono como uma fonte de carbono, com hidrogênio como uma fonte de energia (Wood, 1991). Além disso, também podem ser usados como fontes de carbono álcoois, aldeídos, ácidos carboxílicos, bem como numerosas hexoses (Drake et al., 2004). A via redutora que leva à formação de acetato é referida como via acetil- CoA ou via Wood-Ljungdahl.[031] The term "acetogenic bacteria", as used here, refers to a microorganism that is capable of carrying out the Wood-Ljungdahl pathway and is therefore capable of converting CO, CO2 and/or hydrogen into acetate. These microorganisms include microorganisms that, in their wild-type form, do not have the Wood-Ljungdahl pathway, but which have acquired this characteristic as a result of genetic modification. Such microorganisms include, but are not limited to, E. coli cells. These microorganisms can also be known as carboxydotrophic bacteria. Currently, 21 different genera of acetogenic bacteria are known in the prior art (Drake et al., 2006) and these may also include some Clostridia (Drake & Kusel, 2005). These bacteria are able to utilize carbon dioxide or carbon monoxide as a carbon source, with hydrogen as an energy source (Wood, 1991). In addition, alcohols, aldehydes, carboxylic acids, as well as numerous hexoses can also be used as carbon sources (Drake et al., 2004). The reductive pathway leading to acetate formation is referred to as the acetyl-CoA pathway or the Wood-Ljungdahl pathway.

[032] Em particular, a bactéria acetogênica pode ser selecionada do grupo que consiste em Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), Acetobacterium species no. 446 (Morinaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194), Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950, anteriormente Ruminococcus productus, anteriormente Peptostreptococcus productus), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 e DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC no. PTA- 10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium ljungdahlii (DSM 13528), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), espécies de Clostridium ATCC 29797 (Schmidt et al., 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et al., 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612), Moorella thermoacetica (DSM 521, anteriormente Clostridium thermoaceticum), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440) eThermoanaerobacter kivui (DSM 2030, anteriormente Acetogenium kivui). Mais particularmente, pode ser usada a cepa ATCC BAA-624 do Clostridium carboxidivorans. Ainda mais particularmente, podem ser usadas as cepas bacterianas rotuladas de "P7" e "P11" do Clostridium carboxidivorans, conforme descrito, por exemplo, nos documentos US 2007/0275447 e US 2008/0057554.[032] In particular, the acetogenic bacteria can be selected from the group consisting of Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), Acetobacterium species no. 446 (Morinaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194), Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950, formerly Ruminococcus productus, formerly Peptostreptococcus productus), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 and DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243 ), Clostridium coskatii (ATCC no. PTA-10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium ljungdahlii (DSM 13528), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757) , Clostridium species ATCC 29797 (Schmidt et al., 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et al., 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612), Moorella thermoacetica (DSM 521, formerly Clostridium thermoaceticum), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322 ), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440), and Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030, formerly Acetogenium kivui). More particularly, the ATCC BAA-624 strain of Clostridium carbidivorans can be used. Even more particularly, bacterial strains labeled "P7" and "P11" from Clostridium carboxidivorans can be used, as described, for example, in US 2007/0275447 and US 2008/0057554 .

[033] Outra bactéria particularmente adequada pode ser o Clostridium ljungdahlii. Em particular, podem ser usadas cepas selecionadas do grupo que consiste em Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium ljungdahlii COL e Clostridium ljungdahlii O-52 na conversão de gás de síntese a ácido hexanoico. Estas cepas são descritas, por exemplo, nos documentos WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 e ATCC 55989. Em outro exemplo, a bactéria acetogênica selecionada para o primeiro organismo pode ser o Clostridium autoethanogenum.[033] Another particularly suitable bacterium may be Clostridium ljungdahlii. In particular, strains selected from the group consisting of Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium ljungdahlii COL and Clostridium ljungdahlii O-52 can be used in the conversion of synthesis gas to hexanoic acid. These strains are described, for example, in WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 and ATCC 55989. In another example, the acetogenic bacteria selected for the first organism can be Clostridium autoethanogenum.

[034] A bactéria acetogênica pode ser usada em conjunto com um segundo microrganismo que pode ser capaz de realizar a via de fermentação etanol- carboxilato. Em um exemplo, ambas a bactéria acetogênica e um segundo microrganismo, que pode ser capaz de realizar a via de fermentação de etanol- carboxilato, podem ser usados para produzir um ácido superior a partir da fonte de carbono compreendendo CO. O ácido pode, em seguida, ser convertido ao álcool superior correspondente, selecionado do grupo que consiste em hexanol, octanol, nonanol, decanol e semelhantes. Em um exemplo, o álcool superior pode ser selecionado do grupo que consiste em 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 4-heptanol, octanol, nonanol, decanol e semelhantes.[034] The acetogenic bacteria can be used in conjunction with a second microorganism that may be able to carry out the ethanol-carboxylate fermentation pathway. In one example, both acetogenic bacteria and a second microorganism, which may be capable of carrying out the ethanol-carboxylate fermentation pathway, can be used to produce a higher acid from the carbon source comprising CO. The acid can then be converted to the corresponding higher alcohol selected from the group consisting of hexanol, octanol, nonanol, decanol and the like. In one example, the higher alcohol may be selected from the group consisting of 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 4-heptanol, octanol, nonanol, decanol and the like .

[035] Em um exemplo, o etanol e/ou acetato podem ser convertidos no ácido superior correspondente na presença do segundo microrganismo, capaz de realizar a via de fermentação etanol-carboxilato. A via de fermentação etanol- carboxilato é descrita em detalhes, pelo menos, em Seedorf, H., et al., 2008. Em particular, o segundo organismo pode ser selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri, C. Carboxidivorans e semelhantes. Estes segundo microrganismo incluem microrganismos que, na sua forma de tipo selvagem, não têm uma via de fermentação etanol-carboxilato, mas que adquiriram esta característica como resultado de modificação genética. Em particular, o segundo microrganismo pode ser Clostridium kluyveri.[035] In one example, ethanol and/or acetate can be converted to the corresponding higher acid in the presence of the second microorganism, capable of carrying out the ethanol-carboxylate fermentation pathway. The ethanol-carboxylate fermentation pathway is described in detail at least in Seedorf, H., et al., 2008. In particular, the second organism can be selected from the group consisting of Clostridium kluyveri, C. Carboxidivorans and the like. These second microorganisms include microorganisms which, in their wild-type form, do not have an ethanol-carboxylate fermentation pathway, but which have acquired this characteristic as a result of genetic modification. In particular, the second microorganism may be Clostridium kluyveri.

[036] Em outro exemplo, o segundo microrganismo pode ser um organismo do tipo selvagem que expressa pelo menos uma enzima selecionada do grupo que consiste em E1 a E11, em que E1 é uma álcool desidrogenase (adh), E2 é uma acetaldeído desidrogenase (ald), E3 é uma acetoacetil-CoA tiolase (thl), E4 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd), E5 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidratase (crt), E6 é uma butiril-CoA desidrogenase (bcd), E7 é uma subunidade de transferência de elétron da flavoproteína (etf), E8 é uma coenzima A transferase (cat), E9 é uma acetato quinase (ack), E10 é uma fosfotransacetilase (pta) e E11 é uma transhidrogenase. Em particular, o segundo microrganismo do tipo selvagem, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E2, E3 e E4. Ainda mais em particular, o terceiro microrganismo do tipo selvagem, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E4.[036] In another example, the second microorganism may be a wild-type organism that expresses at least one enzyme selected from the group consisting of E1 through E11, where E1 is an alcohol dehydrogenase (adh), E2 is an acetaldehyde dehydrogenase ( ald), E3 is an acetoacetyl-CoA thiolase (thl), E4 is a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (hbd), E5 is a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (crt), E6 is a butyryl-CoA dehydrogenase (bcd) , E7 is a flavoprotein electron transfer subunit (etf), E8 is a coenzyme A transferase (cat), E9 is an acetate kinase (ack), E10 is a phosphotransacetylase (pta) and E11 is a transhydrogenase. In particular, the second wild-type microorganism according to any aspect of the present invention can express at least E2, E3 and E4. Even more particularly, the third wild-type microorganism according to any aspect of the present invention can express at least E4.

[037] Em outro exemplo, o segundo microrganismo, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser um organismo geneticamente modificado que tem a expressão aumentada em relação ao microrganismo de tipo selvagem, de pelo menos uma enzima selecionada de E1 a E11, em que E1 é uma álcool desidrogenase (adh), E2 é uma acetaldeído desidrogenase (ald), E3 é uma acetoacetil-CoA tiolase (thl), E4 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd), E5 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidratase (crt), E6 é uma butiril-CoA desidrogenase (bcd), E4 é uma subunidade de flavoproteína de transferência de elétron (etf), E8 é uma coenzima A transferase (cat), E9 é uma acetato quinase (ack), E10 é uma fosfotransacetilase (pta) e E11 é uma transhidrogenase. Em particular, o segundo microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E2, E3 e E4. Ainda mais em particular, o segundo microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E4. As enzimas E1 a E11 podem ser isoladas a partir de Clostridium kluyveri. Um especialista na técnica pode ser capaz de medir a atividade de cada uma destas enzimas, usando métodos conhecidos no estado da técnica. Em particular, a atividade das enzimas E1 e E2 pode ser medida usando os ensaios ensinados em, pelo menos, Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979; a atividade da enzima E2 também pode ser medida usando o ensaio ensinado em Smith L. T., 1980; a atividade das enzimas E3 e E4 pode ser medida usando os ensaios ensinados em, pelo menos, Sliwkowski M.X., 1984; a atividade de E4 também pode ser medida usando o ensaio ensinado em Madan, V.K., 1972; a atividade de E5também pode ser medida usando o ensaio ensinado em Bartsch, R.G., 1961; a atividade das enzimas E6e E7pode ser medida usando o ensaio ensinado em Li, F., 2008; a atividade de E7 também pode ser medida utilizando o ensaio ensinado em Chowdhury, 2013; a atividade ded E8 pode ser medida usando o ensaio ensinado em Stadman, 1953; a atividade de E9 pode ser medida usando o ensaio ensinado em Winzer, K., 1997; a atividade de E10 pode ser medida usando o ensaio ensinado em Smith L.T., 1976; e a atividade de E11 pode ser medida usando o ensaio ensinado em Wang S., 2,010.[037] In another example, the second microorganism, according to any aspect of the present invention, may be a genetically modified organism that has increased expression, relative to the wild-type microorganism, of at least one enzyme selected from E1 to E11, where E1 is an alcohol dehydrogenase (adh), E2 is an acetaldehyde dehydrogenase (ald), E3 is an acetoacetyl-CoA thiolase (thl), E4 is a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (hbd), E5 is a 3-hydroxybutyryl -CoA dehydratase (crt), E6 is a butyryl-CoA dehydrogenase (bcd), E4 is a subunit of flavoprotein electron transfer (etf), E8 is a coenzyme A transferase (cat), E9 is an acetate kinase (ack) , E10 is a phosphotransacetylase (pta) and E11 is a transhydrogenase. In particular, the second genetically engineered microorganism according to any aspect of the present invention can express at least E2, E3 and E4. Even more particularly, the second genetically engineered microorganism according to any aspect of the present invention can express at least E4. Enzymes E1 to E11 can be isolated from Clostridium kluyveri. A person skilled in the art may be able to measure the activity of each of these enzymes using methods known in the art. In particular, the activity of the E1 and E2 enzymes can be measured using the assays taught in at least Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979; E2 enzyme activity can also be measured using the assay taught in Smith L.T., 1980; activity of E3 and E4 enzymes can be measured using the assays taught in at least Sliwkowski M.X., 1984; E4 activity can also be measured using the test taught in Madan, V.K., 1972; E5 activity can also be measured using the assay taught in Bartsch, R.G., 1961; the activity of the E6 and E7 enzymes can be measured using the assay taught in Li, F., 2008; E7 activity can also be measured using the test taught in Chowdhury, 2013; E8 activity can be measured using the test taught in Stadman, 1953; E9 activity can be measured using the assay taught in Winzer, K., 1997; E10 activity can be measured using the assay taught in Smith L.T., 1976; and E11 activity can be measured using the assay taught in Wang S., 2010.

[038] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o primeiro e/ou segundo microrganismo pode ser um microrganismo geneticamente modificado. Uma célula ou microrganismo geneticamente modificado pode ser geneticamente diferente da célula ou microrganismo de tipo selvagem. A diferença genética entre o microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, e o microrganismo de tipo selvagem pode estar na presença de um gene completo, aminoácido, nucleotídeo etc. no microrganismo geneticamente modificado, que pode estar ausente no microrganismo de tipo selvagem. Em um exemplo, o microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode compreender enzimas que permitem que o microrganismo produza pelo menos um ácido carboxílico. O microrganismo de tipo selvagem, em relação ao microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode não ter nenhuma atividade ou nenhuma atividade detectável das enzimas que permitem que o microrganismo geneticamente modificado produza pelo menos um ácido carboxílico. Conforme utilizado aqui, o termo "microrganismo geneticamente modificado" pode ser utilizado alternadamente com o termo "célula geneticamente modificada". A modificação genética, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser realizada na célula do microrganismo.[038] According to any aspect of the present invention, the first and/or second microorganism may be a genetically modified microorganism. A genetically engineered cell or microorganism may be genetically different from the wild-type cell or microorganism. The genetic difference between the genetically engineered microorganism according to any aspect of the present invention and the wild-type microorganism may be in the presence of a complete gene, amino acid, nucleotide, etc. in the genetically modified microorganism, which may be absent in the wild-type microorganism. In one example, the genetically modified microorganism according to any aspect of the present invention can comprise enzymes that enable the microorganism to produce at least one carboxylic acid. The wild-type microorganism, relative to the genetically modified microorganism, according to any aspect of the present invention may have no activity or no detectable activity of enzymes that allow the genetically modified microorganism to produce at least one carboxylic acid. As used herein, the term "genetically modified microorganism" may be used interchangeably with the term "genetically modified cell". Genetic modification, in accordance with any aspect of the present invention, can be performed on the cell of the microorganism.

[039] A frase "de tipo selvagem", conforme utilizada aqui em conjunto com uma célula ou microrganismo, pode denotar uma célula com um genoma manipulado, que está em uma forma presente naturalmente na natureza. O termo pode ser aplicável tanto para toda a célula como para genes individuais. O termo "de tipo selvagem", por conseguinte, não inclui tais células ou tais genes onde as sequências de genes foram alteradas, pelo menos parcialmente, pelo homem, usando métodos recombinantes.[039] The phrase "wild-type", as used herein in conjunction with a cell or microorganism, may denote a cell with an engineered genome, which is in a form naturally present in nature. The term can be applied both to the whole cell and to individual genes. The term "wild-type", therefore, does not include such cells or such genes where the gene sequences have been altered, at least partially, by man using recombinant methods.

[040] Um especialista na técnica será capaz de usar qualquer método conhecido no estado da técnica para modificar geneticamente uma célula ou um microrganismo. De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a célula geneticamente modificada pode ser geneticamente modificada de modo que, em um intervalo de tempo definido, em 2 horas, em particular, em 8 horas ou 24 horas, ela produza, pelo menos, duas vezes, especialmente, pelo menos, 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes mais ácido carboxílico e/ou o respectivo éster de ácido carboxílico, do que a célula de tipo selvagem. O aumento na formação do produto pode ser determinado, por exemplo, cultivando a célula de acordo com qualquer aspecto da presente invenção e a célula de tipo selvagem, cada uma, separadamente, nas mesmas condições (mesma densidade celular, mesmo meio nutriente, mesmas condições de cultura), durante um intervalo de tempo especificado, em um meio nutriente apropriado e, em seguida, determinando a quantidade de produto alvo (ácido carboxílico) no meio nutriente.[040] A person skilled in the art will be able to use any method known in the prior art to genetically modify a cell or a microorganism. According to any aspect of the present invention, the genetically modified cell can be genetically modified so that, in a defined time interval, in 2 hours, in particular, in 8 hours or 24 hours, it produces at least twice especially at least 10 times, at least 100 times, at least 1,000 times or at least 10,000 times more carboxylic acid and/or the carboxylic acid ester thereof than the wild-type cell. The increase in product formation can be determined, for example, by culturing the cell according to any aspect of the present invention and the wild-type cell, each separately, under the same conditions (same cell density, same nutrient medium, same conditions of culture), for a specified time interval, in an appropriate nutrient medium and then determining the amount of target product (carboxylic acid) in the nutrient medium.

[041] Em outro exemplo, um ácido pode ser produzido a partir da fonte de carbono compreendendo CO por qualquer método descrito em Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M.C.A.A., 2013, Ding H. et al, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B.T., et al., 1948 e outros semelhantes. Ainda mais em particular, o ácido pode ser produzido a partir da fonte de carbono compreendendo CO na presença de, pelo menos, Clostridium kluyveri.[041] In another example, an acid can be produced from the carbon source comprising CO by any method described in Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M.C.A.A., 2013, Ding H. et al, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B.T., et al., 1948 and the like. Even more particularly, the acid can be produced from the carbon source comprising CO in the presence of at least Clostridium kluyveri.

[042] Ainda mais em particular, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o ácido é produzido na presença de pelo menos um microrganismo acetogênico e de Clostridium kluyveri. Em um exemplo, o microrganismo acetogênico pode ser Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdahlei.[042] Even more particularly, according to any aspect of the present invention, the acid is produced in the presence of at least one acetogenic microorganism and Clostridium kluyveri. In one example, the acetogenic microorganism can be Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdahlei.

[043] Na produção de ácido a partir da fonte de carbono contendo CO, pode ser usada uma combinação de bactérias. Pode haver mais de uma bactéria acetogênica presente em combinação com um ou mais segundos microrganismos. Em outro exemplo, pode haver mais de um tipo de bactéria acetogênica presente e apenas um tipo de segundo microrganismo. Em ainda outro exemplo, pode haver mais de um segundo microrganismo presente em combinação com uma única bactéria acetogênica.[043] In the production of acid from the CO-containing carbon source, a combination of bacteria can be used. There may be more than one acetogenic bacteria present in combination with one or more second microorganisms. In another example, there may be more than one type of acetogenic bacteria present and only one type of second microorganism. In yet another example, there may be more than a second microorganism present in combination with a single acetogenic bacterium.

[044] A mistura de reação pode compreender os dois microrganismos em uma mistura homogênea. O termo "mistura homogênea", conforme utilizado aqui, se refere a uma mistura dos microrganismos distribuída espacialmente de maneira uniforme em um meio. Em particular, a mistura pode compreender, pelo menos, dois microrganismos, um microrganismo acetogênico e um segundo microrganismo, distribuídos uniformemente em um meio aquoso. Em um exemplo, pode haver um número aproximadamente igual do microrganismo acetogênico e segundo microrganismo na mistura. Em outro exemplo, pode haver mais do microrganismo acetogênico, em comparação ao segundo microrganismo, na mistura. Em ainda outro exemplo, pode haver mais do segundo microrganismo, em comparação ao microrganismo acetogênico, na mistura. Em todos os exemplos possíveis, os microrganismos estão em uma única mistura homogênea, onde eles estão uniformemente distribuídos por toda a mistura. O "meio aquoso", conforme utilizado aqui, pode ser usado utilizado alternadamente com o termo "mistura de reação".[044] The reaction mixture may comprise the two microorganisms in a homogeneous mixture. The term "homogeneous mixture", as used herein, refers to a spatially uniformly distributed mixture of microorganisms in a medium. In particular, the mixture may comprise at least two microorganisms, an acetogenic microorganism and a second microorganism, uniformly distributed in an aqueous medium. In one example, there may be approximately equal numbers of the acetogenic microorganism and the second microorganism in the mixture. In another example, there may be more of the acetogenic microorganism, compared to the second microorganism, in the mixture. In yet another example, there may be more of the second microorganism, as compared to the acetogenic microorganism, in the mixture. In all possible examples, the microorganisms are in a single homogeneous mixture, where they are uniformly distributed throughout the mixture. "Aqueous medium" as used herein may be used interchangeably with the term "reaction mixture".

[045] O termo "acetato", conforme utilizado aqui, se refere tanto ao ácido acético como a seus sais inevitavelmente resultantes, porque, conforme conhecido no estado da técnica, uma vez que os microrganismos trabalham em um ambiente aquoso, sempre existe um equilíbrio entre o sal e ácido presentes.[045] The term "acetate", as used herein, refers both to acetic acid and its inevitably resulting salts, because, as known in the prior art, since microorganisms work in an aqueous environment, there is always an equilibrium between the salt and acid present.

[046] O termo "segundo microrganismo" se refere a um microrganismo que é diferente do "primeiro microrganismo", de acordo com qualquer aspecto da presente invenção.[046] The term "second microorganism" refers to a microorganism that is different from the "first microorganism" in accordance with any aspect of the present invention.

[047] Em outro exemplo, a etapa (a) e a etapa (b) podem ser realizadas em dois recipientes diferentes. Em um exemplo, a etapa (a) pode ser realizada no fermentador 1, em que o primeiro microrganismo entra em contato com a fonte de carbono compreendendo CO para produzir de acetato e/ou etanol. O etanol e/ou acetato podem, então, ser colocados em contato com um segundo microrganismo no fermentador 2, para produzir pelo menos um ácido. O ácido pode, então, ser realimentado ao fermentador 1, para conversão deste no álcool superior desejado. Pode ser criado um ciclo em que o acetato e/ou etanol produzidos no fermentador 1 podem ser alimentados regularmente ao fermentador 2, o acetato e/ou etanol no fermentador 2 podem ser convertidos em pelo menos um ácido e o ácido no fermentador 2 realimentado ao fermentador 1. O CO alimentado ao fermentador 1 pode ser transferido para o fermentador 2, juntamente com o acetato e/ou etanol. Pode não ser necessário nenhum método de extração especial, já que foi descoberto que o segundo microrganismo, surpreendentemente, pode converter acetato e/ou etanol em pelo menos um ácido, na presença de CO.[047] In another example, step (a) and step (b) can be performed in two different containers. In one example, step (a) can be carried out in fermenter 1, where the first microorganism is contacted with the carbon source comprising CO to produce acetate and/or ethanol. Ethanol and/or acetate can then be contacted with a second microorganism in fermenter 2 to produce at least one acid. The acid can then be fed back to fermenter 1 for conversion to the desired higher alcohol. A cycle can be created in which the acetate and/or ethanol produced in fermenter 1 can be regularly fed to fermenter 2, the acetate and/or ethanol in fermenter 2 can be converted into at least one acid, and the acid in fermenter 2 fed back to fermenter 1. The CO fed to fermenter 1 can be transferred to fermenter 2 along with the acetate and/or ethanol. No special extraction method may be required, as it has been found that the second microorganism, surprisingly, can convert acetate and/or ethanol to at least one acid in the presence of CO.

[048] Em outro exemplo, o meio é reciclado entre os fermentadores 1 e 2. Portanto, o etanol e/ou acetato produzidos no fermentador 1 podem ser alimentados ao fermentador 2 e o ácido produzido no fermentador 2 pode ser realimentado ao fermentador 1. No processo de reciclagem do meio, o CO do fermentador 1 pode ser introduzido no fermentador 2. Além disso, os ácidos produzidos no fermentador 2 podem ser, consequentemente, reintroduzidos no fermentador 1. O segundo microrganismo no fermentador 2 pode ser capaz de continuar a produzir ácidos a partir de acetato e etanol na presença de CO reciclado do fermentador 1 para o fermentador 2. Os álcoois acumulados nos fermentadores 1 e 2 podem, então, ser extraídos por métodos conhecidos no estado da técnica.[048] In another example, the medium is recycled between fermenters 1 and 2. Therefore, the ethanol and/or acetate produced in fermenter 1 can be fed to fermenter 2 and the acid produced in fermenter 2 can be fed back to fermenter 1. In the process of recycling the medium, CO from fermenter 1 may be introduced into fermenter 2. In addition, acids produced in fermenter 2 may subsequently be reintroduced into fermenter 1. The second microorganism in fermenter 2 may be able to continue to producing acids from acetate and ethanol in the presence of CO recycled from fermenter 1 to fermenter 2. Alcohols accumulated in fermenters 1 and 2 can then be extracted by methods known in the prior art.

[049] Em outro exemplo, pode haver três recipientes presentes para a realização do método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. O primeiro microrganismo pode estar presente em um primeiro fermentador, o segundo microrganismo em um segundo fermentador e um terceiro fermentador novamente com o primeiro microrganismo. No fermentador 1, o primeiro microrganismo entra em contato com a fonte de carbono para produzir acetato e/ou etanol. O etanol e/ou acetato podem, então, ser colocados em contato com o segundo microrganismo no fermentador 2, para produzir pelo menos um ácido. O ácido pode, em seguida, ser alimentado ao fermentador 3 para produzir pelo menos um álcool.[049] In another example, there may be three containers present for carrying out the method according to any aspect of the present invention. The first microorganism can be present in a first fermenter, the second microorganism in a second fermenter, and a third fermenter again with the first microorganism. In fermenter 1, the first microorganism comes into contact with the carbon source to produce acetate and/or ethanol. Ethanol and/or acetate can then be brought into contact with the second microorganism in fermenter 2 to produce at least one acid. The acid can then be fed to fermenter 3 to produce at least one alcohol.

[050] Em particular, o CO pode ser fornecido ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. O CO no fluxo de gás pode estar presente em uma concentração de, pelo menos, 2 % em volume do volume da quantidade total de gás no fluxo de gás. Em particular, o CO pode estar presente em uma faixa de concentração de 2 a 99 % em volume, em uma faixa de 2 a 95 % em volume, 5 a 95 % em volume, 10 a 90 % em volume, 15 a 85% em de volume, em particular na faixa de 20 a 80 % em volume. Mais em particular, a concentração de CO pode ser de cerca de 7 %, 24 % em volume. A concentração de monóxido de carbono na fase gasosa da fonte de carbono pode ser medida usando pelo menos um cromatógrafo a gás GC 6890N da Agilent Technologies Inc., com um detector de condutividade térmica.[050] In particular, CO can be supplied to the aqueous medium in a continuous flow of gas. The CO in the gas stream may be present in a concentration of at least 2% by volume of the total amount of gas in the gas stream. In particular, CO can be present in a concentration range of 2 to 99% by volume, in a range of 2 to 95% by volume, 5 to 95% by volume, 10 to 90% by volume, 15 to 85% by volume, in particular in the range of 20 to 80% by volume. More particularly, the CO concentration can be about 7%, 24% by volume. The concentration of carbon monoxide in the gas phase of the carbon source can be measured using at least an Agilent Technologies Inc. GC 6890N gas chromatograph with a thermal conductivity detector.

[051] O termo "cerca de", conforme utilizado aqui, se refere a uma variação na faixa de 20 por cento. Em particular, o termo "cerca de", conforme utilizado aqui, se refere a +/- 20 %, mais em particular, +/- 10 %, ainda mais em particular, +/- 5 % de uma dada medida ou valor.[051] The term "about" as used herein refers to a variation in the 20 percent range. In particular, the term "about" as used herein refers to +/- 20%, more in particular +/- 10%, even more in particular +/- 5% of a given measurement or value.

[052] Todas as percentagens (%) são, salvo indicação em contrário, percentagem em volume.[052] All percentages (%) are, unless otherwise stated, percentage by volume.

[053] A fonte de carbono, usada de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, compreende dióxido de carbono e/ou monóxido de carbono. Um especialista na técnica entende que existem muitas fontes possíveis para a provisão de CO e/ou CO2 como fonte de carbono. Pode ser visto que, na prática, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser usado como fonte de carbono, qualquer gás ou mistura de gases capazes de fornecer aos microrganismos uma quantidade suficiente de carbono, de modo que o acetato e/ou etanol possam ser formados a partir da fonte de CO e/ou CO2.[053] The carbon source used in accordance with any aspect of the present invention comprises carbon dioxide and/or carbon monoxide. One skilled in the art understands that there are many possible sources for the provision of CO and/or CO2 as a carbon source. It can be seen that, in practice, according to any aspect of the present invention, any gas or gas mixture capable of supplying the microorganisms with a sufficient amount of carbon can be used as a source of carbon, so that the acetate and/or ethanol can be formed from the source of CO and/or CO2.

[054] Geralmente, para a cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a fonte de carbono compreende, pelo menos, 50 % em volume, pelo menos, 70 % em volume, particularmente, pelo menos, 90 % em volume de CO e/ou CO2, em que as percentagens por volume - % se referem a todas as fontes de carbono que estão disponíveis para o primeiro microrganismo na cultura mista.[054] Generally, for mixed culture according to any aspect of the present invention, the carbon source comprises at least 50% by volume, at least 70% by volume, particularly at least 90% by volume of CO and/or CO2, where percentages by volume - % refer to all carbon sources that are available to the first microorganism in the mixed culture.

[055] Na cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser proporcionado o material fonte de carbono. Exemplos de fontes de carbono em forma gasosa incluem gases de escape, tal como gás de síntese, gases de combustão e gases de refinaria de petróleo produzidos pela fermentação por levedura ou fermentação por Clostridium. Estes gases de escape são formados a partir da gaseificação de materiais que contêm celulose, ou da gaseificação do carvão. Em um exemplo, estes gases de escape podem não necessariamente ser produzidos como subprodutos de outros processos, mas podem ser produzidos, especificamente, para uso com a cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção.[055] In the mixed culture, according to any aspect of the present invention, the carbon source material may be provided. Examples of sources of carbon in gaseous form include exhaust gases, such as synthesis gas, flue gases, and oil refinery gases produced by yeast fermentation or Clostridial fermentation. These exhaust gases are formed from the gasification of cellulose-containing materials, or from the gasification of coal. In one example, these exhaust gases may not necessarily be produced as a by-product of other processes, but may be produced specifically for use with the mixed crop in accordance with any aspect of the present invention.

[056] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a fonte de carbono pode ser o gás de síntese. O gás de síntese pode, por exemplo, ser produzido como um subproduto da gaseificação do carvão. Consequentemente, o microrganismo da cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser capaz de converter uma substância, que é um produto residual, em um recurso valioso. Em outro exemplo, o gás de síntese pode ser um subproduto da gaseificação de matérias-primas agrícolas de baixo custo e amplamente disponíveis para uso com a cultura mista da presente invenção, para produzir pelo menos um álcool superior.[056] According to any aspect of the present invention, the carbon source may be the synthesis gas. Synthesis gas can, for example, be produced as a by-product of coal gasification. Consequently, the mixed culture microorganism, according to any aspect of the present invention, may be able to convert a substance, which is a waste product, into a valuable resource. In another example, syngas can be a by-product of gasification of low cost and widely available agricultural feedstocks for use with the mixed crop of the present invention to produce at least one higher alcohol.

[057] Existem numerosos exemplos de matérias-primas que podem ser convertidas em gás de síntese, visto que quase todas as formas de vegetação podem ser utilizadas para este fim. Em particular, as matérias-primas são selecionadas do grupo que consiste em espécies perenes, tais como miscanthus, resíduos de milho, resíduos de processamento, tal como serragem e semelhantes.[057] There are numerous examples of raw materials that can be converted into synthesis gas, since almost all forms of vegetation can be used for this purpose. In particular, the raw materials are selected from the group consisting of perennial species such as miscanthus, corn waste, processing waste such as sawdust and the like.

[058] Em geral, o gás de síntese pode ser obtido em um aparelho de gaseificação de biomassa seca, principalmente por meio de pirólise, oxidação parcial e reforma a vapor, em que os produtos primários do gás de síntese são CO, H2 e CO2. O gás de síntese também pode ser um produto da eletrólise de CO2. Um especialista na técnica compreenderá as condições adequadas para realizar a eletrólise do CO2 para produzir gás de síntese compreendendo CO em uma quantidade desejada.[058] In general, synthesis gas can be obtained in a dry biomass gasification apparatus, mainly through pyrolysis, partial oxidation and steam reforming, in which the primary products of synthesis gas are CO, H2 and CO2 . Synthesis gas can also be a product of CO2 electrolysis. One skilled in the art will understand the proper conditions for carrying out the electrolysis of CO2 to produce synthesis gas comprising CO in a desired amount.

[059] Geralmente, uma porção do gás de síntese obtido do processo de gaseificação é primeiramente processado, de modo a otimizar os rendimentos do produto e para evitar a formação de alcatrão. O craqueamento do alcatrão indesejado e CO no gás de síntese podem ser realizados usando cal e/ou dolomita. Estes processos são descritos em detalhe, por exemplo, em Reed, 1981.[059] Generally, a portion of the syngas obtained from the gasification process is first processed, in order to optimize product yields and to avoid tar formation. Cracking of unwanted tar and CO in syngas can be accomplished using lime and/or dolomite. These processes are described in detail, for example, in Reed, 1981.

[060] Misturas de fontes podem ser usadas como uma fonte de carbono.[060] Mixtures of sources can be used as a carbon source.

[061] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser fornecido um agente redutor, por exemplo, hidrogênio, em conjunto com a fonte de carbono. Em particular, este hidrogênio pode ser fornecido quando o C e/ou CO2 é fornecido e/ou usado. Em um exemplo, o hidrogênio gás é parte do gás de síntese, presente de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. Em outro exemplo, onde o hidrogênio gás no gás de síntese é insuficiente para o método da presente invenção, pode ser fornecido hidrogênio gás adicional.[061] According to any aspect of the present invention, a reducing agent, for example, hydrogen, may be provided together with the carbon source. In particular, this hydrogen can be supplied when C and/or CO2 is supplied and/or used. In one example, hydrogen gas is part of the synthesis gas present in accordance with any aspect of the present invention. In another example, where hydrogen gas in the synthesis gas is insufficient for the method of the present invention, additional hydrogen gas can be supplied.

[062] Um especialista na técnica compreenderá as outras condições necessárias para realizar o método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. Em particular, as condições no recipiente (p. ex., fermentador) podem ser variadas, dependendo do primeiro e segundo microrganismos usados. As variações das condições para serem adequadas ao funcionamento ideal dos microrganismos são conhecidas por um especialista na técnica.[062] One skilled in the art will understand the other conditions necessary to carry out the method according to any aspect of the present invention. In particular, the conditions in the vessel (eg fermenter) can be varied depending on the first and second microorganisms used. Variations of conditions to suit optimal functioning of microorganisms are known to a person skilled in the art.

[063] Em um exemplo, o método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode ser realizado em um meio aquoso com pH entre 5 e 8, 5,5 e 7. A pressão pode estar entre 1 e 10 bar.[063] In one example, the method according to any aspect of the present invention can be carried out in an aqueous medium with a pH between 5 and 8, 5.5 and 7. The pressure can be between 1 and 10 bar.

[064] Em particular, o meio aquoso pode compreender uma fonte de carbono que compreende CO e/ou CO2. Mais em particular, a fonte de carbono compreendendo CO e/ou CO2 é fornecida ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. Ainda mais em particular, o fluxo contínuo de gás compreende gás de síntese. Em um exemplo, os gases são parte do mesmo fluxo/corrente. Em outro exemplo, cada gás é um fluxo/corrente separado fornecido ao meio aquoso. Estes gases podem ser divididos, por exemplo, usando bicos separados que se abrem para dentro do meio aquoso, fritas, membranas no interior do tubo de fornecimento do gás para o meio aquoso e semelhantes.[064] In particular, the aqueous medium may comprise a carbon source comprising CO and/or CO2. More particularly, the carbon source comprising CO and/or CO2 is supplied to the aqueous medium in a continuous gas flow. Even more particularly, the continuous flow of gas comprises synthesis gas. In one example, the gases are part of the same flow/current. In another example, each gas is a separate flow/stream supplied to the aqueous medium. These gases can be divided, for example, using separate nozzles that open into the aqueous medium, frits, membranes inside the gas supply tube for the aqueous medium, and the like.

[065] Em particular, a mistura de reação, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção (isto é, a mistura do primeiro microrganismo - o organismo acetogênico, do segundo microrganismo e da fonte de carbono compreendendo monóxido de carbono) pode ser usada em qualquer biorreator ou fermentador conhecido, para a realização de qualquer aspecto da presente invenção.[065] In particular, the reaction mixture according to any aspect of the present invention (i.e., the mixture of the first microorganism - the acetogenic organism, the second microorganism and the carbon source comprising carbon monoxide) can be used in any known bioreactor or fermenter, for carrying out any aspect of the present invention.

[066] "Álcoois superiores", conforme utilizado aqui, se refere a álcoois que contêm 6 a 10 átomos de carbono e que podem ser um pouco viscosos, ou oleosos e têm odores frutados mais fortes. Álcoois superiores podem incluir, mas não estão limitados a, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol e semelhantes. Mais em particular, o álcool superior pode ser selecionado do grupo que consiste em 1-hexanol, 1-octanol, 1-pentanol, 1-heptanol, 3-metil-1- pentanol, 4-metil-1-hexanol, 5-metil-1-heptanol, 4-metil-1-pentanol, 5-metil-1- hexanol, 6-metil-1-heptanol e as suas combinações.[066] "Higher alcohols", as used herein, refers to alcohols that contain 6 to 10 carbon atoms and that can be somewhat viscous, or oily and have stronger fruity odors. Higher alcohols can include, but are not limited to, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol and the like. More particularly, the higher alcohol may be selected from the group consisting of 1-hexanol, 1-octanol, 1-pentanol, 1-heptanol, 3-methyl-1-pentanol, 4-methyl-1-hexanol, 5-methyl -1-heptanol, 4-methyl-1-pentanol, 5-methyl-1-hexanol, 6-methyl-1-heptanol and combinations thereof.

[067] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o "álcool superior correspondente" se refere a um álcool com o mesmo número de átomos de carbono que o do ácido a partir do qual o álcool superior correspondente é formado. Por exemplo, o ácido hexanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - hexanol; ácido heptanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - heptanol; ácido octanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - octanol; ácido nonanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - nonanol; ácido decanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - decanol e semelhantes.[067] According to any aspect of the present invention, the "corresponding higher alcohol" refers to an alcohol having the same number of carbon atoms as that of the acid from which the corresponding higher alcohol is formed. For example, hexanoic acid can be converted to the corresponding alcohol - hexanol; heptanoic acid can be converted to the corresponding alcohol - heptanol; octanoic acid can be converted to the corresponding alcohol - octanol; nonanoic acid can be converted to the corresponding alcohol - nonanol; Decanoic acid can be converted to the corresponding alcohol - decanol and the like.

[068] Em um exemplo, o método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode resultar na formação de uma mistura de ácidos e/ou álcoois superiores. Em outro exemplo, os parâmetros do método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção podem ser ajustados para produzir mais de um ácido e/ou álcool superior em comparação ao resto. Por exemplo, com os seguintes parâmetros de crescimento de uma cultura mista em um meio complexo (0,25 g/l de NH4Cl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,31 g/l de K2HPO4, 0,23 g/l de KH2PO4, 2,5 g/l de NaHCO3, 1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de K- acetato, 20 g/l de etanol, 0,25 g/l de L-cisteína-HCl, 1,5 mg/l de FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l de ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l de MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l de ácido bórico, 190 μg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 μg/l de CuCl2 x 6 H2O, 24 μg/l de NÍCI2 x 6 H2O, 36 μg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 3 μg/l de Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 μg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 100 μg/l de vitamina B12, 80 μg/l de ácido p-aminobenzoico, 20 μg/l de biotina, 200 μg/l de ácido nicotínico, 100 μg/l de ácido Ca-pantotenoico, 300 μg/l de piridoxina-HCl, 200 μg/l de tiamina-HCl x H2O) a 37 °C, com um pH de cerca de 6,5 por cerca de 240 horas, a concentração de butanol e/ou a produção hexanol pode ser controlada.[068] In one example, the method according to any aspect of the present invention may result in the formation of a mixture of higher acids and/or alcohols. In another example, the parameters of the method according to any aspect of the present invention can be adjusted to produce more than one acid and/or alcohol higher than the rest. For example, with the following growth parameters of a mixed culture in a complex medium (0.25 g/l NH4Cl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.31 g/l K2HPO4, 0. 23 g/l KH2PO4, 2.5 g/l NaHCO3, 1 g/l yeast extract, 10 g/l K-acetate, 20 g/l ethanol, 0.25 g/l L- cysteine-HCl, 1.5 mg/l FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l boric acid, 190 μg/l COCl2 x 6 H2O, 2 µg/l CuCl2 x 6 H2O, 24 µg/l NCI2 x 6 H2O, 36 µg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 3 µg/l Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 µg/l Na2WO4 x 2 H2O, 100 μg/l vitamin B12, 80 μg/l p-aminobenzoic acid, 20 μg/l biotin, 200 μg/l nicotinic acid, 100 μg/l capantothenoic acid, 300 μg/ l of pyridoxine-HCl, 200 μg/l of thiamine-HCl x H2O) at 37 °C, with a pH of about 6.5 for about 240 hours, butanol concentration and/or hexanol production can be controlled .

[069] Pode estar presente, na mistura de reação de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, oxigênio. Por conseguinte, o primeiro e segundo microrganismos, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, podem ser cultivados em condições aeróbicas. Em particular, o oxigênio pode ser fornecido ao meio aquoso, de acordo com qualquer aspecto da invenção, em um fluxo contínuo de gás. Mais em particular, a concentração de O2 no fluxo de gás pode ser de inferior a 1 % em volume da quantidade total de gás no fluxo de gás. Em particular, o oxigênio pode estar presente em uma faixa de concentração de 0,000005 a 2% em volume, 0,00005 a 2% em volume, 0,0005 a 2% em volume, 0,005 a 2% em volume, 0,05 a 2% em volume, 0,00005 a 1,5% em volume, 0,0005 a 1,5% em volume, 0,005 a 1,5% em volume, 0,05 a 1,5% em volume, 0,5 a 1,5% em volume, 0,00005 a 1% em volume, 0,0005 a 1% em volume, 0,005 a 1% em volume, 0,05 a 1% em volume, 0,5 a 1% em volume, 0,55 a 1% em volume, 0,60 a 1% em volume, particularmente na faixa de 0,60 a 1,5%, 0,65 a 1% e 0,70 a 1% em volume. Em particular, o microrganismo acetogênico é particularmente adequado quando a proporção de O2 na fase/fluxo gasoso é de cerca de 0,00005, 0,0005, 0,005, 0,05, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8. 0,9, 1, 1,5, 2% em volume, em relação ao volume de gás no fluxo de gás. Um especialista na técnica será capaz de usar qualquer um dos métodos conhecidos no estado da técnica para medir a concentração em volume de oxigênio no fluxo de gás. Em particular, o volume de oxigênio pode ser medido utilizando qualquer método conhecido no estado da técnica. Em um exemplo, a concentração de oxigênio em fase gasosa pode ser medida por uma sonda de imersão para detecção de oxigênio da PreSens Precision Sensing GmbH. A concentração de oxigênio pode ser medida por desativação de fluorescência, em que o grau de desativação se correlaciona com a pressão parcial de oxigênio na fase gasosa. Ainda mais em particular, o primeiro e segundo microrganismos, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, são capazes de trabalhar de forma ideal no meio aquoso quando o oxigênio é fornecido por um fluxo de gás com concentração de oxigênio inferior a 1% em volume do gás total, de cerca de 0,015% em volume do volume total de gás no fluxo de gás fornecido à mistura de reação.[069] Oxygen may be present in the reaction mixture according to any aspect of the present invention. Therefore, the first and second microorganisms according to any aspect of the present invention can be grown under aerobic conditions. In particular, oxygen may be supplied to the aqueous medium, in accordance with any aspect of the invention, in a continuous flow of gas. More particularly, the O2 concentration in the gas stream may be less than 1% by volume of the total amount of gas in the gas stream. In particular, oxygen may be present in a concentration range of 0.000005 to 2% by volume, 0.00005 to 2% by volume, 0.0005 to 2% by volume, 0.005 to 2% by volume, 0, 05 to 2% by volume, 0.00005 to 1.5% by volume, 0.0005 to 1.5% by volume, 0.005 to 1.5% by volume, 0.05 to 1.5% by volume, 0 .5 to 1.5% by volume, 0.00005 to 1% by volume, 0.0005 to 1% by volume, 0.005 to 1% by volume, 0.05 to 1% by volume, 0.5 to 1% by volume, 0.55 to 1% by volume, 0.60 to 1% by volume, particularly in the range of 0.60 to 1.5%, 0.65 to 1% and 0.70 to 1% by volume. In particular, the acetogenic microorganism is particularly suitable when the O2 ratio in the gas phase/flow is about 0.00005, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5, 0.6, 0.7, 0 ,8. 0.9, 1, 1.5, 2% by volume, based on the volume of gas in the gas stream. A person skilled in the art will be able to use any of the methods known in the prior art to measure the volume concentration of oxygen in the gas stream. In particular, the volume of oxygen can be measured using any method known in the art. In one example, the gas phase oxygen concentration can be measured by an immersion oxygen detection probe from PreSens Precision Sensing GmbH. The oxygen concentration can be measured by fluorescence quenching, where the degree of quenching correlates with the partial pressure of oxygen in the gaseous phase. Even more particularly, the first and second microorganisms, according to any aspect of the present invention, are able to work optimally in the aqueous medium when oxygen is supplied by a gas flow with an oxygen concentration of less than 1% by volume of the total gas, about 0.015% by volume of the total volume of gas in the gas stream supplied to the reaction mixture.

[070] O meio aquoso, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode compreender oxigênio. O oxigênio pode ser dissolvido no meio por quaisquer meios conhecidos no estado da técnica. Em particular, o oxigênio pode estar presente a 0,5 mg/l. Em particular, a concentração de oxigênio livre dissolvido no meio aquoso pode ser de, pelo menos, 0,01 mg/l. Em outro exemplo, o oxigênio dissolvido pode ser cerca de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 mg/l. Em particular, a concentração de oxigênio dissolvido pode ser 0,01 a 0,5mg/l, 0.01 a 0,4 mg/l, 0,01 a 0,3 mg/l, 0,01 a 0,1 mg/l. Em particular, o oxigênio pode ser fornecido ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. Mais em particular, o meio aquoso pode compreender oxigênio e uma fonte de carbono compreendendo CO e/ou CO2. Mais em particular, o oxigênio e uma fonte de carbono que compreende CO e/ou CO2 é fornecida ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. Ainda mais em particular, o fluxo contínuo de gás compreende gás de síntese e oxigênio. Em um exemplo, ambos os gases são parte do mesmo fluxo/corrente. Em outro exemplo, cada gás é um fluxo/corrente separado fornecido ao meio aquoso. Estes gases podem ser divididos, por exemplo, usando bicos separados que se abrem para dentro do meio aquoso, fritas, membranas no interior do tubo de fornecimento do gás para o meio aquoso e semelhantes. O oxigênio pode ser oxigênio livre. De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, "uma mistura de reação compreendendo oxigênio livre" se refere à mistura de reação compreendendo oxigênio elementar na forma de O2. O O2 pode ser oxigênio dissolvido na mistura de reação. Em particular, o oxigênio dissolvido pode estar na concentração de > 5ppm (0,000005 % em vol.; 5x10-6). Um especialista na técnica será capaz de utilizar qualquer método conhecido no estado da técnica para medir a concentração de oxigênio dissolvido. Em um exemplo, o oxigênio dissolvido pode ser medido por sondas se imersão para oxigênio (do Tipo PSt6 da PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Alemanha).[070] The aqueous medium, according to any aspect of the present invention, may comprise oxygen. Oxygen can be dissolved in the medium by any means known in the prior art. In particular, oxygen may be present at 0.5 mg/l. In particular, the concentration of free oxygen dissolved in the aqueous medium can be at least 0.01 mg/l. In another example, dissolved oxygen might be about 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/l. In particular, the dissolved oxygen concentration can be 0.01 to 0.5mg/l, 0.01 to 0.4mg/l, 0.01 to 0.3mg/l, 0.01 to 0.1mg/l . In particular, oxygen can be supplied to the aqueous medium in a continuous gas flow. More particularly, the aqueous medium may comprise oxygen and a carbon source comprising CO and/or CO2. More particularly, oxygen and a carbon source comprising CO and/or CO2 is supplied to the aqueous medium in a continuous gas flow. Even more particularly, the continuous gas flow comprises synthesis gas and oxygen. In one example, both gases are part of the same flow/current. In another example, each gas is a separate flow/stream supplied to the aqueous medium. These gases can be divided, for example, using separate nozzles that open into the aqueous medium, frits, membranes inside the gas supply tube for the aqueous medium, and the like. The oxygen may be free oxygen. According to any aspect of the present invention, "a reaction mixture comprising free oxygen" refers to the reaction mixture comprising elemental oxygen in the form of O2. The O2 can be dissolved oxygen in the reaction mixture. In particular, dissolved oxygen can be at a concentration of > 5ppm (0.000005 vol.%; 5x10-6). A person skilled in the art will be able to use any method known in the prior art to measure dissolved oxygen concentration. In one example, dissolved oxygen can be measured by oxygen immersion probes (Type PSt6 from PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany).

[071] Em um exemplo de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a fonte de carbono é gás de síntese e a fonte de carbono pode ser misturada com o oxigênio gás antes de ser fornecida ao meio aquoso. Este etapa de mistura pode melhorar a eficiência e a produção de álcoois superiores na reação. A eficiência global, produtividade de álcool e/ou captura geral de carbono do método da presente invenção pode ser dependente da estequiometria do CO2, CO, H2 e O2 no fluxo contínuo de gás. O fluxo contínuo de gás usado pode ser composto de O2, CO2 e H2. Em particular, no fluxo contínuo de gás, a faixa de concentração de O2 pode ser de 0,000005 % a 1 % em volume, de CO/CO2 de cerca de 10 a 50 %, em particular 33 % em volume e de H2 pode estar na faixa de 44 % a 84 %, em particular, 64 a 66,04 % em volume. Mais em particular, a concentração dos gases no fluxo contínuo de gás pode ser de 0,15 % em volume de O2, 32 % em volume de CO/CO2 e 64 % em volume de H2. Em outro exemplo, o fluxo contínuo de gás também pode incluir gases inertes, como N2, até uma concentração de N2 de até 50 % em volume.[071] In an example according to any aspect of the present invention, the carbon source is synthesis gas and the carbon source can be mixed with the oxygen gas before being supplied to the aqueous medium. This mixing step can improve the efficiency and production of higher alcohols in the reaction. The overall efficiency, alcohol productivity and/or overall carbon capture of the method of the present invention may be dependent on the stoichiometry of CO2, CO, H2 and O2 in the continuous gas stream. The continuous flow of used gas can be composed of O2, CO2 and H2. In particular, in continuous gas flow, the concentration range for O2 can be from 0.000005% to 1% by volume, of CO/CO2 from about 10 to 50%, in particular 33% by volume, and of H2 can be be in the range of 44% to 84%, in particular 64 to 66.04% by volume. More particularly, the concentration of the gases in the continuous gas flow may be 0.15% by volume O2, 32% by volume CO/CO2 and 64% by volume H2. In another example, the continuous gas flow can also include inert gases such as N2 up to an N2 concentration of up to 50% by volume.

[072] Um especialista na técnica compreenderá que pode ser necessário monitorar a composição e as vazões das correntes em intervalos relevantes. O controle da composição da corrente pode ser obtido através da variação das proporções das correntes constituintes, para atingir um alvo ou uma composição desejável. A composição e a vazão da corrente combinada podem ser monitoradas por qualquer meio conhecido no estado da técnica. Em um exemplo, o sistema está adaptado para monitorar continuamente as vazões e as composições de, pelo menos, duas correntes e combiná-las para produzir uma única corrente de substrato misturado, em um fluxo contínuo de gás com composição ideal e meios para fazer passar o fluxo de substrato ideal na cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção.[072] One skilled in the art will understand that it may be necessary to monitor the composition and flow rates of streams at relevant intervals. Control of stream composition can be achieved by varying the proportions of constituent streams to achieve a target or desirable composition. The composition and flow rate of the combined stream can be monitored by any means known in the prior art. In one example, the system is adapted to continuously monitor the flow rates and compositions of at least two streams and combine them to produce a single stream of mixed substrate, in a continuous flow of gas with ideal composition and means for passing it. the ideal substrate flux in mixed culture, according to any aspect of the present invention.

[073] É vantajoso incorporar O2 na mistura de reação e/ou no fluxo de gás sendo fornecido à mistura de reação, já que a maioria dos gases residuais, incluindo gás de síntese, compreende oxigênio em quantidades pequenas ou grandes. É difícil e caro remover este oxigênio antes do uso do gás de síntese como fonte de carbono para a produção de álcoois superiores. O método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção permite a produção de pelo menos um álcool superior sem a necessidade de primeiro remover qualquer traço de oxigênio da fonte de carbono. Isto permite economia de tempo e dinheiro.[073] It is advantageous to incorporate O2 into the reaction mixture and/or into the gas stream being supplied to the reaction mixture, as most waste gases, including synthesis gas, comprise oxygen in small or large amounts. It is difficult and expensive to remove this oxygen before using syngas as a carbon source for the production of higher alcohols. The method according to any aspect of the present invention allows the production of at least one higher alcohol without the need to first remove any trace oxygen from the carbon source. This saves time and money.

[074] Em um exemplo, onde O2 está presente na mistura de reação, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o primeiro microrganismo, as bactérias acetogênicas, pode estar presente em duas fases de crescimento. Em um exemplo pelo menos uma bactéria acetogênica pode estar na fase de crescimento exponencial e as outras bactérias acetogênicas podem estar em qualquer outra fase de crescimento do ciclo de vida de um microrganismo acetogênico. Em particular, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, as bactérias acetogênicas no meio aquoso podem compreender uma bactéria acetogênica em uma fase de crescimento exponencial e outra na fase estacionária. Na presença de oxigênio, sem a presença de bactérias acetogênicas em crescimento exponencial, as bactérias acetogênicas na fase estacionária podem não ser capazes de produzir acetato e/ou etanol. Este fenômeno é confirmado, pelo menos, por Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013 e outros semelhantes. Os inventores descobriram assim, surpreendentemente, que na presença de bactérias acetogênicas em crescimento exponencial, as bactérias acetogênicas em qualquer fase de crescimento podem respirar e produzir aerobicamente acetato e/ou etanol em quantidades maiores ou iguais às quantidades produzidas quando a mistura de reação não tem oxigênio. Em um exemplo, as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial podem ser capazes de remover o oxigênio livre da mistura de reação, proporcionando um ambiente adequado (sem oxigênio livre) para as bactérias acetogênicas, em qualquer fase de crescimento, metabolizarem o substrato de carbono compreendendo CO e produzirem acetato e/ou etanol.[074] In an example, where O2 is present in the reaction mixture, according to any aspect of the present invention, the first microorganism, the acetogenic bacteria, can be present in two phases of growth. In one example at least one acetogenic bacteria can be in the exponential growth phase and the other acetogenic bacteria can be in any other growth phase of the life cycle of an acetogenic microorganism. In particular, according to any aspect of the present invention, the acetogenic bacteria in the aqueous medium may comprise one acetogenic bacteria in an exponential growth phase and another in a stationary phase. In the presence of oxygen, without the presence of exponentially growing acetogenic bacteria, acetogenic bacteria in the stationary phase may not be able to produce acetate and/or ethanol. This phenomenon is at least confirmed by Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013 and similar others. The inventors thus discovered, surprisingly, that in the presence of exponentially growing acetogenic bacteria, acetogenic bacteria at any stage of growth can respire and aerobically produce acetate and/or ethanol in amounts greater than or equal to the amounts produced when the reaction mixture has no oxygen. In one example, acetogenic bacteria in the exponential growth phase may be able to remove free oxygen from the reaction mixture, providing a suitable environment (without free oxygen) for acetogenic bacteria, in any phase of growth, to metabolize the carbon substrate. comprising CO and producing acetate and/or ethanol.

[075] Em outro exemplo, o meio aquoso já pode compreender bactérias acetogênicas em qualquer fase de crescimento, particularmente na fase estacionária, na presença de uma fonte de carbono compreendendo CO. Neste exemplo, pode haver oxigênio presente na fonte de carbono fornecida ao meio aquoso ou no meio aquoso em si. Na presença de oxigênio, as bactérias acetogênicas podem estar inativas e não produzir acetato e/ou etanol antes da adição das bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial. Neste mesmo exemplo, as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial podem ser adicionadas ao meio aquoso. As bactérias acetogênicas inativas já existentes no meio aquoso podem, então, ser ativadas e podem começar a produzir acetato e/ou etanol.[075] In another example, the aqueous medium can already comprise acetogenic bacteria in any phase of growth, particularly in the stationary phase, in the presence of a carbon source comprising CO. In this example, there may be oxygen present in the carbon source supplied to the aqueous medium or in the aqueous medium itself. In the presence of oxygen, the acetogenic bacteria may be inactive and not produce acetate and/or ethanol before the addition of the acetogenic bacteria in the exponential growth phase. In this same example, acetogenic bacteria in the exponential growth phase can be added to the aqueous medium. Inactive acetogenic bacteria already present in the aqueous medium can then be activated and can begin to produce acetate and/or ethanol.

[076] Em outro exemplo, as bactérias acetogênicas em qualquer fase de crescimento podem, primeiramente, ser misturadas com as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial e, em seguida, adicionadas a fonte de carbono e/ou oxigênio.[076] In another example, acetogenic bacteria in any growth phase can first be mixed with acetogenic bacteria in the exponential growth phase and then added to a carbon and/or oxygen source.

[077] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, um microrganismo na fase de crescimento exponencial na presença de oxigênio pode resultar na adaptação do microrganismo em crescer e metabolizar na presença de oxigênio. Em particular, o microrganismo pode ser capaz de remover o oxigênio do ambiente em torno dele. Esta adaptação recém-adquirida permite que as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial livrem o ambiente de oxigênio e, portanto, produzam acetato e etanol a partir da fonte de carbono. Em particular, a nova adaptação recém-adquirida das bactérias acetogênicas permite que estas convertam a fonte de carbono, compreendendo CO, em acetato e/ou etanol e um ácido recém-formado no álcool superior correspondente, na presença de álcool. O segundo microrganismo selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri e C.Carboxidivorans pode converter o acetato e/ou etanol para formar o ácido recém-formado. Conforme mencionado anteriormente, é vantajoso que este processo seja realizado na presença de O2 (ou seja, incluir O2 na mistura de reação), já que a maioria dos gases residuais, incluindo gás de síntese, compreende oxigênio em quantidades pequenas ou grandes. Esta mistura de reação permite um método de produção de álcoois superiores a partir de gases residuais, sem que seja necessária a etapa adicional cara de extração de oxigênio primeiro.[077] According to any aspect of the present invention, a microorganism in the exponential growth phase in the presence of oxygen can result in the adaptation of the microorganism to grow and metabolize in the presence of oxygen. In particular, the microorganism may be able to remove oxygen from the environment around it. This newly acquired adaptation allows acetogenic bacteria in the exponential growth phase to rid the environment of oxygen and therefore produce acetate and ethanol from the carbon source. In particular, the newly acquired novel adaptation of acetogenic bacteria allows them to convert the carbon source, comprising CO, into acetate and/or ethanol and a newly formed acid into the corresponding higher alcohol, in the presence of alcohol. The second microorganism selected from the group consisting of Clostridium kluyveri and C.Carboxidivorans can convert acetate and/or ethanol to form the newly formed acid. As mentioned earlier, it is advantageous for this process to be carried out in the presence of O2 (i.e., including O2 in the reaction mixture), as most waste gases, including synthesis gas, comprise oxygen in small or large amounts. This reaction mixture allows for a method of producing higher alcohols from waste gases without the additional expensive step of extracting oxygen first.

[078] A mistura de reação, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode, portanto, compreender CO, oxigênio livre e bactérias acetogênicas em uma fase de crescimento exponencial.[078] The reaction mixture, according to any aspect of the present invention, may therefore comprise CO, free oxygen and acetogenic bacteria in an exponential growth phase.

[079] Um especialista na técnica compreenderá as diferentes fases de crescimento de microrganismos e os métodos para medi-las e identificá-las. Em particular, a maioria dos microrganismos em cultura em lotes (bateladas) pode ser encontrada em, pelo menos, quatro fases de crescimento diferentes, nomeadamente: fase lag (A), fase log ou fase exponencial (B), fase estacionária (C) e fase de declínio (D). A fase log pode ser dividida ainda em fase log precoce e fase log/exponencial média para tardia. A fase estacionária também pode ser adicionalmente distinguida em fase estacionária precoce e fase estacionária. Por exemplo, Cotter, J.L., 2009, Najafpour. G., 2006, Younesi, H., 2005, e Kopke, M., 2009 divulgam diferentes fases de crescimento de bactérias acetogênicas. Em particular, a fase de crescimento das células pode ser medida usando métodos descritos, pelo menos, em Shuler M.L., 1992 e Fuchs G., 2007.[079] A person skilled in the art will understand the different stages of growth of microorganisms and the methods for measuring and identifying them. In particular, most microorganisms in batch (batch) culture can be found in at least four different growth phases, namely: lag phase (A), log phase or exponential phase (B), stationary phase (C) and decline phase (D). The log phase can be further divided into an early log phase and a medium to late log/exponential phase. The stationary phase can also be further distinguished into early stationary phase and stationary phase. For example, Cotter, J.L., 2009, Najafpour. G., 2006, Younesi, H., 2005, and Kopke, M., 2009 disclose different stages of growth of acetogenic bacteria. In particular, the growth phase of cells can be measured using methods described at least in Shuler M.L., 1992 and Fuchs G., 2007.

[080] A fase lag é a fase imediatamente após a inoculação das células em um meio fresco, a população permanece temporariamente inalterada. Embora não ocorra nenhuma divisão celular aparente, as células podem estar crescendo em volume ou massa, sintetizando enzimas, proteínas, RNA, etc. e aumentando a atividade metabólica. O comprimento da fase lag pode ser dependente de uma ampla variedade de fatores, incluindo o tamanho do inóculo; o tempo necessário para a recuperação de danos físicos ou do choque da transferência; o tempo necessário para a síntese de coenzimas essenciais ou fatores de divisão; e o tempo necessário para a síntese de novas enzimas (induzíveis), que são necessárias para metabolizar os substratos presentes no meio.[080] The lag phase is the phase immediately after the inoculation of cells in a fresh medium, the population remains temporarily unchanged. Although no apparent cell division is taking place, cells may be growing in volume or mass, synthesizing enzymes, proteins, RNA, etc. and increasing metabolic activity. The length of the lag phase can be dependent on a wide variety of factors, including inoculum size; the time required to recover from physical damage or transfer shock; the time required for the synthesis of essential coenzymes or splitting factors; and the time required for the synthesis of new (inducible) enzymes, which are necessary to metabolize the substrates present in the medium.

[081] A fase exponencial (log) de crescimento é um padrão de crescimento equilibrado, em que todas as células estão se dividindo regularmente por fissão binária e estão crescendo em progressão geométrica. As células se dividem a uma taxa constante, dependendo da composição do meio de crescimento e das condições de incubação. A taxa de crescimento exponencial de uma cultura bacteriana é expressa como o tempo de geração e também como o tempo de duplicação da população bacteriana. O tempo de geração (G) é definido como o tempo (t) por geração (n = número de gerações). Assim, G = t/n é a equação a partir da qual são derivados os cálculos de tempo de geração. A fase exponencial pode ser dividida em (i) fase log precoce e (ii) fase log/exponencial média para tardia. Um especialista na técnica pode facilmente identificar quando um microrganismo, em particular bactérias acetogênicas, entram na fase log. Por exemplo, o método para calcular a taxa de crescimento das bactérias acetogênicas, para determinar se elas estão na fase log, pode ser realizado usando o método ensinado, pelo menos, em Henstra A.M. de 2007. Em particular, o microrganismo na fase de crescimento exponencial, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode incluir células na fase log precoce e fase log/exponencial média para tardia.[081] The exponential (log) phase of growth is a balanced growth pattern where all cells are dividing regularly by binary fission and are growing in geometric progression. Cells divide at a constant rate, depending on the composition of the growth medium and the incubation conditions. The exponential growth rate of a bacterial culture is expressed as the generation time and also as the doubling time of the bacterial population. The generation time (G) is defined as the time (t) per generation (n = number of generations). Thus, G = t/n is the equation from which generation time calculations are derived. The exponential phase can be divided into (i) early log phase and (ii) medium to late log/exponential phase. A person skilled in the art can easily identify when a microorganism, in particular acetogenic bacteria, enters the log phase. For example, the method to calculate the growth rate of acetogenic bacteria, to determine whether they are in the log phase, can be carried out using the method taught at least in Henstra A.M. 2007. In particular, the microorganism in the growth phase exponential, in accordance with any aspect of the present invention, may include cells in early log phase and mid to late log/exponential phase.

[082] A fase estacionária é a fase em que o crescimento exponencial termina, já que o crescimento exponencial não pode ser mantido para sempre em uma cultura em batelada (por exemplo, um sistema fechado tal como um tubo de ensaio ou balão). O crescimento populacional é limitado por um de três fatores: 1. exaustão de nutrientes disponíveis; 2. acumulação de metabólitos ou produtos finais inibitórios; 3. exaustão do espaço, neste caso denominado de falta de "espaço biológico". Durante a fase estacionária, se as células viáveis estiverem sendo contadas, não pode ser determinado se algumas células estão morrendo e um número igual de células está se dividindo, ou se a população de células simplesmente parou de crescer e de se dividir. A fase estacionária, como a fase lag, não é necessariamente um período de repouso/imutabilidade. As bactérias que produzem metabólitos secundários, tais como antibióticos, o fazem durante a fase estacionária do ciclo de crescimento (metabólitos secundários são definidos como metabólitos produzidos após a fase ativa de crescimento).[082] The stationary phase is the phase where exponential growth ends, as exponential growth cannot be maintained forever in a batch culture (eg, a closed system such as a test tube or flask). Population growth is limited by one of three factors: 1. exhaustion of available nutrients; 2. accumulation of metabolites or inhibitory end products; 3. exhaustion of space, in this case called lack of "biological space". During the stationary phase, if viable cells are being counted, it cannot be determined whether some cells are dying and an equal number of cells are dividing, or whether the cell population has simply stopped growing and dividing. The stationary phase, like the lag phase, is not necessarily a period of rest/immutability. Bacteria that produce secondary metabolites, such as antibiotics, do so during the stationary phase of the growth cycle (secondary metabolites are defined as metabolites produced after the active phase of growth).

[083] A fase de declínio se segue à fase estacionária. Durante a fase de declínio, o número de células viáveis diminui geometricamente (exponencialmente), essencialmente o inverso do crescimento durante a fase log.[083] The decline phase follows the stationary phase. During the decline phase, the number of viable cells decreases geometrically (exponentially), essentially the inverse of the growth during the log phase.

[084] Em um exemplo, as bactérias acetogênicas, no método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, podem compreender uma combinação de células: células na fase log e células na fase estacionária. No método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, as células acetogênicas na fase log podem compreender uma taxa de crescimento selecionada do grupo que consiste em 0,01 a 2 h-1, 0,01 a 1 h-1, 0,05 a 1 h-1, 0,05 a 2 h-1, 0,05 a 0,5 h-1 e semelhantes. Em um exemplo, a OD600 de células da fase log das células acetogênicas na mistura de reação pode ser selecionada do intervalo que consiste em 0,001 a 2, 0,01 a 2, 0,1 a 1, 0,1 a 0,5 e semelhantes. Um especialista na técnica será capaz de usar qualquer método conhecido no estado da técnica para medir a OD600 e determinar a taxa de crescimento das células na mistura de reação e/ou a serem adicionadas na mistura de reação. Por exemplo, pode ser usado Koch (1994). Em particular, o crescimento bacteriano pode ser determinado e controlado usando métodos diferentes. Um dos mais comuns é uma medida da turbidez, que depende da densidade óptica (OD) de bactérias em suspensão e utiliza um espectrofotômetro. A OD pode ser medida a 600 nm usando um espectrômetro de UV.[084] In one example, acetogenic bacteria, in the method according to any aspect of the present invention, may comprise a combination of cells: cells in the log phase and cells in the stationary phase. In the method according to any aspect of the present invention, the acetogenic cells in the log phase may comprise a growth rate selected from the group consisting of 0.01 to 2 h-1, 0.01 to 1 h-1, 0.05 to 1 h -1 , 0.05 to 2 h -1 , 0.05 to 0.5 h -1 and the like. In one example, the OD600 of log phase cells of acetogenic cells in the reaction mixture can be selected from the range consisting of 0.001 to 2, 0.01 to 2, 0.1 to 1, 0.1 to 0.5 and similar. A person skilled in the art will be able to use any method known in the art to measure the OD600 and determine the growth rate of cells in the reaction mixture and/or to be added to the reaction mixture. For example, Koch (1994) can be used. In particular, bacterial growth can be determined and controlled using different methods. One of the most common is a measurement of turbidity, which depends on the optical density (OD) of suspended bacteria and uses a spectrophotometer. The DO can be measured at 600 nm using a UV spectrometer.

[085] Em um exemplo, o método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção compreende a mistura de (i) oxigênio livre, (ii) um lote de células acetogênicas na fase log, (iii) um lote de células acetogênicas na fase estacionária, (iii) um lote de Clostridium kluyveri e (iv) uma fonte de carbono compreendendo CO, juntos. As células acetogênicas na fase log permitem que quaisquer outras células acetogênicas no meio aquoso produzam acetato e/ou etanol na presença de oxigênio. A concentração de células acetogênicas na fase log pode ser mantida, na mistura de reação. Portanto, em qualquer ponto no tempo da reação, a mistura de reação compreende células acetogênicas na fase log e células acetogênicas em outra fase de crescimento, por exemplo, na fase estacionária.[085] In one example, the method according to any aspect of the present invention comprises mixing (i) free oxygen, (ii) a batch of acetogenic cells in the log phase, (iii) a batch of acetogenic cells in the stationary phase , (iii) a batch of Clostridium kluyveri and (iv) a carbon source comprising CO, together. Ketogenic cells in the log phase allow any other keto cells in the aqueous medium to produce acetate and/or ethanol in the presence of oxygen. The concentration of acetogenic cells in the log phase can be maintained in the reaction mixture. Therefore, at any point in the time of the reaction, the reaction mixture comprises acetogenic cells in the log phase and acetogenic cells in another phase of growth, for example, in the stationary phase.

[086] O método, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode compreender ainda a etapa de extração do álcool superior produzido. Um especialista na técnica saberá os meios para fazer isso, com base nos métodos conhecidos no estado da técnica.[086] The method, according to any aspect of the present invention, may further comprise the step of extracting the higher alcohol produced. A person skilled in the art will know the means for doing this, based on methods known in the prior art.

[087] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um uso da mistura de reação de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, para a produção de pelo menos um álcool superior compreendendo, pelo menos, 6 átomos de carbono. Em particular, o álcool superior é produzido a partir de pelo menos uma fonte de carbono compreendendo CO.[087] According to another aspect of the present invention, there is provided a use of the reaction mixture according to any aspect of the present invention, for the production of at least one higher alcohol comprising at least 6 carbon atoms. In particular, the higher alcohol is produced from at least one carbon source comprising CO.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[088] Não há figuras.[088] There are no figures.

[089] EXEMPLOS[089] EXAMPLES

[090] O texto acima descreve formas de realização preferidas, as quais, conforme será entendido por especialistas na técnica, podem estar sujeitas a variações ou modificações na concepção, construção e operação, sem se afastarem do escopo das reivindicações. Estas variações, por exemplo, se destinam a ser abrangidas pelo escopo das reivindicações.[090] The text above describes preferred embodiments, which, as will be understood by experts in the art, may be subject to variations or modifications in design, construction and operation, without departing from the scope of the claims. These variations, for example, are intended to fall within the scope of the claims.

[091] Exemplo 1[091] Example 1

[092] Co-cultivo de Clostridium ljungdahlii e Clostridium kluyveri em meio definido com hidrogênio e dióxido de carbono[092] Co-culture of Clostridium ljungdahlii and Clostridium kluyveri in defined medium with hydrogen and carbon dioxide

[093] Neste exemplo, C. ljungdahlii, como primeiro organismo, foi cultivado autotroficamente em meio definido, de modo a produzir acetato e etanol. Depois de determinado tempo, C. kluyveri como segundo organismo foi, então, inoculado no mesmo reator, para a conversão de acetato e etanol em butirato e hexanoato. Subsequentemente, C. ljungdahlii converte butirato em butanol.[093] In this example, C. ljungdahlii, as the first organism, was grown autotrophically in a defined medium, in order to produce acetate and ethanol. After a certain time, C. kluyveri as a second organism was then inoculated into the same reactor for the conversion of acetate and ethanol into butyrate and hexanoate. Subsequently, C. ljungdahlii converts butyrate to butanol.

[094] Foi usado um meio definido para o pré-cultivo de ambos os microrganismos consistindo em 2 g/l de (NH4)2HPO4, 0,2 g/l de NaCl, 0,15 g/l de KCl, 1 g/l de KOH, 0,5 g/l de MgCl2 x 6 H2O, 0,2 g/l de CaCl2 x 2 H2O, 15 mg/l de FeCl2 x 4 H2O, 0,4 g/l de L-cisteína-HCl, 0,4 g/l de Na2S x 9 H2O, 3 mg/l de ácido bórico, 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O, 1 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O, 0,3 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,3 mg/l de MnSO4 x H2O, 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O, 0,1 mg/l de CuCl2 x 2 H2O, 0,1 mg/l de Na2SeO3, 106 μg/l de biotina, 5 μg/L de ácido fólico, 2,5 μg/l de piridoxina-HCl, 266 μg/l de tiamina-HCl x H2O, 12,5 μg/l de riboflavina, 12,5 μg/l de ácido nicotínico, 413 μg/l de ácido Ca-pantotenoico, 12,5 μg/l de vitamina B12, 12,5 μg/l de ácido p-aminobenzoico, 15 μg/L ácido lipoico.[094] A defined medium was used for the pre-cultivation of both microorganisms consisting of 2 g/l of (NH4)2HPO4, 0.2 g/l of NaCl, 0.15 g/l of KCl, 1 g/ l KOH, 0.5 g/l MgCl2 x 6 H2O, 0.2 g/l CaCl2 x 2 H2O, 15 mg/l FeCl2 x 4 H2O, 0.4 g/l L-cysteine-HCl , 0.4 g/l Na2S x 9 H2O, 3 mg/l boric acid, 2 mg/l CoCl2 x 6 H2O, 1 mg/l ZnSO4 x 7 H2O, 0.3 mg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 0.3 mg/l MnSO4 x H2O, 0.2 mg/l NiCl2 x 6 H2O, 0.1 mg/l CuCl2 x 2 H2O, 0.1 mg/l Na2SeO3, 106 μg/ l of biotin, 5 μg/L of folic acid, 2.5 μg/l of pyridoxine-HCl, 266 μg/l of thiamine-HCl x H2O, 12.5 μg/l of riboflavin, 12.5 μg/l of nicotinic acid, 413 μg/l capantothenoic acid, 12.5 μg/l vitamin B12, 12.5 μg/l p-aminobenzoic acid, 15 μg/l lipoic acid.

[095] O cultivo autotrófico foi realizado em 250 ml de meio definido em um frasco de soro de 500 ml, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2, a uma taxa de 1 l/h. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. O pH foi mantido em uma faixa de pH 5,0 - 6,5 por adição contínua de uma solução padrão anaeróbica de KOH (40 g/l).[095] Autotrophic cultivation was carried out in 250 ml of defined medium in a 500 ml serum bottle, which was continuously gassed with synthesis gas consisting of 67% H2 and 33% CO2, at a rate of 1 l/ H. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 150 min-1. The pH was maintained in a range of pH 5.0 - 6.5 by continuous addition of an anaerobic standard KOH solution (40 g/l).

[096] No início da experiência, C. ljungdahlii foi inoculado com uma OD600 de 0,1, com células cultivadas de forma autotrófica. Portanto, o C. ljungdahlii foi cultivado em meio complexo, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2 a uma taxa de 3 l/h, em frascos de soro de 1 l com 500 ml de meio complexo. Foi usado um meio de cultura complexo consistindo em 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,8 g/l de NaCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/l de CaCl2 x 2 H2O, 20 g/L MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L-cisteína-HCl, 0,4 g/l de Na2S x 9 H2O, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnSO4 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O, 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O, 0,2 mg/l de Na2SeO4, 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l de biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 μg/l de piridoxina-HCl, 50 μg/l de tiamina-HCl x H2O, 50 μg/l de riboflavina, 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-ácido pantotenoico, 1 μg/l de vitamina B12, 50 μg/l de ácido p-aminobenzoico, 50 μg/l de ácido lipoico. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica, com uma OD600 de 0,67 e um pH de 4,69, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocular a experiência de co-cultura.[096] At the beginning of the experiment, C. ljungdahlii was inoculated at an OD600 of 0.1 with autotrophically cultured cells. Therefore, C. ljungdahlii was cultured in complex medium, under continuous gassing with synthesis gas consisting of 67% H2 and 33% CO2 at a rate of 3 l/h, in 1 l serum bottles with 500 ml of kinda complex. A complex culture medium consisting of 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.8 g/l NaCl, 0.1 g /l of KH2PO4, 20 mg/l of CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l MES, 1 g/l of yeast extract, 0.4 g/l of L-cysteine-HCl, 0.4 g/l of Na2S x 9 H2O, 20 mg/l nitrilotriacetic acid, 10 mg/l MnSO4 x H2O, 8 mg/l (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l CoCl2 x 6 H2O, 2 mg /l ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 0.2 mg/l NiCl2 x 6 H2O, 0.2 mg/l Na2SeO4 , 0.2 mg/l Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l biotin, 20 μg/l folic acid, 100 μg/l pyridoxine-HCl, 50 μg/l thiamine-HCl x H2O, 50 μg /l riboflavin, 50 μg/l nicotinic acid, 50 μg/l Ca-pantothenoic acid, 1 μg/l vitamin B12, 50 μg/l p-aminobenzoic acid, 50 μg/l lipoic acid. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 150 min-1. Cells were harvested in log phase, with an OD600 of 0.67 and a pH of 4.69, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the medium described above. This cell suspension was then used to inoculate the co-culture experiment.

[097] Paralelo a isso, C. kluyveri foi cultivado heterotroficamente em 200ml de meio complexo em frascos de soro de 500 ml em acetato e etanol. Foi usado um meio complexo consistindo em 0,25 g/l de NH4Cl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,31 g/l de K2HPO4, 0,23 g/l de KH2PO4, 2,5 g/l de NaHCO3, 1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de K-acetato, 20 g/l de etanol, 0,25 g/l de L-cisteína-HCl, 1,5 mg/l de FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l de ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l de MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l de ácido bórico, 190 μg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 μg/l de CuCl2 x 6 H2O, 24 μg/l de NÍCI2 x 6 H2O, 36 μg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 3 μg/l de Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 μg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 100 μg/l de vitamina B12, 80 μg/l de ácido p-aminobenzoico, 20 μg/l de biotina, 200 μg/l de ácido nicotínico, 100 μg/l de ácido Ca- pantotenoico, 300 μg/l de piridoxina-HCl, 200 μg/l de tiamina-HCl x H2O. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 100 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica, com uma OD600 de 0,81 e um pH de 5,96, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio descrito acima. A suspensão de células foi, então, usada para inocular a experiência de co-cultura com uma OD600 de 0,2, após 96 horas de duração da experiência.[097] Parallel to this, C. kluyveri was cultured heterotrophically in 200ml of complex medium in 500ml serum vials in acetate and ethanol. A complex medium consisting of 0.25 g/l NH4Cl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.31 g/l K2HPO4, 0.23 g/l KH2PO4, 2.5 g /l of NaHCO3, 1 g/l of yeast extract, 10 g/l of K-acetate, 20 g/l of ethanol, 0.25 g/l of L-cysteine-HCl, 1.5 mg/l of FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l boric acid, 190 μg/l COCl2 x 6 H2O, 2 μg/l CuCl2 x 6 H2O, 24 μg/l NIC2 x 6 H2O, 36 μg/l Na2MoO4 × 2 H2O, 3 μg/l Na2SeOO3 × 5 H2O, 4 μg/l Na2WO4 × 2 H2O, 100 μg/l vitamin B12 , 80 μg/l of p-aminobenzoic acid, 20 μg/l of biotin, 200 μg/l of nicotinic acid, 100 μg/l of capantothenoic acid, 300 μg/l of pyridoxine-HCl, 200 μg/l of thiamine-HCl x H2O. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 100 min-1. Cells were harvested in log phase, with an OD600 of 0.81 and a pH of 5.96, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the medium described above. The cell suspension was then used to inoculate the co-culture experiment with an OD 600 of 0.2 after the 96 hour duration of the experiment.

[098] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da OD600, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.[098] During the experiment, 5 ml samples were collected for the determination of OD600, pH and product concentrations. The latter was determined by quantitative 1H-NMR spectroscopy.

[099] Após a inoculação de C. ljungdahlii, as células começaram a crescer e a produzir acetato continuamente. Concomitante à produção de acetato, foi produzido etanol a uma taxa mais baixa, em comparação com a produção de acetato. Após 96 horas, C. kluyveri foi inoculado no reator e foi medida uma diminuição na concentração do etanol na sequencia da experiência. A produção simultânea de butirato (máx. 1163 mg/l) e hexanoato (máx. 136 mg/l) foi, então, medida nas 113 horas seguintes da experiência de. Paralelamente à produção de butirato pelo C. kluyveri, C. ljungdahlii converteu o butirato em butanol até uma concentração máxima de 20 mg/l de butanol no final da experiência. [099] After C. ljungdahlii inoculation, the cells began to grow and continuously produce acetate. Concurrent with acetate production, ethanol was produced at a lower rate compared to acetate production. After 96 hours, C. kluyveri was inoculated into the reactor and a decrease in ethanol concentration was measured in the sequence of the experiment. The simultaneous production of butyrate (max. 1163 mg/l) and hexanoate (max. 136 mg/l) was then measured over the next 113 hours of the experiment. Parallel to the production of butyrate by C. kluyveri, C. ljungdahlii converted butyrate into butanol up to a maximum concentration of 20 mg/l of butanol at the end of the experiment.

[100] Tabela 1. Resultados do Exemplo 1 (n.d. = não detectado)[100] Table 1. Results of Example 1 (n.d. = not detected)

[101] Exemplo 2[101] Example 2

[102] Co-cultivo de Clostridium ljungdahlii e Clostridium kluyveri em meio complexo com gás contendo CO (25 % de CO)[102] Co-culture of Clostridium ljungdahlii and Clostridium kluyveri in complex medium with CO gas (25% CO)

[103] C. ljungdahlii, como primeiro organismo, foi cultivado autotroficamente em meio complexo, de modo a produzir acetato e etanol. Depois de determinado tempo, C. kluyveri como segundo organismo foi, então, inoculado no mesmo reator, para a conversão de acetato e etanol em butirato e hexanoato. Subsequentemente, C. ljungdahlii converte butirato em butanol e hexanaoto em hexanol.[103] C. ljungdahlii, as the first organism, was grown autotrophically in complex medium to produce acetate and ethanol. After a certain time, C. kluyveri as a second organism was then inoculated into the same reactor for the conversion of acetate and ethanol into butyrate and hexanoate. Subsequently, C. ljungdahlii converts butyrate to butanol and hexanate to hexanol.

[104] Foi usado um meio complexo para o co-cultivo de ambos os microrganismos, consistindo em 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,8 g/l de NaCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/l de CaCl2 x 2 H2O, 20 g/L MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L-cisteína-HCl, 0,4 g/l de Na2S x 9 H2O, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnSO4 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O, 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O, 0,2 mg/l de Na2SeO4, 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l de biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 μg/l de piridoxina-HCl, 50 μg/l de tiamina-HCl x H2O, 50 μg/l de riboflavina, 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-ácido pantotenoico, 1 μg/l de vitamina B12, 50 μg/l de ácido p-aminobenzoico, 50 μg/l de ácido lipoico.[104] A complex medium was used for the co-cultivation of both microorganisms, consisting of 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0, 8 g/l NaCl, 0.1 g/l KH2PO4, 20 mg/l CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l MES, 1 g/l yeast extract, 0.4 g/l L- cysteine-HCl, 0.4 g/l Na2S x 9 H2O, 20 mg/l nitrilotriacetic acid, 10 mg/l MnSO4 x H2O, 8 mg/l (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 0.2 mg/l NiCl2 x 6 H2O, 0.2 mg/l Na2SeO4, 0.2 mg/l Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l biotin, 20 μg/l folic acid, 100 μg/l pyridoxine HCl, 50 μg /l thiamine-HCl x H2O, 50 μg/l riboflavin, 50 μg/l nicotinic acid, 50 μg/l Ca-pantothenoic acid, 1 μg/l vitamin B12, 50 μg/l p-acid aminobenzoic acid, 50 μg/l of lipoic acid.

[105] O cultivo autotrófico foi realizado em 500 ml de meio complexo em um frasco de soro de 1 l, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 5 % de H2, 25 % de CO2 e 45 % N2 a uma taxa de ~3,6 l/h (£ 0,5 ppm de oxigênio gás). O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 120 min-1. O pH não foi controlado durante esta experiência.[105] Autotrophic cultivation was performed on 500 ml of complex medium in a 1 L serum flask, which was continuously gassed with synthesis gas consisting of 5% H2, 25% CO2, and 45% N2 at a rate of ~3.6 l/hr (£0.5 ppm oxygen gas). The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 120 min-1. The pH was not controlled during this experiment.

[106] No início da experiência, C. ljungdahlii foi inoculado com uma OD600 de 0,1, com células cultivadas autotroficamente. Portanto, o C. ljungdahlii foi cultivado no meio complexo descrito acima, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2 a uma taxa de 3 l/h, em frascos de soro de 1 l com 500 ml de meio complexo. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma OD600 de 0,51 e um pH de 5,04, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio complexo descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocular a experiência de co-cultura.[106] At the start of the experiment, C. ljungdahlii was inoculated at an OD600 of 0.1 with autotrophically cultured cells. Therefore, C. ljungdahlii was cultured in the complex medium described above, under continuous gassing with synthesis gas consisting of 67% H2 and 33% CO2 at a rate of 3 L/h, in 1 L serum bottles with 500 ml of complex medium. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 150 min-1. Cells were harvested in late log phase, with an OD600 of 0.51 and a pH of 5.04, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the complex medium described above. This cell suspension was then used to inoculate the co-culture experiment.

[107] Paralelo a isso, C. kluyveri foi cultivado heterotroficamente em 200 ml de meio complexo em frascos de soro de 500 ml em acetato e etanol. Foi usado um meio complexo consistindo em 0,25 g/l de NH4Cl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,31 g/l de K2HPO4, 0,23 g/l de KH2PO4, 2,5 g/l de NaHCO3, 1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de K-acetato, 20 g/l de etanol, 0,25 g/l de L-cisteína-HCl, 1,5 mg/l de FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l de ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l de MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l de ácido bórico, 190 μg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 μg/l de CuCl2 x 6 H2O, 24 μg/l de NÍCI2 x 6 H2O, 36 μg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 3 μg/l de Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 μg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 100 μg/l de vitamina B12, 80 μg/l de ácido p-aminobenzoico, 20 μg/l de biotina, 200 μg/l de ácido nicotínico, 100 μg/l de ácido Ca- pantotenoico, 300 μg/l de piridoxina-HCl, 200 μg/l de tiamina-HCl x H2O. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 100 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica, com uma OD600 de 0,54 e um pH de 6,60, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio complexo descrito acima. A suspensão de células foi, então, usada para inocular a experiência de co-cultura após 240 horas de duração da experiência.[107] In parallel, C. kluyveri was grown heterotrophically in 200 ml of complex medium in 500 ml serum vials in acetate and ethanol. A complex medium consisting of 0.25 g/l NH4Cl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.31 g/l K2HPO4, 0.23 g/l KH2PO4, 2.5 g /l of NaHCO3, 1 g/l of yeast extract, 10 g/l of K-acetate, 20 g/l of ethanol, 0.25 g/l of L-cysteine-HCl, 1.5 mg/l of FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l boric acid, 190 μg/l COCl2 x 6 H2O, 2 μg/l CuCl2 x 6 H2O, 24 μg/l NIC2 x 6 H2O, 36 μg/l Na2MoO4 × 2 H2O, 3 μg/l Na2SeOO3 × 5 H2O, 4 μg/l Na2WO4 × 2 H2O, 100 μg/l vitamin B12 , 80 μg/l of p-aminobenzoic acid, 20 μg/l of biotin, 200 μg/l of nicotinic acid, 100 μg/l of capantothenoic acid, 300 μg/l of pyridoxine-HCl, 200 μg/l of thiamine-HCl x H2O. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 100 min-1. Cells were harvested in log phase, with an OD600 of 0.54 and a pH of 6.60, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the complex medium described above. The cell suspension was then used to inoculate the co-culture experiment after 240 hours of experiment duration.

[108] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da OD600, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.[108] During the experiment, 5 ml samples were collected for the determination of OD600, pH and product concentrations. The latter was determined by quantitative 1H-NMR spectroscopy.

[109] Após a inoculação do C. ljungdahlii, as células começaram a crescer e a produzir acetato continuamente até uma concentração de ~ 3 g/l e etanol até uma concentração de ~0,5 g/l, após 71 horas. No decurso de tempo seguinte da experiência, o acetato foi completamente convertido em etanol até uma concentração de 4,8 g/l, após 240 horas. Em um tempo de processo de 240 horas, C. kluyveri foi então inoculado no reator. Como este organismo necessita de acetato além do etanol como substrato, simultaneamente à inoculação do C. kluyveri foram adicionados anaerobicamente ao reator aproximadamente 3 g/l de acetato (na forma de Na-acetato). No decurso de tempo seguinte da experiência, foi medida a produção de butirato e hexanoato até concentrações de 1,6 g/l de cada. Paralelamente à produção de butirato e hexanoato pelo C. kluyveri, C. ljungdahlii converteu butirato em butanol, até uma concentração máxima de 690 mg/l de butanol e converteu hexanoato em hexanol até uma concentração máxima de 1478 mg/l de hexanol. [109] After inoculation of C. ljungdahlii, cells began to grow and continuously produce acetate to a concentration of ~3 g/l and ethanol to a concentration of ~0.5 g/l after 71 hours. In the next time course of the experiment, the acetate was completely converted into ethanol to a concentration of 4.8 g/l after 240 hours. In a process time of 240 hours, C. kluyveri was then inoculated into the reactor. As this organism needs acetate in addition to ethanol as a substrate, simultaneously with the inoculation of C. kluyveri, approximately 3 g/l of acetate (in the form of Na-acetate) was added anaerobically to the reactor. In the following time course of the experiment, the production of butyrate and hexanoate was measured up to concentrations of 1.6 g/l of each. Parallel to the production of butyrate and hexanoate by C. kluyveri, C. ljungdahlii converted butyrate into butanol, up to a maximum concentration of 690 mg/l of butanol, and converted hexanoate into hexanol, up to a maximum concentration of 1478 mg/l of hexanol.

[110] Tabela 2. Resultados do Exemplo 2 (n.d. = não detectado)[110] Table 2. Results of Example 2 (n.d. = not detected)

[111] Exemplo 3[111] Example 3

[112] Produção de acetato e etanol com Clostridium ljungdahlii a partir de gás de síntese sem oxigênio[112] Production of acetate and ethanol with Clostridium ljungdahlii from synthesis gas without oxygen

[113] Neste exemplo, C. ljungdahlii foi cultivado anaerobicamente em meio complexo, com gás de síntese consistindo em H2 e CO2 na ausência de oxigênio, de modo a produzir de acetato e etanol. Para a cultura celular do C. ljungdahlii, 2 ml de crio cultura foram cultivados anaerobicamente em 200 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCl, 1 g/l deNH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnSO4 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O; 0,2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O; 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O; 0,2 mg/l de Na2SeO4; 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l de d- biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 g/l de piridoxina-HCl, 50 μg/L tiamina-HCl x H2O; 50 μg/l de riboflavina; 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-pantotenato; 1 μg/l de vitamina B12; 50 μg/l de p-aminobenzoato; 50 μg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H2O. O cultivo foi realizado de forma quimilitoautotrófica em um frasco de vidro à prova de chamas de 1 l, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e uma fumigação de 1-3 l/h durante 161 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, montado no meio do reator em um tubo de gaseificação. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.[113] In this example, C. ljungdahlii was grown anaerobically in complex medium with synthesis gas consisting of H2 and CO2 in the absence of oxygen, in order to produce acetate and ethanol. For cell culture of C. ljungdahlii, 2 ml of cryoculture were cultivated anaerobically in 200 ml of medium (ATCC1754 medium: pH 6.0; 20 g/l MES; 1 g/l yeast extract, 0.8 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.1 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O; 0.02 g/l CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l of nitrilotriacetic acid, 10 mg/l of MnSO4 x H2O; 8 mg/l of (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l of CoCl2 x 6 H2O; 2 mg /l of ZnSO4 x 7 H2O; 0.2 mg/l of CuCl2 x 2 H2O; 0.2 mg/l of Na2MoO4 x 2 H2O; 0.2 mg/l of NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/l of Na2SeO4; 0.2 mg/l of Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l of d-biotin, 20 μg/l of folic acid, 100 g/l of pyridoxine-HCl, 50 μg/L of thiamine-HCl x H2O ; 50 μg/l riboflavin; 50 μg/l nicotinic acid, 50 μg/l capantothenate; 1 μg/l vitamin B12; 50 μg/l p-aminobenzoate; 50 μg/l lipoic acid, approximately 67.5 mg/l of NaOH) with approximately 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride and 400 mg/l of Na2S x 9 H2O. Cultivation was carried out in a chemolithoautotrophic manner in a 1 L flameproof glass flask, with a premixed gaseous mixture composed of 67% H2, 33% CO2, in a shaker with an open water bath at 37° C, 150 rpm and a fumigation of 1-3 l/h for 161 h. The inlet of gas into the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, mounted in the middle of the reactor in a gasification tube. Cells were centrifuged, washed with 10 ml of ATCC medium and centrifuged again.

[114] Para a pré-cultura, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. ljungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma OD600 de 0,12. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 65 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de tampão de produção (pH 6,2; 0,5 g/l de KOH, areado durante 1 h com uma mistura gasosa pré-misturada de 67 % de H2, 33 % de CO2 a 1 l/h), lavadas e centrifugadas novamente .[114] For pre-culturing, many washed cells from the C. ljungdahlii growth culture were transferred to 200 ml ATCC medium with about 400 mg/l L-cysteine hydrochloride and grown to an OD600 of 0.12 . Cultivation was carried out in a 500 ml pressure-resistant glass flask, with a premixed gaseous mixture composed of 67% H2, 33% CO2, in a shaker with an open water bath at 37 °C, 150 rpm and with aeration of 3 l/h for 65 h. The gas inlet in the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, placed in the center of the reactors. The cells were centrifuged, washed with 10 ml of production buffer (pH 6.2; 0.5 g/l KOH, aerated for 1 h with a premixed gaseous mixture of 67% H2, 33% CO2 to 1 l/h), washed and centrifuged again.

[115] Para a pré-cultura, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. ljungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma OD600 de 0,12. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 118 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. Quando o pH caiu abaixo de 5,0, foi adicionado 1 ml de uma solução a 140 g/l de KOH. Ao coletar as amostras, cada amostra de 5 ml foi removida para determinação da OD600, pH e da faixa de produtos. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP).[115] For pre-culturing, many washed cells from the C. ljungdahlii growth culture were transferred to 200 ml ATCC medium with about 400 mg/l L-cysteine hydrochloride and grown to an OD600 of 0.12 . Cultivation was carried out in a 500 ml pressure-resistant glass flask, with a premixed gaseous mixture composed of 67% H2, 33% CO2, in a shaker with an open water bath at 37 °C, 150 rpm and with aeration of 3 l/h for 118 h. The gas inlet in the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, placed in the center of the reactors. When the pH dropped below 5.0, 1 ml of a 140 g/l KOH solution was added. When collecting samples, each 5 ml sample was removed for OD600, pH and product range determination. Determination of product concentration was performed by semiquantitative 1H-NMR spectroscopy. Sodium trimethylsilyl propionate was used as an internal quantitation standard (T(M)SP).

[116] Durante o período de cultura de 118 horas, a densidade celular na cultura de produção permaneceu constante, reconhecível por uma OD600 de 0,2 estagnada, que corresponde a uma taxa de crescimento de μ = 0 h-1. Ao mesmo tempo, a concentração de acetato aumentou significativamente de 4 mg/l para 3194 mg/l e a concentração de etanol de 17 mg/l para 108 mg/l.[116] During the 118 hour culture period, the cell density in the production culture remained constant, recognizable by a stagnant OD600 of 0.2, which corresponds to a growth rate of μ = 0 h-1. At the same time, the acetate concentration increased significantly from 4 mg/l to 3194 mg/l and the ethanol concentration from 17 mg/l to 108 mg/l.

[117] Exemplo 4[117] Example 4

[118] Nenhuma produção de acetato e etanol com Clostridium ljungdahlii a partir de gás de síntese compreendendo CO2 e H2 com oxigênio[118] No production of acetate and ethanol with Clostridium ljungdahlii from synthesis gas comprising CO2 and H2 with oxygen

[119] C. ljungdahlii foi cultivado em meio complexo com gás de síntese e oxigênio. C. ljungdahlii foi cultivado, primeiramente, na presença de gás de síntese consistindo em H2 e CO2 na ausência de oxigênio, de modo a produzir de acetato e etanol. Para o cultivo, as células foram cultivadas em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma tampa de borracha de butila. Todas as etapas nas quais as células de C. ljungdahlii estavam envolvidas foram realizadas em condições anaeróbicas.[119] C. ljungdahlii was grown in complex medium with synthesis gas and oxygen. C. ljungdahlii was first grown in the presence of synthesis gas consisting of H2 and CO2 in the absence of oxygen, in order to produce acetate and ethanol. For cultivation, cells were grown in pressure-resistant glass vials that could be tightly closed with a butyl rubber stopper. All steps in which C. ljungdahlii cells were involved were performed under anaerobic conditions.

[120] Para a cultura celular do C. ljungdahlii, 2 ml de crio cultura foram cultivados anaerobicamente em 200 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCl, 1 g/l deNH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnSO4 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O; 0,2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O; 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O; 0,2 mg/l de Na2SeO4; 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l de d-biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 g/l de piridoxina-HCl, 50 μg/L tiamina-HCl x H2O; 50 μg/l de riboflavina; 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-pantotenato; 1 μg/l de vitamina B12; 50 μg/l de p-aminobenzoato; 50 μg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H2O. O cultivo foi realizado de forma quimilitoautotrófica em um frasco de vidro à prova de chamas de 1 l, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e uma fumigação de 1-3 l/h durante 161 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, montado no centro do reator em um tubo de gaseificação. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.[120] For cell culture of C. ljungdahlii, 2 ml of cryoculture were grown anaerobically in 200 ml of medium (ATCC1754 medium: pH 6.0; 20 g/l MES; 1 g/l yeast extract, 0.8 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.1 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O; 0.02 g/ l of CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l of nitrilotriacetic acid, 10 mg/l of MnSO4 x H2O; 8 mg/l of (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l of CoCl2 x 6 H2O ; 2 mg/l of ZnSO4 x 7 H2O; 0.2 mg/l of CuCl2 x 2 H2O; 0.2 mg/l of Na2MoO4 x 2 H2O; 0.2 mg/l of NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/l of Na2SeO4; 0.2 mg/l of Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l of d-biotin, 20 μg/l of folic acid, 100 g/l of pyridoxine-HCl, 50 μg/l of thiamine- HCl x H2O; 50 μg/l of riboflavin; 50 μg/l of nicotinic acid, 50 μg/l of Cap-pantothenate; 1 μg/l of vitamin B12; 50 μg/l of p-aminobenzoate; 50 μg/l of lipoic acid, approximately 67.5 mg/l of NaOH) with about 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride and 400 mg/l of Na2S x 9 H2O. Cultivation was carried out in a chemolithoautotrophic manner in a 1 L flameproof glass flask, with a premixed gaseous mixture composed of 67% H2, 33% CO2, in a shaker with an open water bath at 37° C, 150 rpm and a fumigation of 1-3 l/h for 161 h. The gas inlet in the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, mounted in the center of the reactor in a gasification tube. Cells were centrifuged, washed with 10 ml of ATCC medium and centrifuged again.

[121] Para a pré-cultura, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. ljungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma OD600 de 0,12. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composto de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 24 h. Subsequentemente, a mistura gasosa foi alterada para uma com a composição de 66,85 % de H2, 33 % de CO2 e 0,15 % de O2 e as células foram gaseificadas adicionalmente durante 67 h a 3 l/h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro de frita (Begasungsfritte) com um tamanho de poro de 10 micra, que foi colocado no centro dos reatores em um pulverizador. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.[121] For pre-cultivation, many washed cells from the C. ljungdahlii growth culture were transferred to 200 ml ATCC medium with about 400 mg/l L-cysteine hydrochloride and grown to an OD600 of 0.12 . Cultivation was carried out in a 500 ml pressure-resistant glass flask, with a pre-mixed gaseous mixture composed of 67% H2, 33% CO2, in a shaker with an open water bath at 37 °C, 150 rpm and with aeration of 3 l/h for 24 h. Subsequently, the gas mixture was changed to one with the composition of 66.85% H2, 33% CO2 and 0.15% O2 and the cells were further gassed for 67 h at 3 l/h. The gas inlet in the medium was carried out through a frit filter (Begasungsfritte) with a pore size of 10 microns, which was placed in the center of the reactors in a pulverizer. Cells were centrifuged, washed with 10 ml of ATCC medium and centrifuged again. The gas inlet in the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, placed in the center of the reactors. Cells were centrifuged, washed with 10 ml of ATCC medium and centrifuged again.

[122] Para a cultura de produção, muitas células lavadas da pré-cultura de C. ljungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma OD600 de 0,1. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 66,85 % de H2, 33 % de CO2 e 0,15 % de O2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 113 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. Ao coletar as amostras, cada amostra de 5 ml foi removida para determinação da OD600, pH e da faixa de produtos. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP).[122] For the production culture, many washed cells from the C. ljungdahlii preculture were transferred to 200 ml of ATCC medium with about 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride and grown to an OD600 of 0.1 . The cultivation was carried out in a 500 ml pressure-resistant glass flask, with a pre-mixed gaseous mixture composed of 66.85% H2, 33% CO2 and 0.15% O2, in a shaker with a water bath. open water at 37 °C, 150 rpm and with aeration of 3 l/h for 113 h. The gas inlet in the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, placed in the center of the reactors. When collecting samples, each 5 ml sample was removed for OD600, pH and product range determination. Determination of product concentration was performed by semiquantitative 1H-NMR spectroscopy. Sodium trimethylsilyl propionate was used as an internal quantitation standard (T(M)SP).

[123] Não houve crescimento celular reconhecível no período de 89 h até 113 h. A OD600 ficou estagnada em 0,29, correspondente a uma taxa de crescimento μ = 0 h-1. A concentração de acetato aumentou ligeiramente durante este período, de 89,4 mg/l para 86,9 mg/l e a concentração de etanol diminuiu de 16,2 mg/l para 11,9 mg/l.[123] There was no recognizable cell growth from 89 h to 113 h. The OD600 stagnated at 0.29, corresponding to a growth rate of μ = 0 h-1. The acetate concentration increased slightly during this period, from 89.4 mg/l to 86.9 mg/l and the ethanol concentration decreased from 16.2 mg/l to 11.9 mg/l.

[124] Exemplo 5[124] Example 5

[125] Cultura de Clostridium ljungdahlii na fase log na presença de gás de síntese compreendendo CO2 e oxigênio[125] Log-phase culture of Clostridium ljungdahlii in the presence of synthesis gas comprising CO2 and oxygen

[126] C. ljungdahlii foi alimentado com H2 e CO2 através da passagem da fase gasosa e foram formados acetato e etanol. Para o cultivo, foram usados frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma tampa de borracha de butila. Todas as etapas de cultivo nas quais as células de C. ljungdahlii estavam envolvidas foram realizadas em condições anaeróbicas.[126] C. ljungdahlii was fed H2 and CO2 through the gas phase passage and acetate and ethanol were formed. For cultivation, pressure-resistant glass flasks that could be hermetically closed with a butyl rubber stopper were used. All cultivation steps in which C. ljungdahlii cells were involved were carried out under anaerobic conditions.

[127] Para a cultura celular do C. ljungdahlii, 5 ml de crio cultura foram cultivados anaerobicamente em 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCl, 1 g/l deNH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,1 g/l de KH5PO4, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnSO4 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O; 0,2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O; 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O; 0,2 mg/l de Na2SeO4; 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l de d-biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 g/l de piridoxina-HCl, 50 μg/L tiamina-HCl x H2O; 50 μg/l de riboflavina; 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-pantotenato; 1 μg/l de vitamina B12; 50 μg/l de p-aminobenzoato; 50 μg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H2O. O cultivo foi realizado de forma quimilitoautotrófica em um frasco de vidro à prova de chamas de 1 l, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 100 rpm e uma fumigação de 3 l/h durante 72 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, montado no centro do reator em um tubo de gaseificação. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.[127] For cell culture of C. ljungdahlii, 5 ml of cryoculture was grown anaerobically in 500 ml of medium (ATCC1754 medium: pH 6.0; 20 g/l MES; 1 g/l yeast extract, 0.8 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.1 g/l KH5PO4, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O; 0.02 g/ l of CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l of nitrilotriacetic acid, 10 mg/l of MnSO4 x H2O; 8 mg/l of (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l of CoCl2 x 6 H2O ; 2 mg/l of ZnSO4 x 7 H2O; 0.2 mg/l of CuCl2 x 2 H2O; 0.2 mg/l of Na2MoO4 x 2 H2O; 0.2 mg/l of NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/l of Na2SeO4; 0.2 mg/l of Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l of d-biotin, 20 μg/l of folic acid, 100 g/l of pyridoxine-HCl, 50 μg/l of thiamine- HCl x H2O; 50 μg/l of riboflavin; 50 μg/l of nicotinic acid, 50 μg/l of Cap-pantothenate; 1 μg/l of vitamin B12; 50 μg/l of p-aminobenzoate; 50 μg/l of lipoic acid, approximately 67.5 mg/l of NaOH) with about 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride and 400 mg/l of Na2S x 9 H2O. Cultivation was carried out in a chemolithoautotrophic manner in a 1 L flameproof glass flask, with a premixed gaseous mixture composed of 67% H2, 33% CO2, in a shaker with an open water bath at 37° C, 100 rpm and a fumigation of 3 l/h for 72 h. The gas inlet in the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, mounted in the center of the reactor in a gasification tube. Cells were centrifuged, washed with 10 ml of ATCC medium and centrifuged again.

[128] Para a cultura principal, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. ljungdahlii foram transferidas para 500 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma OD600 de 0,1. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 1 l resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 66,85 % de H2, 33 % de CO2 e 0,15 % de O2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 1 l/h durante 45 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. Ao coletar as amostras, cada amostra de 5 ml foi removida para determinação da OD600 nm, pH e da faixa de produtos. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP).[128] For the main culture, many washed cells from the C. ljungdahlii growth culture were transferred to 500 ml ATCC medium with about 400 mg/l L-cysteine hydrochloride and grown to an OD600 of 0.1. The cultivation was carried out in a pressure-resistant 1-L glass flask, with a pre-mixed gaseous mixture composed of 66.85% H2, 33% CO2 and 0.15% O2, in a shaker with a water bath. open water at 37 °C, 150 rpm and with aeration of 1 l/h for 45 h. The gas inlet in the medium was carried out through a filter with a pore size of 10 microns, placed in the center of the reactors. When collecting samples, each 5 ml sample was removed for OD600 nm, pH and product range determination. Determination of product concentration was performed by semiquantitative 1H-NMR spectroscopy. Sodium trimethylsilyl propionate was used as an internal quantitation standard (T(M)SP).

[129] Houve crescimento celular significativo durante o período de cultivo, evidenciado por um aumento da OD600 nm de 0,10 para 0,54, correspondente a uma taxa de crescimento de μ = 0,037 h -1. Ao mesmo tempo, a concentração de acetato aumentou de 9,6 mg/l para 3.304 mg/l e a concentração de etanol de 2,2 mg/l para 399 mg/l.[129] There was significant cell growth during the culture period, evidenced by an increase in OD600 nm from 0.10 to 0.54, corresponding to a growth rate of μ = 0.037 h -1 . At the same time, the acetate concentration increased from 9.6 mg/l to 3304 mg/l and the ethanol concentration from 2.2 mg/l to 399 mg/l.

[130] Exemplo 6[130] Example 6

[131] Cultura de Clostridium ljungdahlii na fase log na presença de gás de síntese compreendendo CO2 e oxigênio (65 % de CO)[131] Log-phase culture of Clostridium ljungdahlii in the presence of synthesis gas comprising CO2 and oxygen (65% CO)

[132] C. ljungdahlii foi cultivado autotroficamente em meio complexo com gás de síntese consistindo em H2 e CO2 na presença de oxigênio, de modo a produzir de acetato e etanol.[132] C. ljungdahlii was grown autotrophically on complex medium with synthesis gas consisting of H2 and CO2 in the presence of oxygen to produce acetate and ethanol.

[133] Foi usado um meio de cultura complexo consistindo em 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,8 g/l de NaCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/l de CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l de MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L- cisteína-HCl, 0,4 g/l de Na2S x 9 H2O, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnSO4 x H2O, 8 mg/l de (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O, 0,2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O, 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O, 0,2 mg/l de Na2SeO4, 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l de biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 μg/l de piridoxina-HCl, 50 μg/l de tiamina-HCl x H2O, 50 μg/l de riboflavina, 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-ácido pantotenóico, 1 μg/l de vitamina B12, 50 μg/l de ácido p- aminobenzoico, 50 μg/l de ácido lipoico.[133] A complex culture medium consisting of 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.8 g/l NaCl, 0 .1 g/l KH2PO4, 20 mg/l CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l MES, 1 g/l yeast extract, 0.4 g/l L-cysteine-HCl, 0.4 g/l Na2S x 9 H2O, 20 mg/l nitrilotriacetic acid, 10 mg/l MnSO4 x H2O, 8 mg/l (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 0.2 mg/l NiCl2 x 6 H2O, 0 .2 mg/l Na2SeO4, 0.2 mg/l Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l biotin, 20 μg/l folic acid, 100 μg/l pyridoxine HCl, 50 μg/l thiamine -HCl x H2O, 50 μg/l riboflavin, 50 μg/l nicotinic acid, 50 μg/l Ca-pantothenoic acid, 1 μg/l vitamin B12, 50 μg/l p-aminobenzoic acid, 50 μg /l of lipoic acid.

[134] O cultivo autotrófico foi realizado em 500 ml de meio em um frasco de soro de 1 l, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 65 % de CO, 4 % de H2 e 15 % de CO2 a uma taxa de 3,6 l/h. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 120 min-1. O pH não foi controlado.[134] Autotrophic cultivation was performed on 500 ml of medium in a 1 L serum bottle, which was continuously gassed with syngas consisting of 65% CO, 4% H2, and 15% CO2 at a rate of 3.6 l/h. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 120 min-1. The pH was not controlled.

[135] No início da experiência, C. ljungdahlii foi inoculado com uma OD600 de 0,1, com células cultivadas autotroficamente H2/CO2. Portanto, o C. ljungdahlii foi cultivado em meio complexo, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2 a uma taxa de 3 l/h, em frascos de soro de 1 l com 500 ml de meio complexo. O meio descrito acima também foi usado para esta cultura. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica, com uma OD600 de 0,49 e um pH de 5,03, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocular a experiência de cultivo. A concentração de monóxido de carbono na fase gasosa foi medida por amostragem desta e análise offline em um cromatógrafo a gás GC 6890N da Agilent Technologies Inc., com um detector de condutividade térmica. A concentração de oxigênio na fase gasosa foi medida por uma sonda de imersão para detecção de oxigênio da PreSens Precision Sensing GmbH. A concentração de oxigênio foi medida por desativação de fluorescência, em que o grau de desativação se correlaciona com a pressão parcial de oxigênio na fase gasosa. A medição de oxigênio indicou uma concentração de 0,1 % em volume de O2 no gás de síntese usado.[135] At the start of the experiment, C. ljungdahlii was inoculated at an OD600 of 0.1 with H2/CO2 autotrophically cultured cells. Therefore, C. ljungdahlii was cultured in complex medium, under continuous gassing with synthesis gas consisting of 67% H2 and 33% CO2 at a rate of 3 l/h, in 1 l serum bottles with 500 ml of kinda complex. The medium described above was also used for this culture. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 150 min-1. Cells were harvested in log phase, with an OD600 of 0.49 and a pH of 5.03, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the medium described above. This cell suspension was then used to inoculate the culture experiment. The concentration of carbon monoxide in the gas phase was measured by sampling and offline analysis on an Agilent Technologies Inc. GC 6890N gas chromatograph with a thermal conductivity detector. The oxygen concentration in the gas phase was measured by an immersion probe for oxygen detection from PreSens Precision Sensing GmbH. The oxygen concentration was measured by fluorescence quenching, where the degree of quenching correlates with the partial pressure of oxygen in the gas phase. gaseous phase. Oxygen measurement indicated a concentration of 0.1% by volume of O2 in the used synthesis gas.

[136] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da OD600, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.[136] During the experiment, 5 ml samples were collected for the determination of OD600, pH and product concentrations. The latter was determined by quantitative 1H-NMR spectroscopy.

[137] Após a inoculação do C. ljungdahlii, as células começaram a crescer a uma taxa de crescimento μ de 0,062 h-1 e produziram acetato continuamente, até uma concentração de 6,2 g/l, após 94,5 horas. Concomitante à produção de acetato, foi produzido etanol, a uma taxa mais baixa em comparação com a produção de acetato, até uma concentração de 1 g/l, após 94,5 horas. [137] After inoculation of C. ljungdahlii, cells began to grow at a μ growth rate of 0.062 h-1 and continually produced acetate to a concentration of 6.2 g/l after 94.5 hours. Concomitant with acetate production, ethanol was produced, at a lower rate compared to acetate production, up to a concentration of 1 g/l, after 94.5 hours.

[138] Tabela 3. Resultados do Exemplo 6 (n.d. = não detectado)[138] Table 3. Results from Example 6 (n.d. = not detected)

[139] Exemplo 7[139] Example 7

[140] Crescimento e produção de acetato por Clostridium ljungdahlii em gás de síntese com oxigênio[140] Growth and acetate production by Clostridium ljungdahlii in oxygen synthesis gas

[141] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético, a bactéria homoacetogênica Clostridium ljungdahlii foi cultivada em gás de síntese com oxigênio. Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.[141] For the biotransformation of hydrogen and carbon dioxide to acetic acid, the homoacetogenic bacterium Clostridium ljungdahlii was grown in synthesis gas with oxygen. All cultivation steps were carried out under anaerobic conditions, in pressure-resistant glass vials that could be hermetically closed with a butyl rubber stopper.

[142] Para a pré-cultura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCl, 1 g/l deNH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnSO4 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O; 0,2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O; 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O; 0,2 mg/l de Na2SeO4; 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l de d-biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 μg/l de piridoxina-HCl, 50 μg/L tiamina-HCl x H2O; 50 μg/l de riboflavina; 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-pantotenato; 1 μg/l de vitamina B12; 50 μg/l de p-aminobenzoato; 50 μg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H2O foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de C. ljungdahlii. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 l, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto durante 72 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 μm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH.[142] For the preculture, 500 ml of medium (ATCC1754 medium: pH 6.0; 20 g/l of MES; 1 g/l of yeast extract, 0.8 g/l of NaCl, 1 g/l of l of NH4Cl, 0.1 g/l of KCl, 0.1 g/l of KH2PO4, 0.2 g/l of MgSO4 x 7 H2O; 0.02 g/l of CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l of nitrilotriacetic acid, 10 mg/l of MnSO4 x H2O; 8 mg/l of (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l of CoCl2 x 6 H2O; 2 mg/l of ZnSO4 x 7 H2O; 0 .2 mg/l of CuCl2 x 2 H2O; 0.2 mg/l of Na2MoO4 x 2 H2O; 0.2 mg/l of NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/l of Na2SeO4; 0.2 mg/l of Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l of d-biotin, 20 μg/l of folic acid, 100 μg/l of pyridoxine HCl, 50 μg/l thiamine-HCl x H2O; 50 μg/l of riboflavin; 50 μg/l nicotinic acid, 50 μg/l capantothenate; 1 μg/l vitamin B12; 50 μg/l p-aminobenzoate; 50 μg/l lipoic acid, approximately 67.5 mg/l NaOH ) with about 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride and 400 mg/l of Na2S x 9 H2O were inoculated with 5 ml of cryofrozen standard of C. ljungdahlii. Chemolithoautotrophic cultivation was carried out in a 1 L pressure resistant glass flask at 37 °C, 100 rpm and a ventilation rate of 3 L/h with a gas premixed with 67% H2, 33% CO2 , in a shaker with an open water bath for 72 h. The gas was discharged through a nozzle with a pore size of 10 μm, which was mounted in the center of the reactors. The culture was performed without pH control.

[143] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi lavado com 10 ml de meio e centrifugado novamente. Para a cultura principal, tantas células lavadas da pré-cultura quanto necessárias para uma OD600nm de 0,1 foram transferidas para 200 ml de meio com 400 mg/l adicionais de cloridrato de L-cisteína. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 250 ml a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 65 % de H2, 33 % de CO2, 2 % de O2 em um agitador com banho de água aberto durante 47 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 μm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH. Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da OD600nm, pH e formação de produto. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).[143] After pre-culturing, the cell suspension was centrifuged (10 min, 4200 rpm) and the pellet was washed with 10 ml medium and centrifuged again. For the main culture, as many preculture washed cells as needed for an OD600nm of 0.1 were transferred to 200 ml of medium with an additional 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride. Chemolithoautotrophic cultivation was carried out in 250 ml pressure-resistant glass flasks at 37°C, 150 rpm and a ventilation rate of 1 l/h with a gas premixed with 65% H2, 33% CO2, 2 % O2 in a shaker with an open water bath for 47 h. The gas was discharged through a nozzle with a pore size of 10 μm, which was mounted in the center of the reactors. The culture was performed without pH control. During cultivation, several 5 ml samples were taken for the determination of OD600nm, pH and product formation. Determination of product concentration was performed by semiquantitative 1H-NMR spectroscopy. Sodium trimethylsilyl propionate was used as an internal quantitation standard (T(M)SP). In addition, dissolved oxygen in the culture medium was measured online by immersion probes for oxygen measurement (PSt6 with Oxy4Trace, PreSens, Germany).

[144] Durante o período de cultivo, o crescimento das células foi observado por um aumento da OD600nm de 0,11 para 0,32, que se correlaciona com uma taxa de crescimento de μ = 0,022 h-1. A concentração de acetato aumentou de 8 mg/l até 91 mg/l; não foi observado um aumento da concentração de etanol. Durante o período de cultivo, a concentração de oxigênio dissolvido variou entre 0,06 e 0,15 mg/l.[144] During the cultivation period, cell growth was observed by an increase in OD600nm from 0.11 to 0.32, which correlates with a growth rate of μ = 0.022 h-1. The acetate concentration increased from 8 mg/l to 91 mg/l; no increase in ethanol concentration was observed. During the cultivation period, the dissolved oxygen concentration varied between 0.06 and 0.15 mg/l.

[145] Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,50 mg/l.[145] In a similar technical setup, with the same parameters (medium composition, volume, flask, gas, ventilation rate, temperature, stirring frequency), but without cells in the medium, a dissolved oxygen concentration of 0 was measured .50 mg/l.

[146] Exemplo 8[146] Example 8

[147] Crescimento e produção de acetato por Clostridium ljungdahlii em gás de síntese com oxigênio[147] Growth and acetate production by Clostridium ljungdahlii in oxygen synthesis gas

[148] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético, a bactéria homoacetogênica Clostridium ljungdahlii foi cultivada em gás de síntese com oxigênio. Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.[148] For the biotransformation of hydrogen and carbon dioxide to acetic acid, the homoacetogenic bacterium Clostridium ljungdahlii was grown in synthesis gas with oxygen. All cultivation steps were carried out under anaerobic conditions, in pressure-resistant glass vials that could be hermetically closed with a butyl rubber stopper.

[149] Para a pré-cultura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCl, 1 g/l deNH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnSO4 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O; 0,2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O; 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O; 0,2 mg/l de Na2SeO4; 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l de d-biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 μg/l de piridoxina-HCl, 50 μg/L tiamina-HCl x H2O; 50 μg/l de riboflavina; 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-pantotenato; 1 μg/l de vitamina B12; 50 μg/l de p-aminobenzoato; 50 μg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H2O foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de C. ljungdahlii. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 l, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto durante 72 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 μm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH.[149] For the preculture, 500 ml of medium (ATCC1754 medium: pH 6.0; 20 g/l of MES; 1 g/l of yeast extract, 0.8 g/l of NaCl, 1 g/l of l of NH4Cl, 0.1 g/l of KCl, 0.1 g/l of KH2PO4, 0.2 g/l of MgSO4 x 7 H2O; 0.02 g/l of CaCl2 x 2 H2O; 20 mg/l of nitrilotriacetic acid, 10 mg/l of MnSO4 x H2O; 8 mg/l of (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O; 2 mg/l of CoCl2 x 6 H2O; 2 mg/l of ZnSO4 x 7 H2O; 0 .2 mg/l of CuCl2 x 2 H2O; 0.2 mg/l of Na2MoO4 x 2 H2O; 0.2 mg/l of NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/l of Na2SeO4; 0.2 mg/l of Na2WO4 x 2 H2O; 20 μg/l of d-biotin, 20 μg/l of folic acid, 100 μg/l of pyridoxine HCl, 50 μg/l thiamine-HCl x H2O; 50 μg/l of riboflavin; 50 μg/l nicotinic acid, 50 μg/l capantothenate; 1 μg/l vitamin B12; 50 μg/l p-aminobenzoate; 50 μg/l lipoic acid, approximately 67.5 mg/l NaOH ) with about 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride and 400 mg/l of Na2S x 9 H2O were inoculated with 5 ml of cryofrozen standard of C. ljungdahlii. Chemolithoautotrophic cultivation was carried out in a 1 L pressure resistant glass flask at 37 °C, 100 rpm and a ventilation rate of 3 L/h with a gas premixed with 67% H2, 33% CO2 , in a shaker with an open water bath for 72 h. The gas was discharged through a nozzle with a pore size of 10 μm, which was mounted in the center of the reactors. The culture was performed without pH control.

[150] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi lavado com 10 ml de meio e centrifugado novamente. Para a cultura principal, tantas células lavadas da pré-cultura quanto necessárias para uma OD600nm de 0,1 foram transferidas para 200 ml de meio com 400 mg/l adicionais de cloridrato de L-cisteína. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 250 ml a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 66,85% de H2, 33 % de CO2, 0,15 % de O2 em um agitador com banho de água aberto durante 47 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 μm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH.[150] After pre-culturing, the cell suspension was centrifuged (10 min, 4200 rpm) and the pellet was washed with 10 ml medium and centrifuged again. For the main culture, as many preculture washed cells as needed for an OD600nm of 0.1 were transferred to 200 ml of medium with an additional 400 mg/l of L-cysteine hydrochloride. Chemolithoautotrophic cultivation was carried out in 250 ml pressure-resistant glass flasks at 37 °C, 150 rpm and a ventilation rate of 1 l/h with a gas premixed with 66.85% H2, 33% CO2 , 0.15% O2 on a shaker with an open water bath for 47 h. The gas was discharged through a nozzle with a pore size of 10 μm, which was mounted in the center of the reactors. The culture was performed without pH control.

[151] Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da OD600nm, pH e formação de produto. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).[151] During cultivation, several 5 ml samples were taken for determination of OD600nm, pH, and product formation. Determination of product concentration was performed by semiquantitative 1H-NMR spectroscopy. Sodium trimethylsilyl propionate was used as an internal quantitation standard (T(M)SP). In addition, dissolved oxygen in the culture medium was measured online by immersion probes for oxygen measurement (PSt6 with Oxy4Trace, PreSens, Germany).

[152] Durante o período de cultivo, o crescimento das células foi observado por um aumento da OD600nm de 0,10 para 0,45, que se correlaciona com uma taxa de crescimento de μ = 0,032 h-1. A concentração de acetato aumentou de 7 mg/l para 2347 mg/l e a concentração de etanol aumentou de 2 mg/l para 319 mg/l. Durante todo o período de cultivo, a concentração do oxigênio dissolvido foi de 0,00 mg/l.[152] During the cultivation period, cell growth was observed by an increase in OD600nm from 0.10 to 0.45, which correlates with a growth rate of μ = 0.032 h-1. The acetate concentration increased from 7 mg/l to 2347 mg/l and the ethanol concentration increased from 2 mg/l to 319 mg/l. During the entire cultivation period, the dissolved oxygen concentration was 0.00 mg/l.

[153] Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,03 mg/l.[153] In a similar technical setup, with the same parameters (medium composition, volume, flask, gas, ventilation rate, temperature, stirring frequency), but without cells in the medium, a dissolved oxygen concentration of 0 was measured .03 mg/l.

[154] Exemplo 9[154] Example 9

[155] Co-cultivo de Clostridium ljungdahlii e Clostridium kluyveri em meio complexo com gás contendo CO (7 % de CO)[155] Co-culture of Clostridium ljungdahlii and Clostridium kluyveri in complex medium with CO gas (7 % CO)

[156] C. ljungdahlii, como primeiro organismo, foi cultivado de forma autotrófica em meio complexo, de modo a produzir acetato e etanol. Depois de determinado tempo, C. kluyveri como segundo organismo foi, então, inoculado no mesmo reator, para a conversão de acetato e etanol em butirato e hexanoato. Subsequentemente, C. ljungdahlii converte butirato em butanol e hexanoato em hexanol.[156] C. ljungdahlii, as the first organism, was grown autotrophically in complex medium to produce acetate and ethanol. After a certain time, C. kluyveri as a second organism was then inoculated into the same reactor for the conversion of acetate and ethanol into butyrate and hexanoate. Subsequently, C. ljungdahlii converts butyrate to butanol and hexanoate to hexanol.

[157] Foi usado um meio complexo para o co-cultivo de ambos os microrganismos, consistindo em 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,8 g/l de NaCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/l de CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l de MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L-cisteína-HCl, 0,4 g/l de Na2S x 9 H2O, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnSO4 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O, 0,2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O, 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O, 0,2 mg/l de Na2SeO4, 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l de biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 μg/l de piridoxina-HCl, 50 μg/l de tiamina-HCl x H2O, 50 μg/l de riboflavina, 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de Ca-ácido pantotenóico, 1 μg/l de vitamina B12, 50 μg/l de ácido p-aminobenzóico, 50 μg/l de ácido lipoico.[157] A complex medium was used for the co-cultivation of both microorganisms, consisting of 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0, 8 g/l NaCl, 0.1 g/l KH2PO4, 20 mg/l CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l MES, 1 g/l yeast extract, 0.4 g/l L -cysteine-HCl, 0.4 g/l Na2S x 9 H2O, 20 mg/l nitrilotriacetic acid, 10 mg/l MnSO4 x H2O, 8 mg/l (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 0.2 mg/l of NiCl2 x 6 H2O, 0.2 mg/l of Na2SeO4, 0.2 mg/l of Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l of biotin, 20 μg/l of folic acid, 100 μg/l of pyridoxine HCl , 50 μg/l thiamine-HCl x H2O, 50 μg/l riboflavin, 50 μg/l nicotinic acid, 50 μg/l Ca-pantothenoic acid, 1 μg/l vitamin B12, 50 μg/l p-aminobenzoic acid, 50 μg/l lipoic acid.

[158] O cultivo autotrófico foi realizado em 500 ml de meio complexo em um frasco de soro de 1 l, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 63 % de H2, 7 % de CO2 e 2 % CO a uma taxa de ~3,6 l/h (> 0,5 ppm de oxigênio). O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 120 min-1. O pH não foi controlado durante esta experiência.[158] Autotrophic cultivation was performed on 500 ml of complex medium in a 1 L serum flask, which was continuously gassed with synthesis gas consisting of 63% H2, 7% CO2, and 2% CO at a rate of ~3.6 l/h (> 0.5 ppm of oxygen). The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 120 min-1. The pH was not controlled during this experiment.

[159] No início da experiência, C. ljungdahlii foi inoculado com uma OD600 de 0,1, com células cultivadas autotroficamente. Portanto, o C. ljungdahlii foi cultivado no meio complexo descrito acima, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2 a uma taxa de 3 l/h, em frascos de soro de 1 l com 500 ml de meio complexo. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. As células foram colhidas na fase estacionária, com uma OD600 de 0,89 e um pH de 4,52, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio complexo descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocular a experiência de co-cultura.[159] At the start of the experiment, C. ljungdahlii was inoculated at an OD600 of 0.1 with autotrophically cultured cells. Therefore, C. ljungdahlii was cultured in the complex medium described above, under continuous gassing with synthesis gas consisting of 67% H2 and 33% CO2 at a rate of 3 L/h, in 1 L serum bottles with 500 ml of complex medium. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 150 min-1. Cells were harvested in the stationary phase, with an OD600 of 0.89 and a pH of 4.52, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the complex medium described above. This cell suspension was then used to inoculate the co-culture experiment.

[160] Paralelamente a isso, C. kluyveri foi cultivado heterotroficamente em 200ml de meio complexo em frascos de soro de 500 ml em acetato e etanol. Foi usado um meio complexo consistindo em 0,25 g/l de NH4Cl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,31 g/l de K2HPO4, 0,23 g/l de KH2PO4, 2,5 g/l de NaHCO3, 1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de K-acetato, 20 g/l de etanol, 0,25 g/l de L-cisteína- HCl, 1,5 mg/l de FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l de ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l de MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l de ácido bórico, 190 μg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 μg/l de CuCl2 x 6 H2O, 24 μg/l de NiCl2 x 6 H2O, 36 μg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 3 μg/l de Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 μg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 100 μg/l de vitamina B12, 80 μg/l de ácido p- aminobenzoico, 20 μg/l de biotina, 200 μg/l de ácido nicotínico, 100 μg/l de ácido Ca-pantotenoico, 300 μg/l de piridoxina-HCl, 200 μg/l de tiamina-HCl x H2O. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 100 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma OD600 de 0,86 e um pH de 6,01, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio complexo descrito acima. A suspensão de células foi, então, usada para inocular a experiência de co-cultura após 49 horas de duração da experiência.[160] In parallel with this, C. kluyveri was grown heterotrophically in 200ml of complex medium in 500ml serum vials in acetate and ethanol. A complex medium consisting of 0.25 g/l NH4Cl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.31 g/l K2HPO4, 0.23 g/l KH2PO4, 2.5 g /l of NaHCO3, 1 g/l of yeast extract, 10 g/l of K-acetate, 20 g/l of ethanol, 0.25 g/l of L-cysteine-HCl, 1.5 mg/l of FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l boric acid, 190 μg/l COCl2 x 6 H2O, 2 μg/l CuCl2 x 6 H2O, 24 µg/l NiCl2 x 6 H2O, 36 µg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 3 µg/l Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 µg/l Na2WO4 x 2 H2O, 100 µg/l vitamin B12 , 80 μg/l of p-aminobenzoic acid, 20 μg/l of biotin, 200 μg/l of nicotinic acid, 100 μg/l of capantothenoic acid, 300 μg/l of pyridoxine HCl, 200 μg/l of thiamine-HCl x H2O. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 100 min-1. Cells were harvested in late log phase, with an OD600 of 0.86 and a pH of 6.01, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the complex medium described above. The cell suspension was then used to inoculate the co-culture experiment after 49 hours of experiment duration.

[161] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da OD600, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.[161] During the experiment, 5 ml samples were collected for the determination of OD600, pH and product concentrations. The latter was determined by quantitative 1H-NMR spectroscopy.

[162] Após a inoculação do C. ljungdahlii, as células começaram a crescer e a produzir acetato continuamente até uma concentração de ~1,3 g/l e etanol até uma concentração de ~ 0,8 g/l, após 49 horas. Em um tempo de processo de 49 horas, C. kluyveri foi então inoculado no reator. No decurso de tempo seguinte da experiência, foi medida a produção de butirato e hexanoato até concentrações de 0,6 g/l de cada. Paralelamente à produção de butirato e hexanoato pelo C. kluyveri, C. ljungdahlii converteu butirato em butanol, até uma concentração máxima de 472 mg/l de butanol e converteu hexanoato em hexanol até uma concentração máxima de 630 mg/l de hexanol. Tabela 4. Resultados do Exemplo 9 (n.d. = não detectado)[162] After inoculation of C. ljungdahlii, cells began to grow and continuously produce acetate to a concentration of ~1.3 g/l and ethanol to a concentration of ~0.8 g/l after 49 hours. In a process time of 49 hours, C. kluyveri was then inoculated into the reactor. In the next time course of the experiment, the production of butyrate and hexanoate was measured up to concentrations of 0.6 g/l of each. Parallel to the production of butyrate and hexanoate by C. kluyveri, C. ljungdahlii converted butyrate into butanol, up to a maximum concentration of 472 mg/l of butanol, and converted hexanoate into hexanol, up to a maximum concentration of 630 mg/l of hexanol. Table 4. Results of Example 9 (nd = not detected)

[163] Exemplo 10[163] Example 10

[164] Co-cultivo de Clostridium autoethanogenum e Clostridium kluyveri em meio complexo com gás contendo CO, para a produção de álcoois superiores, tais como hexanol e octanol (10% de CO)[164] Co-cultivation of Clostridium autoethanogenum and Clostridium kluyveri in complex medium with CO-containing gas for the production of higher alcohols such as hexanol and octanol (10% CO)

[165] Neste exemplo, C. autoethanogenum, como primeiro organismo, foi cultivado autotroficamente em meio definido, de modo a produzir acetato e etanol. Depois de determinado tempo, C. kluyveri como segundo organismo foi inoculado no mesmo reator, para a conversão de acetato e etanol em butirato e hexanoato. Na etapa seguinte, C. autoethanogenum converte butirato em butanol e hexanoato em hexanol. Também foi observada produção de octanol.[165] In this example, C. autoethanogenum, as the first organism, was grown autotrophically in defined medium to produce acetate and ethanol. After a certain time, C. kluyveri as a second organism was inoculated in the same reactor, for the conversion of acetate and ethanol into butyrate and hexanoate. In the next step, C. autoethanogenum converts butyrate into butanol and hexanoate into hexanol. Octanol production was also observed.

[166] Foi usado um meio complexo para o co-cultivo de ambos os microrganismos, consistindo em 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de KCl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,8 g/l de NaCl, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/l de CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l de MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L-cisteína-HCl, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnSO4 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l de CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l de CuCl2 x 2 H2O, 0,2 mg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 0,2 mg/l de NiCl2 x 6 H2O, 0,2 mg/l de Na2SeO4, 0,2 mg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l de biotina, 20 μg/l de ácido fólico, 100 μg/l de piridoxina-HCl, 50 μg/l de tiamina-HCl x H2O, 50 μg/l de riboflavina, 50 μg/l de ácido nicotínico, 50 μg/l de ácido Ca-pantotenoico, 1 μg/l de vitamina B12, 50 μg/l de ácido p-aminobenzoico, 50 pg/ç de ácido lipoico.[166] A complex medium was used for the co-cultivation of both microorganisms, consisting of 1 g/l NH4Cl, 0.1 g/l KCl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0, 8 g/l NaCl, 0.1 g/l KH2PO4, 20 mg/l CaCl2 x 2 H2O, 20 g/l MES, 1 g/l yeast extract, 0.4 g/l L -cysteine-HCl, 20 mg/l nitrilotriacetic acid, 10 mg/l MnSO4 x H2O, 8 mg/l (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2 mg/l CoCl2 x 6 H2O, 2 mg /l ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/l CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 0.2 mg/l NiCl2 x 6 H2O, 0.2 mg/l Na2SeO4 , 0.2 mg/l Na2WO4 x 2 H2O, 20 μg/l biotin, 20 μg/l folic acid, 100 μg/l pyridoxine-HCl, 50 μg/l thiamine-HCl x H2O, 50 μg /l of riboflavin, 50 μg/l of nicotinic acid, 50 μg/l of Ca-pantothenoic acid, 1 μg/l of vitamin B12, 50 μg/l of p-aminobenzoic acid, 50 pg/ç of lipoic acid.

[167] O cultivo autotrófico foi realizado em 500 ml de meio complexo em um frasco de soro de 1 l, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 60 % de H2, 30 % de CO2 e 10 % CO a uma taxa de 1,0 l/h. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. O pH foi ajustado uma vez durante esta experiência, pela adição anaeróbica de KOH.[167] Autotrophic cultivation was performed on 500 ml of complex medium in a 1 L serum flask, which was continuously gassed with synthesis gas consisting of 60% H2, 30% CO2, and 10% CO at a rate of 1.0 l/h. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 150 min-1. The pH was adjusted once during this experiment by the anaerobic addition of KOH.

[168] No início da experiência, C. autethanogenum foi inoculado com uma OD600 de 0,1, com células cultivadas autotroficamente. Portanto, o C. autethanogenum foi cultivado no meio complexo descrito acima, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2 a uma taxa de 1 l/h, em frascos de soro de 1 l com 500 ml de meio complexo. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 μm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma OD600 de 0,62 e um pH de 5,15, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio complexo descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocular a experiência de co-cultura. Em uma fase posterior da experiência, C. autoethanogenum foi novamente inoculado à experiência em andamento, com uma OD600 de 0,2, a partir de uma pré-cultura cultivada nas mesmas condições conforme descrito acima. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma OD600 de 0,55 e um pH de 5,12, por centrifugação anaeróbica (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio retirado da experiência em andamento anaerobicamente. Esta suspensão de células foi, então, usada para transferir novamente as células à experiência de co-cultura após 74 horas de duração desta.[168] At the start of the experiment, C. autethanogenum was inoculated at an OD600 of 0.1 with autotrophically cultured cells. Therefore, C. autethanogenum was cultured in the complex medium described above, under continuous gassing with synthesis gas consisting of 67% H2 and 33% CO2 at a rate of 1 L/h, in 1 L serum bottles with 500 ml of complex medium. The gas was introduced into the liquid phase by a microbubble disperser with a pore diameter of 10 μm. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 150 min-1. Cells were harvested in late log phase, with an OD600 of 0.62 and a pH of 5.15, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the complex medium described above. This cell suspension was then used to inoculate the co-culture experiment. In a later phase of the experiment, C. autoethanogenum was re-inoculated to the ongoing experiment, with an OD600 of 0.2, from a preculture grown under the same conditions as described above. Cells were harvested in late log phase, with an OD600 of 0.55 and a pH of 5.12, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet resuspended in 10 ml of medium taken from the anaerobically running experiment. This cell suspension was then used to transfer the cells back to the co-culture experiment after the 74 hour duration of the co-culture experiment.

[169] Paralelamente a isso, C. kluyveri foi cultivado heterotroficamente em 200ml de meio complexo em frascos de soro de 500 ml em acetato e etanol. Foi usado um meio complexo consistindo em 0,25 g/l de NH4Cl, 0,2 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,31 g/l de K2HPO4, 0,23 g/l de KH2PO4, 2,5 g/l de NaHCO3, 1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de K-acetato, 20 g/l de etanol, 0,25 g/l de L-cisteína- HCl, 1,5 mg/l de FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l de ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l de MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l de ácido bórico, 190 μg/l de CoCl2 x 6 H2O, 2 μg/l de CuCl2 x 6 H2O, 24 μg/l de NiCl2 x 6 H2O, 36 μg/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 3 μg/l de Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 μg/l de Na2WO4 x 2 H2O, 100 μg/l de vitamina B12, 80 μg/l de ácido p- aminobenzoico, 20 μg/l de biotina, 200 μg/l de ácido nicotínico, 100 μg/l de ácido Ca-pantotenoico, 300 μg/l de piridoxina-HCl, 200 μg/l de tiamina-HCl x H2O. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 100 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma OD600 de 0,86 e um pH de 6,01, por centrifugação anaeróbica (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio retirado da experiência em andamento anaerobicamente. Esta suspensão de células foi, então, usada para transferir as células à experiência de co-cultura após 23 horas de duração desta. Em uma fase posterior da experiência, C. kluyveri foi novamente inoculado com uma OD600 de 0,15, a partir de uma pré-cultura cultivada nas mesmas condições conforme descrito acima. As células foram colhidas na fase logarítmica, com uma OD600 de 0,38 e um pH de 6,67, por centrifugação anaeróbica (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio retirado da experiência corrente anaerobicamente. Esta suspensão de células foi, então, usada para transferir novamente as células à experiência de co-cultura após 74 horas de duração desta.[169] In parallel with this, C. kluyveri was grown heterotrophically in 200ml of complex medium in 500ml serum vials in acetate and ethanol. A complex medium consisting of 0.25 g/l NH4Cl, 0.2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.31 g/l K2HPO4, 0.23 g/l KH2PO4, 2.5 g /l of NaHCO3, 1 g/l of yeast extract, 10 g/l of K-acetate, 20 g/l of ethanol, 0.25 g/l of L-cysteine-HCl, 1.5 mg/l of FeCl2 x 4 H2O, 70 μg/l ZnCl2 x 7 H2O, 100 μg/l MnCl2 x 4 H2O, 6 μg/l boric acid, 190 μg/l CoCl2 x 6 H2O, 2 μg/l CuCl2 x 6 H2O, 24 µg/l NiCl2 x 6 H2O, 36 µg/l Na2MoO4 x 2 H2O, 3 µg/l Na2SeOO3 x 5 H2O, 4 µg/l Na2WO4 x 2 H2O, 100 µg/l vitamin B12 , 80 μg/l of p-aminobenzoic acid, 20 μg/l of biotin, 200 μg/l of nicotinic acid, 100 μg/l of capantothenoic acid, 300 μg/l of pyridoxine HCl, 200 μg/l of thiamine-HCl x H2O. The vial of serum was continuously agitated in a New Brunswick Scientific Innova 3100 open water bath at 37°C and an agitation speed of 100 min-1. Cells were harvested in late log phase, with an OD600 of 0.86 and a pH of 6.01, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet resuspended in 10 ml of medium taken from the anaerobically running experiment. This cell suspension was then used to transfer the cells to the co-culture experiment after the 23 hour duration of the co-culture experiment. In a later phase of the experiment, C. kluyveri was re-inoculated with an OD600 of 0.15, from a preculture grown under the same conditions as described above. Cells were harvested in log phase, with an OD600 of 0.38 and a pH of 6.67, by anaerobic centrifugation (4500 min-1, 4300 g, 20 °C, 10 min). The supernatant was discarded and the pellet resuspended in 10 ml of medium taken from the running experiment anaerobically. This cell suspension was then used to transfer the cells back to the co-culture experiment after the 74 hour duration of the co-culture experiment.

[170] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da OD600, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.[170] During the experiment, 5 ml samples were collected for the determination of OD600, pH and product concentrations. The latter was determined by quantitative 1H-NMR spectroscopy.

[171] Após a inoculação do C. autoethanogenum, as células começaram a crescer e a produzir acetato até uma concentração de ~2,2 g/l até uma concentração de ~ 0,5 g/l, após 23 horas. Neste ponto, C. kluyveri foi inoculado à experiência em andamento e, em seguida, foram produzidos butirato e hexanoato. O butirato e o hexanoato foram, então, reduzidos aos álcoois correspondentes pelo C. autoethanogenum. Após 69 horas de realização da experiência, o pH foi aumentado de 4,74 para 6,01 pela adição anaeróbica de KOH. Após isso, foram adicionados 50 mg/l de L-cisteína HCl ao meio e as células de ambos o C. autoethanogenum e C. kluyveri foram inoculadas às experiências em andamento. Após 140 horas de cultivo foram produzidos 650 mg/l de butanol, 220 mg/l de hexanol e 4,5 mg/l de octanol. Tabela 5. Resultados do Exemplo 10 (n.d. = não detectado; - = não medido)[171] After C. autoethanogenum inoculation, cells began to grow and produce acetate to a concentration of ~2.2 g/l to a concentration of ~0.5 g/l after 23 hours. At this point, C. kluyveri was inoculated into the ongoing experiment, and then butyrate and hexanoate were produced. Butyrate and hexanoate were then reduced to the corresponding alcohols by C. autoethanogenum. After 69 hours of carrying out the experiment, the pH was increased from 4.74 to 6.01 by the anaerobic addition of KOH. After that, 50 mg/l of L-cysteine HCl was added to the medium and cells from both C. autoethanogenum and C. kluyveri were inoculated into ongoing experiments. After 140 hours of cultivation, 650 mg/l of butanol, 220 mg/l of hexanol and 4.5 mg/l of octanol were produced. Table 5. Results from Example 10 (nd = not detected; - = not measured)

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Springer: New York, pp 354-420. Shuler ML, Kargi F. 1992. Bioprocess Engineering. Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ. Sliwkowski M.X., 1984, Analytical Biochemistry, 141:344-347 Smith L.T., 1976, Analytical biochemistry, 95:2-7 Smith L.T., 1980, Archives of biochemistry and biophysics, 203 (2): 663-675 Stadtman E.R., 1950, Fed. Proc., 9, 233 Stadtman E.R., 1953, J Biol Chem;202(2):873-90 Steinbusch, 2011, Energy Environ. Sci., 4, 216-224 Thauer, R. K., et al., Eur.K.Biochem., 1974, 42, 447-452 Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013, ACS Sustainable Chemistry & Engineering 1 (5), 513-518 Wang S, 2010, Journal of Bacteriology, 192 (19): 5115-5123 Winzer K. et al., 1997 Micrbiology 143:3279-3286 Wood, 1991 Life with CO or CO2 and H2 as a source of carbon and energy. FASEB J. 5:156-163 Younesi H. et al. Biochemical Engineering Journal 27 (2005) 110-119 Zhang Y, 2013, Bioprocess Biosyst Eng; 36(12):1897-1904 U.S. 2007/0275447, U.S. 2008/0057554, WO 98/00558, WO 00/68407.[172] REFERENCES Baffert, C., et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 2096-2099 Barker H.A., 1949, J. Biol. chem. 180: 1085-1093 Bartsch, R.G., 1961, Archives of Biochemistry and biophysics, 92: 122-132 Bornstein B.T., et al., 1948 J Bact, 55:223 Bornstein B.T., et al., 1948 J Biol Chem, 172: 659 Brioukhanov, 2007, Applied Biochemistry and Microbiology, 43(6):567-582 Chowdhury N.P., 2014, J.Biol.Chem, 289(8):5145-57 Cotter, J.L (2009) Enzyme and Microbial Technology 44 281- 288, Ding H. et al., 2010, Bioresour Technol, 101(24):9550-9 Drake et al., 2004. Strict and Facultative Anaerobes: Medical and Environmental Aspects. pp. 251-281, Horizon Scientific Press, United Kingdom Drake & Kusel, 2005 Acetogenic clostridia. In: Dürre, P. (ed.), Handbook on Clostridia, pp. 719-746. CRC Press, Boca Raton, Florida. 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Claims

1. Method of producing at least one higher alcohol in an aqueous medium, comprising a reaction mixture, comprising a first and a second microorganism, characterized in that - the first microorganism is an acetogenic microorganism capable of converting a carbon source comprising CO in acetate and/or ethanol; and - the second microorganism is selected from the group consisting of Clostridium kluyveri and C. carboxidivorans, capable of converting acetate and/or ethanol to form an acid; wherein the first microorganism is additionally capable of converting the acid to the corresponding higher alcohol comprising at least 6 carbon atoms wherein the first microorganism is selected from the group consisting of Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum ( DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), Acetobacterium species n° 446, Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304 ), Blautia producta (DSM 2950), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 and DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC No. PTA - 10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium ljungdahlii (DSM 13528), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii ERI-2 ( ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), Clostridium species ATCC 29797, Desulfotomaculum kuznet sovii ( DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1, Moorella thermoacetica (DSM 521), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440) and Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030).

Method of producing at least one higher alcohol according to claim 1, characterized in that the carbon source comprises 2% to 99% by volume of carbon monoxide gas.

3. Method of producing at least one higher alcohol, according to claim 1 or 2, characterized in that the higher alcohol is selected from the group consisting of 2-methyl-1-butanol, 3-methyl-1-butanol, 1 -hexanol, 1-octanol, 1-heptanol, 3-methyl-1-pentanol, 4-methyl-1-hexanol, 5-methyl-1-heptanol, 4-methyl-1-pentanol, 5-methyl-1-hexanol , 6-methyl-1-heptanol and combinations thereof.

Method for producing at least one higher alcohol, according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the first microorganism is Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 and DSM 23693).

Method for producing at least one higher alcohol, according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the first microorganism is Clostridium ljungdahlii.

Method for producing at least one higher alcohol according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the higher alcohol is a C6 to C8 alcohol.

7. Method of producing at least one higher alcohol, according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the aqueous medium comprises free oxygen.

8. Method of producing at least one higher alcohol, according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the mixture comprises acetogenic bacteria in the log phase and acetogenic bacteria in the stationary phase.

9. Method of producing at least one higher alcohol, according to claim 8, characterized in that the first acetogenic microorganism in the exponential growth phase has a growth rate of 0.01 to 2h-1.

10. Method of producing at least one higher alcohol, according to claims 8 or 9, characterized in that the first acetogenic microorganism in the exponential growth phase has an OD600 of 0.01 to 2.

11. Use of a reaction mixture comprising a mixed culture of a first and a second microorganism in an aqueous medium comprising carbon monoxide gas, wherein - the first microorganism is an acetogenic microorganism capable of converting a carbon source to acetate and /or ethanol; and - the second microorganism is selected from the group consisting of Clostridium kluyveri and C. carboxidivorans, capable of converting acetate and/or ethanol to form an acid; wherein the first microorganism is additionally capable of converting the acid to the corresponding higher alcohol and the higher acid comprises at least 6 carbon atoms characterized in that it produces at least one higher alcohol comprising at least 6 carbon atoms, wherein the first microorganism is selected from the group consisting of Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), Acetobacterium species n° 446, Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 and DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC No. PTA-10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium ljungdahlii (DSM 13528), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei ( DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), Clostridium species ATCC 29797, Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1, Moorella thermoacetica (DSM 521), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440) and Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030).