BR102015008841A2

BR102015008841A2 - expression cassette, genetically modified microorganism, process for the production of biofuels and / or biochemicals and biofuels and / or biochemicals

Info

Publication number: BR102015008841A2
Application number: BR102015008841A
Authority: BR
Inventors: Luzia Drezza Angela; Amarante Guimarães Pereira Gonçalo
Original assignee: Biocelere Agroindustrial Ltda
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2017-05-30

Abstract

resumo cassete de expressão, micro-organismo geneticamente modificado, processo para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustíveis e/ou bioquímicos a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo a partir de polímeros da parede celular. dentre outros objetos, a presente invenção descreve novos cassetes de expressão, bem como novos micro-organismos geneticamente modificados, com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis com eficiente desempenho em escala industrial. o processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos utilizando-se o micro-organismo descrito no presente documento, também é objeto da presente invenção, bem como os biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos.expression cassette, genetically modified microorganism, process for the production of biofuels and / or biochemicals and biofuels and / or biochemicals The present invention provides technical solutions for the production of second generation fuels based on the conversion of plant biomass, e.g. from cell wall polymers. Among other objects, the present invention describes novel expression cassettes as well as new genetically modified microorganisms with efficient fermentative performance in converting sugars present in plant biomass into biochemical and / or biofuels with efficient performance on an industrial scale. The process of producing biofuels and / or biochemicals using the microorganism described herein is also the object of the present invention as well as the biofuels and / or biochemicals and the products thus obtained.

Description

CASSETE DE EXPRESSÃO, MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOS E BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOSEXPRESSION CASSETTE, GENETICALLY MODIFIED MICRO-ORGANISM, PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS AND / OR BIOCHEMICALS AND / OR BIOCHEMICALS

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF INVENTION

[0001] A presente invenção se relaciona a biocombustíveis, bioquímicos e a processos para sua obtenção. Mais especificamente, a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo, a partir de polímeros da parede celular vegetal. Dentre outros objetos, a presente tecnologia descreve cassetes de expressão para transformação de células eucarióticas e pelo menos um micro-organismo geneticamente modificado, com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis. O(s) micro-organismo(s) geneticamente modificado(s) pela inserção de cassete(s) descrito(s) no presente documento apresenta ampliado consumo de xilose em relação a micro-organismos não modificados com o descrito na invenção, favorecendo assim seu desempenho em escala industrial. São também descritos um processo para a obtenção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos. A presente invenção situa-se nos campos da da Biotecnologia e da Engenharia Química.[0001] The present invention relates to biofuels, biochemicals and processes for obtaining them. More specifically, the present invention provides technical solutions for the production of second generation fuels based on the conversion of plant biomass, for example from plant cell wall polymers. Among other objects, the present technology describes expression cassettes for eukaryotic cell transformation and at least one genetically modified microorganism with efficient fermentative performance in the conversion of sugars present in plant biomass to biochemicals and / or biofuels. The genetically modified microorganism (s) by the cassette insert (s) described herein has increased xylose consumption over unmodified microorganisms as described in the invention, thus favoring its performance on an industrial scale. Also described are a process for obtaining biofuels and / or biochemicals and the products thus obtained. The present invention is in the fields of Biotechnology and Chemical Engineering.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] A necessidade da substituição da matriz mundial de combustíveis baseada em fontes fósseis por alternativas renováveis tornou a produção de combustíveis de segunda geração, por exemplo, etanol, uma das mais promissoras tecnologias em fase de desenvolvimento. Este processo consiste na conversão de polímeros que formam a biomassa vegetal, principalmente aqueles presentes na parede celular como celulose, hemicelulose e lignina, em biocombustíveis e/ou bioquímicos.The need to replace the world's fossil-based fuel matrix with renewable alternatives has made the production of second-generation fuels, for example ethanol, one of the most promising technologies under development. This process consists of converting polymers that form plant biomass, especially those present in the cell wall such as cellulose, hemicellulose and lignin, into biofuels and / or biochemicals.

[0003] A biomassa vegetal é uma mistura complexa de compostos quimicamente distintos que podem ser fracionados gerando componentes com aplicações específicas. Assim, do mesmo modo que uma refinaria petroquímica produz uma grande variedade de produtos derivados do petróleo bruto, os mesmos princípios podem ser aplicados a biorrefinarias, ou seja, refinarias baseadas em biomassa (Santos, L. V.; Pereira, G. A. G. Petroquímica verde - Anais do Simpósio Microrganismos em Agroenergia: da Prospecção aos Bioprocessos. Editora Embrapa. ISSN 2177-4439, 2013).Plant biomass is a complex mixture of chemically distinct compounds that can be fractionated into components with specific applications. Thus, just as a petrochemical refinery produces a wide variety of crude oil products, the same principles can be applied to biorefineries, ie biomass-based refineries (Santos, LV; Pereira, GAG Green Petrochemicals - Anais do Symposium Microorganisms in Agroenergy: From Prospecting to Bioprocesses (Embrapa Publishing House ISSN 2177-4439, 2013).

[0004] A utilização da biomassa vegetal como fonte de açúcares fermentescíveis é uma alternativa promissora e sustentável, entretanto, alguns desafios ainda precisam ser superados, como a disponibilização dos açúcares da parede celular vegetal. Esse procedimento pode ser feito através da ação de enzimas hidrolíticas (celulases e hemicelulases), as quais disponibilizam os monômeros de açúcares (hexoses e pentoses) que, por sua vez, são posteriormente metabolizados por micro-organismos para geração de bioquímicos e biocombustíveis.The use of plant biomass as a source of fermentable sugars is a promising and sustainable alternative, however, some challenges still need to be overcome, such as the availability of plant cell wall sugars. This procedure can be done through the action of hydrolytic enzymes (cellulases and hemicellulases), which provide the sugar monomers (hexoses and pentoses) which, in turn, are later metabolized by microorganisms to generate biochemicals and biofuels.

[0005] Entretanto, micro-organismos naturalmente capazes de consumir açúcares presentes nas cadeias de celulose e hemi-celulose, não são geralmente passíveis de utilização em escala industrial de forma eficiente. Assim, torna-se necessário o desenvolvimento de micro-organismos com capacidade de utilizar esses açúcares da parede celular vegetal de forma eficiente em escala industrial, como o(s) descrito(s) na presente invenção.However, microorganisms naturally capable of consuming sugars present in the cellulose and hemi-cellulose chains are generally not capable of industrial use efficiently. Thus, it is necessary to develop microorganisms capable of using such plant cell wall sugars efficiently on an industrial scale, as described in the present invention.

[0006] A utilização de micro-organismos como plataformas eficientes na conversão de açúcares da biomassa em produtos de alto valor agregado é amplamente descrita. Nesse contexto, a levedura Saccharomyces cerevisiae tem recebido papel de destaque devido à sua robustez e tolerância em condições de fermentação industriais. A facilidade de manipulação genética desse organismo e o uso de ferramentas de engenharia metabólica, em sinergia com biologia de sistemas e biologia sintética tem possibilitado a inclusão de novas rotas metabólicas para a produção de combustíveis e de químicos como etanol, biobutanol, biodiesel, 1,2-propanediol, ácido succínico, ácido pirúvico, dentre outros [Cellular and Molecular Life Sciences, 69(16):2671-90, 2012], [0007] Linhagens selvagens de S. cerevisae não são naturalmente capazes de fermentar pentoses, como, por exemplo, a xilose, presente na biomassa. Entretanto, diversos trabalhos já realizaram procedimentos de engenharia metabólica em S. cerevisiae através da introdução nesses organismos de vias metabólicas para consumo de xilose, tendo como foco duas vias principais: a via Xilose Redutase - Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (XI).[0006] The use of microorganisms as efficient platforms for converting sugars from biomass into high value added products is widely described. In this context, Saccharomyces cerevisiae yeast has been given a prominent role due to its robustness and tolerance under industrial fermentation conditions. The ease of genetic manipulation of this organism and the use of metabolic engineering tools, in synergy with systems biology and synthetic biology, has enabled the inclusion of new metabolic routes for the production of fuels and chemicals such as ethanol, biobutanol, biodiesel, 1, 2-propanediol, succinic acid, pyruvic acid, among others [Cellular and Molecular Life Sciences, 69 (16): 2671-90, 2012], [0007] Wild S. cerevisae strains are not naturally capable of fermenting pentoses such as, for example, xylose, present in biomass. However, several studies have already performed metabolic engineering procedures in S. cerevisiae by introducing metabolic pathways for xylose consumption in these organisms, focusing on two main pathways: the Xylose Reductase - Xylitol Dehydrogenase (XR-XDH) pathway and the Xylose pathway. Isomerase (XI).

[0008] Dentre os trabalhos realizados, a introdução de gene que codifica a enzima xilose isomerase (XI) permite que a cepa apresente maior rendimento na produção de álcool e/ou ácidos do que quando ela é modificada com outros genes, como por exemplo, gene que codifica xilose redutase ou xilitol desidrogenase, visto que ocorre um menor acúmulo de subprodutos não desejáveis, como xilitol e glicerol [2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664], [0009] A via XR-XDH, presente em micro-organismos eucariotos, consiste em duas reações de oxi-redução, onde a xilose é reduzida a xilitol pela ação da enzima xilose redutase (XR), em uma reação mediada por NADPH/NADH e em seguida, o xilitol é oxidado a xilulose por meio da enzima xilitol desidrogenase (XDH), mediada exclusivamente por NAD+. O cofator NADPH é principalmente regenerado na fase oxidativa da via das pentoses fosfato, com produção de C02. Porém, NAD+ é regenerado principalmente na cadeia respiratória, com o 02 como aceptor final de elétrons. Sob limitadas concentrações de oxigênio, não ocorre a completa reoxidação de NAD+, resultando em um desbalanço redox e no acúmulo de xilitol, o que impacta diretamente no rendimento final de etanol [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1, p.49-59, 2002], Além do xilitol, outro subproduto formado é o glicerol, devido à reoxidação do excesso de NADH via XDH [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004].Among the works carried out, the introduction of a gene encoding the enzyme xylose isomerase (XI) allows the strain to show higher yield in the production of alcohol and / or acids than when it is modified with other genes, such as gene encoding xylose reductase or xylitol dehydrogenase as less accumulation of undesirable byproducts such as xylitol and glycerol occurs [2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664], [0009] The XR-XDH pathway present in micro eukaryotic organisms, consists of two oxy-reduction reactions, where xylose is reduced to xylitol by the action of the enzyme xylose reductase (XR), a NADPH / NADH-mediated reaction and then xylitol is oxidized to xylulose by xylitol dehydrogenase (XDH) enzyme mediated exclusively by NAD +. The NADPH cofactor is mainly regenerated in the oxidative phase of the pentose phosphate pathway with CO2 production. However, NAD + is mainly regenerated in the respiratory chain, with 02 as the final electron acceptor. Under limited oxygen concentrations, complete NAD + reoxidation does not occur, resulting in redox imbalance and xylitol accumulation, which directly impacts the final ethanol yield [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1, p .49-59, 2002], In addition to xylitol, another formed byproduct is glycerol due to the reoxidation of excess NADH via XDH [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004 ].

[0010] A via XR-XDH tem maior produtividade inicial por produzir etanol mais rapidamente, apenas com a inserção dos genes responsáveis pela conversão da xilose, porém a via XI tem um maior rendimento por não acumular subprodutos [Microbial Cell Factories, Londres, v.6, n.5, p.1-10, 2007], [0011] A via xilose isomerase (XI), mais comum em procariotos, ocorre em um único passo, evitando o desbalanço redox e a formação de subprodutos que diminuem o rendimento de etanol. Por várias décadas, tentativas de expressão heteróloga de XI bacterianas em S. cerevisiae não foram bem sucedidas [Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v.32, n.2, p.252-259, 2003]. Em 2003, a expressão funcional em S. cerevisiae de uma xilose isomerase do fungo anaeróbio Piromyces sp. [FEMS Yeast Research, Delft, v,4, n.1, p.69-78, 2003] e em 2009 do fungo Orpiromyces sp. [Applied Microbiology and Biotechnology, Heidelberg, v.82, n„6, p. 1067-1078, 2009], resultou em mutantes capazes de crescer em xilose como única fonte de carbono, com altas atividades dessas enzimas, maior rendimento na produção de etanol, menor produção e acúmulo de metabólitos intermediários e com menor repressão catabólica em meio contendo glicose e xilose [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.4, p.399-409, 2005a; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.10, p.925934, 2005b], [0012] Para que seja capaz de consumir xilose, é necessário que o micro-organismo seja geneticamente modificado, no mínimo, com a adição do gene que codifica a xilose isomerase. Dessa forma, é descrito na literatura que o aumento da expressão dos genes da via das pentoses fosfato favorece a conversão de xilose a etanol é necessário para que o consumo desse açúcar seja eficiente. Assim, os micro-organismos descritos no estado da técnica, que foram geneticamente modificados para consumo de xilose, invariavelmente possuem as modificações genéticas descritas acima. Basicamente, o diferencial de cada um desses micro-organismos é a combinação desses genes e dos promotores pelos quais estão regulados, com o gene que codifica a xilose isomerase, pois é esse o principal gene que possibilita o consumo de xilose por cada micro-organismo modificado.The XR-XDH pathway has higher initial productivity by producing ethanol faster with the insertion of the genes responsible for xylose conversion, but the XI pathway has a higher yield by not accumulating byproducts [Microbial Cell Factories, London, v. .6, n.5, p.1-10, 2007], [0011] The xylose isomerase (XI) pathway, most common in prokaryotes, occurs in one step, avoiding redox imbalance and the formation of byproducts that decrease the ethanol yield. For several decades, attempts at heterologous bacterial XI expression in S. cerevisiae have not been successful [Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v.32, n.2, p.252-259, 2003]. In 2003, the functional expression in S. cerevisiae of an xylose isomerase of the anaerobic fungus Piromyces sp. [FEMS Yeast Research, Delft, v. 4, no. 1, p.69-78, 2003] and in 2009 of the fungus Orpiromyces sp. [Applied Microbiology and Biotechnology, Heidelberg, v.82, no. 6, p. 1067-1078, 2009], resulted in mutants capable of growing on xylose as the sole carbon source, with high enzyme activity, higher yield in ethanol production, lower production and accumulation of intermediate metabolites, and lower catabolic repression in glucose-containing medium. and xylose [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, no. 6, p.655-664, 2004; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, no. 4, p.399-409, 2005a; FEMS Yeast Research, Delft, v.5, n.10, p.925934, 2005b], [0012] In order to be able to consume xylose, it is necessary for the microorganism to be genetically modified at least with the addition of gene encoding xylose isomerase. Thus, it is described in the literature that increased expression of the pentose phosphate pathway genes favors the conversion of xylose to ethanol is necessary for the consumption of this sugar to be efficient. Thus, the microorganisms described in the prior art which have been genetically modified for xylose consumption invariably have the genetic modifications described above. Basically, the differential of each of these microorganisms is the combination of these genes and the promoters by which they are regulated, with the gene that encodes xylose isomerase, because this is the main gene that enables the consumption of xylose by each microorganism. modified.

[0013] A busca por outros micro-organismos que contenham em seu genoma genes que codifiquem proteínas com função xilose isomerase tem crescido nos últimos anos devido à relevância que o tema adquiriu atualmente. Bibliotecas de metagenômica que permitem a busca de xiloses isomerases nos mais diferentes ambientes tornam-se cada vez mais comuns, como por exemplo, a biblioteca de metagenômica do fluido de rumen bovino, que permitiu a obtenção da xilose isomerase descrita no documento US 2012/0225452 A1.The search for other microorganisms that contain in their genome genes that encode proteins with xylose isomerase function has grown in recent years due to the relevance that the subject has acquired today. Metagenomic libraries that allow the search for xylose isomerases in different environments become increasingly common, such as the bovine rumen fluid metagenomic library, which allowed the obtention of xylose isomerase described in US 2012/0225452 TO 1.

[0014] Essa busca por xiloses isomerases em diferentes organismos não garante, entretanto, que elas sejam funcionalmente expressas quando inseridas em Saccharomyces. O documento WO 2010074577, por exemplo, descreve a existência de alguns domínios que seriam conservados na proteína xilose isomerase e que a presença desses domínios no peptídeo garantiría que a proteína fosse expressa de maneira funcional em Saccharomyces. Essas análises basearam-se sequências de aminoácidos de xiloses isomerases de Piromyces sp E2, previamente descrita em WO 03062430, Cyllamyces aberensi e Bacteroides thetaitaomicron, descritas em US 7943366 e Clostridium phylofermentans, descrita por Brat, D e colaboradores [Applied and Environmental Microbiology, vol. 75, No. 8, pp. 2304-2311, Apr. 2009].This search for xylose isomerases in different organisms does not guarantee, however, that they are functionally expressed when inserted into Saccharomyces. WO 2010074577, for example, describes the existence of some domains that would be conserved in the xylose isomerase protein and that the presence of these domains in the peptide would ensure that the protein was functionally expressed in Saccharomyces. These analyzes were based on amino acid sequences from Piromyces sp E2 xylose isomerases, previously described in WO 03062430, Cyllamyces aberensi and Bacteroides thetaitaomicron, described in US 7943366 and Clostridium phylofermentans, described by Brat, D and colleagues [Applied and Environmental Microbiology, vol. . 75, No. 8, pp. 2304-2311, Apr. 2009].

[0015] Entretanto, genes de xiloses isomerases de vários outros organismos que possuem os domínios indicados no documento WO 2010074577 também foram inseridas em leveduras, mas não apresentaram atividade funcional [Appl Eviron Microbiol. 2009; 75(8): 2304-11; Enzyme and Microbial Technology, vol. 32, pp. 252-259, 2003.; Applied and Environmental Microbiology, vol. 62, No. 12, pp. 4648-4651, Dec. 1996; Biotechnology and Bioengineering Symposium, No. 13, pp. 245-250,1983]. Este fato nos mostra que atualmente ainda não existe qualquer padrão em proteínas com atividade xilose isomerase que garanta que a inserção de seu gene codificante em Saccharomyces irá gerar proteína com atividade xilose isomerase funcional.However, xylose isomerase genes from various other organisms that have the domains indicated in WO 2010074577 have also been inserted into yeast, but have no functional activity [Appl Eviron Microbiol. 2009; 75 (8): 2304-11; Enzyme and Microbial Technology, Vol. 32, pp. 252-259, 2003; Applied and Environmental Microbiology, Vol. 62, No. 12, pp. 4,648-4,651, Dec. 1996; Biotechnology and Bioengineering Symposium, No. 13, pp. 245-250,1983]. This fact shows us that currently there is no standard in proteins with xylose isomerase activity that ensures that the insertion of its coding gene into Saccharomyces will generate protein with functional xylose isomerase activity.

[0016] De fato, a grande maioria das xiloses isomerases identificadas em bactérias quando expressas em S. cerevisiae não conferem a habilidade na levedura de crescer em xilose. Pelo menos um trabalho tem estudado esse tema [Enzyme and Microbial Technology 32 (2003) 252-259] sugerindo que a não formação do tetrâmero (xilose isomerase é uma proteína tetramérica) seja a principal causa da não funcionalidade em S. cerevisiae. A presença da combinação correta de aminoácidos na interface do tetrâmero gerando pontes de sulfeto e alto número de ligações iônicas, além de condições fisiológicas como pH interno da célula diferente do hospedeiro original, poderíam ser os principais motivos da não funcionalidade das xiloses isomerases quando expressas em S. cerevisiae, mas atualmente essa informação não pode ser afirmada com certeza.Indeed, the vast majority of xylose isomerases identified in bacteria when expressed in S. cerevisiae do not confer the ability of yeast to grow into xylose. At least one paper has studied this topic [Enzyme and Microbial Technology 32 (2003) 252-259] suggesting that non-formation of tetramer (xylose isomerase is a tetrameric protein) is the major cause of non-functionality in S. cerevisiae. The presence of the correct combination of amino acids at the tetramer interface generating sulfide bridges and high number of ionic bonds, as well as physiological conditions such as cell internal pH different from the original host, could be the main reasons for the non-functionality of xylose isomerases when expressed in S. cerevisiae, but at present this information cannot be stated with certainty.

[0017] Portanto, a obtenção de micro-organismos, preferencialmente leveduras, que produzam proteínas com atividade de xilose isomerase a partir da inserção em seu genoma de gene de outro micro-organismo, não é um processo trivial.Therefore, obtaining microorganisms, preferably yeasts, that produce proteins with xylose isomerase activity from insertion into their genome of another microorganism gene is not a trivial process.

[0018] Adicionalmente, é importante salientar que, no processo fermentativo brasileiro para produção de etanol, é usual que as usinas façam a reutilização intensiva de células de levedura utilizadas na fermentação, processo esse conhecido como reciclagem. Nesse processo até 90% das leveduras podem ser reutilizadas de uma fermentação para outra, resultando em densidades celulares muito elevadas no interior do fermentador e fazendo com que o tempo de fermentação seja muito curto [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008], [0019] Em algumas plantas industriais, a reciclagem pode ocorrer durante todo o período da safra, durando até nove meses. Assim, o período prolongado de reciclagem somado à contínua entrada de contaminantes microbianos no sistema, torna o ambiente da fermentação altamente competitivo, impondo severas tensões bióticas e abióticas sobre as cepas de leveduras utilizadas no processo [International Sugar Journal, Londres, v.112, p.86-89, 2010], Este ambiente competitivo resulta na substituição das leveduras que iniciaram o processo de fermentação por leveduras selvagens. Esse fato acontece, pois as leveduras selvagens ocorrem naturalmente na cana-de-açúcar e, portanto, são inseridas juntamente com ela no processo de fermentação, acabando, assim, por contaminar todo o processo industrial [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008], [0020] Adícionalmente, alguns trabalhos já demonstraram que aquelas leveduras que iniciam o processo de fermentação, e acabam sendo substituídas pelas selvagens, também não são capazes de sobreviver às situações estressantes do processo industrial de fermentação, como alta concentração de etanol, alta temperatura, estresse osmótico em decorrência de sais e açúcares, acidez, sulfitos e contaminação bacteriana [FEMS yeast research, 8(7):1155-63, 2008]. Assim, a obtenção de linhagem com eficiente capacidade de resistência ao agressivo processo de fermentação industrial, bem como passível de modificações genéticas para aquisição de características de interesse, como consumo de pentoses, mais especificamente xilose, não é um processo trivial.In addition, it is important to note that in the Brazilian fermentative process for ethanol production, it is usual for mills to make intensive reuse of yeast cells used in fermentation, a process known as recycling. In this process up to 90% of yeast can be reused from one fermentation to another, resulting in very high cell densities within the fermenter and making the fermentation time very short [FEMS yeast research, 8 (7): 1155-63 , 2008], [0019] In some industrial plants, recycling can occur throughout the harvest period, lasting up to nine months. Thus, the prolonged recycling period coupled with the continued entry of microbial contaminants into the system makes the fermentation environment highly competitive, imposing severe biotic and abiotic stresses on the yeast strains used in the process [International Sugar Journal, London, v.112, p.86-89, 2010], This competitive environment results in the replacement of yeast that started the fermentation process with wild yeast. This is because wild yeasts occur naturally in sugarcane and are therefore inserted with it in the fermentation process, thus contaminating the entire industrial process [FEMS yeast research, 8 (7): 1155-63, 2008], [0020] In addition, some studies have already shown that those yeasts that start the fermentation process, and are eventually replaced by the wild ones, are also unable to survive the stressful situations of the industrial fermentation process, such as high levels. ethanol concentration, high temperature, osmotic stress due to salts and sugars, acidity, sulfites and bacterial contamination [FEMS yeast research, 8 (7): 1155-63, 2008]. Thus, obtaining a strain with an efficient capacity to resist the aggressive industrial fermentation process, as well as being susceptible to genetic modifications to acquire characteristics of interest, such as pentose consumption, more specifically xylose, is not a trivial process.

[0021] O(s) micro-organismo(s) descrito(s) na presente invenção é(são), portanto, vantajosamente adaptado(s) ao processo brasileiro de fermentação industrial e mostra(m)-se diferencialmente eficiente(s) na conversão de açúcares da biomassa vegetal, principalmente material lignocelulósico, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, ou seja, com rendimento suficiente para ser aplicado em escala industrial, mesmo sob as condições estressantes do processo de fermentação brasileiro. Adicionalmente, o micro-organismo descrito na presente invenção apresenta características de interesse industrial como: ser uma cepa não floculante, apresentar alto rendimento de etanol, baixa formação de glicerol e xilitol, alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produção de espuma, entre outros.The microorganism (s) described in the present invention is, therefore, advantageously adapted to the Brazilian industrial fermentation process and is differentially efficient. in the conversion of sugars from plant biomass, mainly lignocellulosic material, to biofuels and / or biochemicals, that is, with sufficient yield to be applied on an industrial scale, even under the stressful conditions of the Brazilian fermentation process. Additionally, the microorganism described in the present invention has characteristics of industrial interest such as: being a non-flocculating strain, presenting high ethanol yield, low glycerol and xylitol formation, high viability, high growth rate, non-foaming, among others. others.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[0022] É um dos objetos da presente invenção um cassete de expressão que compreende: a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar um peptideo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com pelo uma das sequências SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17; e b) ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante.It is an object of the present invention an expression cassette comprising: a) at least one nucleotide sequence capable of encoding a peptide with xylose isomerase function and having at least 70% identity to at least one of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and / or SEQ ID NO: 17; and b) at least one promoter for said coding nucleotide sequence.

[0023] Opcionalmente, um dos cassetes de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO: 18), Transaldolase (SEQ ID NO:19), Transcetolase (SEQ ID NO:20), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:21) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:22).Optionally, one of the expression cassettes of the invention also comprises sequences selected from the group comprising the coding sequences for the enzymes Xylulokinase (SEQ ID NO: 18), Transaldolase (SEQ ID NO: 19), Transcetolase (SEQ ID NO: 20) ), Ribose 5-Phosphate Isomerase (SEQ ID NO: 21) and / or Ribose 5-Phosphate Epimerase (SEQ ID NO: 22).

[0024] É um outro objeto da presente invenção um micro-organismo geneticamente modificado para a expressão de xilose isomerase e que expressa pelo menos um peptideo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.Another object of the present invention is a genetically modified microorganism for the expression of xylose isomerase and which expresses at least one peptide with at least 70% identity to the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

[0025] O micro-organismo geneticamente modificado apresenta eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado a versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas descritas no presente documento.The genetically modified microorganism exhibits efficient fermentative performance in the conversion of sugars contained in plant biomass such as lignocellulosic materials into biofuels and / or biochemicals when compared to the version of the same microorganism without the genetic modifications described. in this document.

[0026] O micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a célula eucariótica transformada geneticamente, como, por exemplo, levedura ou fungo filamentoso.The genetically modified microorganism described in the present invention refers to genetically transformed eukaryotic cell, such as yeast or filamentous fungus.

[0027] É um outro objeto da presente invenção um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetal caracterizado por compreender as etapas de: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o micro-organismo conforme definido e revelado no presente pedido de patente; e b) recolher o biocombustível e/ou bioquímico produzido após a etapa a).Another object of the present invention is a process for producing biofuels and / or biochemicals from plant biomass comprising the steps of: a) bringing lignocellulosic plant biomass in contact with the microorganism as defined and disclosed in present patent application; and (b) collect biofuel and / or biochemical produced after step a).

[0028] Em uma concretização, a presente invenção descreve um microorganismo geneticamente modificado, como, por exemplo, levedura do gênero Saccharomyces mais eficiente, quando comparado com à versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas contidas no presente documento, na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - polihidróxido butirato, sem entretanto restringir-se a eles.In one embodiment, the present invention describes a genetically modified microorganism, such as, for example, the most efficient yeast of the genus Saccharomyces, as compared to the version of the same microorganism without the genetic modifications contained herein, in the conversion of pentoses present in the lignocellulosic material in alcohols and / or biochemicals such as, for example, succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2, 3-butanediol, PHB - polyhydroxide butyrate, but not limited to them.

[0029] Em uma concretização, a pentose utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é a xilose sem, entretanto, restringir-se a ela.In one embodiment, the pentose used by the microorganism for conversion to alcohols and / or biochemicals indicated above is, but is not limited to, xylose.

[0030] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO;2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16 e/ou SEQ ID NO:17, sendo que cada um desses peptídeos podem ser expressos nessa célula eucariótica, por exemplo, em sua forma ativa e funcional de xilose isomerase. Salienta-se que qualquer uma das sequências de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, podem apresentar-se em cópia única ou, em uma outra concretização, em múltiplas cópias de cada uma das sequências de nucleotídeos inseridas no genoma.The microorganism described in the present invention is genetically modified by the introduction of at least one nucleotide sequence encoding a peptide with xylose isomerase function and having at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO ; 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and / or SEQ ID NO: 17, each of which Peptides can be expressed in this eukaryotic cell, for example, in its active and functional form of xylose isomerase. Note that any of the nucleotide sequences capable of encoding peptides with xylose isomerase function and having at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 may be in single copy or, in another embodiment, multiple copies of each of the nucleotide sequences inserted into the genome.

[0031] A célula hospedeira geneticamente modificada descrita na presente invenção adicionalmente compreende modificações genéticas que visam o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentoses fosfato, de forma que a inserção de qualquer sequência de nucleotídeos que codifique peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com as sequências descritas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, possa favorecer a isomerização de xilose em xilulose.The genetically modified host cell described in the present invention further comprises genetic modifications aimed at enhancing metabolic flow through the pentose phosphate pathway, such that the insertion of any nucleotide sequence encoding xylose isomerase peptide having at least 70% identity to the described sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17, may favor the isomerization of xylose into xylulose.

[0032] Assim, para o aumento de fluxo da via das pentoses fosfato na célula hospedeira, são inseridos genes que codificam as enzimas Xiluloquinase (XKS1, EC 2.7.1.17), cuja sequência de nucleotídeos é representada neste documento por SEQ ID NO:18, a Transaldolase (TAL1, EC 2.2.1.2), representada pela sequência SEQ ID NO:19, Transcetolase (TKL1, EC 2.2.1.1), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:20, Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1, EC 5.3.1.6), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:21; e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1, EC 5.1.3.1), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:22. A inserção dos genes da via das pentoses-fosfato não é obrigatória ou restritiva para transformação da célula hospedeira com qualquer das ditas sequências de nucleotídeos capazes de codificar peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com aqueles descritos pelas sequências de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.Thus, to increase the flux of the pentose phosphate pathway in the host cell, genes encoding the xylulokinase enzymes (XKS1, EC 2.7.1.17) are inserted, the nucleotide sequence of which is represented herein by SEQ ID NO: 18 , Transaldolase (TAL1, EC 2.2.1.2), represented by the sequence SEQ ID NO: 19, Transcetolase (TKL1, EC 2.2.1.1), whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 20, Ribose 5-Phosphate Isomerase ( RKI1, EC 5.3.1.6), whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 21; and Ribose 5-Phosphate Epimerase (RPE1, EC 5.1.3.1), whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 22. Insertion of the pentose phosphate pathway genes is not obligatory or restrictive for transformation of the host cell with any of said nucleotide sequences capable of encoding at least 70% identity peptides with xylose isomerase function with those described by the sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and / or SEQ ID NO: 17

[0033] Assim, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um ou mais cassetes de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, em uma das concretizações, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.Thus, the present invention describes host cell comprising one or more expression cassettes containing endogenous enzyme genes of the non-oxidative phase of the pentose phosphate pathway, which are, in one embodiment, constructed using strong and constitutive promoters. of the cell into which they will be inserted and stably integrated into the host cell genome.

[0034] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:23. Aldose redutase favorece o acúmulo de xilitol cujo acúmulo na célula, por sua vez, diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.In addition to the insertion of expression cassettes, the present invention also describes the deletion or inactivation of the GRE3 gene, which encodes an aldose reductase and is represented in SEQ ID NO: 23. Aldose reductase favors the accumulation of xylitol whose accumulation in the cell, in turn, decreases the total ethanol yield that can be obtained. In addition, xylitol is an inhibitor of the action of the enzyme xylose isomerase.

[0035] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, como por exemplo, o micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos, em uma das concretizações, em alto número de cópias e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente.This document therefore describes a eukaryotic cell, such as the genetically modified Saccharomyces cerevisiae microorganism containing in its genome at least one of the enzyme genes needed to favor the non-oxidative part of the pathway. phosphate pentoses, inserted in one embodiment in high copy number and in the region between the centromere and its first adjacent gene.

[0036] Assim, após ser submetido às modificações genéticas descritas anteriormente, o micro-organismo é então submetido a processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do micro-organismo de interesse em um meio de cultura contendo concentrações variáveis e crescentes de fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo para seleção daquele com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis ou bioquímicos.Thus, after undergoing the genetic modifications described above, the microorganism is then subjected to an evolutionary engineering process comprising successive subcultures of the microorganism of interest in a culture medium containing varying and increasing concentrations of carbon source. usable by the microorganism for selection of the one with substantial and improved pentose conversion performance, especially xylose in fuels or biochemicals.

[0037] O micro-organismo descrito na presente invenção é, em uma de suas concretizações, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir de espuma, entre outros.The microorganism described in the present invention is, in one of its embodiments, of industrial lineage and has differentially the characteristics of being non-flocculant, allow low glycerol and xylitol formation, have high viability, high growth rate, no produce foam, among others.

[0038] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetal.The present invention also discloses and comprises a process for producing biofuels and / or biochemicals from plant biomass.

[0039] Em uma das concretizações, a presente invenção revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir da porção lignocelulósica da biomassa vegetal, utilizando o microorganismo descrito pela presente invenção.In one embodiment, the present invention discloses and comprises a process for producing biofuels and / or biochemicals from the lignocellulosic portion of plant biomass using the microorganism described by the present invention.

[0040] O referido processo compreende as seguintes etapas: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o microorganismo descrito na presente invenção; e b) opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.Said process comprises the following steps: a) bringing lignocellulosic plant biomass in contact with the microorganism described in the present invention; and b) optionally retracting the generated compound.

[0041] O processo revelado pela presente invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).The process disclosed by the present invention provides for the production of biofuels comprising predominantly alcohols, especially ethanol. The process of the invention provides for the production of biochemicals selected from the group comprising, but not limited to: succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol 2,3-butanediol and / or PHB - poly (butyrate hydroxide).

[0042] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, preferencialmente etanol, e bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção.Finally, the present invention describes biofuels, preferably ethanol, and biochemicals produced by the process using the microorganism of the invention.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0043] É um dos objetos da presente invenção um cassete de expressão que compreende: a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar um peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com pelo uma das sequências descritas em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17; e b) ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante.It is an object of the present invention an expression cassette comprising: a) at least one nucleotide sequence capable of encoding a peptide having xylose isomerase function and having at least 70% identity to at least one of the sequences described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and / or SEQ ID NO: 17; and b) at least one promoter for said coding nucleotide sequence.

[0044] Em uma concretização, o referido promotor para a referida sequência nucleotídica codificante é um promotor forte e/ou constitutivo do micro-organismo no qual o cassete será inserido.In one embodiment, said promoter for said coding nucleotide sequence is a strong and / or constitutive promoter of the microorganism into which the cassette will be inserted.

[0045] Em uma concretização, o cassete de expressão compreende uma sequência nucleotídica adicional selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outras enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas.In one embodiment, the expression cassette comprises an additional nucleotide sequence selected from: a transcription terminator nucleotide sequence; a selection marker; one or more nucleotide sequence (s) encoding other enzymes; combinations thereof or a plasmid comprising such sequences, with at least one of the nucleotide sequences defined above being heterologous.

[0046] Em uma concretização, o cassete de expressão compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste de sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:18), Transaldolase (SEQ ID NO:19), Transcetolase (SEQ ID NO:20), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:21) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:22) e/ou combinações destas.In one embodiment, the expression cassette comprises at least one sequence selected from the group consisting of coding sequences for the enzymes Xylulokinase (SEQ ID NO: 18), Transaldolase (SEQ ID NO: 19), Transcetolase (SEQ ID NO: 20), Ribose 5-Phosphate Isomerase (SEQ ID NO: 21) and / or Ribose 5-Phosphate Epimerase (SEQ ID NO: 22) and / or combinations thereof.

[0047] É um outro objeto da presente invenção um micro-organismo geneticamente modificado para a expressão de xilose isomerase e que expressa pelo menos um peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0;14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16 e/ou SEQ ID NO:17.Another object of the present invention is a microorganism genetically modified for the expression of xylose isomerase and which expresses at least one peptide with at least 70% identity to the sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

[0048] Em uma concretização, o micro-organismo expressa o peptídeo conforme definido pela sequência descrita em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.In one embodiment, the microorganism expresses the peptide as defined by the sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

[0049] Em uma concretização, os peptídeos conforme definidos em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16 e/ou SEQ ID NO:17podem ser expressos de forma isolada ou simultaneamente.In one embodiment, the peptides as defined in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 may be expressed singly or simultaneously.

[0050] Em uma concretização, a sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17 apresenta-se em alto número de cópias em seu genoma.In one embodiment, the nucleotide sequence capable of expressing peptide with at least 70% identity to the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 is high in copy number in its genome.

[0051] Em uma concretização, são inseridas na célula hospedeira no mínimo de cinco cópias a vinte cópias da sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.In one embodiment, at least five copies to twenty copies of the nucleotide sequence capable of expressing at least 70% identity to the sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: are inserted into the host cell. 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

[0052] Em uma concretização, são inseridas na célula hospedeira pelo menos vinte cópias da sequência de nucleotídeos capaz de expressar peptídeo com pelo menos 70% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO;1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.In one embodiment, at least twenty copies of the nucleotide sequence capable of expressing peptide of at least 70% identity to the sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID are inserted into the host cell. NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

[0053] Em uma concretização, um ou mais dos referidos cassetes de expressão pode(m) ser inserido(s) na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele, tanto na direção upstream quanto downstream, podendo ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.In one embodiment, one or more of said expression cassettes may be inserted into the region of the target chromosome located between the centromere and the first gene adjacent to it, either upstream or downstream, and may be just upstream, just downstream or both simultaneously.

[0054] Em uma concretização, um ou mais dos referidos cassetes de expressão pode(m) estar presente(s) na região dos 5 mil primeiros pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.In one embodiment, one or more of said expression cassettes may be present in the region of the first 5,000 base pairs counted from the centromere in either the upstream or downstream direction, and may even be upstream only. , just downstream or both simultaneously.

[0055] Em uma concretização, o micro-organismo é eucarionte.In one embodiment, the microorganism is eukaryote.

[0056] Em uma concretização, o micro-organismo eucarionte é fungo ou levedura.In one embodiment, the eukaryotic microorganism is fungus or yeast.

[0057] Em uma concretização, o micro-organismo eucarionte é um fungo filamentoso.In one embodiment, the eukaryotic microorganism is a filamentous fungus.

[0058] Em uma concretização, a levedura é do gênero Saccharomyces.[0058] In one embodiment, the yeast is of the genus Saccharomyces.

[0059] Em uma concretização, o microrganismo que recebe o(s) referido(s) cassete(s) de expressão é de uma linhagem industrial.In one embodiment, the microorganism receiving said expression cassette (s) is from an industrial strain.

[0060] Em uma concretização, o gene GRE3 (SEQ ID NO:23) do microorganismo é inativado ou deletado em/de seu genoma.In one embodiment, the GRE3 gene (SEQ ID NO: 23) of the microorganism is inactivated or deleted in / from its genome.

[0061] Em uma concretização, o micro-organismo consome material lignocelulósico da biomassa vegetal.In one embodiment, the microorganism consumes lignocellulosic material from plant biomass.

[0062] Em uma concretização, o micro-organismo consome pentoses presentes em material lignocelulósico, preferencialmente a xilose.In one embodiment, the microorganism consumes pentoses present in lignocellulosic material, preferably xylose.

[0063] Em uma concretização, o micro-organismo consome xilose em condições anaeróbias.In one embodiment, the microorganism consumes xylose under anaerobic conditions.

[0064] Em uma concretização, o micro-organismo produz como biocombustível o etanol.In one embodiment, the microorganism produces ethanol as biofuel.

[0065] Em uma concretização, o micro-organismo geneticamente modificado produz como bioquímico: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).In one embodiment, the genetically modified microorganism produces as biochemical: succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3 -butanediol and / or PHB - poly (butyrate hydroxide).

[0066] É um outro objeto da presente invenção um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetal caracterizado por compreender as etapas de: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o micro-organismo conforme definido e revelado no presente pedido de patente; e b) recolher o biocombustível e/ou bioquímico produzido após a etapa a).Another object of the present invention is a process for producing biofuels and / or biochemicals from plant biomass comprising the steps of: a) bringing lignocellulosic plant biomass in contact with the microorganism as defined and disclosed in present patent application; and (b) collect biofuel and / or biochemical produced after step a).

[0067] Em uma concretização, a biomassa vegetal lignocelulósica da etapa a) do referido processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir da porção lignocelulósica da biomassa vegetal é, em uma das concretizações, submetida previamente a pré-tratamento e/ou à hidrólise.In one embodiment, the lignocellulosic plant biomass from step a) of said biofuel and / or biochemical production process from the lignocellulosic portion of the plant biomass is, in one embodiment, previously pretreated and / or to hydrolysis.

[0068] Em uma concretização, o contato entre a biomassa vegetal lignocelulósica e o micro-organismo descrito pela presente invenção ocorre em condições anaeróbias. Tais condições anaeróbias não são, entretanto, uma condição restritiva para o processo que é revelado pela presente invenção.In one embodiment, contact between the lignocellulosic plant biomass and the microorganism described by the present invention occurs under anaerobic conditions. Such anaerobic conditions are not, however, a restrictive condition for the process which is disclosed by the present invention.

[0069] É um outro objeto da presente invenção um biocombustível e/ou bioquímico obtido com o micro-organismo conforme revelado na presente invenção.Another object of the present invention is a biofuel and / or biochemical obtained with the microorganism as disclosed in the present invention.

[0070] Em uma concretização, o biocombustível e/ou bioquímico é o etanol.In one embodiment, the biofuel and / or biochemical is ethanol.

[0071] É um outro objeto da presente invenção o biocombustível e/ou bioquímico que é obtido pelo processo revelado na presente invenção.Another object of the present invention is the biofuel and / or biochemical that is obtained by the process disclosed in the present invention.

[0072] Em uma concretização, o biocombustível e/ou bioquímico é o etanol.In one embodiment, the biofuel and / or biochemical is ethanol.

[0073] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas descritas no presente pedido de patente.The present invention describes, among other objects, a genetically modified microorganism with efficient fermentative performance in the conversion of sugars contained in plant biomass such as lignocellulosic materials into biofuels and / or biochemicals when compared to the same version of the same. -organism without the genetic modifications described in this patent application.

[0074] De forma mais específica, o micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a célula eucariótica transformada geneticamente [0075] Em uma concretização, o micro-organismo é uma levedura ou fungo filamentoso.More specifically, the genetically modified microorganism described in the present invention refers to the genetically transformed eukaryotic cell. In one embodiment, the microorganism is a yeast or filamentous fungus.

[0076] Na presente invenção, leveduras são consideradas como qualquer indivíduo do grupo Eumycotina, ou seja, fungos verdadeiros, que crescem de modo unicelular e que façam, por exemplo, fermentação anaeróbia. Exemplos não limitantes de tais fungos são: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.In the present invention, yeast are considered to be any individual of the Eumycotina group, that is, true fungi, which grow unicellularly and which do, for example, anaerobic fermentation. Non-limiting examples of such fungi are: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula and Yarrowia.

[0077] Fungos filamentosos, por sua vez, são aqueles caracterizados por apresentarem micélio vegetativo e crescerem a partir da elongação das hifas, além de realizarem respiração aeróbia como, por exemplo, Aspergillus, Penicillium, Fusaríum, Trichoderma, Moniliophthora e Acremonium.Filamentous fungi, in turn, are those characterized by presenting vegetative mycelium and growing from the elongation of hyphae, as well as performing aerobic respiration such as Aspergillus, Penicillium, Fusari, Trichoderma, Moniliophthora and Acremonium.

[0078] A presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado, por exemplo, levedura do gênero Saccharomyces.The present invention describes a genetically modified microorganism, for example, yeast of the genus Saccharomyces.

[0079] Em uma concretização, é descrito na presente invenção um micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae mais eficiente na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poli(hidróxido butirato), sem entretanto restringir-se a eles, quando comparado com à versão do mesmo micro-organismo sem as modificações genéticas contidas no presente documento.In one embodiment, a microorganism of the species Saccharomyces cerevisiae more efficient in converting pentoses present in the lignocellulosic material into alcohols and / or biochemicals, such as, for example, succinic acid, malic acid, is described in the present invention. , 3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poly (butyrate hydroxide), but not limited to them as compared to the version same microorganism without the genetic modifications contained herein.

[0080] Em uma concretização, a pentose utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é xilose sem, entretanto, restringir-se a ela.In one embodiment, the pentose used by the microorganism for conversion to alcohols and / or biochemicals above is xylose without, however, being restricted to it.

[0081] Na presente invenção são feitas referências a diversas sequências gênicas, todas listadas na seção Listagem de Sequências. Para breve referência e facilidade de compreensão, suas funções ou genes respectivos são indicados na tabela 1 a seguir.In the present invention references are made to various gene sequences, all listed in the Sequence Listing section. For brief reference and ease of understanding, their respective functions or genes are shown in table 1 below.

Tabela 1 - Sequências gênicas ou de aminoácidos referidas na presente invenção e respectivos genes/funções.Table 1 - Gene or amino acid sequences referred to in the present invention and their genes / functions.

[0082] As sequências de aminoácidos apresentadas nas sequências SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO;11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17 representam peptídeos com característica de xilose isomerase que, quando expressos de forma isolada ou simultaneamente em célula eucariótica, favorecem a isomerização de xilose em xilulose.The amino acid sequences shown in the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 represent peptides with xylose isomerase characteristic which, when expressed singly or simultaneously in eukaryotic cell, favor the xylose isomerization into xylulose.

[0083] Salienta-se ainda que a expressão simultânea desses peptídeos na célula não caracteriza, de nenhuma forma, qualquer dependência entre eles para sua expressão. Portanto, define-se que a expressão simultânea desses peptídeos refere-se apenas à expressão dos peptídeos ao mesmo tempo, na mesma célula, sendo que a expressão de cada um dos referidos peptídeos independe da expressão do outro. Por exemplo, se ocorre a expressão simultânea dos peptídeos representados pelas sequências SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 na célula, entende-se que a expressão do peptídeo representado pela SEQ ID NO:1 independe da expressão do peptídeo representado pela SEQ ID NO:2 e vice-versa.It is also emphasized that the simultaneous expression of these peptides in the cell does not characterize, in any way, any dependence between them for their expression. Therefore, it is defined that the simultaneous expression of these peptides refers only to the expression of the peptides at the same time in the same cell, and the expression of each of these peptides is independent of the expression of the other. For example, if simultaneous expression of the peptides represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 occur in the cell, it is understood that expression of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 is independent of expression of the peptide represented by SEQ ID NO: 2 and vice versa.

[0084] Assim, o micro-organismo descrito pela presente invenção é geneticamente modificado pela introdução de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO;2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, sendo que cada um desses peptídeos podem ser expressos nessa célula eucariótica, por exemplo, em sua forma ativa e funcional de xilose isomerase.Thus, the microorganism described by the present invention is genetically modified by introducing at least one nucleotide sequence encoding a peptide with xylose isomerase function and having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and / or SEQ ID NO: 17, each of which One such peptide may be expressed in this eukaryotic cell, for example, in its active and functional form of xylose isomerase.

[0085] Assim, a presente invenção descreve célula hospedeira eucariótica/micro-organismo sendo, por exemplo, levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, porém salienta-se que qualquer célula eucariótica pode ser transformada com um ou mais cassetes de expressão da presente invenção, que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e o qual possui pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO;4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17. Salienta-se também que as sequências de nucleotídeos que codificam os ditos peptídeos podem ser inseridas na célula eucariótica, e podem ser incorporadas no mesmo cassete ou em cassetes diferentes.Thus, the present invention describes eukaryotic host cell / microorganism being, for example, yeast of the Saccharomyces cerevisiae species, but it is emphasized that any eukaryotic cell can be transformed with one or more expression cassettes of the present invention which comprises at least one nucleotide sequence capable of encoding peptide having xylose isomerase function and having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO; 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17. It is also noted that nucleotide sequences encoding said peptides may be inserted into the eukaryotic cell, and may be incorporated into the same or different cassettes.

[0086] Portanto, a presente invenção descreve uma célula hospedeira eucariótica, leveduras ou fungos filamentosos, como por exemplo levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, transformada com um ou mais cassetes de expressão da invenção, sendo que ao menos um cassete compreenda sequência de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.Therefore, the present invention describes a eukaryotic host cell, yeast or filamentous fungi, such as yeast of the Saccharomyces cerevisiae species, transformed with one or more expression cassettes of the invention, with at least one cassette comprising nucleotide sequence capable of coding peptide having xylose isomerase function and having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

[0087] Adicionalmente, salienta-se que qualquer uma das sequências de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase que possua pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO;2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, podem apresentar-se em cópia única ou em múltiplas cópias de cada uma das sequências de nucleotídeos inseridas no genoma.In addition, it is noted that any of the nucleotide sequences capable of encoding xylose isomerase function peptide having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 may be in single copy or multiple copies of each. of nucleotide sequences inserted into the genome.

[0088] A célula hospedeira geneticamente modificada descrita na presente invenção adicionalmente compreende modificações genéticas que visam o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentoses fosfato, de forma que a inserção de qualquer sequência de nucleotídeos que codifique peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16 e/ou SEQ ID NO: 17 possa favorecer a isomerização de xilose em xilulose.The genetically modified host cell described in the present invention further comprises genetic modifications aimed at enhancing metabolic flow through the pentose phosphate pathway, such that the insertion of any nucleotide sequence encoding xylose isomerase peptide having at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 may favor the isomerization of xylose into xylulose.

[0089] Assim, para aumento de fluxo da via das pentoses fosfato na célula hospedeira, são inseridos genes que codificam as enzimas Xiluloquinase (.XKS1, EC 2.7.1.17), cuja sequência de nucleotídeos é representada neste documento por SEQ ID NO:18, a Transaldolase (TAL1, EC 2.2.1.2), representada pela sequência SEQ ID NO:19, Transcetolase (TKL1, EC 2.2.1.1), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:20, Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1, EC 5.3.1.6), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:21; e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1, EC 5.1.3.1), cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:22.Thus, for increased flow of the pentose phosphate pathway in the host cell, genes encoding the xylulokinase enzymes (.XKS1, EC 2.7.1.17) are inserted, the nucleotide sequence of which is represented herein by SEQ ID NO: 18 , Transaldolase (TAL1, EC 2.2.1.2), represented by the sequence SEQ ID NO: 19, Transcetolase (TKL1, EC 2.2.1.1), whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 20, Ribose 5-Phosphate Isomerase ( RKI1, EC 5.3.1.6), whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 21; and Ribose 5-Phosphate Epimerase (RPE1, EC 5.1.3.1), whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 22.

[0090] Salienta-se que, apesar da inserção dos genes da via das pentoses-fosfato ser relevante para favorecer a isomerização de xilose pela célula hospedeira, essas modificações genéticas não são, de nenhuma forma, obrigatórias ou restritivas para transformação da célula hospedeira com qualquer sequência de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase e com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17.It should be noted that although insertion of the pentose phosphate pathway genes is relevant for favoring xylose isomerization by the host cell, such genetic modifications are in no way obligatory or restrictive for host cell transformation with any nucleotide sequence capable of encoding peptides with xylose isomerase function and having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

[0091] Na célula hospedeira descrita na presente invenção, ao menos um dos genes que codificam as enzimas apresentadas, compreendidas na via das pentose-fosfato e/ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar peptídeo com função xilose isomerase que possui pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, deve apresentar-se superexpresso e, em uma concretização, ligado a promotores constitutivos ou naturalmente induzíveis.In the host cell described in the present invention, at least one of the genes encoding the disclosed enzymes comprised in the pentose phosphate pathway and / or at least one nucleotide sequence capable of encoding xylose isomerase function peptide having at least 70% identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17, must be overexpressed and, in one embodiment, bound to constitutive or naturally inducible promoters.

[0092] A superexpressão dos genes que codificam essas enzimas pode ser em decorrência do aumento do número de cópias de cada uma das sequências de nucleotídeos que as codifica, expressão de genes epissomais presentes em vetores que podem ser inseridos na célula eucariótica hospedeira, através do uso de promotores heterólogos àquela sequência na qual ele encontra-se operativamente ligado, ou mesmo homólogos da célula onde foram inseridos, ou como endógenos na célula hospedeira, desde que eles sejam capazes de produzir um estado estável de transcrição mais elevado do que seria realizado pela célula em sua versão sem as presentes modificações genéticas, nas situações em que fontes de carbono como glicose e xilose estiverem disponíveis no meio. Esses promotores podem ser constitutivos ou naturalmente induzíveis.Overexpression of genes encoding such enzymes may be due to increased copy number of each of the nucleotide sequences encoding them, expression of episomal genes present in vectors that can be inserted into the host eukaryotic cell via the use of heterologous promoters to that sequence in which it is operably linked, or even homologues of the cell into which they were inserted, or as endogenous in the host cell, provided that they are capable of producing a higher stable state of transcription than would be accomplished by cell in its version without the present genetic modifications, in situations where carbon sources such as glucose and xylose are available in the medium. Such promoters may be constitutive or naturally inducible.

[0093] É também objeto da presente invenção um cassete de expressão caracterizado por compreender: - pelo menos uma sequência de nucleotídeos capazes de codificar peptídeos com função xilose isomerase e que possui pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17, sendo que esses peptídeos podem ser expressos na célula eucariótica de forma isolada ou simultaneamente; - ao menos um promotor para quaisquer das diferentes sequências nucleotídicas codificantes; e - uma sequência nucleotídica selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outra enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas.It is also an object of the present invention an expression cassette comprising: - at least one nucleotide sequence capable of encoding peptides having xylose isomerase function and having at least 70% identity to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17, with these peptides being may be expressed in the eukaryotic cell singly or simultaneously; at least one promoter for any of the different coding nucleotide sequences; and - a nucleotide sequence selected from: a transcription terminator nucleotide sequence; a selection marker; one or more nucleotide sequence (s) coding for another enzyme; combinations thereof or a plasmid comprising such sequences, with at least one of the nucleotide sequences defined above being heterologous.

[0094] Um ou mais cassetes de expressão podem ser usados na transformação de células eucarióticas de acordo com a invenção.One or more expression cassettes may be used in the transformation of eukaryotic cells according to the invention.

[0095] Em uma concretização, um dos cassetes de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:18), Transaldolase (SEQ ID NO:19), Transcetolase (SEQ ID NO:20), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:21) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:22).In one embodiment, one of the expression cassettes of the invention also comprises sequences selected from the group comprising the coding sequences for the enzymes Xylulokinase (SEQ ID NO: 18), Transaldolase (SEQ ID NO: 19), Transcetolase (SEQ ID NO). : 20), Ribose 5-Phosphate Isomerase (SEQ ID NO: 21) and / or Ribose 5-Phosphate Epimerase (SEQ ID NO: 22).

[0096] Assim, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um ou mais cassetes de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, por exemplo, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.Thus, the present invention describes host cell comprising one or more expression cassettes containing endogenous enzyme genes of the non-oxidative phase of the pentose phosphate pathway, which are, for example, constructed using strong and constitutive cell promoters. into which they will be inserted and stably integrated into the host cell genome.

[0097] Todos os cassetes de expressão com os genes da via metabólica das pentoses fosfato que favorecem o consumo de xilose e/ou sequências de nucleotídeos capazes de codificar peptídeos com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO:17 são inseridos na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele. Por exemplo, na região dos 5 mil primeiros pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, ser apenas downstream ou ser ambos simultaneamente.All expression cassettes with the pentose phosphate metabolic pathway genes that favor the consumption of xylose and / or nucleotide sequences capable of encoding xylose isomerase function peptides with at least 70% identity with SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 are entered. in the target chromosome region located between the centromere and the first gene adjacent to it. For example, in the region of the first 5,000 base pairs counted from the centromere in either the upstream or downstream direction, it may even be upstream only, downstream only, or both simultaneously.

[0098] Direção upstream é considerada aquela localizada anteriormente ao ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA, a qual se inicia no promotor e encerra no terminador. Por sua vez, downstream é considerada a região localizada após o ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA.Upstream direction is considered to be that located prior to the start point of the transcription unit of a DNA sequence, which starts at the promoter and ends at the terminator. In turn, downstream is considered the region located after the starting point of the transcription unit of a DNA sequence.

[0099] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:23. Aldose redutase favorece o acúmulo de xilitol cujo acúmulo na célula, por sua vez, diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.In addition to the insertion of expression cassettes, the present invention also describes deletion or inactivation of the GRE3 gene, which encodes an aldose reductase and is represented in SEQ ID NO: 23. Aldose reductase favors the accumulation of xylitol whose accumulation in the cell, in turn, decreases the total ethanol yield that can be obtained. In addition, xylitol is an inhibitor of the action of the enzyme xylose isomerase.

[0100] Dessa maneira, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias de pelo menos um cassete contendo sequência de nucleotídeos que codifica peptídeo com função xilose isomerase com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e/ou SEQ ID NO;17, sendo que esses peptídeos podem ser expressos na célula hospedeira de forma isolada ou simultaneamente.Accordingly, the present invention describes the stable and high copy integration of at least one nucleotide sequence cassette containing peptide encoding xylose isomerase with at least 70% identity to SEQ ID N: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO; 17, all of which Peptides may be expressed in the host cell singly or simultaneously.

[0101] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, preferencialmente micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos preferencialmente em alto número de cópias e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente. Possuindo toda a via metabólica necessária para conversão de xilose, em condições aeróbicas, a linhagem é capaz de metabolizar a xilose presente no meio de cultivo, porém, em condições anaeróbicas, o consumo é muito lento.This document therefore describes a eukaryotic cell, preferably a microorganism of the species Saccharomyces cerevisiae, genetically modified containing in its genome at least one of the enzyme genes required to favor the non-oxidative part of the pentose phosphate pathway inserted preferably in high copy number and in the region between the centromere and its first adjacent gene. Having all the metabolic pathway required for xylose conversion under aerobic conditions, the strain is able to metabolize the xylose present in the culture medium, but under anaerobic conditions consumption is very slow.

[0102] Assim, após ser submetido às modificações genéticas descritas anteriormente, o micro-organismo é então submetido ao processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do microorganismo de interesse em um meio de cultura contendo concentrações variáveis e crescentes de fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo. A repetição desta operação proporciona selecionar micro-organismos com capacidade de metabolizar de forma mais eficiente e com maior produtividade a fonte de carbono de interesse. Assim, o processo de obtenção de microorganismos da invenção foi ajustado para a obtenção de um micro-organismo com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis ou bioquímicos.Thus, after undergoing the genetic modifications described above, the microorganism is then subjected to the evolutionary engineering process comprising successive subcultures of the microorganism of interest in a culture medium containing varying and increasing concentrations of carbon source usable by the microorganism. microorganism. The repetition of this operation allows the selection of microorganisms capable of metabolizing the carbon source of interest more efficiently and with greater productivity. Thus, the process of obtaining microorganisms of the invention has been adjusted to obtain a microorganism with substantial and improved performance in the conversion of pentoses, mainly xylose to fuels or biochemicals.

[0103] O micro-organismo descrito na presente invenção é, em uma de suas concretizações, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir de espuma, entre outros.The microorganism described in the present invention is, in one of its embodiments, of industrial lineage and has differentially the characteristics of being non-flocculant, allow low glycerol and xylitol formation, have high viability, high growth rate, no produce foam, among others.

[0104] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos a partir de biomassa vegetal, por exemplo, a partir da porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo revelado pela presente invenção para a produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.[0104] The present invention also discloses and comprises a process of producing biofuels and / or biochemicals from plant biomass, for example from the lignocellulosic portion of plant biomass. The biofuel and / or biochemical production process described in the present invention utilizes the microorganism disclosed by the present invention for the production of biofuels and / or biochemicals.

[0105] O referido processo compreende as seguintes etapas: a) colocar biomassa vegetal lignocelulósica em contato com o micro-organismo descrito na presente invenção; e b) opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.Said process comprises the following steps: a) bringing lignocellulosic plant biomass in contact with the microorganism described in the present invention; and b) optionally retracting the generated compound.

[0106] A biomassa vegetal lignocelulósica da etapa a) do referido processo pode ser, em uma das concretizações, submetida previamente a pré-tratamento e/ou hidrólise.The lignocellulosic plant biomass of step a) of said process may be, in one embodiment, previously subjected to pretreatment and / or hydrolysis.

[0107] O contato entre a biomassa vegetal lignocelulósica e o microorganismo descrito da etapa a. do referido processo ocorre, em uma das concretizações, em condições anaeróbias. No entanto, é importante ressaltar que as condições anaeróbias não são obrigatórias para o contato entre biomassa e micro-organismo revelado na presente invenção.[0107] The contact between the lignocellulosic plant biomass and the described microorganism from step a. This process occurs in one embodiment under anaerobic conditions. However, it is important to note that anaerobic conditions are not required for contact between biomass and microorganism disclosed in the present invention.

[0108] O processo revelado pela presente invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).The process disclosed by the present invention provides for the production of biofuels comprising predominantly alcohols, especially ethanol. The process of the invention provides for the production of biochemicals selected from the group comprising, but not limited to: succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol 2,3-butanediol and / or PHB - poly (butyrate hydroxide).

[0109] A presente invenção também se refere aos biocombustíveis, como, por exemplo, o etanol, e bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção.[0109] The present invention also relates to biofuels, such as ethanol, and biochemicals produced by the process using the microorganism of the invention.

[0110] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir do presente pedido de patente, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.Those skilled in the art will immediately understand from this patent application that the inventive concept claimed herein is not limited to the exemplified embodiments above, which are to be construed as: evidence of the material existence of the invention; and as an informational medium that readily enables a person skilled in the art to reproduce it - both in the specific forms here exemplified and in others legally within the full scope of the disclosed inventive concept and claimed objects.

[0111] Salienta-se, então, que o microrganismo que é um dos objetos da invenção é particularmente eficiente na conversão de pentoses constituintes de material lignocelulósico em álcoois e/ou ácidos. Referido microrganismo é eficiente na conversão de pentoses, incluindo xilose, presentes no material lignocelulósico, como aquele previamente submetido a processo de hidrólise.It is emphasized, then, that the microorganism which is one of the objects of the invention is particularly efficient in converting pentoses constituting lignocellulosic material into alcohols and / or acids. Said microorganism is efficient in the conversion of pentoses, including xylose, present in lignocellulosic material, such as that previously subjected to hydrolysis process.

REIVINDICAÇÕES

CASSETE DE EXPRESSÃO, MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEISEXPRESSION CASSETTE, GENETICALLY MODIFIED MICRO-ORGANISM, BIOFUEL PRODUCTION PROCESS

E/OU BIOQUÍMICOS E BIOCOMBUSTÍVEIS E/OU BIOQUÍMICOSAND / OR BIOCHEMICAL AND BIOFUELS AND / OR BIOCHEMICAL

Claims

Expression cassette comprising: (a) at least one nucleotide sequence capable of coding for peptide with xylose isomerase function and having at least 70% identity to at least one of the sequences described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17; and b) at least one promoter for said coding nucleotide sequence.

Expression cassette according to claim 1, characterized in that said promoter is a strong and / or constitutive promoter of the microorganism into which the cassette will be inserted.

Expression cassette according to claim 1, characterized in that it comprises an additional nucleotide sequence selected from: a transcription terminator nucleotide sequence; a selection marker; one or more nucleotide sequence (s) encoding other enzymes; combinations thereof or a plasmid comprising such sequences, with at least one of the nucleotide sequences defined above being heterologous.

Expression cassette according to Claim 3, characterized in that it comprises at least one sequence selected from the group consisting of coding sequences for the enzymes Xylulokinase (SEQ ID NO: 18), Transaldolase (SEQ ID NO: 19), Transcetolase ( SEQ ID NO: 20), Ribose 5-Phosphate Isomerase (SEQ ID NO: 21) and / or Ribose 5-Phosphate Epimerase (SEQ ID NO: 22) and / or combinations thereof.

Genetically modified micro-organism for xylose isomerase expression characterized in that it expresses at least one peptide with at least 70% identity to the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

Microorganism according to claim 5, characterized in that it expresses the peptide as defined by the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17.

Microorganism according to claim 5 or 6, characterized in that the peptides are defined by the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 may be expressed singly or simultaneously.

Microorganism according to any one of claims 5 to 7, characterized in that the nucleotide sequence capable of expressing peptide of at least 70% identity to the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17 appear in large number of copies at your genome.

Microorganism according to any one of claims 5 to 8, characterized in that at least five to twenty copies of the nucleotide sequence capable of expressing at least 70% identity to the peptide are inserted into the host cell. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and / or SEQ ID NO: 17.

Microorganism according to any one of claims 5 to 9, characterized in that at least twenty copies of the nucleotide sequence capable of expressing at least 70% identity to the sequence SEQ ID NO are inserted into the host cell. : 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and / or SEQ ID NO: 17 .

Genetically modified microorganism according to any one of claims 1 to 10, characterized in that one or more of said expression cassettes may be inserted into the region of the target chromosome located between the centromere and the first gene adjacent to it, either in the upstream or downstream direction and can be upstream only, downstream only, or both simultaneously.

Genetically modified microorganism according to Claim 11, characterized in that one or more of said expression cassettes may be present in the region of the first 5,000 base pairs counted from the centromere. both upstream and downstream, and may even be upstream only, downstream only, or both simultaneously.

Microorganism according to any one of Claims 5 to 12, characterized in that it is eukaryotic microorganism.

Microorganism according to Claim 13, characterized in that the eukaryotic microorganism is a fungus or yeast.

Microorganism according to Claim 14, characterized in that the yeast is of the genus Saccharomyces.

Genetically modified microorganism according to any one of claims 5 to 15, characterized in that the lineage receiving said expression cassette (s) is an industrial lineage.

Genetically modified microorganism according to any one of claims 5 to 16, characterized in that the GRE3 gene (SEQ ID NO: 23) is inactivated or deleted in / from its genome.

Genetically modified microorganism according to any one of Claims 5 to 17, characterized in that it consumes lignocellulosic material from plant biomass.

Genetically modified microorganism according to any one of claims 5 to 18, characterized in that it consumes pentoses present in lignocellulosic material, preferably xylose.

Genetically modified microorganism according to any one of Claims 5 to 19, characterized in that it consumes xylose under anaerobic conditions.

Genetically modified microorganism according to any one of Claims 5 to 20, characterized in that it produces ethanol as biofuel.

Genetically modified micro-organism according to any one of Claims 5 to 20, characterized in that it produces as biochemical: succinic acid, malic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4 -butanediol, 2,3-butanediol and / or PHB-poly (butyrate hydroxide).

Process for producing biofuels and / or biochemicals from plant biomass comprising the steps of: (a) bringing the lignocellulosic plant biomass in contact with the microorganism as defined in any one of claims 5 to 22; and b) collect biofuel and / or biochemical generated after step a).

Biofuel and / or biochemical characterized in that it is obtained from the microorganism as defined in any one of claims 5 to 22.

25. Biofuel and / or biochemical characterized by being ethanol.

Biofuel and / or biochemical characterized in that it is obtained by the process as defined by claim 23.

27. Biofuel and / or biochemical characterized by being ethanol.