BR102015018076A2 - composições farmacêuticas contendo um peptídeo capaz de prevenir ou tratar doenças da agregação plaquetária - Google Patents

Abstract

composições farmacêuticas contendo um peptídeo capaz de prevenir ou tratar doenças da agregação plaquetária a presente invenção refere-se às composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo cxxc desenhados com base na sequência linear dos sítios ativos ditiólicos da pdi (proteína disulfetoisomerase) ou estruturas derivadas dele, mas que mantenham o mesmo grupo químico ativo. estas composições farmacêuticas contém, portanto, um peptídeo capaz de prevenir ou tratar doenças ou condições associadas ao aumento patológico da agregação plaquetária.

Description

“COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO UM PEPTÍDEO CAPAZ DE PREVENIR OU TRATAR DOENÇAS DA AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA” I) Campo Técnico ou Estado da Técnica [001] Apresente invenção refere-se a composições farmacêuticas contendo o Peptsdeo CxxC (VEFYAPWCGHCK) ou estruturas derivadas do mesmo, que seja capaz prevenir ou tratar doenças ou condições associadas ao aumento patológico da agregação piaquetária, li) Antecedentes da Invenção [002] Os distúrbios tromboembóiicos constituem uma das causas mais comuns de morbimortalidade ao redor do mundo (Kasper, LD et. ai. Harrisons McGraw-Hiü. 17 od. 2008). No Brasil, entre janeiro e novembro de 2018, o número de internações por embolia pulmonar, embolia e trombose arteriais, fiebiíe íromboflebíte, embolia e trombose venosa foi de 59.938, a um custo total de R$ 81,683.409,54. Em uma análise mais ampla, as doenças do aparelho circulatório representam 7,28% das causas de óbito, um dos maiores índices de mortalidade do país, sendo 2.38% diretamente decorrentes de distúrbios tromboembóiicos (MINISTÉRIO DA SAÚDE - Sistema de informações Hospitalares do SUS (SIH/SUS), DATASUS, Brasil, 2010. Disponível em www.saude.gov.brhtfp://'tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?sih/cnv/niuf.def.

[003] O tromboembotismo consiste na obstrução aguda da circulação venosa ou arterial pela instalação de coágulos sanguíneos (ALVARES F,; PADUA A.; TERRA FILHO J. Medicina, abr./dez v. 36, p. 214-240, 2003). De acordo com o local acometido, a obstrução arterial tromboembólica pode expressar-se dinicamente por intarto agudo do míocárdio, angina pecforis, acidente vascular cerebral isquêmico ou obstrução arterial periférica (BIZZACCHI. J.M.A. In: Zago, M.A. (Org.). Hematologia: Fundamentos e Pratica. São Paulo: Atheneu, p. 879-88, 2004). O trombo venoso tem maior composição de fibrína e hemácias e o arterial tem maior composição de plaqueías. Esses aspectos têm implicações terapêuticas, visto que os agentes ísfarinoSíticos constituem a terapêutica de escolha na trombose venosa, enquanto os antiagregantes plaquetários são mais utilizados nos processos arteriais, As plaquetas tem uma açáo crucial à formação do trombo arterial, pois se ligam r«u endotélio lesado índependentemente do fluxo sanguíneo e desencadeiam todo o processo de agregação local e consequente formação do trombo (MORELL!, V.M. in; Zago, Μ. A,, Falcão, R. P.. Pasquini, R, Hematologia: Fundamentos e Prática. São Paulo: Atheneu, p.731-38, 2004), [004] Os principais receptores envolvidos na ativação inicial das plaquetas incluem os receptores cie trombina, PAR1 e PAR4, o receptor GPVl de colágeno e os receptores cie ADP, P2Y1 e P2Y12, assim como os receptores de íromboxano A2 (ESSEX, D.W. Antioxid Redox Signai, v.11, n. 5, p i 101-225, 2009). A ativação resulta em alteração conformacional de uma integrina de membrana denominada GP ulibps, Essa mudança conformacional e uma resposta a eventos intracelulares que envolvem a propagação e alteração conformacional do domínio citoplasmático da integrina levando a exposição do sitio ativo para ligação ao fibrinogênio solúvel no plasma (SHATTíL S. J.: NEWMAN P, J. Bíood, v.104, p, 1606-15, 2004).

[005] Diversos estudos tem demonstrado que parte desse processo de estimulação de respostas plaquetárías, incluindo secreção e agregação, tem sido atribuída a rearranjos envolvendo grupamentos fíóís e dissuifetos expostos na membrana cia plaqueta (ESSEX. D.W. Antioxid Redox Signai, v.11. n. 5, p. 1Λ1 /25, 2009: ESSEX, D.W. Antioxid Redox Signai. v. 6, p. 736-46, 2004; ESSE7 V/ to af.Blood, v. 86. p. 2168-73. 1995). Os receptores ctllbp3, α2β1. GPlb, P2Y12, e GPVt possuem grupamentos tiol livres e sáo, portanto, sítios potenciais de regulação redox a ser exercida por proteínas tiólícas. Tal grupo inclui proteínas com atividade dissulfetoredutase como tiorredoxina, gíütarredoxina o :t r/oteína clissuifetoisomerase - (PD1) (ESSEX. D.W. Antioxid Reaox Signai. v. 6, p. 736-46, 2004).

[006] PAES. A. Μ. A. et al. J. ofleukocyteBiology, v.90. p.799-810, 2011 .verificaramque a atividade da PDI tanto in vitro quanto in vivo pode ser inibida pelo uso de peptídeos cuja sequência mimetiza o sítio catalítico da proteína. Mostraram que estes peptídeos são capazes de inibir a atividade reduíase da PDF contribuindo assim para a redução da geração de espécies reativas jo oxigênio pela NADPH oxidase de neutrófiíos humanos. Dados da literatura mostram que a agregação piaquetária pode ser inibida com o uso de alquiiantestióiicos ou inibidores da PD1 {ssim. estes peptídeos também poderíam inibir a agregação piaquetária.DTNB - 5.5’ ditiobis-(2- ácido nttrobenzóíco) e anticorpos anti-PDI respectívamente), 111} Descrição Detalhada da Invenção [007] Apresente invenção refere-se às composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo CxxC (VEFYAPWCGHCK) desenhados com base na sequência linear dos sítios ativos didáticos da PD! (proteína disulfefoísomerase) ou estruturas derivadas dele, mas que mantenham o mesmo grupo químico ativo. O peptídeo CxxC (VEFYAPWCGHCK) contém exatamente o motivo redox CGHC da PDI como grupo químico responsável pela atividade biológica.

[008] A presente invenção refere-se também às composições farmacêuticas contendo associações do peptídeo CGHC (VEFYAPWCGHCK) com vários excipientes ou veículos inertes farmaceutícamenle aceitáveis.

[009] Dentre as composições farmacêuticas, de acordo com a invenção, poderão ser citadas mais particularmente aquelas que são convenientes para a administração orai. parenteral, nasal, os comprimidos simples ou drageificados, os comprimidos subtínguais e as cápsulas.

[010] A posologia e adaptável segundo a natureza e o rigor da aíecção. a via de administração, assim como o peso e a idade do paciente.

[011] Estas composições farmacêuticas pode ter concentrações variadas do peptídeo CxxC (VEFYAPWCGHCK), desde que a concentração piasmática atingida, entenda-se concentração biodisponível, atinja níveis entre 1 a 100 μΜ.

Caracterização da associação entre o peptídeos CxxC c os tióis livres expostos na superfície da piaquefa [012] Para analisar a possível associação do pepíídeo CxxC com os tióís da PD1 e demais proteínas tiolicas expostas na superfície da plaqueta, submeíemos plaquetas em repouso, pré-incubadas ou não com o pepíídeo, à marcação com MPB, um reagente biotínifado específico para tióís e impermeável à membrana. Como resultado, constatamos que o peptídeo CxxC não modificou a marcação dos tióís livres totais expostos na superfície da membrana da píaqueta. Porém, quando analisamos a marcação específica da PDI observamos redução da mesma. Este dado é indicativo de que o peptídeo CxxC iiga-se especificamenie à PDI e não constitui-se como um ligante inespedfíCQ de tióis livres expostos na superfície da plaqueta.

[013] Burgess, J.K., et ai., J BiolChem, 2000.275(13): p. 9758-66, encontraram que a ativação da agregação plaquetária com trombina elevava em 460% a marcação de tióís livres peio MPB, Porém, quando as plaquetas eram impedidas de agregar, esta elevação era de apenas 60%, Mais recentemente, demonstrou-se que sucessivas trocas iioi-díssuifeto entre cisternas críticas, mais que a redução de dissulfetosper si, constituem um evento chave na ativação-agregação plaquetária, para o qual a PDI é urn componente indispensável (ESSEX, D.W. Antioxid Redox Signal, v.l 1, n. 5, p. 1191-225, 2609: ESSEX, D.W. Antioxid Redox Signal. v, 6, p. 736-46, 2004).

[014] Analises computacionais preditívas da interação molecular dos peplidecs a PDí, mostraram uma íntima associação dos peptideos CxxC e Scr com ·; PD· via formação de uma ponte dissuifeto mista. Por este motivofoi investigado ainda a possibilidade de uma ligação específica deste peptídeo o m. a PDI através da precipitação das proteínas marcadas com MPB, Os resultados mostraram que a redução de dissulfetos com o TCEP (1 mM) dobrou a marcação da PDI. Este dado é corroborado por evidências já descritas de que os sítios ativos dos domínios a e a’ coexistem nas formas reduzida e oxidada (Appenzelíer-Herzog, C. and LEügaard. Antioxid Redox Signal. 2008. 10(1): p. 55-64. Além disso, redução dos tióis cia superfície não interferiu no conteúdo de PDÍ intracelular, analisado no sobrenadante obtido Cipós a !iv*t das plaqueías e precipitação da PDI de membrana marcada com MPB.

[015] Quando as pfaquetas foram incubadas com os peptídeos, observou-se que o peptídeo CxxC (25 μΜ) promoveu uma discreta, mas importante, redução da marcação de tióis üvres da PDI pelo MPB, o que result·. u um menor precipitação da proteína. Estes dados reforçam a hipótese de formação de uma ponte dissulfeto entre o peptídeo CxxC e a PDI, talvez por um mecanismo semelhante ao descrito para a bacitracina. Embora o mecanismo cia inibição da PDI pela bacitracina seja alvo de debate, foi demonstrado que eia age via formação de pontes dissulfeto com as Cys314 e Cys345, localizadas no domínio b’ e na região ligadora x, respectivamente. Além disso, tipos mais hidrofóbícos de bacitracina, tais como bacitracina F e H, promovem maior efeito inibidor da atividade redutase da PDI (Dickerhof, M, et ai., FEBS J. 2011. 278(12): p, 2034-43). Neste contexto, é notável que nossos dados mostrem que o peptídeo CxxC associa-se a PDI via interações bidroíóbícas e também iniba a atividade redutase desta enzima (de, A.P.A.M., et a!,,J LeitkocSiol. 2011.90(4): p. 799-810).

Avaliação do efeito cios peptídeos CxxC, sobre a agregação plaquetária induzida por ADP, [016] Frente aos achados recentes de que peptídeos curtos e moléculas fenólicas íníbicJoras da PDI sáo potenciais agentes antitrombóticos [16], testamos a capacidade cM peptídeo CxxC, de inibir a agregação plaquetária induzida por ADP (SjiM)em plasma rico em plaquetas (PRP). A escolha do ADP como agonísfa deveu-se ao fato de ser um agente de grande relevância físíoiógica, cujo padrão bifásico da resposta agregante está plenamente caracterizado no PRP. A primeira fase ocorre pela ligação do agonista ao seu receptor e culmina na ativação da allbps. A segunda ocorre com a ligação da allbp3 ao fífarinogênÍG e promove uma agregação mais estável e irreversível [8, 10]. 45 [017] ínicialmente, foi caracterizado o papel de moduladores do estado redox de proteínas tíóiicas e da própria PDI de superfície sobre a agregação plaquetária. A adição de 3 mívl cios agentes redutores TCEP e DTT promoveu lenta e progressiva agregação pfaquetária, com efeito máximo de 50% da agregação induzida por ADP, A semelhança dos perfis da agregação mostrou quo a pctmeabílidade do DTT à membrana não promoveu efeito adiciona! à agregaçeo plaquetária induzida pela redução de díssulfetos da superfície da plaqueta peío TCEP. Por outro fado. a atividade agregante do ADP foi drasticamente reduzida pota adição de DTWB {2,5 mM), um alquilante de tióis, ou totaimeníe abolida pelo PAO {30 μΜ), uni bloqueador de tióis vicmais. Por íióis vicinais compreendem-se grupamentos tíólícos que estão suficientemente próximos para realizarem trocas fioi-dissutfeío, tais como aquelas realizadas pelo sitio ativo CGHC da PD1. A adição de bacítracina (5 mM) quanto do anticorpo anti-PDl RL90 (1:250) resultou na redução de aproximadamente 50% cia agregação maxíma induzida por ADP, Estes dados são corroborados por outros autores que mostraram cuo o anticorpo RL90 inibe apenas parcialmente a ^pregação plaquetaria induzida por este agonista. Ademais, foi demonstrado recontemente que o anticorpo RL90 inibe apenas a atividade reduíase da PDI. comprometendo a atividade isomerase, sem interferir com a atividade oxídase, [018] Quando analisada a capacidade dos peptídeos de interferir com a agregação plaquetaria induzida por ADR, encontramos que o peptideo CxxC redu. u α agregação máxima em 14%. 27% e 30% nas concentrações de 3, 10 a óóuíyI respeeíivamente. Concentrações maiores não resultaram em redução adicionai.

[019j Este conjunto dos dados aqui apresentados sugerem que o peptideo CxxC associa-se a PDI de superfície e inibe parcialmente a agregação plaquetaria v,n mecanismos mediados por trocas tiol-dissulfeto. No entanto, há análises adicionais a serem realizadas em estudos futuros. Especialmente, há a necessidade cie se avaliar a possibilidade de interação direta co peptideo CxxC com tiois críticos da aflbp3. Além disso, realizar estudos de ancoragem molecular dos peptídeos com a forma oxidada da PDI. a qual e predominante nas plaquetas em repouso. Em todo caso, este trabalho roí orça o potencial uso do peptideo CxxC. ou moléculas similares, como agente antiaoregante piaquetario.

REIVINDICAÇÕES “COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO UM PEPTÍDEO CAPAZ DE PREVENIR OU TRATAR DOENÇAS DA AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA”

Claims (6)

1- Composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo CxxC (VEFYAPVVCGHCK) caracterizada pelo fato do peptídeo CxxC (VEFYAPWCGHCK) conter o motivo redox CGHC da PDI.

2- Composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo CxxC (VEFYAPWCGHCK) de acordo com a reivindicação t, caracterizada por conter a sequência peptídica CGHC (VEFYAPWCGHCK) em concentrações variadas, sendo preferenciaimente usados nas concentrações entrei a TOO píVi.

3- Composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo CxxC (VEFYAPWCGHCK) de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por conter associações do peptídeo CGHC (VEFYAPWCGHCK) com vários excipioníes ou veículos inertes farmaceuíicamenle aceitáveis.

4- Composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo CxxC (VEFYAPWCGHCK) de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por ser preparadas para a administração oral, parenterai, nasai, os comprimidos simples ou drageifiçados, os comprimidos sublínguais e as cápsuías.

5- Composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo CxxC(VEFYAPWCGHCK) de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser capaz de reduzir a agregação plaquetaria através da inibição da capacidade isomerauo da proteína dísulíeíoisomerase proteíca (PDI) e seus isòmeros ativos.

6- Composições farmacêuticas contendo a sequência peptídica do peptídeo CxxC(VEFYAPWCGHCK) de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser eficaz para o tratamento das doenças cardiovascuiares ligadas a merosclerose. bipertençâo. ao diabetes e a insuficiência cardíaca, e à prevenção e tratamento das perturbações tromboembóüeas associadas a aferoscíerose e gestos cirúrgicos invasivos em cardiologia e neurologia.