BR102015019108B1

BR102015019108B1 - PROCESS FOR OBTAINING MANNOSYLERYTHRITOL LIPIDS (HONEY)

Info

Publication number: BR102015019108B1
Application number: BR102015019108-1A
Authority: BR
Inventors: Gláucia Maria Pastore; Cristiano José De Andrade; Francisco Fábio Cavalcanti Barros
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2023-07-18

Abstract

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MANOSILERITRITOL LIPÍDIO (MEL), COMPOSIÇÕES E USOS DAS MESMAS A presente invenção faz referência a um processo de obtenção de manosileritritol lipídio (MEL), preferencialmente do tipo B (MEL-B), por meio da fermentação, preferencialmente pela levedura Pseudozyma tsukubaensis, de manipueira (resíduo da indústria farinheira) como meio de cultura. Neste processo, o MEL é recuperado pela formação de espuma no biorreator e purificação desta por membranas em uma única etapa de ultrafiltração, que não utiliza solvente orgânico. Adicionalmente, a invenção faz referência a composições compreendendo alto teor de MEL, preferencialmente MEL-B, obtidos através do processo descrito, assim como seu uso para aplicações em cosméticos, como agente tensoativo, emulsificante na recuperação de petróleo e na pulverização em cultivares.PROCESS FOR OBTAINING MANNOSYLERYTHRITOL LIPID (HONEY), COMPOSITIONS AND USES THEREOF The present invention refers to a process for obtaining mannosylerythritol lipid (MEL), preferably type B (MEL-B), through fermentation, preferably by yeast Pseudozyma tsukubaensis, from manipueira (residue from the flour industry) as a culture medium. In this process, MEL is recovered by the formation of foam in the bioreactor and its purification by membranes in a single ultrafiltration step, which does not use organic solvent. Additionally, the invention refers to compositions comprising a high content of MEL, preferably MEL-B, obtained through the described process, as well as their use for applications in cosmetics, as a surfactant, emulsifier in oil recovery and for spraying on cultivars.

Description

Field of invention:

[001] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de manosileritritol lipídios (MEL) usando manipueira como meio de cultura, composições com alto teor de MEL obtido através do processo descrito e uso.[001] The present invention refers to a process for obtaining mannosylerythritol lipids (MEL) using manipueira as a culture medium, compositions with a high MEL content obtained through the described process and use.

[002] A invenção se aplica no campo de gerenciamento de resíduos, de forma mais específica na área de aproveitamento de resíduos, preferencialmente manipueira (resíduo da indústria farinheira), que não utiliza solvente orgânico. A composição obtida pelo processo da presente invenção pode ser aplicada em cosméticos, como agente tensoativo, como emulsificante na recuperação de petróleo ou para pulverização em cultivares.[002] The invention applies in the field of waste management, more specifically in the area of waste recovery, preferably manipueira (residue from the flour industry), which does not use organic solvent. The composition obtained by the process of the present invention can be applied in cosmetics, as a surfactant, as an emulsifier in oil recovery or for spraying on cultivars.

Fundamentals of the invention:

[003] Biossurfactantes são compostos que consistem em subprodutos metabólicos de bactérias, fungos e leveduras e que exibem propriedades surfactantes, isto é, diminuem a tensão superficial e possuem alta capacidade emulsificante.[003] Biosurfactants are compounds that consist of metabolic byproducts of bacteria, fungi and yeast and that exhibit surfactant properties, that is, they reduce surface tension and have high emulsifying capacity.

[004] Em comparação com seus homólogos químicos, os biossurfactantes apresentam menor toxicidade, biodegradabilidade e estabilidade em condições extremas. Um exemplo de biossurfactante é o manosileritritol lipídio (MEL) dos tipos -A, -B, ou -C ou, o qual consiste em uma mistura de derivados parcialmente acilados de 4-O-β-D- manopiranosil-D-eritritol, contendo ácidos graxos diferentes na sua porção hidrofóbica. Este biossurfactante é produzido por leveduras do gênero Pseudozyma, sendo reportado na literatura que a espécie Pseudozyma tsukubaensis produz apenas o MEL-B.[004] Compared to their chemical counterparts, biosurfactants have lower toxicity, biodegradability and stability in extreme conditions. An example of a biosurfactant is the lipid mannosylerythritol (MEL) of types -A, -B, or -C or, which consists of a mixture of partially acylated derivatives of 4-O-β-D-mannopyranosyl-D-erythritol, containing different fatty acids in its hydrophobic portion. This biosurfactant is produced by yeasts of the genus Pseudozyma, and it is reported in the literature that the species Pseudozyma tsukubaensis produces only MEL-B.

[005] Atualmente, em escala industrial, a produção do manosileritritol lipídio (MEL) é realizada com o uso de meio de cultura sintético (solução de sais minerais). Além disso, o processo de purificação é dispendioso, pois engloba as etapas de: extração líquido-líquido (acetato de etila) do manosileritritol lipídio diretamente do meio de cultura, seguido de secagem do mesmo, sua dissolução em clorofórmio e cromatografia em coluna de sílica.[005] Currently, on an industrial scale, the production of lipid mannosylerythritol (MEL) is carried out using synthetic culture medium (mineral salt solution). Furthermore, the purification process is expensive, as it encompasses the steps of: liquid-liquid extraction (ethyl acetate) of the lipid mannosylerythritol directly from the culture medium, followed by drying it, dissolving it in chloroform and chromatography on a silica column .

[006] Os passos de purificação podem representar cerca de 60% do custo de produção. Dessa maneira, devido ao alto custo associado a métodos ineficientes de recuperação do produto e ao uso de substratos caros, o uso comercial de biossurfactantes é restritivo. Contudo, uma alternativa é a produção de MEL por meio de cultura através de resíduos agroindustriais.[006] Purification steps can represent around 60% of the production cost. Therefore, due to the high cost associated with inefficient product recovery methods and the use of expensive substrates, the commercial use of biosurfactants is restrictive. However, an alternative is the production of HONEY through cultivation using agro-industrial waste.

[007] A manipueira é um líquido de cor amarelada que sai da mandioca depois dela prensada, durante a fabricação da farinha. Se a mesma for despejada na natureza, provoca a poluição do solo e das águas (rios, riachos e açudes), causando grandes prejuízos ao meio ambiente e ao homem.[007] Manipueira is a yellowish liquid that comes out of cassava after it is pressed, during the manufacture of flour. If it is dumped into nature, it causes soil and water pollution (rivers, streams and reservoirs), causing great damage to the environment and humans.

[008] Portanto, visto que a manipueira é um resíduo da indústria de farinha, rica em minerais e carboidratos, a presente invenção propõe um processo de obtenção de MEL, preferencialmente o MEL-B, usando manipueira como meio de cultura, através da recuperação do biossurfactante pela formação de espuma no biorreator e purificação desta por membranas em uma única etapa de ultrafiltração, o qual não é utilizado solvente orgânico.[008] Therefore, since manipueira is a residue from the flour industry, rich in minerals and carbohydrates, the present invention proposes a process for obtaining MEL, preferably MEL-B, using manipueira as a culture medium, through the recovery of the biosurfactant by the formation of foam in the bioreactor and its purification by membranes in a single ultrafiltration step, in which no organic solvent is used.

[009] Com isso, as principais vantagens obtidas com a presente invenção podem ser divididas em duas grandes seções: (i) impacto ambiental e (ii) redução do custo de produção.[009] Therefore, the main advantages obtained with the present invention can be divided into two large sections: (i) environmental impact and (ii) reduction in production costs.

[010] A primeira (i) é relacionada à utilização de um resíduo agroindustrial como meio de cultura, que atualmente, é um problema para a indústria que gera tal resíduo e que deve realizar o seu descarte de maneira ambientalmente correta. Além disso, a invenção não utiliza solventes orgânicos, que são potencialmente prejudiciais ao meio ambiente.[010] The first (i) is related to the use of agro-industrial waste as a culture medium, which is currently a problem for the industry that generates such waste and must dispose of it in an environmentally correct manner. Furthermore, the invention does not use organic solvents, which are potentially harmful to the environment.

[011] A segunda (ii) é relacionada ao fator econômico, pois o meio de cultura é obtido com custo nulo (uma vez que é um resíduo) e a indústria que gera o resíduo economiza as despesas relacionadas ao tratamento e ao correto descarte deste.[011] The second (ii) is related to the economic factor, as the culture medium is obtained at zero cost (since it is waste) and the industry that generates the waste saves expenses related to the treatment and correct disposal of this .

[012] Ainda, a recuperação do MEL através da coleta da espuma produzida durante a fermentação não implica em altos investimentos de equipamentos. E finalmente, a etapa de purificação com a ultrafiltração é simples, rápida, de baixo custo (uma vez que as membranas são reutilizáveis) e resulta em um elevado nível de pureza do biossurfactante.[012] Furthermore, the recovery of MEL through the collection of foam produced during fermentation does not imply high equipment investments. And finally, the purification step with ultrafiltration is simple, fast, low cost (since the membranes are reusable) and results in a high level of purity of the biosurfactant.

[013] Assim, de forma geral, o novo processo aqui proposto reduz o impacto ambiental e econômico da obtenção e purificação do biossurfactante MEL.[013] Thus, in general, the new process proposed here reduces the environmental and economic impact of obtaining and purifying the MEL biosurfactant.

State of the art:

[014] Alguns documentos do estado da técnica descrevem um processo no qual a ultrafiltração é uma etapa comum para a purificação dos produtos relativos a cada documento ou descrevem um processo de obtenção de biossurfactante.[014] Some prior art documents describe a process in which ultrafiltration is a common step for purifying the products related to each document or describe a process for obtaining biosurfactant.

[015] Em WO200420647, é descrito um processo de obtenção de manosileritritol lipídio com um meio de cultura composto por fontes hidrofóbicas de carbono (óleos vegetais) e de nitrogênio (nitrato) por Pseudozyma aphidis. Além disso, este documento reporta a recuperação e a purificação do manosileritritol lipídio (MEL) da seguinte forma: aquecendo e resfriando o meio de cultura após a fermentação (para obter duas fases) e utilizando soluções de álcool para purificar o mesmo.[015] In WO200420647, a process for obtaining mannosylerythritol lipid is described with a culture medium composed of hydrophobic sources of carbon (vegetable oils) and nitrogen (nitrate) by Pseudozyma aphidis. Furthermore, this document reports the recovery and purification of the lipid mannosylerythritol (MEL) in the following way: heating and cooling the culture medium after fermentation (to obtain two phases) and using alcohol solutions to purify it.

[016] Diferentemente, a presente invenção utiliza meio de cultura não hidrofóbico. Em uma modalidade preferida, utiliza a espécie Pseudozyma tsukubaensis e recupera o MEL do tipo B através da formação de espuma no biorreator, a qual é purificada com ultrafiltração.[016] Differently, the present invention uses non-hydrophobic culture medium. In a preferred embodiment, it uses the species Pseudozyma tsukubaensis and recovers type B MEL through the formation of foam in the bioreactor, which is purified with ultrafiltration.

[017] O documento US20060194294 se refere à purificação de estaurosporina por etapas específicas de ultrafiltração, diafiltração (utilizando solventes orgânicos solúveis em água) e precipitação.[017] Document US20060194294 refers to the purification of staurosporine by specific steps of ultrafiltration, diafiltration (using water-soluble organic solvents) and precipitation.

[018] A invenção proposta promove a recuperação do MEL através da formação de espuma formada durante a fermentação. Já o documento US20060194294 extrai o composto de interesse do meio de cultura. Além disso, a presente invenção utiliza apenas um processo de purificação por membranas e utiliza apenas água como solvente, enquanto o documento de anterioridade adiciona solvente orgânico solúvel em água anteriormente ao processo de ultrafiltração e diafiltração, seguido de precipitação. Resumindo, o método da invenção proposta é muito mais simples, pois não inclui uso de solvente orgânico, precipitação e diafiltração.[018] The proposed invention promotes the recovery of HONEY through the formation of foam formed during fermentation. Document US20060194294 extracts the compound of interest from the culture medium. Furthermore, the present invention uses only a membrane purification process and uses only water as a solvent, while the prior document adds water-soluble organic solvent prior to the ultrafiltration and diafiltration process, followed by precipitation. In short, the method of the proposed invention is much simpler, as it does not include the use of organic solvent, precipitation and diafiltration.

[019] Os documentos WO9915464 e US6004466 se referem a etapas de tratamento de resíduo, com a utilização de surfactantes não iônicos, em que o surfactante é adicionado ao resíduo. Em seguida, a solução é ultrafiltrada e os surfactantes e água são recuperados no permeado, enquanto os contaminantes são retidos.[019] Documents WO9915464 and US6004466 refer to waste treatment steps, using non-ionic surfactants, in which the surfactant is added to the waste. Then, the solution is ultrafiltered and the surfactants and water are recovered in the permeate, while the contaminants are retained.

[020] A invenção proposta difere destes documentos principalmente pelo fato de que clama pela produção seguida da purificação do MEL, preferencialmente o MEL-B. A ultrafiltração retém o biossurfactante, enquanto as impurezas são permeadas. Ou seja, é o oposto ao descrito nos referidos documentos.[020] The proposed invention differs from these documents mainly in that it calls for the production followed by purification of MEL, preferably MEL-B. Ultrafiltration retains the biosurfactant, while impurities are permeated. In other words, it is the opposite of what is described in the aforementioned documents.

[021] O documento US5071751 se refere ao aumento do rendimento da produção de ácido hialurônico (HA) pela adição de soro do sangue (diversos animais) ao meio de cultura, seguido de purificação do HA por centrifugação ou filtração, diafiltração ou ultrafiltração, adição de álcool ao permeado, coleta do precipitado e finalmente, purificação do mesmo por coluna de troca iônica ou permeação em gel.[021] Document US5071751 refers to increasing the yield of hyaluronic acid (HA) production by adding blood serum (various animals) to the culture medium, followed by purification of the HA by centrifugation or filtration, diafiltration or ultrafiltration, addition of alcohol to the permeate, collection of the precipitate and finally, its purification by ion exchange column or gel permeation.

[022] A invenção proposta difere do documento US5071751 principalmente pelo fato de que aborda a produção de MEL (compostos muito diferentes). Além disso, há a etapa de recuperação pela formação de espuma. A etapa de purificação da invenção proposta é muito mais simples, com apenas uma etapa de ultrafiltração, em que o produto de interesse é retido. Ou seja, não utiliza solvente, colunas de troca iônica ou permeação em gel.[022] The proposed invention differs from document US5071751 mainly due to the fact that it addresses the production of MEL (very different compounds). In addition, there is the recovery stage through foam formation. The purification step of the proposed invention is much simpler, with just one ultrafiltration step, in which the product of interest is retained. In other words, it does not use solvents, ion exchange columns or gel permeation.

[023] O documento US20100137579 se refere à produção e purificação do ácido hialurônico (HA) por Streptococcus zooepidemicus, em meio sintético, seguida da diafiltração do meio de cultura. A invenção proposta difere do referido documento principalmente pelo fato de que clama pela produção seguida da purificação do MEL, preferencialmente o MEL-B. Ou seja, trata-se de produções e purificações de compostos totalmente diferentes, no qual o documento US20100137579 utiliza o ajuste de pH e diafiltração para purificar o HA, enquanto a invenção proposta utiliza a recuperação do biossurfactante pela formação de espuma seguida da ultrafiltração.[023] Document US20100137579 refers to the production and purification of hyaluronic acid (HA) by Streptococcus zooepidemicus, in synthetic medium, followed by diafiltration of the culture medium. The proposed invention differs from the aforementioned document mainly due to the fact that it calls for the production followed by the purification of MEL, preferably MEL-B. In other words, these are productions and purifications of completely different compounds, in which document US20100137579 uses pH adjustment and diafiltration to purify HA, while the proposed invention uses the recovery of the biosurfactant by foaming followed by ultrafiltration.

[024] A tecnologia descrita nos documentos PT 106959A e WO2014185805A1 reporta a obtenção de MEL utilizando substratos alternativos. Porém, a tecnologia descrita nesses documentos engloba apenas substratos lignocelulósicos, ou seja, trata-se de uma fermentação em estado sólido. A invenção proposta também utiliza resíduos, entretanto, são resíduos não lignocelulósicos, tal como a manipueira, e aplica-se um processo de fermentação submersa. Além disso, não é mencionado nenhum processo de purificação, enquanto a invenção proposta purifica o MEL com membranas.[024] The technology described in documents PT 106959A and WO2014185805A1 reports the obtaining of MEL using alternative substrates. However, the technology described in these documents only encompasses lignocellulosic substrates, that is, it is solid-state fermentation. The proposed invention also uses waste, however, it is non-lignocellulosic waste, such as manipueira, and a submerged fermentation process is applied. Furthermore, no purification process is mentioned, while the proposed invention purifies MEL with membranes.

[025] Portanto, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve um processo de obtenção de MEL, preferencialmente o MEL-B por Pseudozyma tsukubaensis, usando manipueira como meio de cultura, em que este processo promove a recuperação do MEL pela formação de espuma no biorreator e purificação desta por membranas em uma única etapa de ultrafiltração, em que não se utiliza solvente orgânico, tal como o descrito na presente invenção.[025] Therefore, none of the prior art documents describe a process for obtaining MEL, preferably MEL-B by Pseudozyma tsukubaensis, using manipueira as a culture medium, in which this process promotes the recovery of MEL through the formation of foam in the bioreactor and purification of this by membranes in a single ultrafiltration step, in which no organic solvent is used, such as that described in the present invention.

[026] Consequentemente, também não há documentos que fazem referência à composição com alto teor de MEL, preferencialmente o MEL-B, obtidos através do processo descrito, bem como seus usos para aplicações em cosméticos, como agente tensoativo, emulsificante na recuperação de petróleo e na pulverização em cultivares.[026] Consequently, there are also no documents that refer to the composition with a high content of MEL, preferably MEL-B, obtained through the described process, as well as its uses for applications in cosmetics, as a surfactant, emulsifier in oil recovery and spraying on cultivars.

Brief description of the invention:

[027] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de manosileritritol lipídios (MEL) usando manipueira (resíduo da indústria farinheira) como meio de cultura.[027] The present invention refers to a process for obtaining mannosylerythritol lipids (MEL) using manipueira (residue from the flour industry) as a culture medium.

[028] No processo, o MEL é recuperado pela formação de espuma no biorreator e purificado por membranas em uma única etapa de ultrafiltração, que não utiliza solvente orgânico.[028] In the process, MEL is recovered by foaming in the bioreactor and purified by membranes in a single ultrafiltration step, which does not use organic solvent.

[029] Em uma modalidade preferida da invenção, propõe-se um processo de obtenção do biossurfactante manosileritritol lipídio do tipo B (MEL-B) por Pseudozyma tsukubaensis.[029] In a preferred embodiment of the invention, a process is proposed for obtaining the biosurfactant mannosylerythritol lipid type B (MEL-B) by Pseudozyma tsukubaensis.

[030] Adicionalmente, a invenção faz referência a composições com alto teor de MEL obtido através do processo descrito. Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere à composição com alto teor de MEL-B obtida, assim como seus usos para aplicações em cosméticos, como agente tensoativo, emulsificante na recuperação de petróleo e na pulverização em cultivares.[030] Additionally, the invention refers to compositions with a high MEL content obtained through the described process. In a preferred embodiment, the present invention refers to the composition with a high content of MEL-B obtained, as well as its uses for applications in cosmetics, as a surface-active agent, emulsifier in oil recovery and for spraying on cultivars.

Brief description of the figures:

[031] Para obter um total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.[031] To obtain a total and complete visualization of the object of this invention, the figures to which references are made are presented, as follows.

[032] A Figura 1 representa graficamente o perfil dos parâmetros fermentativos, sendo estes a tensão superficial do meio de cultura (círculo preto), a diluição micelar crítica - 10x (triângulo), a diluição micelar crítica - 100x (losango) e a contagem de células (círculo branco).[032] Figure 1 graphically represents the profile of the fermentative parameters, these being the surface tension of the culture medium (black circle), the critical micellar dilution - 10x (triangle), the critical micellar dilution - 100x (diamond) and the count of cells (white circle).

[033] A Figura 2 representa graficamente o processo de ultrafiltração baseado no fluxo do sistema.[033] Figure 2 graphically represents the ultrafiltration process based on the system flow.

[034] A Figura 3 representa graficamente o perfil do processo de ultrafiltração baseado no volume de alimentação através das concentrações do manosileritritol lipídio tipo B retido (círculo), proteína no retido (triângulo) e proteína no permeado (quadrado).[034] Figure 3 graphically represents the profile of the ultrafiltration process based on the feed volume through the concentrations of the type B lipid mannosylerythritol retained (circle), protein in the retained (triangle) and protein in the permeate (square).

[035] A Figura 4 representa graficamente a análise de infravermelho da amostra de manosileritritol lipídio purificada por ultrafiltração.[035] Figure 4 graphically represents the infrared analysis of the lipid mannosylerythritol sample purified by ultrafiltration.

[036] A Figura 5 representa graficamente a análise de MALDI-TOF-MS da amostra de manosileritritol lipídio purificada por ultrafiltração.[036] Figure 5 graphically represents the MALDI-TOF-MS analysis of the lipid mannosylerythritol sample purified by ultrafiltration.

[037] A Figura 6 representa graficamente a análise de CG-MS (perfil dos ácidos graxos) da amostra de manosileritritol lipídio purificada por ultrafiltração, após extração e esterificação dos ácidos graxos.[037] Figure 6 graphically represents the GC-MS analysis (fatty acid profile) of the lipid mannosylerythritol sample purified by ultrafiltration, after extraction and esterification of the fatty acids.

Detailed description of the invention:

[038] A presente invenção se refere a um processo de obtenção de manosileritritol lipídios (MEL) usando manipueira (resíduo da indústria farinheira) como meio de cultura.[038] The present invention refers to a process for obtaining mannosylerythritol lipids (MEL) using manipueira (residue from the flour industry) as a culture medium.

[039] O processo de obtenção de MEL desta invenção compreende as etapas de: a) Tratar a manipueira; b) Produzir o MEL por fermentação; b.1) Fermentação nas primeiras 24 horas b.2) Fermentação de 24 a 84 horas c) Recuperar e centrifugar a espuma produzida; d) Secar e reidratar a solução obtida na etapa “c”; e) Filtrar a solução obtida em “d” em um equipamento de ultrafiltração com agitação magnética; f) Obter a solução com concentração de MEL que varia de 800 a 900mg/L.[039] The process of obtaining MEL of this invention comprises the steps of: a) Treating manipueira; b) Produce HONEY by fermentation; b.1) Fermentation in the first 24 hours b.2) Fermentation from 24 to 84 hours c) Recover and centrifuge the foam produced; d) Dry and rehydrate the solution obtained in step “c”; e) Filter the solution obtained in “d” using ultrafiltration equipment with magnetic stirring; f) Obtain the solution with a MEL concentration that varies from 800 to 900mg/L.

[040] Os MELs que podem ser obtidos através do processo descrito são selecionados dos grupos que consistem em manosileritritol lipídios dos tipos -A, -B, -C e -D, preferencialmente manosileritritol lipídio do tipo B (MEL- B).[040] The MELs that can be obtained through the described process are selected from the groups consisting of mannosylerythritol lipids of types -A, -B, -C and -D, preferably mannosylerythritol lipid of type B (MEL-B).

[041] A manipueira, que é um líquido de cor amarelada que sai da mandioca depois que ela é prensada, durante a processo de fabricação da farinha, é utilizada no presente processo como meio de cultura devido ao seu alto teor de nutrientes, conforme exemplo de composição apresentado na Tabela 1.[041] Manipueira, which is a yellowish liquid that comes out of cassava after it is pressed, during the flour manufacturing process, is used in the present process as a culture medium due to its high nutrient content, as shown in the example. composition presented in Table 1.

[042] No entanto, alternativamente, a manipueira pode ser substituída por quaisquer outros resíduos, desde que sejam resíduos agroindustriais com elevada solubilidade em água, ou meio de cultura, desde que os mesmos apresentem componentes e possuam condições que supram as necessidades do micro-organismo usado para a produção do MEL de interesse, preferencialmente os que contêm açúcar; e meios de cultura sintéticos e naturais. Tabela 1 - Composição da manipueira [042] However, alternatively, manipueira can be replaced by any other waste, as long as they are agro-industrial waste with high solubility in water, or culture medium, as long as they have components and conditions that meet the needs of the micro- organism used to produce the HONEY of interest, preferably those containing sugar; and synthetic and natural culture media. Table 1 - Composition of manipueira

[043] Sendo assim, na etapa “a”, o tratamento da manipueira ocorre através de aquecimento até seu ponto de ebulição durante um intervalo de tempo que varia de 1 a 5 minutos, preferencialmente 3 minutos. Em seguida, a mesma é centrifugada a uma força centrífuga que varia de 103 a 5x104g, preferencialmente 104g. Assim, o sobrenadante obtido é utilizado como substrato no processo fermentativo.[043] Therefore, in step “a”, the treatment of manipueira occurs through heating to its boiling point during a time interval that varies from 1 to 5 minutes, preferably 3 minutes. It is then centrifuged at a centrifugal force ranging from 103 to 5x104g, preferably 104g. Thus, the supernatant obtained is used as a substrate in the fermentation process.

[044] Na etapa “b”, a produção do MEL é realizada com a manipueria tratada na etapa “a”, a qual deve ser previamente esterilizada em uma temperatura que varia de 110 a 130oC, preferencialmente 121oC, durante um intervalo de tempo que varia de 10 a 30 minutos, preferencialmente 20 minutos, em bioreator industrial de 7,5 litros com volume de trabalho de 3,0 litros.[044] In step “b”, the production of MEL is carried out with the manipueria treated in step “a”, which must be previously sterilized at a temperature ranging from 110 to 130oC, preferably 121oC, for a period of time that varies from 10 to 30 minutes, preferably 20 minutes, in a 7.5 liter industrial bioreactor with a working volume of 3.0 liters.

[045] Deste modo, a sub-etapa “b.1” compreende as primeiras 24 horas do processo fermentativo e ocorre nas condições em que a taxa de agitação varia de 50 a 150rpm, preferencialmente 100rpm, e a taxa de aeração varia de 0,1 a 1,0vvm, preferencialmente 0,4vvm (volume de ar por volume de meio, por minuto). A sub-etapa “b.2” compreende entre 24 a 84 horas, a taxa de agitação varia de 100 a 200rpm, preferencialmente 150rpm, e a taxa de aeração varia de 0,4 a 1,6vvm, preferencialmente 0,8vvm (Figura 1).[045] Thus, sub-step “b.1” comprises the first 24 hours of the fermentation process and occurs under conditions in which the agitation rate varies from 50 to 150 rpm, preferably 100 rpm, and the aeration rate varies from 0 .1 to 1.0vvm, preferably 0.4vvm (volume of air per volume of medium, per minute). Sub-step “b.2” comprises between 24 and 84 hours, the agitation rate varies from 100 to 200rpm, preferably 150rpm, and the aeration rate varies from 0.4 to 1.6vvm, preferably 0.8vvm (Figure 1).

[046] Por conseguinte, o processo fermentativo é iniciado com a inoculação de meio de cultura YEPD que varia de 100 a 300ml, preferencialmente 210mL, na concentração que varia de 0,02 a 0,231g, preferencialmente 0,02155g de células de levedura por 100mL, em que estas leveduras são selecionadas do grupo que compreende Schizonella melanogramma, Kurtzmanomyces sp, Ustilago sp e Pseudozyma tsukubaensis.[046] Therefore, the fermentative process is initiated with the inoculation of YEPD culture medium ranging from 100 to 300ml, preferably 210mL, at a concentration ranging from 0.02 to 0.231g, preferably 0.02155g of yeast cells per 100mL, in which these yeasts are selected from the group comprising Schizonella melanogramma, Kurtzmanomyces sp, Ustilago sp and Pseudozyma tsukubaensis.

[047] Em uma modalidade preferida da presente invenção, as células de levedura utilizadas são do tipo Pseudozyma tsukubaensis para a obtenção de MEL-B (Figura 2).[047] In a preferred embodiment of the present invention, the yeast cells used are of the Pseudozyma tsukubaensis type to obtain MEL-B (Figure 2).

[048] Na etapa “c”, a recuperação primária de MEL é realizada durante o processo fermentativo, devido à agitação e aeração descrita na etapa anterior, em que de 0,5 a 1,5L, preferencialmente 1L, de espuma é recuperada por orifício no topo do fermentador.[048] In step “c”, the primary recovery of MEL is carried out during the fermentation process, due to the agitation and aeration described in the previous step, in which 0.5 to 1.5L, preferably 1L, of foam is recovered by hole at the top of the fermenter.

[049] Este processo separa os compostos que são capazes de formar espuma, neste caso, separar o MEL de interesse do meio de cultura (que contém uma concentração alta de impurezas), ou seja, é uma metodologia que aproveita as características do processo fermentativo (formação de espuma) para recuperar os referidos biossurfactantes e realizar uma etapa de purificação ao mesmo tempo, sem a adição de nenhum material ou aparatos de alta dificuldade.[049] This process separates the compounds that are capable of forming foam, in this case, separating the MEL of interest from the culture medium (which contains a high concentration of impurities), that is, it is a methodology that takes advantage of the characteristics of the fermentative process (foaming) to recover said biosurfactants and carry out a purification step at the same time, without the addition of any highly difficult materials or apparatus.

[050] Em seguida, a espuma é centrifugada à força centrífuga que varia de 103 a 5x104g, preferencialmente 104, durante um intervalo de tempo que varia de 10 a 30 minutos, preferencialmente 20 minutos. Assim, o sobrenadante resultante é utilizado para a sequência dos procedimentos.[050] Next, the foam is centrifuged at a centrifugal force that varies from 103 to 5x104g, preferably 104, for a time interval that varies from 10 to 30 minutes, preferably 20 minutes. Thus, the resulting supernatant is used for the sequence of procedures.

[051] Na etapa “d”, a secagem é realizada por liofilizador de bandeja e o pó remanescente resultante de uma massa que varia entre 10 e 18g, preferencialmente a 14g, é armazenado a uma temperatura que varia de -20 a -1°C, preferencialmente -18oC. A etapa “d” é opcional.[051] In step “d”, drying is carried out using a tray freeze dryer and the remaining powder resulting from a mass ranging between 10 and 18g, preferably 14g, is stored at a temperature ranging from -20 to -1° C, preferably -18oC. Step “d” is optional.

[052] Posteriormente, é realizada a reidratação (adição de água) do pó obtido no processo de secagem em concentração que varia de 700 a 1300mg, preferencialmente 1000mg por litro.[052] Subsequently, the powder obtained in the drying process is rehydrated (addition of water) at a concentration ranging from 700 to 1300mg, preferably 1000mg per liter.

[053] Na etapa “e”, essa solução, que varia de 200 a 300mL, preferencialmente 250mL, é adicionada a um equipamento de ultrafiltração, tal como TFF system, com agitação magnética que varia de 40 a 60rpm e purificação por membrana tal como membrana de polietersulfona (PES), celulose regenerada, polipropileno, ácido poliático, entre outras, preferencialmente membrana de polietersulfona (PES), em que seu peso molecular de corte é de 100kDa e área efetiva de 50cm2. A pressão nas válvulas de alimentação é mantida entre 10 a 30psi, preferencialmente 20psi, pressão nas válvulas do retido (retroalimentação) deve ser mantido entre 9 e 11psi, preferencialmente 10psi. Além disso, não há a adição de solvente orgânico.[053] In step “e”, this solution, which varies from 200 to 300mL, preferably 250mL, is added to ultrafiltration equipment, such as the TFF system, with magnetic stirring that varies from 40 to 60rpm and membrane purification such as polyethersulfone (PES) membrane, regenerated cellulose, polypropylene, polyatic acid, among others, preferably polyethersulfone (PES) membrane, where its cutoff molecular weight is 100kDa and effective area of 50cm2. The pressure in the supply valves is maintained between 10 and 30 psi, preferably 20 psi, pressure in the retainer (feedback) valves must be maintained between 9 and 11 psi, preferably 10 psi. Furthermore, there is no addition of organic solvent.

[054] Sendo assim, a purificação por membranas é possível devido à separação do MEL de diversas impurezas (recuperação da espuma), uma vez que soluções com alto teor de impureza resultam em fouling - entupimento dos poros - ou seja, não há filtração.[054] Therefore, membrane purification is possible due to the separation of MEL from various impurities (foam recovery), since solutions with a high impurity content result in fouling - clogging of the pores - that is, there is no filtration.

[055] Deste modo, o fluxo da ultrafiltração é de 90 a 45L/h.mA2(+/-5) e deve ser calculado baseado na Equação 1 abaixo: Equação 1 - (LMH or L/m2 h) = [flow rate (mL/min)/membrane aerea (cm2)] x 600.[055] Therefore, the ultrafiltration flow is 90 to 45L/h.mA2(+/-5) and must be calculated based on Equation 1 below: Equation 1 - (LMH or L/m2 h) = [flow rate (mL/min)/air membrane (cm2)] x 600.

[056] Cabe ressaltar que o sistema deve ser condicionado (limpeza) antes e após a ultrafiltração e a membrana deve ser armazenada de acordo com o protocolo do fabricante.[056] It should be noted that the system must be conditioned (cleaned) before and after ultrafiltration and the membrane must be stored according to the manufacturer's protocol.

[057] Assim, após um intervalo de tempo que varia de 40 a 50 minutos, preferencialmente 45 minutos de filtração, o volume inicial da alimentação é reduzido a 1/10 do valor inicial. Por exemplo, se o volume inicial da alimentação é de 250mL, este é reduzido a 25mL (Figura 3).[057] Thus, after a time interval ranging from 40 to 50 minutes, preferably 45 minutes of filtration, the initial volume of the feed is reduced to 1/10 of the initial value. For example, if the initial feeding volume is 250mL, it is reduced to 25mL (Figure 3).

[058] Vale ressaltar que, devido às etapas de coleta da espuma, liofilização e ultrafiltração, há uma perda natural de material. Entretanto o diferencial da presente invenção é o fato da ultrafiltração e purificação por membrana do substrato ser realizada em uma única etapa (etapa “e”), melhorando, assim, a produtividade e o rendimento do volume final.[058] It is worth noting that, due to the foam collection, freeze-drying and ultrafiltration stages, there is a natural loss of material. However, the difference of the present invention is the fact that the ultrafiltration and membrane purification of the substrate is carried out in a single step (step “e”), thus improving the productivity and yield of the final volume.

[059] Portanto, na etapa “f”, o volume final da solução, obtido após filtração, apresenta alta concentração de MEL que varia de 800 a 900mg/L.[059] Therefore, in step “f”, the final volume of the solution, obtained after filtration, has a high concentration of MEL ranging from 800 to 900mg/L.

[060] Em uma modalidade alternativa da presente invenção, o volume final obtido na etapa “f” é submetido à secagem da solução por liofilização, visando à obtenção de pó com alta concentração de MEL, o qual varia de 200 a 300mg.[060] In an alternative embodiment of the present invention, the final volume obtained in step “f” is subjected to drying of the solution by freeze-drying, aiming to obtain powder with a high concentration of MEL, which varies from 200 to 300 mg.

[061] Cabe ressaltar que o rendimento do processo e a necessidade de etapas adicionais ou modificadas no processo de purificação podem ser dependentes de cada MEL, tais como do tipo -A, -B, -C, -D ou mistura dos mesmos.[061] It should be noted that the yield of the process and the need for additional or modified steps in the purification process may depend on each MEL, such as type -A, -B, -C, -D or a mixture thereof.

[062] Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere ao processo de obtenção do biossurfactante MEL-B por Pseudozyma tsukubaensis.[062] In a preferred embodiment, the present invention refers to the process of obtaining the biosurfactant MEL-B by Pseudozyma tsukubaensis.

[063] Assim sendo, na etapa “f”, o volume final da solução obtido após filtração, apresenta alta concentração de MEL-B, o qual varia de 800 a 900mg/L, preferencialmente 859,52mg/L (Figura 4).[063] Therefore, in step “f”, the final volume of the solution obtained after filtration, presents a high concentration of MEL-B, which varies from 800 to 900mg/L, preferably 859.52mg/L (Figure 4).

[064] Ainda, o volume final obtido na etapa “f” de MEL-B pode ser submetido à secagem da solução por liofilização, para obtenção de pó com alta concentração de MEL-B, o qual varia de 200 a 300mg.[064] Furthermore, the final volume obtained in step “f” of MEL-B can be subjected to drying of the solution by freeze-drying, to obtain powder with a high concentration of MEL-B, which varies from 200 to 300mg.

[065] Desta forma, adicionalmente, a presente invenção faz referência a composição com alto teor de MEL que varia de 800 a 900mg/L e de 200 a 350mg, respectivamente, na forma de solução e de pó obtida conforme processo aqui descrito.[065] Therefore, in addition, the present invention refers to a composition with a high MEL content that varies from 800 to 900mg/L and from 200 to 350mg, respectively, in the form of solution and powder obtained according to the process described here.

[066] Em uma modalidade preferida da presente invenção a composição obtida compreende alto teor de MEL-B, que varia de 800 a 900mg/L e de 200 a 300mg, respectivamente, na forma de solução e de pó.[066] In a preferred embodiment of the present invention, the composition obtained comprises a high content of MEL-B, which varies from 800 to 900mg/L and from 200 to 300mg, respectively, in solution and powder form.

[067] Adicionalmente, a invenção proposta se refere ao uso da composição com alto teor de MEL-B na forma de solução para a aplicação como agente tensoativo, emulsificante na recuperação de petróleo e na pulverização em cultivares (atividade antimicrobiana); e, na forma de pó, para a aplicação em cosméticos, preferencialmente os dermocosméticos.[067] Additionally, the proposed invention refers to the use of the composition with a high MEL-B content in the form of a solution for application as a surfactant, emulsifier in oil recovery and for spraying on cultivars (antimicrobial activity); and, in powder form, for application in cosmetics, preferably dermocosmetics.

- Tests: - Proportion of MEL-B obtained by each fermentation using the process described here:

[068] Em um teste de obtenção de MEL-B utilizando o processo da presente invenção, a espuma produzida durante cada fermentação resultou em cerca de 1060mL. Após a etapa de liofilização, cerca de 14,01g de pó foram recolhidos. O pó foi, então, solubilizado em uma concentração de 1091,59mg/L e essa solução foi utilizada para o processo de ultrafiltração.[068] In a test to obtain MEL-B using the process of the present invention, the foam produced during each fermentation resulted in around 1060mL. After the freeze-drying step, around 14.01g of powder was collected. The powder was then solubilized at a concentration of 1091.59mg/L and this solution was used for the ultrafiltration process.

[069] O processo de ultrafiltração resultou em 25mL de solução com concentração de manosileritritol lipídio igual a 859,52mg/L, ou seja, 21,49mg de manosileritritol lipídio. Logo, extrapolando a solubilização de 1091,59mg/L para os 14,01g produzidos em cada fermentação, é possível obter aproximadamente 275mg de manosileritritol lipídio purificado.[069] The ultrafiltration process resulted in 25mL of solution with a lipid mannosylerythritol concentration equal to 859.52mg/L, that is, 21.49mg of lipid mannosylerythritol. Therefore, extrapolating the solubilization of 1091.59mg/L to the 14.01g produced in each fermentation, it is possible to obtain approximately 275mg of purified lipid mannosylerythritol.

- Chemical identification of MEL-B:

[070] A identificação química do manosileritritol lipídio pode ser realizada com análises de infravermelho do manosileritritol lipídio, CG-MS e MALDI-TOF-MS.[070] The chemical identification of the lipid mannosylerythritol can be carried out with infrared analysis of the lipid mannosylerythritol, GC-MS and MALDI-TOF-MS.

[071] A análise de infravermelho do manosileritritol lipídio deve indicar alta absorção nos seguintes números de ondas: 3400 (O-H), 1730 (C=O), 1240 (CO), 1075 (-0-). Na Figura 5, os manosileritritol lipídios são identificados por infravermelho.[071] Infrared analysis of the lipid mannosylerythritol should indicate high absorption at the following wave numbers: 3400 (O-H), 1730 (C=O), 1240 (CO), 1075 (-0-). In Figure 5, mannosylerythritol lipids are identified by infrared.

[072] A análise de MALDI-TOF-MS deve indicar a produção de uma série de homólogos, porém com os principais picos com razão carga massa (m/z) de 683,41 e 657,42. Na Figura 6, os manosileritritol lipídios são identificados por MALDI-TOF-MS (espectro).[072] The MALDI-TOF-MS analysis should indicate the production of a series of homologues, however with the main peaks with mass charge ratio (m/z) of 683.41 and 657.42. In Figure 6, mannosylerythritol lipids are identified by MALDI-TOF-MS (spectrum).

[073] A análise dos ácidos graxos por CG-MS deve identificar a presença de C8; C10; C12:1; C12:0; C14:1 e C18:1, no qual C12 e C14:1 devem ser majoritários. Na Figura 7, é possível observar o perfil dos ácidos graxos do manosileritritol lipídio analisados via CG-MS.[073] Analysis of fatty acids by GC-MS should identify the presence of C8; C10; C12:1; C12:0; C14:1 and C18:1, in which C12 and C14:1 must be the majority. In Figure 7, it is possible to observe the profile of the lipid mannosylerythritol fatty acids analyzed via GC-MS.

[074] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.[074] Those skilled in the art will value the knowledge presented here and will be able to reproduce the invention in the presented embodiments and in other variants, covered within the scope of the attached claims.

Claims

1. Process for obtaining lipid mannosylerythritol (MEL) characterized by previously sterilizing the manipueira at 121oC for 20 minutes and comprising the steps of: a) Treating the manipueira: - heating to its boiling point for 3 minutes; - centrifuge at 104g centrifugal force; b) Produce MEL from inoculating between 100 and 300ml of YEPD culture medium with Pseudozyma tsukubaensis yeast, at a concentration between 0.02g and 0.231g of yeast cells/100mL: b.1) Ferment at a stirring rate of 100rpm and aeration rate of 0.4vvm in the first 24 hours; b.2) Ferment at an agitation rate of 150rpm, aeration rate of 0.8vvm from 24 hours to 84 hours; c) Recover and centrifuge the HONEY-rich foam produced in step (b): c.1) recover 1L of foam at the top of the fermenter; c.2) centrifuge the foam obtained in step (c.1) at 104g for 20 minutes; d) Dry and rehydrate the solution obtained in step “c”: d.1) drying using a tray freeze dryer; d.2) storage of remaining powder at -18oC; d.3) rehydration of the powder obtained in step (d.1) at a concentration of 1000 mg per liter; e) Filter the solution obtained in (d.3): e.1) ultrafiltration by TFF system with magnetic stirring that varies from 40 to 60 rpm; e.2) purification by polyethersulfone (PES) membrane with molecular weight cutoff of 100kDa with flow of 90 to 45L/h.mA2 (+/-5), with pressure in the supply valves at 20psi, with pressure in the valve held at 10psi; f) Obtain the solution with lyophilized MEL.

2. Process according to claim 1, characterized in that the MELs obtained are selected from the group consisting of mannosylerythritol lipids of types -A, -B, -C and -D, preferably mannosylerythritol lipid of type B (MEL- B).