BR102015031890A2 - Hybridomas murinos producers of human anti-immunoglobulin antibodies - Google Patents

Abstract

hibridomas murinos produtores de anticorpos antiimunoglobulinas humanas a presente patente de invenção trata da produção de hibridomas com o objetivo de aplicar o seu produto, anticorpos monoclonais, em ensaios in vitro voltados para o diagnóstico de doenças infecciosas, dosagens de proteínas séricas e outras técnicas com aplicação em imunohematologia. a invenção destina-se ao emprego dos referidos hibridomas para a produção de anticorpos anti imunoglobulinas totais (ig) humanas, que poderão ser usados como insumos para ensaios in vitro, como componentes na produção de kits diagnósticos, ou utilizados isoladamente, como anticorpos conjugados (anticorpo + enzimas ou anticorpo + fluorcromos) ou ainda imobilizados na fase sólida de imunoensaios (por exemplo microplacas de poliestireno, membranas de nitrocelulose).

Description

HIBRIDOMAS MURINOS PRODUTORES DE ANTICORPOS ΑΝΤΙ-IMUNOGLOBULINAS HUMANAS

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente patente de invenção trata da produção de hibridomas com o objetivo de aplicar o seu produto, anticorpos monoclonais, em ensaios in vitro voltados para o diagnóstico de doenças infecciosas, dosagens de proteínas séricas e outras técnicas com aplicação em imunohematologia. Esta invenção pertence ao setor de biotecnologia moderna.

[002] O presente pedido de invenção destina-se ao emprego dos referidos hibridomas para a produção de anticorpos anti Imunoglobulinas totais (Ig) humanas, que poderão ser usados como insumos para ensaios in vitro, como componentes na produção de kits diagnósticos, ou utilizados isoladamente, como anticorpos conjugados (anticorpo + enzimas ou anticorpo + fluorcromos) ou ainda imobilizados na fase sólida de imunoensaios (por exemplo microplacas de poliestireno, membranas de nitrocelulose).

ESTADO DA TÉCNICA

[003] Os anticorpos são moléculas compostas de quatro cadeias peptídicas, sendo que duas apresentam peso molecular de aproximadamente 25000 Daltons (cadeias leves) e as outras duas com peso molecular de 50000 Daltons (cadeias pesadas) (Celular and Molecular Immunology, 4. Edm Philadelphia: W.B. Saunders, 2000). A constatação em 1969 de que indivíduos com cânceres linfóides B apresentavam no sangue e urina grandes quantidades de imunoglobulina secretadas de um único clone de linfócito B, possibilitou a purificação destas proteínas de mieloma e permitiu o estudo individual da molécula de anticorpo, determinando-se pela primeira vez a sequência completa dos aminoácidos de uma imunoglobulina (Celular and Molecular Immunology, 4. Edm Philadelphia: W.B. Saunders, 2000). Estes estudos demonstraram que um anticorpo apresenta a capacidade de se ligar a um dado epítopo e discriminar epítopos similares, detendo duas importantes propriedades, a especificidade e a diversidade, ambas decisivas para o exercício de sua função de defesa e vigilância imunológica no organismo contra agentes patogênicos.

[004] Todas as evidências acumuladas ao longo dos últimos 30 anos fazem do anticorpo um agente promissor no uso do diagnóstico e da terapia humana. Esta e outras inúmeras aplicações dos anticorpos se esbarram em uma grande dificuldade: a resposta do sistema imune a um dado antígeno é policlonal. A perspectiva de se isolar uma única célula produtora de anticorpos para manter seu cultivo in vitro, não é uma alternativa viável tendo em vista que estas apresentam um limitado potencial de crescimento, próprio das células somáticas normais.

[005] Este problema foi resolvido em 1975 por Kõhler e Milstein, com a descoberta dos anticorpos monoclonais, produzidos por hibridomas, que são células originadas da hibridização in vitro de células somáticas formadoras de anticorpos (linfócito B) com linhagens celulares de replicação contínua (mieloma), preservando assim a capacidade de se propagar em cultura e de secretar anticorpos. Os mielomas empregados são, geralmente, linhagens celulares adaptadas ao cultivo in vitro a partir de tumores de linfócitos B desenvolvidos em murinos (Eur. J. Immunol. 1975 6: 511-519). Já os linfócitos B normais secretores de anticorpos específicos são obtidos de camundongos ou ratos previamente imunizados com o antígeno de interesse, (referência livro Wirla). Estes anticorpos apresentam a vantagem de serem específicos a um único epítopo antigênico, já que são produzidos a partir de uma única célula produtora de anticorpos, o que torna estas moléculas livres do problema da reatividade cruzada e falta de especificidade. Outra vantagem é o fato de que estes anticorpos podem ser produzidos em grande quantidade, já que a célula híbrida produtora detém a propriedade de imortalidade (Nature. 1975, 256: 495-497).

[006] O processo de produção dos anticorpos monoclonais, ao contrário daqueles para os anticorpos policlonais, apresenta a principal vantagem de não necessitar do uso de antígenos purificados. Além disto, os hibridomas podem ser estocados em nitrogênio líquido, para posterior uso, conforme necessidade.

[007] Segundo Kõhler (1981), duas vantagens dos hibridomas são: na população de híbridos, os anticorpos de escolha secretados têm um aumento de 10 a 50 vezes em relação à frequência de produção das células esplênicas ou dos linfonodos; e a dominância de mielomas com características parenterais que secretam altos níveis de anticorpos. O mieloma quando fundido com linfomas B não-secretores resulta na secreção da imunoglobulina do linfoma de origem, ou seja, o mieloma por si só secreta um anticorpo completo (In: Immunological Methods. Manchester: Academic Press, 1981,2: 285-308).

[008] O sistema de cultura contínua possibilita a verificação da influência de fatores fisiológicos e ambientais que afetam o crescimento celular, o metabolismo e a produção de anticorpos por hibridomas. No entanto, alterações podem ocorrer devido a longos períodos em cultura e podem ser de origem genética, como mutações pontuais, perda de cromossomos causada por rearranjos gênicos, mutações por deleção ou inserção (Nature. 1977, 27: 299-304, (European Journal of Immunology. 1978, 8: 194-199) Também podem ser provenientes de mudanças nas condições ambientais, como pH, temperatura, oxigênio dissolvido ou privações nutricionais (Hybridoma. 1992, 11 (5): 653-664). Todas essas alterações podem resultar em hibridomas com diferentes características fenotípicas, podendo ocorrer inclusive, a perda da capacidade secretora de anticorpos (Hybridoma, 1990, 9: 167-175).

[009] Normalmente, as células em cultura apresentam um padrão proliferativo sigmoidal, denominado curva de crescimento. Ela representa a adaptação celular às condições de cultivo, do ambiente e a disponibilidade de substratos e nutrientes essenciais para a proliferação celular. A construção da curva de crescimento é importante para avaliar as características próprias das células de interesse e para estabelecer a rotina de cultivo, como por exemplo, o estágio em que as células serão coletadas e a concentração celular que deve ser cultivada, dentre outros aspectos (Como cultivar células. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005).

[010] O advento dos anticorpos monoclonais (mAbs) revolucionou o estudo da imunologia e biologia celular. O primeiro anticorpo monoclonal que identificou um subgrupo de célula T (OKT4, atualmente denominada CD4) foi descrito por foi descrito por Patrick Kung e colaboradores, em 1979 (Science. 1979, 206: 347-349). Atualmente, estes anticorpos são extensivamente usados no laboratório, para detecção de antígenos celulares e solúveis nas técnicas de ELISA, IFA, RIA e citometria de fluxo, como componentes de kits para imunoensaios e cromatografia de afinidade, na clínica como agente terapêutico, cujos benefícios estão ainda sob avaliação, mas com enormes perspectivas de sucesso, no uso do tratamento do câncer, na prevenção e tratamento de transplantes, na prevenção das doenças alérgicas, carreando drogas para um determinado alvo, na pesquisa básica, dentre outras aplicações.

[011] De maneira geral a produção dos anticorpos monoclonais inicia-se com a injeção de um antígeno, que não necessita ser purificado, geralmente no camundongo ou rato. Em poucas semanas, quando tem início a proliferação dos linfócitos B em resposta ao antígeno, remove-se o baço do animal, primeira fonte destes linfócitos, para a seleção destas poucas células produtoras dos anticorpos desejados.

[012] Os hibridomas ou híbridos podem ser formados através da fusão de uma suspensão celular de linfócitos com células tumorais de replicação contínua, como mielomas ou linfomas, que são fusionadas pela rápida exposição a polietileno glicol. As células de mielomas não sintetizam Hipoxantina-fosforribosil transferase (HPRT), enzima esta necessária para a célula sintetizar purinas à partir de uma fonte extracelular contendo hipoxantina. O meio HAT de cultivo destas células contém hipoxantina e aminopterina, substância análoga ao ácido fólico que bloqueia a síntese endógena de purinas e pirimidinas, via alternativa de sobrevivência das células não produtoras de HPRT. Desta forma, a linhagem celular de replicação é selecionada em virtude das propriedades de ausência de produção de imunoglobulinas e de atividade da HPRT. Ao final do processo, três populações de células permanecem em cultura: esplenócitos, células de mieloma e os híbridos. A seleção dos híbridos é efetuada aguardando-se a morte natural dos esplenócitos e da linhagem de células do mieloma que morrem por falta de HPRT. Os híbridos começam a se duplicar a cada 24-48 horas, com rápida formação de colônias, já que as células do baço suplementaram as células do mieloma para produção da enzima HPRT, que por sua vez contribuíram com sua propriedade de imortalidade.

[013] As células do hibridoma são então clonadas por método de diluição limite, e os sobrenadantes testados quanto à produção de anticorpos, geralmente usando as técnicas de ELISA, de Imunoblot ou RIA. Efetua-se uma nova clonagem para garantir a monoclonalidade, onde ocorre um crescimento de grande número de células para produção de anticorpos. Extensos estudos imunoquímicos e sorológicos são efetuados para garantir a especificidade dos anticorpos. Os hibridomas selecionados, clonados e testados podem ser produzidos indefinidamente em camundongos (ascite) ou em meio de cultura. Estas células podem também serem estocadas em nitrogênio líquido para uso a longo prazo.

[014] O método de produção dos mAbs no camundongo é denominado de indução de ascite, este procedimento tem se constituído em um método de escolha por apresentar vantagens tais como: fácil execução, obtenção de altas concentrações de mAbs, baixo custo de produção de cada mg de mAbs produzido e alta taxa de sucesso para sua obtenção.

[015] Os hibridomas representam um importante ponto de partida para a obtenção de anticorpos monoclonais altamente específicos, sendo possível nos sobrenadantes de cultura dessas células, é possível detectar anticorpos em quantidades que variam de 20 a 100 pg/ml dessa proteína. Essa quantidade pode ser ampliada para 1 a 40 mg/ml com a administração intraperitoneal dos hibridomas em animais histocompatíveis ou imunodeficientes que desenvolvem um tumor ascítico (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 59: 135-142). A ampliação em maior escala também pode ser realizada in vitro, em níveis comparáveis a aqueles obtidos no fluido ascítico (Res. Immunol. 1998, 149: 532-542 com a possibilidade de cultivo submerso em biorreatores dessas células, tornando ilimitado o suprimento de anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma.

[016] Percebe-se, portanto, a relevância da produção prévia de um hibridoma para que seja possível a obtenção de anticorpos monoclonais.

[017] Atualmente, existem poucos hibridomas capazes de produzir anti-imunoglobulina humana. A ATCC (American Type Culture Collection) é o banco de células mais abrangente e diversificado do mundo, disponibilizando cerca de 1000 hibridomas, sendo que desses, apenas 21 são produtores de anti imunoglobulina humana, classe ou sub-classe o que representa apenas 2,1% de sua coleção.

[018] Esses dados ressaltam a importância de serem produzidos novos hibridomas com a especificidade proposta nesta patente de inveção, já que o anticorpo monoclonal produzido por esses hibridomas é amplamente utilizado em pesquisa, diagnóstico, além disso temos que considerar que cada hibridoma tem especificidade e características próprias sendo capaz de produzir um determinado anticorpo monoclonal específico a partir de um grande número de epítopos que compõem o antígeno, justificando portanto, a existência de atividade inventiva.

[019] No Brasil, 99% dos insumos utilizados para diagnóstico em doenças ou na realização de pesquisas científicas são importados. Parte desses insumos são os anticorpos, cuja importação implica em demora e conseqüentemente o reagente ao chegar ao Brasil pode estar fora do prazo de validade ou estragado por problemas de mau acondicionamento durante o transporte, o que leva a perda de dinheiro e tempo. Além disso, produtos importados geralmente tem custo maior. Estima-se que no Brasil o gasto com esses insumos gira em torno de R$ 1,2 bilhão.

[020] Para solucionar esses problemas é que no Brasil foram fomentadas pesquisas e criação de empresas por diferentes órgãos financiadores de pesquisa e desenvolvimento. Um exemplo de sucesso, é a empresa FK Biotecnologia, com sede em Porto Alegre, que já colocou no mercado mais de 150 anticorpos monoclonais para pesquisa acadêmica e desenvolve anticorpos monoclonais para uso terapêutico para tratamento de câncer. A mesma empresa já desenvoveu hibridomas produtores de anticorpos contra a gonadotrofina coriônica humana para o desenvolvimento de kits para diagnóstico da gravidez. Outra empresa, Célula B, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul , cujo objetivo é produzir anticorpos em pequeno volume, policlonais ou monoclonais, para atender a pesquisadores do Brasil, que precisem de um anticorpo para a caracterização de uma proteína recém descoberta. Na esfera pública, uma das primeiras instituições a se dedicar ao desenvolvimento de anticorpos foi a Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), com o Laboratório de Anticorpos Monoclonais de Bio-Manguinhos, no Rio de Janeiro. Desde 1983, são desenvolvidos anticorpos monoclonais para fins de pesquisa e diagnóstico contra antígenos específicos de interesse para a saúde pública como hepatite A, B e C, leptospirose e febre amarela.

[021] No INPI tualmente encontram-se depositados 7 processos relacionados com a produção de hibridomas (PI0614475-6; PI0613387-8; PI0212136-0; PI01118234; PI9908466-0; PI9709524-9 e PI9507100-8), nenhum desses produz o anticorpo monoclonal com a especificidade por nós reivindicada. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[022] A presente invenção relata um novo hibridoma capaz de produzir um anticorpo monoclonal com especificidade dirigida contra moléculas de imunoglogulinas humanas.

[023] O hibridoma da presente invenção apresenta enorme potencial de aplicação por sua propriedade de expandir-se uniformemente, maciçamente e permanentemente. Ele é capaz de produzir anticorpos monoclonais anti-lgs humanas sem incorrer em possíveis efeitos próprios da resposta individual quando esses são produzidos em animais, coelhos e cabras - os anticorpos policlonais - como correntemente se fazem com perspectivas comerciais. O processo de produção da presente invenção permite que essa seja feita de maneira uniforme e em larga escala com utilidade em diferentes ensaios in vitro com diferentes aplicações, tais como na dosagem de imunoglobulinas em soro humano, como reagente na Técnica de Coombs direta e indireta e no diagnóstico de doenças infecciosas. Além disso, como tratam-se de produtos nacionais, são ótimas opções para suprir a demanda nacional, com custos menores para serem adquiridos, evitando a necessidade de importação.

[024] Foi com base na necessidade de serem produzidos insumos para suprir o mercado nacional, que nos motivamos a fazer um novo hibridoma capaz de produzir um anticorpo monoclonal com especificidade dirigida contra moléculas de Imunoglobulinas humanas. Os nossos hibridomas veêm incrementar a biotecnologia moderna nacional com a produção "in vitro" de anticorpos monoclonais, moléculas imunes de altíssima especificidade que são de importância na produção de kits diagnósticos de diferentes metodologias, como em ensaios imunoenzimáticos, imunofluorescência, imunohistoquímica, radioimunoensaios, ensaios de precipitação, aglutinação, dentre diversos outros.

[025] Os anticorpos monoclonais anti-lgs totais são utilizados na saúde humana no diagnóstico de diversas doenças. Nas doenças infecciosas são importantes no diagnóstico daquelas doenças em que não é necessário identificar a fase em que a doença se encontra (aguda ou crônica), como na Doença de Chagas e na infecção por HIV, por exemplo. No caso de doenças auto-imunes ou em determinados tipos de câncer são importantes para quantificação das imunoglobulinas séricas totais.

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

[026] A Figura 1 apresenta as curvas de crescimento dos hibridomas com as concentrações celulares (x105 células/mL) em função do tempo (horas).

[027] A Figura 2 apresenta as curvas de produção de anticorpos dos hibridomas. Densidade óptica (D.O.) obtida por ELISA, em função do tempo (horas).

[028] A produção de “HIBRIDOMAS ANTI-lgM HUMANA”, consiste nas seguintes etapas descritas abaixo.

Exemplo 1: IMUNIZAÇÃO

[029] Compreende a etapa em que os camundongos são imunizados com o antígeno de interesse, a fim de que haja a expansão clonal dos linfócitos B específicos produtores dos anticorpos de interesse, que serão usados como células somáticas na produção dos hibridomas. Para isto, foram utilizadas como antígeno imunoglobulinas humanas comerciais purificadas do isótipos IgM e lgG2 (Sigma). Como adjuvante utilizamos o hidróxido de alumínio (Peptgel - Laboratório Teuto Brasileiro S/A). Os animais utilizados na imunização foram camundongos Balb/c fêmeas (Biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública - IPTSP da Universidade Federal de Goiás). Deve-se esclarecer que foram feitas várias imunizações com as diferentes subclasses de IgG (lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4), com IgG total e IgM, em todas elas, além dos hibridomas específicos para as imunoglobulinas imunizadas, obtivemos também alguns hibridomas com especificidade para Igs totais, entretanto selecionamos os melhores deles, para os quais estamos reivindicando a presente patente.

[030] Os camundongos foram imunizados via intraperitoneal com 10 pg de IgM ou lgG2 e 180 pg de Hidróxido de alumínio em um volume final de 500 pl por camundongo. O esquema de imunização compreendeu 4 doses em intervalos de 14 dias, sendo que, 3 dias antes de sacrificá-los para obtenção das células esplênicas, foram desafiados seguindo as mesmas condições do esquema de imunização adotado.

Exemplo 2: PRODUÇÃO DOS HIBRIDOMAS

[031] Compreende a etapa de fusão de células de mieloma SP2 Ag 14/10 com células esplênicas de camundongos previamente imunizados, dando origem aos hibridomas murinos produtores de anti-lg humana, conforme a técnica de Fasekas et al (1980) (Journal of Immunological Methods. 1980, 35: 1-21). Exemplo 3: SELEÇÃO DOS HIBRIDOMAS

[032] Compreende a seleção dos hibridomas produtores dos anticorpos de interesse, dentre um “pool” de hibridomas que produzem anticorpos de diferentes especificidades. Para isso, sobrenadantes dos hibridomas recém-produzidos foram testados a fim de selecionar aqueles produtores dos anticorpos de interesse. A seleção foi avaliada através da reação de ELISA “in house” (Enzime-linked immunosorbet assay), na qual microplacas (Corning-Costar Hb) foram sensibilizadas com IgM e lgG2 humanas (as mesmas imunoglobulinas usadas nas imunizações). Para determinar as amostras positivas foi utilizado o “cut-off”, ou limiar de reatividade, calculado pela médias das absorbâncias dos controles negativos acrescidos de 2 desvios padrões. Aqueles hibridomas não produtores de anticorpos que reconhecem as Imunoglobulinas em questão foram então descartados. l·*·* IM IEE ΛΛΙ [033] Compreende a etapa de obtenção e separação de diferentes populações obtendo híbridos homogêneos, ou seja, originadas e replicadas a partir de uma única célula-mãe e, portanto, produtoras de anticorpos também homogênios, direcionados contra os mesmos determinantes antigênicos. Os hibridomas selecionados consistem em um “pool”, havendo células produtoras de anticorpos direcionados a epítopos diversos, tanto presentes no antígeno usado na imunização, como direcionados a outros epítopos distintos. Dessa forma, esse “pool” de hibridomas é policlonal. O objetivo é fazer a clonagem dessas células, para obtenção e separação de diferentes populações obtendo híbridos homogêneos, ou seja, originadas e replicadas a partir de uma única célula-mãe e, portanto, produtoras de anticorpos também homogênios, direcionados contra os mesmos determinantes antigênicos. Para isso, foi utilizada a técnica de diluição limite. Esta consistiu na obtenção de uma suspensão celular diluída, que foi distribuída em placas de cultura de 96 poços (marca usada: Corning Costar) de modo que obtivemos cerca de 1 célula por poço. De 5 a 7 dias após o início da clonagem, as células foram observadas em microscópio invertido. A presença de um único grupo de células caracteriza a proliferação de um único clone. Dois ou mais grupos de células indicam a presença de múltiplos clones. Cerca de 12-15 dias após o início da clonagem, quando as células proliferaram e cobriram toda a superfície do poço, foram coletados sobrenadantes dos poços que continham apenas um grupo de células, para fazer a seleção dos clones produtores do anticorpo de interesse. Esta seleção também foi feita pela mesma técnica de ELISA usada para seleção dos hibridomas pós-fusão. Os sobrenadantes positivos indicaram a presença de hibridomas produtores dos anticorpos de interesse, os quais são considerados monoclonais, pois originaram-se de uma população homogênea de células.

[034] Durante e após a clonagem, os hibridomas foram mantidos em meio HT, constituído de meio de cultura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) (Sigma) suplementado com 15% de SFB, 1,36mg/mL de hipoxantina, 388 pg/mL de timidina, e posteriormente mantidos em meio simples (DMEN suplementado com 10% de SFB).

[035] Os clones selecionados foram expandidos em cultivo para caracterização e avaliação da estabilidade.

Exemplo 5. CARACTERIZAÇÃO

[036] Compreende a determinação dos isótipos de cadeias leve e pesada dos anticorpos produzidos pelos clones selecionados. Para isso foi realizado um ensaio imunoenzimático usando o Monoclonal Antibody Isotyping Kit (AP/PNPP)(Pierce), de acordo com as instruções do fabricante. Na tabela 1 esses dados são mostrados.

Tabela 1. Caracterização dos anticorpos monoclonais quanto aos isótipos de cadeia pesada e leve. m 1 f i i mm m mmm m mm mm m Clones Classe/ Subclasse Cadeia Leve Especificidade (Cadeia Pesada) 4C5F5 lgG1 Kappa Anti-lg 1A5D8 lgG1 Kappa Anti-lg 1A5E8E4 lgG1 Kappa Anti-lg 1A5E2D5 lgG1 Kappa Anti-lg Exemplo 6: AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DOS CLONES, CURVA DE CRESCIMENTO E CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[037] A avaliação da estabilidade dos clones compreende a etapa em que eles são testados quanto à manutenção da capacidade de produzir anticorpos. Para isso,, os clones selecionados foram mantidos em cultivo por pelo menos dois meses ininterruptos, a fim de avaliarmos a estabilidade de produção de anticorpos em tempo de cultivo prolongado. Inicialmente os hibridomas foram cultivados em meio HT, e posteriormente mantidos em meio simples (DMEN suplementado com 10% de SFB). Após esse período, as células passaram por congelamentos e descongelamentos, sendo novamente colocadas em cultivo, para determinarmos a manutenção dos níveis de anticorpos produzidos. Os hibridomas permaneceram no mínimo 64 dias em cultura. Os sobrenadantes coletados durante esse período, foram testados por ELISA para confirmar se manteriam a produção de anticorpos mesmo após tempo de cultivo prolongado.

[038] Como mostra a Tabela 2, todos os hibridomas continuaram produzindo altas concentrações de anticorpos no período analisado. As D.O.s médias mantiveram-se altas e variaram de 2,67 a 3,13. Ozturk e Pallson (1990) relataram que durante o tempo que permanecem em cultivo, as células podem sofrer alterações devido a diversos fatores e mudanças de condições, sejam eles próprios das células ou provenientes do ambiente. Segundo os autores, uma das consequências dessas alterações é a diferenciação fenotípica do hibridoma que pode resultar na perda da capacidade secretora de anticorpos, por isso a necessidade da avaliação periódica da estabilidade (Hybridoma. 1990, 9: 167-175). Além disso, esses hibridomas, após congelamentos e descongelamentos foram colocados em cultivo novamente e mantiveram alta produção de anticorpos.

Tabela 2. Estabilidade dos hibridomas quanto à produção de anticorpos durante o tempo em cultura.

Tempo em cultura D.O Média (dias) 4C5F5 88 2JS4 1A5D8 88 3,13 1A5E8E4 65 2,84 4 ΛίΖΪΖΟΓΛΐΖ CC Q AQ I AOizZUD oD UjUo [039] As células apresentam características específicas que influenciam em seu crescimento, o qual também é determinado por fatores externos à células, como as condições de cultivo e disponibilidade de nutrientes (Como cultivar células. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005). Por isso, são necessárias a construção de curvas de crescimento para uma melhor compreensão do perfil proliferativo das células de interesse.

[040] A curva de crescimento celular compreende a etapa em que a proliferação e morte celulares são avaliadas periodicamente, a fim de se obter uma melhor compreensão do perfil proliferativo das células de interesse. Para isso, 3 dias após descongelamento dos hibridomas de interesse, foi retirada uma alíquota da suspensão de células das garrafas de origem correspondente a 2x105 células, que foi transferida para outra garrafa e o meio foi completado mL (meio DMEM enriquecido com 10% de soro fetal bovino).

[041] As células da curva permaneceram em cultivo por aproximadamente 8 dias, durante esse período o meio de cultivo não foi trocado. As células foram contadas diariamente em hemocitômetro para avaliação da concentração celular e a viabilidade foi avaliada pelo método de exclusão do azul de Trypan (Como cultivar células. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005).

[042] A cinética de produção dos anticorpos é feita simultaneamente à curva de crescimento celular e compreende a determinação dos níveis de anticorpos produzidos por esses hibridomas periodicamente. Para isso, pequenas alíquotas de sobrenadante foram colhidas diariamente das células da curva, as quais foram testadas pelo método de ELISA “in house” conforme reação já mencionada anteriormente.

[043] Na figura 1 temos as curvas de crescimento dos hibridomas. Conforme mostrado nesta figura, o hibridoma 1A5D8 atingiu a concentração celular máxima de 1,15.106 células/mL em 96 horas de cultivo e sua viabilidade se manteve acima de 90% até 96 horas, havendo diminuição após esse período. Este clone entrou na fase de declínio (quando a quantidade de células mortas excede a de células novas e há grande redução do número de células) logo após o término da fase logarítmica e sem passar pela fase estacionária. Já o clone 4C5F5 obteve concentração máxima de 1,46. 106 células/mL no tempo 120 horas, passou por uma rápida fase exponencial e permaneceu mais tempo em fase estacionária ou plateau (período em que a taxa de morte celular é equivalente à taxa de multiplicação celular) de 72 até 168 horas para depois declinar. A viabilidade desse clone permanece acima de 90% até 144 horas, caindo em seguida. Para o hibridoma 1A5D8 a concentração de anticorpos atingiu níveis altos quando as células apresentavem maiores concentrações, mantendo-se constantes mesmo na fase de declínio das curvas de crescimento das células (Figura 2).

[044] O clone 4C5F5 atingiu níveis mais altos de anticorpos em 12 horas, coincidindo com a concentração celular máxima, e também manteve-se alto na fase de declínio (Figura 2). O clone 1A5E2D5 atingiu concentração máxima de 7,2.105 em 96 horas, coincidindo e com os níveis mais elevados de produção de anticorpos. Para este clone a viabilidade máxima foi de 86% em 72 horas e não obtivemos viabilidade de 90% ou maior em nenhuma das curvas feitas. O clone 1A5E8E4 atingiu a maior concentração celular de 8,7.105 células/mL em 120 horas, mantendo esta concentração até 144 horas. A viabilidade máxima foi de 82% em 72 horas, não coincidindo com a máxima concentração celular. Apesar da viabilidade reduzida, os níveis de anticorpos foram altos até o final da curva (192 horas).

[045] Essas diferenças confirmam a afirmação de Peres e Curi (2005) de que as células apresentam características específicas que influenciam em seu crescimento, o qual também é determinado por fatores externos à células, como as condições de cultivo e disponibilidade de nutrientes (Como cultivar células. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005). Por isso, é necessário a construção de curvas de crescimento para uma melhor compreensão do perfil proliferativo das células de interesse.

Exemplo 7: ELISA PARA DETERMINAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DOS CLONES

[046] Compreende a avaliação da especificidade dos anticorpos monoclonais, ou seja, qual ou quais moléculas de imunoglobulina humana os anticorpos produzido reconhecem como antígeno e são capazes de se ligar. Para isso, cada um deles foram testados contra as moléculas completas de IgG e IgM humanas e contra as cadeias leves humanas (kappa e lambda). Microplacas (Corning-Costar Hb) foram sensibilizadas com 10 ug/ml de IgG ou IgM, bem como com 5ug/ml de cada cadeia leve (kappa ou lambda), e incubadas a 4°C por 12 horas. A placa foi bloqueada com leite molico desnatado 5% em PBS-T (tampão de bloqueio). Os sobrenadante dos hibridomas, foram adicionados, bem como os controles positivo e negativo, (respectivamente soros de camundongos imunizados com o antígeno em questão e de animais inoculados apenas com salina mais adjuvante, diluídos a 1:500). Em seguida, colocou-se o conjugado anti-lgG de camundongo marcado com peroxidase (Rabbit antí-Mouse IgG [H+L] HPR Conjugate, Zymed, Invitrogen) diluído a 1/10.000. A solução de substrato cromógeno utilizada foi de OPD (0,38 mg/ml o-Phenylenediamine (OPD) (Sigma), 0,003% H2O2 em tampão citrato-fosfato 0,05M pH 5,0). Por fim, a solução de HCI 2N foi acrescentada a fim de parar a reação enzima/substrato e as absorbâncias foram detectadas a 492nm utilizando-se leitora de microplacas (Thermo). Para determinar as amostras positivas e negativas foi utilizado o “cut-off”, ou limiar de reatividade, calculado pela médias das absorbâncias dos controles negativos acrescidos de 2 desvios padrões. Foram consideradas positivas amostras com absorbâncias maiores que o valor do cut-off acrescido de 10%.

[047] Conforme apresentado na Tabela 3, os anticorpos testados reconhecem tanto a cadeia leve kappa. Como usamos na reação moléculas de IgG e IgM completas (cadeia leve + cadeia pesada) e a reação também se mostrou positiva para essas duas classes de imunoglobulinas humanas, 0 resultado nos mostra que os hibridomas testados são produtores de anticorpos anti-cadeia leve kappa. Como a cadeia leve do tipo kappa é a mais comum nas imunoglobulinas humanas, independente da classe de cadeia pesada (IgM, IgG, IgA, IgE), os resultados sugerem que esses anticorpos testados reconhecem qualquer imunoglobulina humana, podendo, portanto, ser considerado como anti-lmunoglobulinas totais humanas.

Tabela 3. Teste referente à especificidade dos anticorpos monoclonais.

Clones IgG IgM Cadeia leve Cadeia (Cut off = 0,14) (cut-off = 0,53) kappa leve (Cut-off = 0,12) lambda (Cut-off = 0,15) 1A5E2D5 2,14 3^33 - 2^37 1A5E8E4 2,23 3,50 - 2,80 1A5D8 2^46 2^43 - 2^61 4C5F5 2,37 2,47 - 2,04 Exemplo 8: APLICAÇÃO DO PRODUTO

[048] Esta reação foi processada a fim de avaliarmos se os anticorpos produzidos pelos hibridomas a serem patenteados possuíam a capacidade de reconhecer imunoglobulinas humanas presentes no soro, e não apenas purificadas e comerciais, como já testado nas reações de ELISA para seleção. Para isso testamos sua utilização no imunodiagnóstico, como anti-soro humano, usando um kit comercial imunoenzimático para detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruziem soro humano (Chagatest Wiener lab).

[049] Considerando todas as etapas da reação, com exceção da fase de conjugado, processamos conforme instruções do fabricante. Em nosso teste, substituímos o conjugado comercial (anticorpos policlonais de cabra anti-Imunoglobulinas humanas conjugado com peroxidase) pelos nossos anticorpos purificados. Além disso, como os anticorpos utilizados não estavam conjugados, utilizamos na reação anticorpos policlonais de coelho anti-lgG de camundongos conjugados com peroxidase (Zymed/lnvitrogen), a fim de se ligarem aos anti-soros testados. Processamos simultaneamente uma reação utilizando todos os componentes do kit, inclusive o conjugado, a fim de compararmos com os resultados obtidos.

[050] Para os testes utilizamos amostras de soro humano previamente testados e positivos para Chagas.

[051] Dado ao fato dos ensaios anteriores demonstrarem que os anticorpos estão reconhecendo epítopos da cadeia leve lambda, comuns entre as classes e subclasses de imunoglobulinas, verificamos a possibilidade dos anticorpos serem usados em ensaios imunológicos cuja aplicação envolvesse a utilização desses para detectar a presença de Imunoglobulina total. Para isso testamos sua utilização como anti-soro humano, usando um kit comercial imunoenzimático para detecção de anticorpos ar\t\-Trypanosoma cruzi em soro humano (Chagatest Wiener lab). Neste teste, substituímos o conjugado comercial (anticorpos policlonais de cabra anti-lmunoglobulinas humanas conjugado com peroxidase) pelos nossos anticorpos purificados. Além disso, como os anticorpos utilizados não estavam conjugados, utilizamos na reação anticorpos policlonais de coelho anti-lgG de camundongos conjugados com peroxidase, a fim de se ligarem aos anti-soros testados.

[052] A Tabela 4 mostra como exemplo uma das reações feitas, utilizando como amostra soro humano previamente testado e positivo para Chagas. Tabela 4. Resultados de teste de ELISA para detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi em soro humano.

Anticorpos Resultados monoclonais (D.O. 450nm purificados (cut-off = 0,35)* 4C5F5 2^64 1A5D8 2JÍ9 1A5E8E4 2,84 1A5E8D6 2^96 1A5E2D5 2^99 1A5E2E10 3JD5 1A5E3F3 2^49 1A5E3C10 2^32 Comercial: 1,72 ‘Valores de referência do kit [053] Todos os critérios de validação da reação segundo as instruções do fabricante foram observados e cumpridos para todos os anticorpos testados.

[054] A tabela 4 mostra que os nossos anticorpos foram melhores que o próprio conjugado do kit, demonstrando assim que eles podem ser conjugados e usados em ensaios imunológicos com diferentes aplicações, cujo objetivo seja a detecção de anti-lmunoglobulinas humanas, como por exemplo, no diagnóstico de doenças infecciosas.

REINVINDICAÇÕES

HIBRIDOMAS MURINOS PRODUTORES DE ANTICORPOS ΑΝΤΙ- IΛΛ N ¢5 Í3 Ιημη Ο E3 U Lm· IN H U ΛΛ ji^^IN

Claims (6)

1. Hibridomas murinos produtores de anticorpos anti-imunoglobulinas humanas caracterizado por ser capaz de produzir anticorpos monoclonais anti-lgM humana.

2. Hibridomas murinos produtores de anticorpos anti-imunoglobulinas humanas caracterizado por anticorpo monoclonal anti- IgM humana secretado pelo hibridoma murino.

3. Hibridomas murinos produtores de anticorpos anti-imunoglobulinas humanas caracterizado pelo processo para a produção do anticorpo monoclonal anti-imunoglobulinas humana que compreende a cultura do hibridoma reinvindicado no item 1 e 2 bem como a obtenção do anticorpo produzido no sobrenadante da cultura dessas células.

4. Hibridomas murinos produtores de anticorpos anti-imunoglobulinas humanas caracterizado pelo anticorpo monoclonal produzido na ascite após inoculação em Balb/c dos hibridomas reinvindicados no iteml e 2.

5. Hibridomas murinos produtores de anticorpos anti-imunoglobulinas humanas caracterizado pelo anticorpo monoclonal produzido por métodos de cultivo submersos que possibilitem o incremento da massa de anticorpos monoclonais secretados in vitro do hibridoma item 1 e 2.

6. Hibridomas murinos produtores de anticorpos anti-imunoglobulinas humanas caracterizado por poder ser produzidos anticorpos monoclonais para serem usados como insumos na produção de kits de diagnóstico, em ensaios de dosagem dessas proteínas ou como insumo empregado em quaisquer outras reações antígeno-anticorpo.