BR102015016473A2 - uso de fluoroquinolonas e seus derivados - Google Patents

Abstract

uso de fluoroquinolonas e seus derivados. a presente invenção refere-se ao uso de fluoroquinolonas e seus derivados no preparo de um medicamento para prevenir/tratar a obesidade e suas complicações, como por exemplo, a diabetes tipo 2, pois os mesmos são capazes de regular a via de rnai como agentes antiobesogênicos, resultando em, dentre outros efeitos, aumento do gasto energético e inibição do ganho de massa gorda em camundongos.

Description

USO DE FLUOROQUINOLONAS E SEUS DERIVADOS

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se insere no campo de aplicação da Química, Farmácia, Medicina e, mais especificamente, na área de preparações para finalidades médicas uma vez que se refere ao uso de fluoroquinolonas e seus derivados no preparo de um medicamento para prevenir/tratar a obesidade e suas complicações.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O Enoxacino é um antibiótico de amplo espectro, membro da família de antibióticos fluoroquinolonas usado para o tratamento de infecções bacterianas do trato urinário e gonorréia. Em bactérias, o Enoxacino inibe a síntese de DNA ao se ligar à DNA girase, prevenindo assim a proliferação do patógeno sem interferir com as helicases humanas. Recentemente, porém, dois estudos independentes determinaram o potencial do Enoxacino e de alguns outros membros da família das fluoroquinolonas (Balofloxacino, Fleroxacino, Pazufloxacino, Ofloxacino, Norfloxacino, Prulifloxacino e Ciprofloxacino) como moléculas capazes de promover o processo de RNAi em células humanas. Mais especificamente, foi visto que o Enoxacino e presumidamente as outras fluoroquinolonas parecem facilitar a interação entre o RNA dupla-fita e TRBP - uma molécula que recruta Dicer para o complexo Argonaute-2 - promovendo assim o processamento de siRNAs/miRNAs e a ativaçãc^ do RNA-induced silencing complex (RISC). Dessa maneira, foi demonstrado que algumas fluoroquinolonas, incluindo o Enoxacino, podem aumentar em até 5 vezes a produção e ação de siRNAs/miRNAs.

[003] Em estudos subsequentes, o potencial das fluoroquinolonas em promover o processamento e a ação de miRNAs in vivo foi expandido. Demonstrou-se a eficácia do tratamento diário de camundongos com Enoxacino na prevenção da formação de tumores, reforçando assim a possibilidade do uso deste composto em mamíferos, principalmente na prevenção de doenças como o câncer.

[004] A presente invenção traz uma prova de conceito de que o uso de fluoroquinolonas e a consequente modificação da via de RNAi e do processamento/eficiência de microRNAs/siRNAs pode ser benéfico a longo prazo para o combate à obesidade e suas complicações.

[005] Os experimentos foram realizados com Enoxacino e Pefloxacino. A droga Enoxacino, uma vez comercializada em pílulas de 200 ou 400mg sobre o nome de PENETREX® (Sanofi-Aventis), é aprovada pelo FDA. Um estudo em humanos mostra a eficácia de se administrar Enoxacino por via oral a humanos na quantidade de 200 mg, duas vezes ao dia por um total de três dias. O estudo ainda mostra uma boa biodistribuição e biossegurança da droga e propõe o seu uso para o tratamento de infecções em tecidos moles. O uso do Pefloxacino, por outro lado, foi aprovado na Europa em 1985 para tratamento de infecções humanas.

[006] Os resultados provaram que as drogas da família das f luoroquinolonas e qualquer um de seus derivados capazes de afetar o processo de interferência de RNA (RNAi) e o processamento/ação de miRNAs e siRNAs, produtos naturais da via, podem ser usados para o preparo de um medicamento para prevenir/tratar a obesidade e suas complicações, tais como a diabetes do tipo 2.

ESTADO DA TÉCNICA

[007] O documento PI0507309-0 refere-se à derivados do ácido 7—fenilamino—4 —quinolon—3—carboxílico, que têm estruturas similares às fluoroquinolonas, indicados para o tratamento da diabetes do tipo 2. Tal documento se restringe ao uso dos derivados do ácido 7-fenilamino-4-quinolon-3-carboxílico, não deixando explicito (e tão pouco implícito), entretanto, o uso da classe das fluoroquinolonas para o tratamento da diabetes. Além disso, os alvos dos derivados do ácido7-fenilamino-4-quinolon-3-carboxílico para o tratamento da diabetes não foram caracterizados ou sequer definidos. A presente invenção tem como base a demanda de propriedade intelectual sobre drogas com um alvo bem definido, a via de RNAi, para o uso igualmente bem definido, o combate à obesidade e suas complicações. Como algumas fluoroquinolonas já foram demonstradas como ativadoras da via de biogênese de miRNAs, as mesmas foram utilizadas como prova de princípio para demonstrar a validade da invenção e expandi-la para outras formas farmacológicas de ativar a via de RNAi.

[008] O documento WO2014036528 refere-se ao uso do Pefloxacino como um de vários inibidores de Shc para demonstrar o que se caracteriza como a demanda principal dessa propriedade intelectual: que a inibição de Shc pode aumentar a sensibilidade à insulina e proteger contra diabetes do tipo 2. É importante ressaltar, no entanto, que de acordo com a literatura, o Pefloxacino parece não agir potencializando a via de RNAi em células humanas e, portanto, parece proteger contra diabetes de uma maneira diferente do Enoxacino. A presente invenção tem uma demanda completamente diferente - os resultados apresentam dados de prova de princípio que mostram que a ativação da via de RNAi por fluoroquinolonas e seus derivados atuam na prevenção/tratamento da diabetes do tipo 2 e da obesidade por afetarem a síntese de miRNAs ou de outros RNAs pequenos que são produtos da via.

Objetivos e vantagens da invenção [009] A obesidade representa um sério problema de saúde pública e seus tratamentos são ainda limitados e com diversos efeitos colaterais. O tratamento de escolha atual é a cirurgia bariátrica que é em alguns casos mutilante e causa inúmeros prejuízos irreversíveis ao indivíduo. As estratégias farmacológicas, por outro lado, são pouco eficientes e também apresentam efeitos colaterais. Algumas delas, que têm ação no sistema nervoso central, podem levar à náusea e a alguns sintomas psiquiátricos. Outras, que têm ação no trato gastrointestinal, podem causar prejuízo na absorção de nutrientes.

[010] A presente invenção tem por objetivo demonstrar por meio dos resultados obtidos o potencial farmacológico das fluoroquinolonas e de seus derivados capazes de induzir a via de RNAi como agentes antiobesogênicos, resultando em, dentre outros efeitos, aumento do gasto energético e inibição do ganho de massa gorda em camundongos. Dessa forma, o projeto tem caráter inovador, pois propõe um novo uso pleiotrópico a uma classe de drogas comercialmente disponível, aprovada pelo FDA e para o uso na Europa, com patentes de uso e produção vencidas (possibilitando a síntese do fármaco por qualquer empresa farmacêutica) e que pode ser administrada de maneira crônica, por via oral em humanos.

[OH] A presente invenção propõe o uso de fluoroquinolonas e seus derivados no preparo de um medicamento para prevenir/tratar a obesidade e suas complicações por meio do aumento do gasto energético ao induzir a ativação termogênica do tecido adiposo via modulação do processo de RNAi. As vantagens deste tipo de intervenção são a reversibilidade do tratamento, os baixos efeitos colaterais esperados e alguns efeitos benéficos associados, como o aumento da expectativa de vida e a diminuição de doenças associadas ao envelhecimento, como demonstrado em modelos animais invertebrados. Outras vantagens são o baixo custo de produção dos fármacos e sua biotolerabilidade comprovada.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[012] A presente invenção refere-se ao uso de fluoroquinolonas e seus derivados no preparo de um medicamento para prevenir/tratar a obesidade e suas complicações. Realizou-se experimentos em camundongos machos da linhagem C57BL/6, que foram injetados intraperitonealmente, uma vez por dia, cinco dias por semana, com uma dose de 10 mg/kg de Enoxacino ou de Pefloxacino. Além disso, esses animais foram alimentados com dieta hiperlipidica (60% Kcal oriundas de lipideos). Os resultados demonstram a capacidade do uso de fluoroquinolonas de inibir o ganho de peso e diminuir a massa gorda em camundongos, sem interferir com a ingestão alimentar dos animais. 0 efeito parece ser mediado por uma ativação da resposta termogênica no tecido adiposo marrom e bege, aumentando o gasto energético basal. Além disso, o uso de fluoroquinolonas melhora a sensibilidade à insulina e a tolerância à glicose dos camundongos, o gue demonstra a capacidade do fármaco de prevenir a diabetes do tipo 2 associada à obesidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[013] A Figura 1 mostra a identificação de uma dose eficaz de Enoxacino para o aumento de microRNAs no tecido adiposo.

[014] A Figura 2 mostra a inibição do ganho de peso e maior sensibilidade à insulina em camundongos tratados com fluoroquinolonas; (A) Peso corporal (n = 8 animais por grupo); (B) Ganho de peso durante o tratamento (n = 8 animais por grupo); (C) Teste de Tolerância à Insulina (n = 5-4 animais por grupo) com quantificação de área sob a curva (AUC); (D-E) Peso dos depósitos de gordura epididimal e subcutâneo (n = 5-7 animais por grupo); (F) Ingestão alimentar (n = 8 animais por grupo) . Os dados estão mostrados como Média ± Erro Padrão da Média. * P < 0.05 em relação ao veiculo (Teste estatístico utilizado foi ANOVA com Tukey como pós-teste).

[015] A Figura 3 mostra o aumento do gasto energético de animais tratados com fluoroquinolonas; (A) consumo de O2 total após 10 semanas de tratamento (Representado no gráfico como V02) e (B) produção de C02 total (Representado no gráfico como VC02) após 10 semanas de tratamento; (C) consumo de 02 total no final do tratamento e (D) produção de C02 total no final do tratamento. Os dados estão mostrados como Média ± Erro Padrão da Média. * P < 0.05 em relação ao veículo (Teste estatístico utilizado foi ANOVA com Tukey como pós-teste) .

[016] A Figura 4 mostra a resposta termogênica do tratamento com fluoroquinolonas; (A) Temperatura retal durante a exposição a 4°C por 6 horas ou (B) 72h (n = 8 animais por grupo); (C) Peso dos tecidos adiposos epididimal, (D) subcutâneo, (E) tecido adiposo marrom, (F) fígado, e (G) dosagem de triglicérides no fígado dos animais após a exposição de 72h a 4°C. Os dados estão mostrados como Média ± Erro Padrão da Média. * P < 0.05 em relação ao veículo (Teste estatístico utilizado foi ANOVA com Tukey como pós-teste).

[017] A Figura 5 mostra o efeito das fluoroquinolonas na expressão de genes termogênicos no tecido adiposo; (A) Imagem representativa do tecido adiposo marrom (TAM) de animais tratados com o Enoxacino por 10 semanas após 72h de exposição à 4°C; (B-C) Expressão dos mRNA dos genes termogênicos UCP1 e DI02 no tecido adiposo marrom após 72h de exposição à 4°C, avaliado por real time PCR; (D-E) Avaliação da expressão de genes termogênicos, UCP1 e PPAR-alfa, no tecido adiposo branco subcutâneo, em animais eutanasiados em temperatura ambiente (26°C) ou (F-G) após 72h de exposição à 4°C; (H) Imagens histológicas do tecido adiposo subcutâneo (aumento de 40x) e (I) TAM com coloração por hematoxilina e eosina (aumentos de lOx e 40x) de animais tratados por 10 semanas com as fluoroquinolonas. Os dados estão mostrados como Média ± Erro Padrão da Média. * P < 0.05 em relação ao veículo (Teste estatístico utilizado foi ANOVA com Tukey como pós-teste).

[018] A Figura 6 mostra a ativação do metabolismo mitocondrial de animais tratados com fluoroquinolonas; (AB) Atividade da enzima mitocondrial citrato sintase no tecido adiposo subcutâneo e tecido adiposo marrom (TAM) de animais eutanasiados em temperatura ambiente (26°C) ou (CD) após 72h de exposição à 4°C. Os dados estão mostrados como Média ± Erro Padrão da Média. * P < 0.05 em relação ao veiculo (Teste estatístico utilizado foi ANOVA com Tukey como pós-teste).

[019] A Figura 7 mostra os efeitos das fluoroquinolonas na expressão de marcadores de adipócitos marrons em linhagens de adipócitos brancos em cultura; (AD) Expressão de marcadores de adipócitos marrons (UCP1, DI02, PGCl-alfa, ELOVL3) foi avaliada por real-time PCR; (E) Acúmulo de lipídios após a diferenciação, mensurado pela coloração com Oil Red 0 (aumento de lOx) e (F) pela quantificação de triglicérides no interior das células diferenciadas; (G) medição dos genes aP2, adiponectina (AdipoQ) e o marcador de adipócito marrom Eval por RT PCR em tempo real. Os dados estão mostrados como Média ± Erro Padrão da Média. * P < 0.05 em relação ao veículo (Teste estatístico utilizado foi ANOVA com Tukey como pós-teste).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[020] A presente invenção refere-se ao uso de fluoroquinolonas e seus derivados no preparo de um medicamento para prevenir/tratar a obesidade e suas complicações.

Exemplo de concretização da invenção [021] Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6 machos de 12 semanas de idade injetados intraperitonealmente com Enoxacino durante 5 dias, uma injeção diária, nas doses de 2,5 mg/kg, 5,0 mg/kg e 10 mg/kg. O Enoxacino foi administrado nas concentrações entre Ο, 25 e 1 mg/ml diluído em solução salina. Primeiramente analisou-se o papel do Enoxacino em um possível regulação da expressão de miRNAs no tecido adiposo, onde a via de RNAi exerce um papel metabólico fundamental, conforme mostrado na Figura 1.

[022] Nos experimentos para avaliar a expressão de miR-103, miR-125a e miR-145, por meio de Real-Time PCR, verificaram-se tendências para aumento da expressão desses miRNAs em tecido adiposo subcutâneo nas três doses de Enoxacino.

[023] A partir desses resultados iniciou-se um tratamento crônico de 10 semanas utilizando a dose de 10 mg/kg de Enoxacino ou Pefloxacino em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica (60% Kcal oriundas de lipídeos; Research Diets) . Os resultados com camundongos mostraram que o tratamento com os dois antibióticos (Enoxacino ou Pefloxacino) inibe o ganho de peso e de massa gorda, e melhora a sensibilidade à glicose e à insulina, sem afetar a ingestão alimentar, conforme mostrado na Figura 2.

[024] A Figura 3 mostra o aumento do gasto energético de animais tratados com fluoroquinolonas - (A) Após 10 semanas de tratamento os animais foram monitorados pelo sistema (CLAMS) de análise de consumo de O2 total e (B) produção de CO2 total, assim como a área sob a curva (AUC). Os animais foram monitorados por um período de 24h. Os valores foram normalizados pelo peso corporal de cada animal (n = 4-5 animais por grupo) . (C) Ao final do tratamento os animais receberam uma injeção de 1,0 mg/kg de CL-316,243 (agonista beta 3 adrenérgico) e o consumo de O2 e (D) CO2 foi mensurado (n = 4-5 animais por grupo).

[025] A Figura 4 mostra a resposta termogênica do tratamento com fluoroquinolonas; a Figura 5 mostra o efeito das fluoroquinolonas na expressão de genes termogênicos no tecido adiposo; e a Figura 6 mostra a ativação do metabolismo mitocondrial de animais tratados com fluoroquinolonas.

[026] A inibição do ganho de peso foi devido ao aumento do gasto energético, observado por meio do experimento de calorimetria indireta. Além disso, os animais tratados com Enoxacino foram mais responsivos a estímulos beta-adrenérgicos e apresentaram uma maior tolerância ao frio. As análises de expressão gênica no tecido adiposo branco subcutâneo, por meio de Real-Time PCR, revelaram um aumento de genes relacionados a termogênese e beta-oxidação em ambos os tratamentos e um aumento de genes mitocondriais no tecido adiposo branco de animais tratados com o Pefloxacino.

[027] Foram também realizados experimentos em pré-adipócitos imortalizados de tecido adiposo subcutâneo de camundongos (células 9W) e pré-adipócitos de linhagem 3T3-F442A. A Figura 7 mostra os efeitos das fluoroquinolonas na expressão de marcadores de adipócitos marrons em linhagens de adipócitos brancos em cultura.

[028] Nesses experimentos as células foram diferenciadas na presença do meio de diferenciação e de Enoxacino (50 μΜ) , Pefloxacino (50 μΜ) ou veículo (300 μΜ NaOH). Após 8 dias de diferenciação, o RNA foi extraído e os genes aP2, adiponectina (AdipoQ) e o marcador de adipócito marrom Eval foram medidos por Real-Time PCR.

Similar aos ensaios in vivo, as células 9W tratadas com Enoxacino ou Pefloxacino tiveram a expressão aumentada de genes relacionados com a termogênese e a oxidação de ácidos graxos, o gue caracteriza um perfil mais dissipador de energia, característico de adipócitos marrons. Além disso, em células 3T3-F442A, o Enoxacino aumentou de forma significativa à expressão de Adiponectina, um hormônio antidiabético e cardioprotetor expresso exclusivamente em adipócitos.

REIVINDICAÇÕES

Claims (1)

1. Uso de fluoroquinolonas e seus derivados, CARACTERIZADO por ser no preparo de um medicamento para prevenir/tratar a obesidade e suas complicações.