BR102015007543A2

BR102015007543A2 - recombinant multiepitope protein, its procurement process and its cytomegalovirus-related applications

Info

Publication number: BR102015007543A2
Application number: BR102015007543A
Authority: BR
Inventors: Alexsandro Sobreira Galdino; Daniel Silva Dias; Fernando Araripe Gonçalves Torres; Laís Moreira Nogueira; Maria Sueli Soares Felipe; Marilen Queiroz De Souza; Patrícia Aparecida Fernandes Ribeiro
Original assignee: Fundação Universidade De Brasília; Univ Fed São João Del Rei
Priority date: 2015-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2016-11-22

Abstract

1/1 resumo proteína multiepítopo recombinante, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas ao citomegalovírus a presente invenção se refere a uma proteína multiepítopo recombinante contendo epítopos dominantes de proteínas estruturais do citomegalovírus, conservadas entre os diferentes genótipos de cmv circulantes no brasil e no mundo, os quais têm o potencial de reconhecer tanto a fase aguda (igg) como crônica (igm) da doença. os epítopos são ligados entre si por peptídeos conectores flexíveis, minimizando o impedimento estérico da proteína em solução. esta proteína apresenta atividade antigênica, sendo utilizada como insumo para kits de diagnóstico padronizados in vitro, de alta sensibilidade, para citomegalovírus, a partir de amostras fisiológicas humanas para identificar indivíduos que já tiveram contato com o cmv (infecção presente ou passada).This invention relates to a recombinant multiepitope protein containing dominant epitopes of cytomegalovirus structural proteins conserved among the different circulating cmv genotypes in Brazil and around the world. , which have the potential to recognize both the acute (igg) and chronic (igm) phase of the disease. epitopes are linked together by flexible connector peptides, minimizing the steric hindrance of the protein in solution. This protein has antigenic activity and is used as an input for standardized high sensitivity in vitro diagnostic kits for cytomegalovirus from human physiological samples to identify individuals who have had contact with cmv (present or past infection).

Description

PROTEÍNA MULTIEPÍTOPO RECOMBINANTE, SEU PROCESSO DE OBTENÇÃO E SUAS APLICAÇÕES RELACIONADAS AO CITOMEGALOVIRUSRECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN, ITS OBTAINING PROCESS AND ITS APPLICATIONS RELATED TO CITOMEGALOVIRUS

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF INVENTION

[001] A presente invenção trata da construção biotecnológica e da utilização de uma proteína antigênica recombinante contendo epítopos dominantes de proteínas estruturais do Citomegalovírus (CMV), mais especificamente os epítopos imunodominantes selecionados das proteínas fosforiladas ppl50 (614-643), pp38 (60-81), pp65 (401-470), pp28 (15-45), pp52 (266-293) e ppl50 (1011-1048). Esta proteína apresenta atividade antigênica, sendo utilizada como insumo para kits de diagnóstico in vitro para Citomegalovírus, a partir de amostras fisiológicas para identificar indivíduos que já tiveram o contato com o CMV. Adicionalmente, esta proteína também é utilizada em métodos de detecção de Rubéola e na produção de anticorpos monoclonais.The present invention relates to the biotechnological construction and use of a recombinant antigenic protein containing dominant epitopes of Cytomegalovirus (CMV) structural proteins, more specifically the immunodominant epitopes selected from phosphorylated proteins ppl50 (614-643), pp38 (60-). 81), pp65 (401-470), pp28 (15-45), pp52 (266-293) and ppl50 (1011-1048). This protein has antigenic activity and is used as an input for in vitro diagnostic kits for cytomegalovirus, from physiological samples to identify individuals who have had contact with CMV. Additionally, this protein is also used in Rubella detection methods and in the production of monoclonal antibodies.

[002] Destes, as regiões pp52 e ppl50 (1011-1048) tem o potencial de reconhecer tanto a fase aguda (IgG) como crônica (IgM) da doença. As demais regiões reconhecem apenas a fase aguda.Of these, the pp52 and ppl50 regions (1011-1048) have the potential to recognize both the acute (IgG) and chronic (IgM) phase of the disease. The other regions recognize only the acute phase.

ESTADO DA TÉCNICATECHNICAL STATE

[003] O Citomegalovírus Humano (HCMV) é o vírus responsável pela infecção patogênica mais importante em patologias renais e transplantes (DE KEYZER, K. et al. Am J Kidney Dis, 58(1):118-126, 2011). O HCMV é um importante patógeno capaz de estabelecer infecções prolongadas, as quais permanecem assintomáticas durante anos (PIGNATELLI, S. et al. Rev Med Virol, 14(6):383-419, 2004), o que possibilita o desenvolvimento de várias doenças e, consequentemente, de várias manifestações clinicas, especialmente em pacientes com o sistema imune comprometido (MENDRONE-Jr, A. Rev Bras Hematol Hemoter, 32(1):7-8, 2010) . Nesses pacientes, podem ocorrer manifestações diretas da multiplicação viral, como febre, leucopenia, hepatite, bem como sequelas indiretas, incluindo elevado índice de rejeição de enxerto renal e comprometimento da resposta imune celular (FISHMAN, J.A & RUBIN, R.H. N Engl Med, 338(24):1741-1751, 1998).[003] Human Cytomegalovirus (HCMV) is the virus responsible for the most important pathogenic infection in kidney disease and transplantation (DE KEYZER, K. et al. Am J Kidney Dis, 58 (1): 118-126, 2011). HCMV is an important pathogen capable of establishing prolonged infections, which remain asymptomatic for years (PIGNATELLI, S. et al. Rev Med Virol, 14 (6): 383-419, 2004), which enables the development of various diseases. and, consequently, of several clinical manifestations, especially in patients with compromised immune system (MENDRONE-Jr, A. Rev Bras Hematol Hemoter, 32 (1): 7-8, 2010). In these patients, direct manifestations of viral multiplication may occur, such as fever, leukopenia, hepatitis, as well as indirect sequelae, including high renal graft rejection rates and impaired cellular immune response (FISHMAN, JA & RUBIN, RH N Engl Med, 338). (24): 1741-1751, 1998).

[004] A infecção ocorre predominantemente em regiões pobres onde as condições de higiene são precárias. De modo geral, a taxa de prevalência em adultos varia de 40-60% em países do hemisfério norte e de 80-100% na África e na América Latina (MENDRONE-Jr, A. Rev Bras Hematol Hemoter, 32(1):7-8, 2010). No Brasil, alguns estudos da soroprevalência do HCMV mostraram uma alta incidência em populações jovens. Em um estudo com a população entre 15 e 45 anos de idade na cidade de Rio de janeiro, Suassuna e colaboradores (1995) detectaram 81% de soropositividade (SUASSUNA, J. et al. Rev Soc Bras Med Trop, 28(2):105-108, 1995). Almeida e colaboradores (2001) concluíram que nessa mesma faixa etária, na cidade de São Paulo, a soroprevalência foi de 90% (ALMEIDA et al. Rev Saude Publica, 35(2):124-129, 2001) Outro estudo, conduzido por Matos e Colaboradores (2010), mostrou uma incidência de 87,9% em Santa Catarina (MATOS et al. Rev Bras Hematol Hemoter, 32(1):45-9, 2010) [005] O HCMV pertence à família Herpesviridae e é um vírus de DNA fita dupla linear de aproximadamente 250kpb, possuindo mais de 220 ORFs (Open Reading Frame) e consistindo de um único segmento longo (UL) e um curto (US). Cada segmento é flanqueado por repetições invertidas (RL e RS, Figura 1). Muitos dos 200 genes que o HCMV possui codificam proteínas e uma pequena parte codificam RNA não codificante, incluindo 14 microRNAs (miRNA) (KULESZA, C.A & SHENK, T. J Vi rol, 78(23):13182-13189, 2004). A porção central da região UL contém clusters dos genes do core com homologia com outros herpesvirus, como DNA polimerase, a glicoproteína B (gB), e a glicoproteína H (gH) (McGEOCH, D.J. et al. Virus Res, 117(1):90-104, 2006).[004] Infection occurs predominantly in poor regions where hygiene conditions are poor. Overall, the adult prevalence rate ranges from 40-60% in northern countries and 80-100% in Africa and Latin America (MENDRONE-Jr, A. Rev Bras Hematol Hemoter, 32 (1): 7-8, 2010). In Brazil, some HCMV seroprevalence studies have shown a high incidence in young populations. In a study of the population between 15 and 45 years old in the city of Rio de Janeiro, Suassuna et al. (1995) detected 81% of seropositivity (SUASSUNA, J. et al. Rev Soc Bras Med Trop, 28 (2): 105-108, 1995). Almeida et al. (2001) concluded that in this same age group, in the city of São Paulo, seroprevalence was 90% (ALMEIDA et al. Rev Saude Publica, 35 (2): 124-129, 2001). Another study, conducted by Matos et al. (2010), showed an incidence of 87.9% in Santa Catarina (MATOS et al. Rev Bras Hematol Hemoter, 32 (1): 45-9, 2010) [005] HCMV belongs to the Herpesviridae family and is an approximately 250kbp linear double-stranded DNA virus, having more than 220 Open Reading Frame (ORFs) and consisting of a single long (UL) and a short (US) segment. Each segment is flanked by inverted repetitions (RL and RS, Figure 1). Many of the 200 genes that HCMV has encode proteins and a small part encode non-coding RNA, including 14 microRNAs (miRNA) (KULESZA, C.A & SHENK, T.JV rol, 78 (23): 13182-13189, 2004). The central portion of the UL region contains core gene clusters with homology to other herpesviruses, such as DNA polymerase, glycoprotein B (gB), and glycoprotein H (gH) (McGEOCH, DJ et al. Virus Res, 117 (1) : 90-104, 2006).

[006] Por convenção, estabeleceu-se que os genes do HCMV são nomeados segundo sua posição dentro do genoma, como por exemplo, UL54. Essa abreviatura significa que esse gene ocupa a posição 54° na região UL, de acordo com dados publicados do HCMV, cepa AD19 (Chee et al. Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169. In: McDougall, J.K. Curr Top Microbiol Immunol 154: Citomegaloviruses, Springer-Verlag; New York, USA, 125 - 169, 1990) .By convention, it has been established that HCMV genes are named after their position within the genome, such as UL54. This abbreviation means that this gene occupies the 54 ° position in the UL region, according to published data from HCMV strain AD19 (Chee et al. Analysis of the protein-coding content of the human cytomegalovirus strain AD169 sequence. In: McDougall, JK Curr Top Microbiol Immunol 154: Cytomegaloviruses, Springer-Verlag (New York, USA, 125 - 169, 1990).

[007] Outra padronização que existe é quanto aos produtos protéicos. Eles são designados por uma ORF numérica, seguido por prefixos indicando proteína (p) e o estado de fosforilação ou glicosilação (pp e gp, respectivamente). Por exemplo, ppl50 e pp38, referem-se, respectivamente, a produtos protéicos fosforilados de 150 kDa e 38 kDa. Em alguns nomes, são adicionados, ainda, a localização ou o nome comum mais usado entre parênteses, como o caso de gpul55 (gB), que indica um produto protéico glicosilado de 55 kDa, localizado no segmento longo, cujo nome mais comum é glicoproteína B.[007] Another standardization that exists is for protein products. They are designated by a numerical ORF, followed by prefixes indicating protein (p) and the state of phosphorylation or glycosylation (pp and gp, respectively). For example, ppl50 and pp38, respectively, refer to 150 kDa and 38 kDa phosphorylated protein products. In some names, the location or common name most commonly used in parentheses is added, such as gpul55 (gB), which indicates a 55 kDa glycosylated protein product located in the long segment, whose most common name is glycoprotein B.

[008] Embora estudos tenham sido realizados no sentido de se conhecer a função das proteínas codificadas por estas regiões, poucas proteínas têm função sabidamente reconhecida. Dessa forma, a função de muitos produtos protéicos tem sido inferida somente por meio de estudos estruturais. Os genes do HCMV podem codificar para proteínas estruturais ou reguladoras. Aqueles que codificam para proteínas estruturais, fazem parte da arquitetura do vírus (nucleocapsídeo, envelope e tegumento, que está posicionado entre o nucleocapsidio e o envelope viral). Cada um desses componentes virais tem uma composição especifica de proteínas. Dentre cerca de 55 ORFS que codificam para glicoproteínas, pelo menos 10 estão presentes no envelope do citomegalovírus humano e possuem múltiplas funções no ciclo de vida viral, como adesão, penetração e a invasão dentro da célula. Algumas das glicoproteínas do HCMV são complexos de alta massa molecular ligados por pontes dissulfeto chamadas de gCI, gCII e gCIII (GRETCH, D.R. et ai. J Virol, 62:875-881, 1988). Devido à importância das glicoproteínas do envelope do CMV na replicação viral e na indução da proteção da imunidade, os genes que codificam as duas maiores glicoproteínas do envelope, gB e gH, estão sendo estudadas como potenciais alvos para kits de diagnóstico. O gene gB do CMV codifica para uma poliproteína de 160 kDa e os seus produtos gênicos são glicosilados e inseridos no envelope viral. O gene gB está envolvido na replicação, entrada e dispersão viral na célula hospedeira (RASMUSSEN, L. Transpl Infect Dis, 1: 127-134, 1999).Although studies have been conducted to know the function of proteins encoded by these regions, few proteins have known function. Thus, the function of many protein products has been inferred only through structural studies. HCMV genes can code for structural or regulatory proteins. Those that code for structural proteins are part of the architecture of the virus (nucleocapsid, envelope and integument, which is positioned between the nucleocapsid and the viral envelope). Each of these viral components has a specific protein composition. Of the approximately 55 ORFS encoding glycoproteins, at least 10 are present in the human cytomegalovirus envelope and have multiple functions in the viral life cycle, such as adhesion, penetration, and invasion within the cell. Some of the HCMV glycoproteins are disulfide bonded high molecular weight complexes called gCI, gCII and gCIII (GRETCH, D.R. et al. J Virol, 62: 875-881, 1988). Because of the importance of CMV envelope glycoproteins in viral replication and in inducing immunity protection, genes encoding the two largest envelope glycoproteins, gB and gH, are being studied as potential targets for diagnostic kits. The CMV gB gene codes for a 160 kDa polyprotein and its gene products are glycosylated and inserted into the viral envelope. The gB gene is involved in replication, entry, and viral dispersion in the host cell (RASMUSSEN, L. Transpl Infect Dis, 1: 127-134, 1999).

[009] Os inúmeros resultados de experimentos científicos sobre CMV mostraram que o ciclo de vida viral, inicia-se após uma série de etapas. A primeira consiste na ligação do vírus e sua entrada na célula: i) Ligação do vírus à superfície das células, ii) fusão do envelope com a membrana celular liberando capsídios dentro do citoplasma, iii) associação dos capsídios com os elementos do citoesqueleto e translocação para o núcleo (BROCCHIERI et al. J Virol, 79(12): 7570-7596, 2005). As glicoproteínas do envelope viral como gB, gH e gM são as responsáveis pela interação do vírus-membrana celular do hospedeiro. Contudo, vários pesquisadores acreditam que a gB é responsável pela interação inicial entre vírus-membrana celular.[009] The numerous results of scientific experiments on CMV have shown that the viral life cycle begins after a series of steps. The first is the binding of the virus and its entry into the cell: i) virus binding to the cell surface, ii) fusion of the envelope with the cell membrane releasing capsids within the cytoplasm, iii) association of the capsids with the cytoskeleton elements and translocation for the nucleus (BROCCHIERI et al. J Virol, 79 (12): 7570-7596, 2005). Viral envelope glycoproteins such as gB, gH and gM are responsible for the interaction of the host cell membrane virus. However, several researchers believe that gB is responsible for the initial interaction between virus-cell membrane.

[010] Uma vez que os capsídios estão dentro do citoplasma, os microtúbulos do citoplasma facilitam a translocação dos capsídios ao núcleo onde o DNA viral é liberado. Com o genoma viral liberado no núcleo, os genes estruturais IE são ativados. Esses genes controlam o início da infecção viral bem como codificam supressores de morte celular e os produtos de latência viral. As funções dos genes IE1 e IE2 têm sido estudadas intensivamente, contudo, IE1 tem divergido mais do que IE2. Os produtos gênicos de IE1 e IE2 são importantes como alvos para drogas porque eles controlam a replicação viral (STINSKI, M.F & MEIER, J. Betaherpesvirus Immediate Early viral gene regulation and function. In: Arvin, A.M, Mocarski, E.S, Moore P, Whitley, R, Yamanishi K, Campadelli-Fiume G editors. Human herpesviruses: Biology, Therapy and immune prophylaxis. Cambridge: Cambridge Press, 2006p, 2007).Since the capsids are within the cytoplasm, the cytoplasm microtubules facilitate the translocation of the capsids to the nucleus where viral DNA is released. With the viral genome released in the nucleus, the IE structural genes are activated. These genes control the onset of viral infection as well as code for cell death suppressants and viral latency products. The functions of the IE1 and IE2 genes have been intensively studied, however, IE1 has diverged more than IE2. The IE1 and IE2 gene products are important as drug targets because they control viral replication (STINSKI, MF & MEIER, J. Betaherpesvirus Immediate early viral gene regulation and function. In: Arvin, AM, Mocarski, ES, Moore P, Whitley, R., Yamanishi K., Campadelli-Fiume G. editors, Human herpes viruses: Biology, Therapy and immune prophylaxis, Cambridge: Cambridge Press, 2006p, 2007).

[011] Como dito anteriormente, além dos genes que codificam para proteínas estruturais, o genoma do HCMV contém aqueles que codificam para proteínas reguladoras. As ORFs com função de regulação são associadas à infecção e à replicação das fases de infecção inicial, intermediária e posterior.As said above, in addition to the genes that code for structural proteins, the HCMV genome contains those that code for regulatory proteins. ORFs with regulatory function are associated with infection and replication of the early, intermediate and later stages of infection.

[012] No entanto, o estudo do CMV muitas vezes é limitado porque esse vírus possui variações consideráveis entre os isolados. A propagação do vírus restrita aos laboratórios pode selecionar mutantes adaptados para o crescimento em condições de cultivo específicas. Como resultado disso, as cepas usadas em laboratório têm várias mutações, deleções e rearranjos genéticos. Stanton e colaboradores (2010), inativando mutações no gene RL13 descobriram que ele é necessário para a propagação viral em humanos, mas em condições de laboratório específicas, eles inibem a replicação viral em cultura de células de mamíferos (STANTON et al. J Clin Invest, 120(9):3191-3208, 2010). Os avanços científicos da pesquisa sobre a variação genética do CMV estão sendo melhorados no sentido de eliminar artefatos que possam surgir durante a propagação viral em condições de laboratório.[012] However, the study of CMV is often limited because this virus has considerable variations among isolates. Laboratory-restricted virus propagation may select mutants adapted for growth under specific culture conditions. As a result, laboratory strains have various genetic mutations, deletions and rearrangements. Stanton et al. (2010), inactivating mutations in the RL13 gene found that it is necessary for viral propagation in humans, but under specific laboratory conditions, they inhibit viral replication in mammalian cell culture (STANTON et al. J Clin Invest , 120 (9): 3191-3208, 2010). Scientific advances in CMV genetic variation research are being improved to eliminate artifacts that may arise during viral propagation under laboratory conditions.

[013] Entretanto, da mesma forma que ocorre em outros vírus, o genoma do CMV é altamente heterogêneo devido ao acúmulo de mutações. Um nível de conservação razoável (70 genes comuns entre betaherpesvirus) tem sido observado entre os genomas de vírus de roedores e humanos, embora, considerando-se a homologia de sequência de seus resíduos de aminoácidos, os genomas desses vírus codifiquem para um número de proteínas distintas evolutivamente. Embora isolados clínicos de CMV compartilhem 95% de seu DNA, as variações no nível de proteína são bastante diferentes para as ORFs UL73, UL74, UL144 e UL146, todas codificando para glicoproteínas (MOCARSKI-Jr et al. Cytomegaloviruses. Fields of Virology. 4th edition. 176p, 2006).[013] However, as with other viruses, the CMV genome is highly heterogeneous due to the accumulation of mutations. A reasonable level of conservation (70 common betaherpesvirus genes) has been observed between rodent and human virus genomes, although, considering the sequence homology of their amino acid residues, the genomes of these viruses encode a number of proteins. evolutionarily distinct. Although clinical CMV isolates share 95% of their DNA, protein level variations are quite different for UL73, UL74, UL144, and UL146 ORFs, all encoding glycoproteins (MOCARSKI-Jr et al. Cytomegaloviruses. Fields of Virology. 4th edition 176p, 2006).

[014] Um grande número de estudos tem dividido os genes CMV específicos de humanos em genótipos ou ciados e relacionando-os com achados clínicos da doença. Vários estudos sobre a classificação genotípica do HCMV têm encontrado bastante dificuldade devido ao alto grau de variabilidade no genoma do HCMV, um número infinito de possíveis combinações gênicas, ausência de ligações gênica e variabilidade intragênica. Por esses motivos, a classificação genotípica dos isolados de CMV se baseou nas regiões ou epítopos dentro dessas regiões que são mais conservados, como a glicoproteína N, glicoproteína B, glicoproteína H e as proteínas IE1 e IE2.[014] A large number of studies have divided human-specific CMV genes into genotypes or partners and related them to clinical findings of the disease. Several studies on HCMV genotypic classification have encountered considerable difficulty due to the high degree of variability in the HCMV genome, an infinite number of possible gene combinations, absence of gene linkages, and intragenic variability. For these reasons, the genotypic classification of CMV isolates was based on the regions or epitopes within these regions that are most conserved, such as glycoprotein N, glycoprotein B, glycoprotein H and the proteins IE1 and IE2.

[015] A detecção de anticorpos contra antígenos específicos do CMV é a maneira mais frequentemente empregada para identificar uma infecção presente ou passada, o que constitui uma determinação de grande importância clinica para doadores de sangue e de órgãos. Além disso, testes de soroconversão e para anticorpos IgM são comumente usados para identificar se a infecção em indivíduos normais (não imunocomprometidos) ocorreu recentemente. Normalmente, a infecção primária depende da soroconversão anticorpos IgG-CMV negativo a positivo ou da identificação de anticorpos IgM. A avidez de anticorpos IgG aumenta após a fase inicial da infecção e, portanto, a não identificação dessa classe de imunoglobulina caracteriza uma infecção recente primária (GRANGEOT-KEROS, L. et al. J Infec Dis, 175(4):944-946, 1977). Por essa razão, testes de detecção de IgM contra o CMV têm sido usados para o diagnóstico da infecção congênita por CMV, embora, em hospedeiros com sistema imune comprometido, a detecção do vírus deva ser realizada com maior acurácia.[015] Detection of antibodies to CMV-specific antigens is the most commonly used way to identify a present or past infection, which is a clinically important determination for blood and organ donors. In addition, seroconversion and IgM antibody tests are commonly used to identify whether infection in normal (non-immunocompromised) individuals has occurred recently. Primary infection usually depends on seroconversion of negative to positive IgG-CMV antibodies or identification of IgM antibodies. The avidity of IgG antibodies increases after the initial phase of infection and, therefore, failure to identify this immunoglobulin class characterizes a recent primary infection (GRANGEOT-KEROS, L. et al. J Infec Dis, 175 (4): 944-946 , 1977). For this reason, CMV IgM detection tests have been used to diagnose congenital CMV infection, although in hosts with compromised immune systems, virus detection should be performed more accurately.

[016] Estudos de cinética e especificidade de isotipos por anticorpos contra o CMV têm revelado padrões imunológicos que podem ser explorados para propósitos de vários testes de diagnóstico. Por exemplo, dentre os testes que se baseiam em imunoensaios enzimáticos (EIA) e que estão disponíveis no mercado para detecção de anti-CMV, destaca-se o ELISA, que apresenta vantagens como: rapidez no processamento, facilidade de automação e alta confiabilidade. A detecção da infecção do CMV por ELISA[016] Studies of kinetic and isotype specificity by CMV antibodies have revealed immunological patterns that can be explored for the purposes of various diagnostic tests. For example, among the enzymatic immunoassay (EIA) tests available on the market for anti-CMV detection, ELISA stands out, with advantages such as fast processing, ease of automation and high reliability. ELISA detection of CMV infection

pode ser realizada por meio da detecção de anticorpos contra proteínas estruturais, como gB e gH, ou não estruturais como pp28 (UL99), pp71 (UL82), pp65 (UL83), p52 (UL44) e ppl50 (UL32) (SCHOPPEL et al. J Infect Dis, 175:533-44, 1977), sendo que as novas gerações de ELISA utilizam proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos isolados para a detecção do anti-CMV. Testes ELISA de quarta-geração utilizam combinações de peptídeos recombinantes produzidos separadamente ou simultaneamente, visando a uma maior especificidade para os antígenos derivados das proteínas virais estruturais e não estruturais como citadas anteriormente.can be performed by detecting antibodies against structural proteins such as gB and gH or nonstructural proteins such as pp28 (UL99), pp71 (UL82), pp65 (UL83), p52 (UL44) and ppl50 (UL32) (SCHOPPEL et al J Infect Dis, 175: 533-44, 1977), and new generations of ELISA use recombinant proteins or isolated synthetic peptides for anti-CMV detection. Fourth generation ELISA assays use combinations of recombinant peptides produced separately or simultaneously for greater specificity for both structural and nonstructural viral protein antigens as previously cited.

[017] Além dos testes de rastreamento, os testes confirmatórios, principalmente por PCR, são usados para detecção de RNA do CMV. Apesar de ser um teste ser muito sensível, ele precisa de uma maior reprodutibilidade e protocolos bem definidos para cada subtipo viral (BRANDÃO, A.B.M. et ai. Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health, 9(3):161-168, 2001).[017] In addition to screening tests, confirmatory tests, mainly by PCR, are used for CMV RNA detection. Although a test is very sensitive, it needs greater reproducibility and well-defined protocols for each viral subtype (BRANDÃO, ABM et al. Rev Panam Salud Public / Pan Am Public Health, 9 (3): 161-168, 2001).

[018] Existem diversos pedidos de patentes que apresentam diferentes propostas para o uso de peptídeos solúveis, visando detectar e elicitar anticorpos anti-CMV. Quando se usa peptídeos solúveis os preparados brutos do vírus lisado, podem ocorrer reações cruzadas com doenças. Para contornar isso, muitas tecnologias optaram por desenvolver os epítopos por síntese química. A dificuldade em se desenvolver cada epítopo separadamente por síntese química é o custo final do processo, que é elevado.[018] There are several patent applications presenting different proposals for the use of soluble peptides to detect and elicit anti-CMV antibodies. When soluble peptides are used in crude lysate virus preparations, cross-reactions with disease may occur. To circumvent this, many technologies have chosen to develop epitopes by chemical synthesis. The difficulty in developing each epitope separately by chemical synthesis is the high cost of the process.

[019] Nesse sentido, algumas tecnologias têm produzido antígenos recombinantes com o objetivo de tornar o processo com baixo custo de produção. A questão dessas tecnologias é que se resolve o custo, mas a padronização do teste fica comprometida, uma vez que é difícil o operador colocar exatamente a mesma concentração de cada antígeno (que foi produzido separadamente) no teste.In this sense, some technologies have produced recombinant antigens in order to make the process with low production cost. The issue with these technologies is that the cost is solved, but test standardization is compromised as it is difficult for the operator to place exactly the same concentration of each antigen (which was produced separately) in the test.

[020] Dessa forma, alguns pesquisadores têm desenvolvido uma tecnologia de fusão de dois ou mais antígenos recombinantes para resolver tanto o problema do custo do processo quanto da padronização. Entretanto, diversas proteínas de fusão são muito grandes, i.e., pelo fato de serem fusionadas (sem os antígenos serem separados por um linker flexível) há um impedimento estérico em solução, diminuindo a interação entre as imunoglobulinas IgM ou IgG com os antígenos presentes na proteína de fusão, o que resulta em um baixo sinal no teste de ELISA.[020] Thus, some researchers have developed a fusion technology of two or more recombinant antigens to solve both the process cost and the standardization problem. However, many fusion proteins are very large, ie because they are fused (without antigens being separated by a flexible linker) there is a steric hindrance in solution, decreasing the interaction between IgM or IgG immunoglobulins with the antigens present in the protein. which results in a low signal in the ELISA test.

[021] A presente invenção descreve a construção de uma proteína recombinante multiepítopo, tendo como base epítopos dominantes de proteínas estruturais do Citomegalovírus. Esses epítopos são selecionados das proteínas fosforiladas ppl50 (614-643), pp38 (60-81), pp65 (401-407), pp28 (15-45), pp52 (266-293) e ppl50 (1011- 1048). A proteína resultante é utilizada para a composição de um kit de diagnóstico para Citomegalovírus.[021] The present invention describes the construction of a multiepitope recombinant protein based on dominant epitopes of Cytomegalovirus structural proteins. These epitopes are selected from the phosphorylated proteins ppl50 (614-643), pp38 (60-81), pp65 (401-407), pp28 (15-45), pp52 (266-293) and ppl50 (1011-1048). The resulting protein is used for the composition of a cytomegalovirus diagnostic kit.

[022] A busca de anterioridade não retornou nenhum resultado que previsse o desenvolvimento e o uso desses construtos exatamente como é apresentado na invenção, apesar de já haver diversas tecnologias relacionadas à produção de proteínas multiepítopo para diagnóstico ou tratamento de CMV, as quais constam como documentos conflitantes ao escopo de proteção da tecnologia.[022] The search for precedence returned no results that predicted the development and use of these constructs exactly as presented in the invention, although there are already several technologies related to the production of multiepitope proteins for diagnosis or treatment of CMV, which appear as documents conflicting with the scope of technology protection.

[023] Como tal, o pedido de patente US 2003/0120060 se refere à produção de plasmídeo com um ou mais antígenos de CMV derivados de um grupo que inclui, entre outros antígenos, pp65 (UL83 - 297-510) e ppl50 (UL32), ocorrendo uma coincidência dos aminoácidos (AA) dos antígenos de membrana da proteína. A patente visa proteger a molécula de DNA que codifica o plasmídeo em questão, assim como o próprio plasmídeo e as composições imunogênicas que o incluam.As such, US patent application 2003/0120060 relates to the production of plasmid with one or more CMV antigens derived from a group that includes, among other antigens, pp65 (UL83 - 297-510) and ppl50 (UL32 ), a coincidence of amino acids (AA) of the protein membrane antigens. The patent aims to protect the DNA molecule encoding the plasmid in question, as well as the plasmid itself and the immunogenic compositions that include it.

[024] 0 pedido de patente EP 1 304 574 trata de um método de diagnóstico que envolve oito fragmentos de cinco antígenos sintéticos, entre eles o codificado por ppl50 (1011-1048), que é um dos utilizados na presente tecnologia (SEQ ID NO: 12), o ppl50 (594-633), que possui 20 aminoácidos em comum com um dos utilizados na presente tecnologia (SEQ ID NO: 2, ppl50 (614-643)) e o pp28 (7-31) que possui 17 aminoácidos em comum com o pp28 (15-45) da atual tecnologia (SEQ ID NO: 8).EP 1 304 574 deals with a diagnostic method involving eight fragments of five synthetic antigens, among them that encoded by ppl50 (1011-1048), which is one of those used in the present technology (SEQ ID NO. : 12), ppl50 (594-633), which has 20 amino acids in common with one of those used in the present technology (SEQ ID NO: 2, ppl50 (614-643)) and pp28 (7-31), which has 17 amino acids in common with the present technology pp28 (15-45) (SEQ ID NO: 8).

[025] Neste pedido falta padronização do método de diagnóstico quando se usa vários determinantes antigênicos separados. O uso de apenas um antigeno recombinante resolve o problema da padronização relativo a concentração do epitopo no teste. Entretanto, apresenta especificidade comprometida, uma vez que possui apenas um antigeno para o teste.[025] This application lacks standardization of the diagnostic method when using several separate antigenic determinants. The use of only one recombinant antigen solves the problem of epitope concentration standardization in the test. However, it has compromised specificity, since it has only one antigen for the test.

[026] O pedido de patente US 2012/093848 reivindica uma composição imunogênica contendo peptídeos derivados do CMV, e entre eles o pp65 (1-561), o que abrange 7 AA da pp 65 (401-407 - SEQ ID NO: 6) utilizada na presente tecnologia. Da mesma forma, o pedido de patente US 2014/36440, sintetiza anticorpos anti-CMV, capazes de ligar ao MHC especificamente devido à presença dos peptídeos pp64 e pp65 (13-561). Esta também abrange a sequência de 7 aminoácidos da atual invenção, citada anteriormente.[026] US Patent Application 2012/093848 claims an immunogenic composition containing CMV-derived peptides, including pp65 (1-561), which covers 7 AA from pp 65 (401-407 - SEQ ID NO: 6 ) used in the present technology. Similarly, US Patent Application 2014/36440 synthesizes anti-CMV antibodies capable of binding to MHC specifically due to the presence of pp64 and pp65 (13-561) peptides. It also encompasses the 7 amino acid sequence of the present invention, cited above.

[027] O pedido de patente WO 2008/095677 se refere à produção de antígenos quiméricos recombinantes, com a fusão de diferentes fragmentos antigênicos de HCMV, incluindo a região ppl50 (UL82 - 595-614 e 1006-1048), ocorrendo uma coincidência dos aminoácidos dos antígenos de membrana da proteína.WO 2008/095677 relates to the production of recombinant chimeric antigens, with the fusion of different HCMV antigenic fragments, including the ppl50 region (UL82 - 595-614 and 1006-1048), with a coincidence of amino acids of protein membrane antigens.

[028] A tecnologia CN 101220085 consiste em uma proteína recombinante na qual foram fusionados os antígenos gp52 (261-380), ppl50 (587-640), pp65 (361-425), gB (20-243) e pp28 (95-128), sendo ppl50, pp65 e pp28 em comum com os da patente aqui reivindicada. Destes, apenas o pp28 (15-45) não possui aminoácidos em comum com os da presente tecnologia. A fosfoproteina ppl50 (587-640) possui 27 aminoácidos em comum, pp65 (361-425) coincide nos sete aminoácidos com o trecho aqui reivindicado (SEQ ID NO: 6).CN 101220085 technology consists of a recombinant protein in which the antigens gp52 (261-380), ppl50 (587-640), pp65 (361-425), gB (20-243) and pp28 (95- 128), ppl50, pp65 and pp28 being in common with those of the patent claimed herein. Of these, only pp28 (15-45) has no amino acids in common with those of the present technology. Phosphoprotein ppl50 (587-640) has 27 amino acids in common, pp65 (361-425) coincides with the seven amino acids as claimed herein (SEQ ID NO: 6).

[029] O pedido de patente WO 96/01321 envolve a produção de três proteínas de fusão, uma multiepítopo e duas mono-epítopo. A multiepítopo é composta de três regiões determinadas: a primeira região, definida pela fosfoproteina pp52 (202-434), abrange os 28 aminoácidos descritos da pp52 (SEQ ID NO: 10) deste pedido de patente; a segunda e a terceira regiões são descritas pela fosfoproteina ppl50, sendo que a segunda pelos aminoácidos das posições ppl50 (1006-1048), com 38 deles em comum com a SEQ ID NO:12, e a terceira pelos da ppl50 (595-614), com apenas um aminoácido em comum. As duas proteínas de fusão mono-epítopo são sintetizadas a partir dos trechos pp65 (297-373) e pp38 (117-373), respectivamente, ambos sem nenhum aminoácido em comum com os das proteínas sintetizadas na presente tecnologia.WO 96/01321 involves the production of three fusion proteins, one multiepitope and two monoepitope. The multiepitope is made up of three determined regions: the first region, defined by the phosphoprotein pp52 (202-434), encompasses the 28 amino acids described in pp52 (SEQ ID NO: 10) of this patent application; the second and third regions are described by ppl50 phosphoprotein, the second by amino acids of positions ppl50 (1006-1048), with 38 of them in common with SEQ ID NO: 12, and the third by ppl50 (595-614) ), with only one amino acid in common. The two mono-epitope fusion proteins are synthesized from sections pp65 (297-373) and pp38 (117-373), respectively, both without any amino acids in common with those of the proteins synthesized in the present technology.

[030] A tecnologia EP 088213281 se refere à produção de um "antígeno combinado", formado por trechos de UL32 (ppl50) , UL80 (pp38) e UL83 (pp65), porém não há coincidência de nucleotideos sintetizados com os do presente pedido de patente.EP 088213281 refers to the production of a "combined antigen" consisting of sections of UL32 (ppl50), UL80 (pp38) and UL83 (pp65), but there is no coincidence of synthesized nucleotides with those of the present application. patent.

[031] O artigo "The development of Chinese specific human cytomegalovirus polyepitope recombinant vaccine" (Zhao et al.Antiviral Res, 93(2):260-269, 2012) descreve a produção de uma vacina multiepítopo recombinante em que inclui diferentes antigenos, selecionados por serem encontrados na população chinesa. Entre os antigenos utilizados na vacina em questão, pp28, pp65 e pplSO são em comum com os da presente tecnologia, porém apenas o último apresenta aminoácidos em comum. Os trechos que ocorrem coincidência nas posições dos aminoácidos são ppl50 641-649 e 624-632, este com três AA em comum e aquele inteiramente compreendido no trecho da ppl50 (614-643).[031] The article "Development of Chinese specific human cytomegalovirus recombinant polyepitope vaccine" (Zhao et al.Antiviral Res, 93 (2): 260-269, 2012) describes the production of a recombinant multiepitope vaccine which includes different antigens, selected because they are found in the Chinese population. Among the antigens used in the vaccine in question, pp28, pp65 and pplSO are in common with those of the present technology, but only the latter has common amino acids. The coincident portions at amino acid positions are ppl50 641-649 and 624-632, this one with three AAs in common and the one fully understood in the stretch of ppl50 (614-643).

[032] Como observado, foram encontradas diversas anterioridades que realizaram a síntese das mesmas fosfoproteínas utilizadas na atual tecnologia. Assim, a ação imunogênica destas fosfoproteínas já está bem consolidada no estado da arte. A combinação aqui proposta, por sua vez, é inédita.[032] As noted, several anteriorities were found that performed the synthesis of the same phosphoproteins used in current technology. Thus, the immunogenic action of these phosphoproteins is already well established in the state of the art. The combination proposed here, in turn, is unprecedented.

[033] Aquelas tecnologias que apresentam o uso de vários antigenos recombinantes resolvem o problema da especificidade, contudo não resolvem a questão da concentração de cada epítopo recombinante no teste.Those technologies that present the use of various recombinant antigens solve the specificity problem, however do not solve the question of the concentration of each recombinant epitope in the test.

[034] Para tentar resolver estas dificuldades, algumas tecnologias relativas às patentes WO 96/01321, WO 2008/095677, CN 101220085 investiram no desenvolvimento de proteínas de fusão contendo três ou mais determinantes antigênicos fusionados e muitas vezes formadas apenas por um único tipo de proteína repetida em sequência.To address these difficulties, some patent-related technologies WO 96/01321, WO 2008/095677, CN 101220085 have invested in the development of fusion proteins containing three or more fused antigenic determinants and often formed by only one type of fusion. protein repeated in sequence.

[035] Estas tecnologias têm resolvido a complicação da concentração dos epítopos no teste, entretanto, muitas delas reconhecem anticorpos apenas durante a fase aguda ou crônica da doença, nunca as duas. A presente invenção possui epítopos que certamente poderíam ser reconhecidos por anticorpos em diferentes fases da doença.[035] These technologies have solved the complication of epitope concentration in the test, however, many of them recognize antibodies only during the acute or chronic phase of the disease, never both. The present invention has epitopes that could certainly be recognized by antibodies at different stages of the disease.

[036] Outro ponto que pode ser destacado é que muitas proteínas de fusão usadas em kits de diagnósticos são muito grandes, apresentando em solução problemas de conformação da proteína, causando impedimento estérico e diminuindo a avidez entre as imunoglobulinas IgM e IgG e os antígenos da proteína de fusão.Another noteworthy point is that many fusion proteins used in diagnostic kits are very large, presenting protein conformation problems in solution, causing steric hindrance and decreasing avidity between IgM and IgG immunoglobulins and fusion protein.

[037] Para contornar todos esses obstáculos, a presente invenção desenvolveu uma nova proteína multiepítopo recombinante, na qual cada epítopo foi escolhido de forma racional por seu grande potencial como proteína imunogênica, de forma a aumentar a sensibilidade do teste. Além disso, a produção desses epítopos na forma de uma única cadeia multiepítopo garante a padronização da concentração de proteína no teste.To overcome all these obstacles, the present invention has developed a novel recombinant multiepitope protein, in which each epitope was rationally chosen for its great potential as an immunogenic protein in order to increase the sensitivity of the test. In addition, the production of these epitopes in the form of a single multiepitope chain ensures the standardization of protein concentration in the test.

[038] Também com o objetivo de aumentar mais ainda a sensibilidade do kit, foram escolhidos epítopos imunogênicos. E por último, visando fazer com que essa proteína tenha um potencial de detectar tanto a fase aguda como crônica da doença, alguns epítopos escolhidos são úteis em ambas as fases da doença, podendo ser usada como diagnóstico.[038] Also in order to further increase the sensitivity of the kit, immunogenic epitopes were chosen. And lastly, in order to make this protein have the potential to detect both acute and chronic phase of the disease, some chosen epitopes are useful in both phases of the disease and can be used as a diagnosis.

[039] Ainda, visando diminuir o impedimento estérico que essa proteína podería ter em solução, foi proposto um conector de Glicina e Serina entre cada um dos epítopos. Isso deixa a proteína de forma mais flexível, o que expõe melhor os trechos imunogênicos dos epítopos e garante melhor resposta na reação antigênica.Also, in order to reduce the steric hindrance that this protein could have in solution, a Glycine and Serine connector was proposed between each epitope. This makes the protein more flexible, which better exposes the immunogenic stretches of epitopes and ensures better response in the antigenic reaction.

[040] O resultado de todo esse desenho racional foi o desenvolvimento de uma proteína multiepítopo denominada rMECMV, que é capaz de apresentar uma boa sensibilidade (sinal de ELISA através da medida da absorbância a 405 nm) , diagnosticando de forma precisa indivíduos positivos e negativos para Citomegalovírus.[040] The result of this whole rational design was the development of a multiepitope protein called rMECMV, which is capable of good sensitivity (ELISA signal by measuring absorbance at 405 nm), accurately diagnosing positive and negative individuals. for cytomegalovirus.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[041] A presente invenção refere-se a uma proteína multiepítopo recombinante, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas a Citomegalovírus. A proteína multiepítopo sintética é construída a partir de regiões conservadas e imunogênicas entre espécies de Citomegalovírus, contendo dois ou mais epítopos de proteínas do vírus, contendo uma seleção preferencial de até seis epítopos conservados. Seu processo de obtenção está baseado em procedimentos de engenharia genética já estabelecidos pela técnica, utilizando-se um gene especificamente produzido para a expressão da proteína de interesse.[041] The present invention relates to a recombinant multiepitope protein, its production process and its applications related to cytomegalovirus. Synthetic multiepitope protein is constructed from conserved and immunogenic regions between cytomegalovirus species, containing two or more virus protein epitopes, containing a preferred selection of up to six conserved epitopes. Its production process is based on genetic engineering procedures already established by the technique, using a gene specifically produced for the expression of the protein of interest.

[042] A escolha dos epítopos na produção da proteína de interesse envolve as estruturas representadas pelas sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 As quais codificadas, por exemplo, pelas sequências de nucleotídeos representadas pelas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 respectivamente.The choice of epitopes in the production of the protein of interest involves the structures represented by the amino acid sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12 Which are encoded, for example, by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11 respectively.

[043] Essas sequências são unidas por peptídeos conectores flexíveis preferencialmente constituídos de 2 (dois) a 10 (dez) resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente os de glicina e serina, sobretudo representado pela sequência SEQ ID NO: 13.[043] These sequences are joined by flexible connector peptides preferably consisting of 2 (two) to 10 (ten) amino acid residues, more preferably those of glycine and serine, mainly represented by the sequence SEQ ID NO: 13.

[044] A proteína multiepítopo preferencial é a representada pela SEQ ID NO: 14, que é codificada, por exemplo, pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 15, contendo os 6 (seis) epítopos mencionados, também separados por linkers ou conectores mencionados anteriormente, exceto as terminações formadas por sítios de ligação adequadamente escolhidos para facilitar o reconhecimento de enzimas de restrição, facilitando a retirada da sequência codificadora livre, por exemplo, para ser inserida em diferentes vetores de expressão, se necessário.The preferred multiepitope protein is represented by SEQ ID NO: 14, which is encoded, for example, by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15, containing the 6 (six) mentioned epitopes, also separated by mentioned linkers or connectors. previously, except for the termini formed by binding sites suitably chosen to facilitate recognition of restriction enzymes, facilitating the removal of the free coding sequence, for example to be inserted into different expression vectors, if necessary.

[045] A clonagem dessa estrutura gênica pode ser feita em vetores de expressão heteróloga em microrganismos. É facilmente obtido em bactérias, por exemplo as pertencentes aos gêneros Escherichia e Bacillus. A proteína multiepítopo da presente invenção é utilizada como insumo na produção de diferentes produtos, tais como Kits de diagnóstico de Citomegalovírus, composições imunogênicas, vacinas, medicamentos ou biofármacos para prevenir e tratar a citomegalovirose, e ainda aplicável a métodos de diagnóstico e na produção de anticorpos monoclonais.[045] The cloning of this gene structure can be done in heterologous expression vectors in microorganisms. It is easily obtained from bacteria such as Escherichia and Bacillus genera. The multiepitope protein of the present invention is used as an input in the production of different products such as cytomegalovirus diagnostic kits, immunogenic compositions, vaccines, drugs or biopharmaceuticals to prevent and treat cytomegalovirus, and further applicable to diagnostic methods and production of cytomegalovirus. monoclonal antibodies.

DESCRIÇÃO DAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES

[046] A invenção poderá ser mais compreendida com base nas figuras de 1 a 6, cuja descrição segue abaixo: [047] A Figura 1 mostra um esguema ilustrativo da sequência de nucleotídeos que codifica MECMV que codifica a proteína multiepítopo rMECMV exemplificada, contendo os epítopos selecionados. As sequências destacadas por um retângulo representam os sítios de restrição, por exemplo, da enzima Nde I na região 5' e o sítio de restrição da enzima Xhol na região 3'.[046] The invention may be further understood from Figures 1 to 6, the description of which follows below: [047] Figure 1 shows an illustrative drawing of the MECMV encoding nucleotide sequence encoding the exemplified rMECMV multiepitope protein containing the selected epitopes. Sequences highlighted by a rectangle represent the restriction sites, for example, of the enzyme Nde I in the 5 'region and the restriction site of the enzyme XhoI in the 3' region.

[048] A Figura 2 mostra um esquema ilustrativo da sequência primária da proteína multiepítopo rMECMV (exemplificado pela SEQ ID NO: 14), onde os linkers ou conectores flexíveis estão destacados por um retângulo e os epítopos estão sublinhados.[048] Figure 2 shows an illustrative scheme of the primary sequence of the rMECMV multiepitope protein (exemplified by SEQ ID NO: 14), where flexible linkers or connectors are highlighted by a rectangle and epitopes are underlined.

[049] A Figura 3 mostra a análise da cinética de indução em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12 %. Material coletado após a indução de expressão da rMECMV (representada por SEQ ID NO: 14). Legenda: 1) Marcador de massa molecular; 2) Tempo Oh de indução; 3) indução por 30 minutos. 4) indução por lh30 min; 5) indução por 2h30min.[049] Figure 3 shows analysis of 12% SDS-PAGE polyacrylamide gel induction kinetics. Material collected after rMECMV expression induction (represented by SEQ ID NO: 14). Caption: 1) Molecular mass marker; 2) Induction time Oh; 3) induction for 30 minutes. 4) induction for 1h30 min; 5) induction for 2h30min.

[050] A Figura 4 mostra a análise da indução por Western-Blot. Legenda: M) Marcador de massa molecular; 1) Indução por 2 h e 30 min da rMECMV (exemplificado pela SEQ ID NO: 14); e 2) Detecção de proteína por Western-blot em membrana de nitrocelulose.Figure 4 shows Western Blot induction analysis. Caption: M) Molecular mass marker; 1) Induction for 2 h and 30 min of rMECMV (exemplified by SEQ ID NO: 14); and 2) Western blot protein detection on nitrocellulose membrane.

[051] A Figura 5 mostra a analise do gel SDS—PAGE das frações da coluna de afinidade Ni-NTA obtidas no processo de purificação. Legenda: M: Marcador de massa molecular; 1: flowthrough·, 2, 3 e 4: etapas de lavagem da resina com o tampão de lavagem; 5, 6 e 7: frações da eluição da proteína rMECMV (exemplificado pela SEQ ID NO: 14) [052] A Figura 6 mostra o teste de imunoensaioenzimático (ELISA) com amostras positivas e negativas para o Citomegalovírus (CMV) . Legenda: PBS: não há proteína adsorvida na placa, apenas o Tampão fosfato salina (PBS) ; PBS + 35 ng: há 35 ng de proteína adsorvida em tampão PBS; SN + 35 ng: há 35 ng de proteínas com soro negativo para CMV; SP 1 + 35 ng, SP 2+35 ng, SP 3 + 35 ng, SP 4 + 35 ng, SP 5 + 35 ng, SP 6 + 35 ng: nessas amostras há 35 ng de proteína adsorvida com soros positivos para CMV.[051] Figure 5 shows SDS-PAGE gel analysis of Ni-NTA affinity column fractions obtained in the purification process. Caption: M: Molecular mass marker; 1: flowthrough ·, 2, 3 and 4: steps of washing the resin with the wash buffer; 5, 6 and 7: rMECMV protein elution fractions (exemplified by SEQ ID NO: 14) [052] Figure 6 shows the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with positive and negative samples for Cytomegalovirus (CMV). Caption: PBS: There is no protein adsorbed on the plate, only Saline Phosphate Buffer (PBS); PBS + 35 ng: There is 35 ng of protein adsorbed in PBS buffer; SN + 35 ng: There are 35 ng of CMV negative serum proteins; SP 1 + 35 ng, SP 2 + 35 ng, SP 3 + 35 ng, SP 4 + 35 ng, SP 5 + 35 ng, SP 6 + 35 ng: In these samples there is 35 ng of protein adsorbed with CMV positive sera.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃODESCRIPTION OF THE INVENTION

[053] A presente invenção refere-se a uma proteína multiepítopo construída a partir de sequência do Citomegalovírus (CMV), correspondendo a epítopos dominantes de proteínas estruturais do CMV mais representativo do Brasil e do mundo, mais especificamente as regiões fosforiladas ppl50 (614-643), pp38 (60-81), pp65 (401-407), pp28 (15-45), pp52 (266-293) e ppl50 (1011-1048) do genoma do CMV.[053] The present invention relates to a multiepitope protein constructed from the Cytomegalovirus (CMV) sequence, corresponding to dominant epitopes of CMV structural proteins most representative of Brazil and the world, more specifically the ppl50 (614-6) phosphorylated regions. 643), pp38 (60-81), pp65 (401-407), pp28 (15-45), pp52 (266-293) and ppl50 (1011-1048) of the CMV genome.

[054] O termo "proteína multiepítopo" se refere a uma proteína que apresenta dois ou mais epítopos. Entende-se por "epítopo" ou determinante antigênico a representação de uma pequena configuração estrutural de uma molécula do antígeno capaz de se combinar com um local estereoespecífico complementar de uma imunoglobulina (lmol do determinante/lmol receptor), ou de se combinar com um receptor funcional análogo na superfície de um linfócito.The term "multiepitope protein" refers to a protein that has two or more epitopes. An "epitope" or antigenic determinant is meant a representation of a small structural configuration of an antigen molecule capable of combining with a complementary stereoispecific site of an immunoglobulin (1mol of the determinant / 1mol receptor) or of combining with a receptor. analogous function on the surface of a lymphocyte.

[055] Os epítopos selecionados para a construção da proteína multiepítopo de interesse (contendo dois ou mais epítopos) são apresentados na Tabela 1. Estes epítopos derivam de regiões virais mais prevalentes e imunodominantes, sendo responsáveis por elicitarem uma resposta imune de amplo espectro em indivíduos portadores de Rubéola. Na Tabela 1, encontra-se a representação usual dos epítopos selecionados da proteína viral, juntamente com o código de sequência descrito na Listagem de Sequência em anexo, referentes às sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, as quais são codificadas, por exemplo, pelas sequências de nucleotídeos representadas pelas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11, respectivamente.[055] The epitopes selected for the construction of the multiepitope protein of interest (containing two or more epitopes) are shown in Table 1. These epitopes are derived from more prevalent and immunodominant viral regions and are responsible for eliciting a broad spectrum immune response in individuals. Rubella carriers. Table 1 shows the usual representation of selected viral protein epitopes, along with the sequence code described in the attached Sequence Listing, for amino acid sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12, which are encoded, for example, by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11, respectively.

[056] Os epítopos presentes na cadeia da proteína de interesse são unidos por um peptídeo conector de 2 (dois) a 10 (dez) resíduos de aminoácidos, sendo tal peptídeo, preferencialmente um conector flexível de conhecimento pela técnica, como por exemplo, os conectores do tipo GSGSG e GGGG. Este espaçamento é importante para que os anticorpos consigam reconhecer o antígeno e para que vários anticorpos possam reconhecer partes diferentes da molécula ao mesmo tempo. Preferencialmente, são utilizados os conectores de resíduos de aminoácidos glicina e serina para permitir a distenção da proteína deixando-a linear (Dipti, C. A. et al. Protein Expres Purif 47: 319-328, 2006).[056] The epitopes present on the protein chain of interest are joined by a 2 (two) to 10 (ten) amino acid residue connector peptide, such peptide being preferably a flexible connector known in the art, such as the GSGSG and GGGG type connectors. This spacing is important for antibodies to be able to recognize the antigen and for multiple antibodies to recognize different parts of the molecule at the same time. Preferably, the glycine and serine amino acid residue connectors are used to allow protein distension to be linear (Dipti, C.A. et al. Protein Expres Purif 47: 319-328, 2006).

[057] Para a proteína multiepítopo contendo os seis epítopos exemplificada pela SEQ ID NO: 14 e o ácido nucléico precursor (SEQ ID NO: 15), os epítopos selecionados (Tabela 1) foram espaçados por um peptídeo conector flexível de 5 (cinco) resíduos de aminoácidos de glicina-serina, preferencialmente a representada pela SEQ ID NO: 13. De forma geral, cada um dos epítopos encontra-se repetidos e separados com linkers ou conectores flexíveis, preferencialmente de glicina e serina. Isto torna essas regiões mais expostas possível no contato com anticorpos presentes em amostras fisiológicas, principalmente em amostras sorológicas de pacientes infectados.For the multiepitope protein containing the six epitopes exemplified by SEQ ID NO: 14 and the precursor nucleic acid (SEQ ID NO: 15), the selected epitopes (Table 1) were spaced by a 5 (5) flexible connector peptide glycine-serine amino acid residues, preferably represented by SEQ ID NO: 13. In general, each epitope is repeated and separated with flexible linkers or connectors, preferably glycine and serine. This makes these regions as exposed as possible to contact with antibodies present in physiological samples, especially serological samples from infected patients.

[058] Esta característica estrutural da proteína multiepítopo propicia sua aplicação em diferentes tipos de kits de diagnósticos, ou ainda, para diferentes metodologias de detecção de anticorpos de humanos estimulados pelo Citomegalovírus. O uso de conectores também é feito para facilitar a manipulação e caracterização da proteína de interesse, facilitando sua produção em escala industrial e sua aplicação pretendida.[058] This structural feature of the multiepitope protein enables its application in different types of diagnostic kits, or even for different methodologies of detection of cytomegalovirus-stimulated human antibodies. The use of connectors is also made to facilitate the manipulation and characterization of the protein of interest, facilitating its industrial scale production and its intended application.

Tabela 1 Epitopo Código de Código de (No. Aminoácidos do sequência* sequência** epitopo) ppl50 (614-643) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2) pp38 (60-81) (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 4) ^pp65 (401-470) (SEQ ID NO: ~5) (SEQ ID NO: 6) pp28 (15-45) (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8) pp52 (266-293) (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10) pp150 71011-1048) (SEQ ID NO: TI) (SEQ TÕ NO: 12)~ *: Referente à sequência de nucleotídeos exemplificada; **: Referente à sequência de aminoácidos.Table 1 Epitope Code from (Sequence No. Amino Acids * Sequence ** Epitope) ppl50 (614-643) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2) pp38 (60-81) (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 4) ^ pp65 (401-470) (SEQ ID NO: ~ 5) (SEQ ID NO: 6) pp28 (15-45) (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8 ) pp52 (266-293) (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10) pp150 71011-1048) (SEQ ID NO: TI) (SEQ T NO NO: 12) ~ *: Referring to the exemplified nucleotide sequence; **: Refers to amino acid sequence.

[059] Em uma de suas modalidades, a presente invenção refere-se à obtenção de um ácido nucléico recombinante (gene sintético) que irá ser clonado em vetores de expressão heteróloga em microrganismos para a produção da proteína multiepitopo. Tal ácido nucléico recombinante compreende dois ou mais epítopos selecionados entre as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 11, sendo unidos por peptídeos conectores flexíveis mencionados anteriormente. O caso exemplificado foi dado pela sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14. Qualquer outra sequência nucleotídica que permita se chegar à sequência proteica equivalente à apresentada na presente invenção, também faz parte do escopo desta tecnologia.[059] In one of its embodiments, the present invention relates to obtaining a recombinant nucleic acid (synthetic gene) which will be cloned into heterologous expression vectors in microorganisms for the production of multiepitope protein. Such recombinant nucleic acid comprises two or more epitopes selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO. : 11, being joined by the flexible connector peptides mentioned above. The exemplified case was given by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. Any other nucleotide sequence which enables the protein sequence equivalent to that presented in the present invention to be reached is also within the scope of this technology.

[060] Outra modalidade da presente invenção está relacionada ao processo de obtenção de proteína multiepitopo. A síntese dessa proteína envolve a utilização dos epítopos selecionados a partir de proteínas do Citomegalovírus (Tabela 1), na construção de um ácido nucléico recombinante que irá expressar a proteína multiepitopo através de procedimentos de expressão heteróloga em microrganismos. Estes ácidos nucléicos são especialmente engenheirados biotecnologicamente, contendo sítios de restrição para enzimas adequadas para a sua delimitação.Another embodiment of the present invention relates to the process of obtaining multiepitope protein. The synthesis of this protein involves the use of epitopes selected from cytomegalovirus proteins (Table 1) in the construction of a recombinant nucleic acid that will express the multiepitope protein through heterologous expression procedures in microorganisms. These nucleic acids are especially biotechnologically engineered, containing enzyme restriction sites suitable for their delineation.

[061] Nos exemplos, os sítios de restrição da enzima Ndel na região 5' e o sítio de restrição da enzima Xhol na região 3', apresentado para a sequência de nucleotídeos ilustrada na Figura 1 obtida utilizando o vetor de expressão comercial pET21a (SEQ ID NO: 16), já contendo uma cauda de histidina, para facilitar a purificação da proteína de interesse por técnica de cromatografia utilizando níquel. Estas condições foram utilizadas para a expressão da proteína multiepítopo com sequência de aminoácidos ilustrada na Figura 2 (exemplificada por SEQ ID NO: 14) em bactéria Escherichia coli, principalmente de linhagens BL12. A escolha desse microrganismo foi devido à sua praticidade, facilidade de manipulação laboratorial, baixo custo e conhecimento acerca do bom rendimento. A linhagem BL21 possui vetores de expressão muito conhecidos e utilizados, como o pET21a (SEQ ID NO: 16), que facilitam a expressão heteróloga.In the examples, the Ndel enzyme restriction sites in the 5 'region and the Xhol enzyme restriction site in the 3' region shown for the nucleotide sequence shown in Figure 1 obtained using the commercial expression vector pET21a (SEQ ID NO: 16), already containing a histidine tail, to facilitate purification of the protein of interest by chromatography using nickel. These conditions were used for the expression of the amino acid sequence multiepitope protein illustrated in Figure 2 (exemplified by SEQ ID NO: 14) in Escherichia coli bacteria, primarily from BL12 strains. The choice of this microorganism was due to its practicality, ease of laboratory manipulation, low cost and knowledge about good yield. The BL21 strain has well-known and widely used expression vectors, such as pET21a (SEQ ID NO: 16), which facilitate heterologous expression.

[062] Seu processo de obtenção está baseado na clonagem e expressão heteróloga em microrganismos, utilizando um gene especialmente elaborado, contendo epítopos ou regiões virais conservadas entre os diferentes genótipos de CMV circulantes no Brasil e no Mundo. Esta proteína é utilizada como ingrediente de uma composição imunogênica útil na produção de vacinas, medicamentos ou biofármacos para prevenir e tratar essa doença.[062] Its production process is based on cloning and heterologous expression in microorganisms using a specially crafted gene containing conserved epitopes or viral regions between the different CMV genotypes circulating in Brazil and worldwide. This protein is used as an ingredient of an immunogenic composition useful in the production of vaccines, drugs or biopharmaceuticals to prevent and treat this disease.

[063] Outros organismos que expressam proteínas heterólogas são utilizados na produção da proteína multiepítopo recombinante da presente invenção. Leveduras são muito utilizadas devido ao bom rendimento e certa facilidade de manipulação. Entretanto, para usar outro organismo é necessário digerir o vetor que contém o gene de interesse com as enzimas iVdel e Xhol. Desta forma o inserto estaria livre para ser inserido em outro vetor de expressão (que deve ser especifico para o organismo a ser utilizado). As características desejáveis para a escolha do microrganismo são justamente a facilidade de manipulação, bom rendimento para produção em larga escala e baixo custo para viabilizar a comercialização.Other organisms expressing heterologous proteins are used in the production of the recombinant multiepitope protein of the present invention. Yeasts are widely used due to good yield and some ease of handling. However, to use another organism it is necessary to digest the vector containing the gene of interest with the enzymes iVdel and Xhol. This way the insert would be free to be inserted into another expression vector (which must be specific to the organism to be used). The desirable characteristics for choosing the microorganism are precisely the ease of handling, good yield for large scale production and low cost to make commercialization viable.

[064] De forma geral, o processo de obtenção de proteína multiepítopo, da presente invenção compreende as etapas: a. Sub-clonagem do ácido nucléico recombinante de interesse em um vetor de expressão em microrganismos; b. Indução da expressão da proteína no vetor de expressão; c. Purificação da proteína multiepítopo.Generally, the process of obtaining multiepitope protein of the present invention comprises the steps: a. Subcloning of recombinant nucleic acid of interest into a microorganism expression vector; B. Induction of protein expression in the expression vector; ç. Purification of multiepitope protein.

[065] Na etapa a, o ácido nucléico recombinante de interesse compreende multiepítopos de citomegalovírus unidos por peptídeos conectores capazes de resultar na proteína multiepítopo da presente invenção. Estes epítopos e os conectores (preferencialmente conectores de 2 (dois) a 10 (dez) resíduos de aminoácidos e tidos como conectores flexíveis) são conforme descritos anteriormente e utilizados na construção desse gene sintético que codifica a proteína multiepítopo recombinante. Os sítios de restrição para enzimas e partes estruturais que facilitam a etapa de purificação da proteína de interesse dependem do tipo de microrganismo utilizado para a expressão, do vetor utilizado e da técnica de purificação disponível.In step a, the recombinant nucleic acid of interest comprises cytomegalovirus multiepitopes joined by connector peptides capable of resulting in the multiepitope protein of the present invention. These epitopes and connectors (preferably 2 (two) to 10 (ten) amino acid residues and taken as flexible connectors) are as described above and used in the construction of such a synthetic gene encoding the recombinant multiepitope protein. The restriction sites for enzymes and structural parts that facilitate the protein purification step of interest depend on the type of microorganism used for expression, the vector used and the available purification technique.

[066] Os microrganismos preferenciais são bactérias. Nos exemplos, a clonagem se dá pela incorporação de cauda de histidina proveniente do vetor de expressão heteróloga utilizado, no caso, pET21a (SEQ ID NO: 16), para propiciar a purificação da proteína compreendo técnicas de cromatografia utilizando níquel. As sequências de cada um dos epítopos selecionados também foram otimizadas para expressão na bactéria Escherichia coli, visando um aumento na expressão da proteína multiepítopo de interesse, principalmente a de linhagem BL21. Para este caso, o vetor pET21a foi bastante viável, conforme descritos nos Exemplos 1 a 4.[066] Preferred microorganisms are bacteria. In the examples, cloning is by incorporation of histidine tail from the heterologous expression vector used, in this case, pET21a (SEQ ID NO: 16), to provide protein purification comprising nickel chromatography techniques. The sequences of each of the selected epitopes were also optimized for expression in the bacterium Escherichia coli, aiming at an increase in the expression of the multiepitope protein of interest, especially the BL21 strain. For this case, the vector pET21a was quite viable, as described in Examples 1 to 4.

[067] Na etapa b, a indução da proteína de interesse ocorre por meios conhecidos pela técnica em um período na faixa de aproximadamente 1 a 10 horas. Nos exemplos, após o período de indução (etapa b) , a fração celular resultante, passa por um tratamento prévio à etapa de purificação (etapa c) . Este tratamento compreende a centrifugação do sistema entre 5000 a 10000 x g e a adição de tampão de lise, com ou sem sonicação. 0 tampão de lise compreende uma mistura homogênea de uréia de concentração na faixa de 6 a 10 M, NaH2PC>4 de 30 a 70 Mm, NaCl de 100 a 500 Mm e imidazol de 5 a 15 Mm em pH básico, por exemplo, na faixa de 8 a 10.[067] In step b, the induction of the protein of interest occurs by means known in the art over a period of approximately 1 to 10 hours. In the examples, after the induction period (step b), the resulting cell fraction undergoes a treatment prior to the purification step (step c). This treatment comprises centrifuging the system at 5000 to 10000 x g and adding lysis buffer with or without sonication. The lysis buffer comprises a homogeneous mixture of urea concentration ranging from 6 to 10 M, NaH2PC> 4 from 30 to 70 Mm, 100 to 500 M NaCl and 5 to 15 Mm imidazole at basic pH, e.g. 8 to 10 range.

[068] Também nos exemplos, a purificação da proteína de interesse (etapa c) compreende condições desnaturantes e o uso de técnicas de separação por cromatografia, sendo preferidas as baseadas em coluna de afinidade, por exemplo, coluna de níquel. A purificação da proteína multiepítopo, compreendida pela SEQ ID NO: 13 foi feita por coluna de afinidade resina de Ni-NTA, devido a cauda de histidina marcada pelo sublinhado do ácido nucléico precursor, como a compreendida pela SEQ ID NO: 14.Also in the examples, the purification of the protein of interest (step c) comprises denaturing conditions and the use of chromatographic separation techniques, with affinity column based, e.g. nickel column, preferred. Purification of the multiepitope protein comprised by SEQ ID NO: 13 was performed by Ni-NTA resin affinity column due to the histidine tail marked by the precursor nucleic acid underlining such as SEQ ID NO: 14.

[069] Outra modalidade da presente invenção está relacionada a um método de diagnóstico de citomegalovírus ou de sorologia positiva ou negativa em indivíduos portadores do citomegalovírus compreendendo o uso de uma proteína multiepítopo recombinante da presente invenção. Preferencialmente a proteína representada por SEQ ID NO: 14.[069] Another embodiment of the present invention relates to a method of diagnosing cytomegalovirus or positive or negative serology in individuals carrying cytomegalovirus comprising the use of a recombinant multiepitope protein of the present invention. Preferably the protein represented by SEQ ID NO: 14.

[070] Em uma de duas modalidades, a presente invenção relaciona-se a uma composição imunogênica para indução de uma resposta imune ao Citomegalovírus, compreendendo uma proteína multiepítopo recombinante da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta composição é caracterizada ainda por conter adicionalmente um adjuvante.In one of two embodiments, the present invention relates to an immunogenic composition for inducing an immune response to cytomegalovirus, comprising a recombinant multiepitope protein of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. This composition is further characterized by additionally containing an adjuvant.

Nestes casos, a proteína multiepítopo recombinante preferencial é representada por SEQ ID NO: 14.In such cases, the preferred recombinant multiepitope protein is represented by SEQ ID NO: 14.

[071] Outro aspecto da presente invenção está relacionado a um kit de diagnóstico compreendendo uma proteína multiepítopo recombinante da presente invenção e um anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com uma substância ou enzima para a detecção de anticorpos anti-CMV. Para a detecção são utilizadas amostras fisiológicas de seres humanos, preferencialmente, sangue. A proteína multiepítopo recombinante de preferência utilizada no kit de diagnóstico é representada pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14.Another aspect of the present invention relates to a diagnostic kit comprising a recombinant multiepitope protein of the present invention and a human anti-human IgG secondary antibody labeled with a substance or enzyme for the detection of anti-CMV antibodies. For detection physiological samples from humans, preferably blood, are used. The recombinant multiepitope protein preferably used in the diagnostic kit is represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 14.

[072] De uma forma geral, todas as metodologias sorológicas se baseiam na detecção de anticorpos (primário) anti-CMV presentes em amostras fisiológicas, que irá se ligar na proteína multiepítopo da presente invenção, a formação desse complexo (proteína e anticorpo) é detectada por um outro anticorpo (secundário) marcado com uma substância (por exemplo fluoróforo) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase, fosfatase alcalina) que irão permitir a visualização por técnicas adequadas, por exemplo, através de microscópio de fluorescência quando se utiliza fluoróforo ou espectrofotômetro quando se utiliza enzima.Generally, all serological methodologies are based on detection of anti-CMV (primary) antibodies present in physiological samples, which will bind to the multiepitope protein of the present invention, the formation of this complex (protein and antibody) is. detected by another (secondary) antibody labeled with a substance (eg fluorophore) or an enzyme (eg peroxidase, alkaline phosphatase) that will allow visualization by suitable techniques, eg by fluorescence microscope when using fluorophore or spectrophotometer when using enzyme.

[073] A proteína recombinante da presente invenção substituiu a proteína dos kits comerciais, em uma única etapa, com resultados semelhantes (sem padronização). Os testes de atividade imunológica foram mostrados na Figura 6 comprovando a aplicação da proteína multiepítopo da presente invenção, preferencialmente a representada pela SEQ ID NO: 14 em kits de diagnósticos, e ainda, ser aplicável a métodos de diagnóstico ou de detecção de anticorpos anti-IgG humano estimulado pelo citomegalovírus, relacionados a outras modalidades da presente invenção.[073] The recombinant protein of the present invention replaced the commercial kit protein in one step with similar results (without standardization). Immunological activity tests were shown in Figure 6 proving the application of the multiepitope protein of the present invention, preferably that represented by SEQ ID NO: 14 in diagnostic kits, and furthermore being applicable to diagnostic methods or detection of anti-antibody antibodies. Cytomegalovirus-stimulated human IgG, related to other embodiments of the present invention.

[074] Outras modalidades da presente invenção estão relacionadas ao uso da proteína multiepítopo recombinante obtida, principalmente a proteína representada pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14, e ainda, ao uso da composição imunogênica. Esta proteína apresenta atividade imunogênica, uma vez que os epítopos selecionados para a sua construção são imunodominantes, responsáveis por elicitarem uma resposta imune de amplo espectro em indivíduos humanos portadores de Citomegalovírus. Isto implica no seu uso para a preparação de composições imunogênicas e vacinas para a indução de uma resposta imune a esta doença, e ainda, o uso dessa composição na preparação de medicamentos ou biofármacos para prevenção ou tratamento dessa doença, incluindo vacinas anti-CMV. As proteínas multiepítopos recombinantes também são utilizadas na preparação de anticorpos monoclonais. Esses anticorpos monoclonais podem ter aplicações terapêuticas devido a sua alta especificidade com poucos efeitos colaterais, por exemplo, nas pesquisas de doenças que necessitam de tratamento clínico (Santos, R.V. et al. Ver bras Alerg imunopatol 29(2):77-85, 2006).Other embodiments of the present invention relate to the use of the obtained recombinant multiepitope protein, principally the protein represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 14, and further to the use of the immunogenic composition. This protein has immunogenic activity, since the epitopes selected for its construction are immunodominant, responsible for eliciting a broad spectrum immune response in human individuals with cytomegalovirus. This implies its use for the preparation of immunogenic compositions and vaccines for inducing an immune response to this disease, and the use of such composition in the preparation of medicaments or biopharmaceuticals for the prevention or treatment of this disease, including anti-CMV vaccines. Recombinant multiepitope proteins are also used in the preparation of monoclonal antibodies. These monoclonal antibodies may have therapeutic applications due to their high specificity with few side effects, for example, in research on diseases requiring clinical treatment (Santos, RV et al. See bras Alerg immunopatol 29 (2): 77-85, 2006 ).

EXEMPLOSEXAMPLES

[075] Os procedimentos experimentais envolvidos estão detalhados em cada um dos Exemplos a seguir, sendo importante destacar que a invenção não se limita aos exemplos citados, nem pelas figuras apresentadas, sendo utilizada em todas as aplicações descritas ou em quaisquer outras variações equivalentes.[075] The experimental procedures involved are detailed in each of the following Examples, it is important to note that the invention is not limited to the examples cited, nor to the figures presented, being used in all described applications or any other equivalent variations.

EXEMPLO 1: SÍNTESE QUÍMICA DOS GENES E CLONAGEM NO VETOR DE EXPRESSÃOEXAMPLE 1: CHEMICAL SYNTHESIS OF GENES AND EXPRESSION VECTOR CLONING

[076] Uma proteína recombinante produzida nessa invenção foi codificada por sequências de DNA sintetizadas em indústrias especializadas na síntese química de genes. No desenho dos genes, feito pelos autores da invenção foram considerados os seguintes critérios: i. Codon usage dos organismos onde os genes serão expressos; ii. Adição de sítios de restrição apropriados nas extremidades dos genes para facilitar as clonagens; iii. Os genes sintetizados codificam uma proteína multiepítopo clonada no vetor de expressão heteróloga compatível com o microrganismo utilizado.[076] A recombinant protein produced in this invention has been encoded by DNA sequences synthesized in industries specializing in chemical gene synthesis. In the design of the genes made by the inventors the following criteria were considered: i. Codon usage of organisms where genes will be expressed; ii. Addition of appropriate restriction sites at gene ends to facilitate cloning; iii. The synthesized genes encode a multiepitope protein cloned into the heterologous expression vector compatible with the microorganism used.

[077] Seis epítopos foram selecionados para desenhar o gene codificador da proteína multiepítopo (Tabela 1). A[077] Six epitopes were selected to design the multiepitope protein encoding gene (Table 1). THE

Figura 1 mostra a sequência de DNA e a Figura 2 a sequência de aminoácidos da proteína multiepítopo rMECMV.Figure 1 shows the DNA sequence and Figure 2 the amino acid sequence of rMECMV multiepitope protein.

[078] Neste caso, foram exemplificados: o ácido nucléico recombinante (compreendendo a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 15, exceto pelas terminações, que compõem as estratégias de síntese, por exemplo, o ATG) e a proteína multiepítopo recombinante obtida denominada de rMECMV, por exemplo representada por SEQ ID NO: 14 Neste caso, cada um dos epítopos foram separados por linkers ou conectores flexíveis de resíduos de aminoácidos glicina e serina (SEQ ID NO: 13), compondo assim uma proteína de aproximadamente 25 kDa (Figuras 2 e 3) . A partir de análises in silico foram selecionados códons preferenciais para E. coli e foram quantificadas as bases nitrogenadas citosina e guanina (CG), sendo observado um total de 58,6 % das bases para rMECMV (apresentada pela sequência de DNA da Figura 1, que é o desenho da sequência do gene rMECMV possuindo 711 pb).In this case, the following were exemplified: recombinant nucleic acid (comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, except for the terminations that make up the synthesis strategies, eg ATG) and the recombinant multiepitope protein obtained rMECMV, for example represented by SEQ ID NO: 14 In this case, each of the epitopes were separated by linkers or flexible connectors of glycine and serine amino acid residues (SEQ ID NO: 13), thus composing a protein of approximately 25 kDa. (Figures 2 and 3). From in silico analyzes, preferential codons for E. coli were selected and the cytosine and guanine (GC) nitrogen bases were quantified, with a total of 58.6% of the bases for rMECMV (shown by the DNA sequence of Figure 1, which is the sequence design of the rMECMV gene having 711 bp).

[079] Neste exemplo, o gene sintético foi clonado no vetor pET21a (SEQ ID NO: 16, um vetor comercial, largamente utilizado) contendo uma cauda de histidina na extremidade C-terminal. 0 gene foi inserido em E. coli BL21 (ADE3) pLysS, para indução da expressão da proteína recombinante (rMECMV e representada pela SEQ ID NO: 14). Em seguida, a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade.In this example, the synthetic gene was cloned into the pET21a vector (SEQ ID NO: 16, a widely used commercial vector) containing a C-terminal histidine tail. The gene was inserted into E. coli BL21 (ADE3) pLysS for induction of recombinant protein expression (rMECMV and represented by SEQ ID NO: 14). Then the protein was purified by affinity chromatography.

EXEMPLO 2: EXPRESSÃO HETERÓLOGA DAS PROTEÍNAS MULTIEPÍTOPOS RECOMBINANTESEXAMPLE 2: HYPEROLOGICAL EXPRESSION OF RECOMBINANT MULTIEPYPTITE PROTEINS

[080] O gene que codifica para a proteína multiepítopo a ser expresso em E. coli foi clonado no vetor pET21a (SEQ ID NO: 16) que já possui um tag de purificação composto por seis histidinas (His-Tag), o que possibilitará a purificação da proteína recombinante em colunas de afinidade Ni-NTA. A clonagem do gene foi realizada de forma orientada de acordo com os sítios de restrição que foram adicionados na sequência primária dos genes (Figura 1). 0 vetor resultante foi utilizado para a transformação de E. coli cepa BL21(ÀDE3) pLysS.The gene encoding the multiepitope protein to be expressed in E. coli has been cloned into vector pET21a (SEQ ID NO: 16) which already has a purification tag composed of six histidines (His-Tag), which will enable purification of recombinant protein on Ni-NTA affinity columns. Gene cloning was performed in a targeted manner according to the restriction sites that were added in the primary gene sequence (Figure 1). The resulting vector was used for transformation of E. coli strain BL21 (ΔDE3) pLysS.

[081] A expressão pode ser feita em pequena escala ou em escalas maiores em frascos sob agitação ou em reatores adequados de acordo com a necessidade. A indução da expressão foi feita pela adição do agente indutor IPTG, seguindo-se da coleta de amostras e a análise das mesmas através de SDS-PAGE.[081] Expression may be made on a small scale or on larger scales in shake flasks or suitable reactors as needed. Expression was induced by the addition of the inducing agent IPTG, followed by sample collection and analysis by SDS-PAGE.

[082] Após um processo de otimização da produção da proteína multiepítopo, os clones com maiores níveis de expressão, assim como o melhor tempo de indução, foram selecionados para a continuidade do processo de produção. Dados da indução são mostrados na Figura 3 e Figura 4, resultando em uma proteína de aproximadamente 25 kDa representada por rMECMV (SEQ ID NO: 14). Nestes ensaios o marcador de massa molecular utilizado foi o Unstained Protein Molecular Weight Marker - Fermentas Life Science.[082] Following a process of optimizing the production of multiepitope protein, clones with the highest expression levels, as well as the best induction time, were selected for continuity of the production process. Induction data are shown in Figure 3 and Figure 4, resulting in an approximately 25 kDa protein represented by rMECMV (SEQ ID NO: 14). In these assays the molecular mass marker used was the Unstained Protein Molecular Weight Marker - Fermentas Life Science.

EXEMPLO 3: OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPÍTOPOEXAMPLE 3: OPTIMIZATION OF MULTIEPYPE PROTEIN PRODUCTION

[083] Os clones selecionados de acordo com o Exemplo 2 podem ser cultivados em fermentadores, monitorando-se os seguintes parâmetros: crescimento, inóculo inicial, pH e aeração. A análise do perfil protéico é realizada por metodologias já estabelecidas pela técnica, por exemplo, por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), identificando-se deste modo, a presença e integridade das proteínas multiepítopo recombinantes. A quantificação dessas proteínas multiepítopo produzidas neste caso, foi obtida pelo método de Bradford para quantificação de proteínas totais (Bradford MMA. Anal Biochem 72:248-254, 1976).Clones selected according to Example 2 may be cultured in fermenters by monitoring the following parameters: growth, initial inoculum, pH and aeration. Protein profile analysis is performed by methodologies already established by the technique, for example by means of polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), thereby identifying the presence and integrity of recombinant multiepitope proteins. Quantification of these multiepitope proteins produced in this case was obtained by the Bradford method for total protein quantification (Bradford MMA. Anal Biochem 72: 248-254, 1976).

EXEMPLO 4: PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPÍTOPOEXAMPLE 4: PURIFICATION OF MULTIEPYPE PROTEIN

RECOMBINANTERECOMBINANT

[084] As células foram coletadas ao final da indução e centrifugadas, o pellet ressuspendido em tampão desnaturante (tampão de lise, contendo uréia 8 M, 20 NaH2P04 50 Mm, NaCl 300 mM e imidazol 10 mM, pH 8) ou congelado a -20°C. Foi usado somente tampão de lise para liberação do conteúdo intracelular da E. coli, diferente dos outros trabalhos descritos no estado da técnica que usam uma etapa adicional de sonicação, dispensada na presente invenção.Cells were harvested at the end of induction and centrifuged, pellet resuspended in denaturing buffer (lysis buffer containing 8 M urea, 20 M NaH2P04 50, 300 mM NaCl and 10 mM imidazole, pH 8) or frozen at - 20 ° C. Only lysis buffer was used for release of E. coli intracellular content, unlike other works described in the prior art using an additional sonication step dispensed with the present invention.

[085] A sonicação é utilizada para o rompimento das células visando a liberação de uma maior quantidade da proteína de interesse na fração solúvel. Entretanto, no presente pedido de patente a tecnologia foi otimizada de modo a dispensar essa etapa que, em alguns casos, dependendo do tempo de exposição ao ultrassom, pode desnaturar a proteína de interesse. O extrato total foi clarificado por centrif ugação (6000 x g por 30 min) e o sobrenadante, contendo as proteínas solúveis, foi utilizado para as etapas subsequentes de purificação. A purificação da proteína recombinante, que contém a cauda de histidina, foi conduzida em condição desnaturante. O extrato total de proteína foi incubado por 1 h e 30 min, 4°C, sob agitação orbital com a resina Ni-NTA para ligação da proteína recombinante por afinidade. A lavagem e remoção das proteínas não ligadas ou fracamente ligadas à resina foi feita com tampão de lavagem contendo ureia 8M, NaH2P04 50mM, NaCl 300 mM e imidazol 20 mM, pH 8.0, por 4 vezes utilizando 1 mL do tampão em cada etapa. A eluição da proteína recombinante ligada à resina de níquel foi feita com tampão NaH2PC>4 50 mM, NaCl 300 mM contendo imidazol 50 mM, pH 8.0 em 3 etapas de 500 mL cada uma. As análises de purificação por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) das alíquotas da etapa de eluição (15 mL) resultaram nos dados mostrados na Figura 5 sendo a proteína indicada por rMECMV, representada por SEQ ID NO: 13.[085] Sonication is used for cell disruption to release a greater amount of the protein of interest in the soluble fraction. However, in the present patent application the technology has been optimized to dispense with this step which in some cases, depending on the time of ultrasound exposure, may denature the protein of interest. The total extract was clarified by centrifugation (6000 x g for 30 min) and the supernatant containing the soluble proteins was used for subsequent purification steps. Purification of the recombinant protein, which contains the histidine tail, was conducted under denaturing condition. Total protein extract was incubated for 1 hr and 30 min at 4 ° C under orbital shaking with Ni-NTA resin for affinity binding of recombinant protein. Washing and removal of unbound or weakly resin bound proteins was done with wash buffer containing 8M urea, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl and 20mM imidazole, pH 8.0, 4 times using 1mL of buffer in each step. Elution of the nickel resin bound recombinant protein was done with 50 mM NaH2PC buffer, 300 mM NaCl containing 50 mM imidazole, pH 8.0 in 3 steps of 500 mL each. Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) purification analyzes of the elution step aliquots (15 mL) yielded the data shown in Figure 5 with the protein indicated by rMECMV represented by SEQ ID NO: 13.

EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE IMUNOLÓGICAEXAMPLE 5: IMMUNOLOGICAL ACTIVITY ASSESSMENT

[086] A análise de atividade imunológica foi realizada por meio de um teste baseado na interação anticorpo-antígeno empregando-se a técnica ELISA. Este método de diagnóstico se baseia na interação anticorpo-antigeno. Normalmente, é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antigenos de interesse juntamente com um tampão de carbonato. Este processo é conhecido como sensibilização e que pode ser do antígeno ou do anticorpo. Depois é realizada uma lavagem com PBS (Phosphate Buffer Saline) , e é feito o bloqueio com PBS e 5% de BSA (Bovine Serum Albumine) para que esta ocupe os espaços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente, é feita a lavagem com PBS contendo 0,05 % de Tween, um surfactante bastante empregado para esta finalidade. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário, cujo conteúdo é soro de pacientes com anticorpos contra o citomegalovírus ou soros controles positivos e negativos comerciais. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína.[086] Immunological activity analysis was performed by a test based on antibody-antigen interaction using the ELISA technique. This diagnostic method is based on antibody-antigen interaction. Usually, an inert surface plate with wells is used where the antigens of interest will be adsorbed along with a carbonate buffer. This process is known as sensitization and may be antigen or antibody. Then a wash with PBS (Phosphate Buffer Saline) is performed, and PBS and 5% BSA (Bovine Serum Albumine) are blocked in order to occupy the free spaces (non-specific sites that may generate false positive or negative results). Again, wash with PBS containing 0.05% Tween, a surfactant widely used for this purpose. The surface is then treated with primary antibody solution, the contents of which are serum from patients with cytomegalovirus antibodies or positive and negative commercial control sera. The surface is washed again to remove primary antibodies that have not been incorporated into any protein.

[087] Em seguida, adiciona-se o anticorpo secundário, que irá se ligar ao anticorpo primário (anti-IgG humana conjugado com peroxidase ou anti-IgM humana conjugada com peroxidase). A enzima acoplada irá produzir uma substância corada quando adicionado o substrato de revelação. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se substrato de revelação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, para quantificar, verificar a presença e a capacidade da proteína adsorvida na placa em reconhecer os anticorpos primários presentes no soro de pacientes.Secondary antibody is then added, which will bind to the primary antibody (peroxidase-conjugated anti-human IgG or peroxidase-conjugated anti-human IgM). The coupled enzyme will produce a colored substance when added the developing substrate. The surface is washed again for removal of secondary antibody that did not bind to the primary antibody. Development substrate is added for the enzyme to produce the stained substance and thus, by measuring the intensity of the surface color, to quantify, verify the presence and ability of the adsorbed protein on the plate to recognize the primary antibodies present in the serum. patients.

[088] Os resultados apresentados na Figura 6 ilustram a capacidade desta proteína se ligar aos anticorpos IgG presentes nos soros de indivíduos infectados com CMV. Estes resultados confirmam a aplicação da proteína multiepítopo na preparação de kits de diagnóstico e método de diagnóstico de Citomegalovírus ou de detecção de anticorpos anti-IgG humano estimulado pelo Citomegalovírus.The results shown in Figure 6 illustrate the ability of this protein to bind to IgG antibodies present in the sera of CMV-infected individuals. These results confirm the application of the multiepitope protein in the preparation of cytomegalovirus diagnostic and diagnostic kits or detection of cytomegalovirus-stimulated anti-human IgG antibodies.

REINVIDICAÇÕES

Claims

1. RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN characterized by comprising two or more conserved and immunogenic cytomegalovirus (CMV) epitopes.

A RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN according to claim 1, characterized in that it comprises two or more epitopes selected from amino acid sequences preferably represented by SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12.

RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN according to one of Claims 1 to 3, characterized in that it preferably comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.

RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN according to one of Claims 1 to 3, characterized in that it is preferably encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15.

RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN according to one of Claims 1 to 4, characterized in that the epitopes are joined by a connector peptide of 2 to 10 amino acid residues.

RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN according to claim 5, characterized in that the connector peptide is preferably a flexible connector comprising amino acids of serine and / or glycine.

RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN according to Claim 5 or 6, characterized in that the connector peptide is preferably comprised of the amino acid sequence SEQ ID NO: 13.

RECOMBINANT NUCLEIC ACID characterized in that it expresses the protein defined in one of claims 1 to 7.

RECOMBINANT NUCLEIC ACID according to claim 8, characterized in that it comprises two or more epitopes selected from the nucleotide sequences preferably represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO. : 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11.

RECOMBINANT NUCLEIC ACID according to claim 8 or 9, characterized in that it preferably comprises the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15.

A RECOMBINANT MULTIEPYTE PROTEIN PROCESS, as defined in one of claims 1 to 7, characterized in that it comprises the steps: (a) Subcloning the recombinant nucleic acid defined in one of claims 8 to 10 into a vector of expression in microorganisms; (b) Induction of protein expression in the expression vector; (c) purifying the multiepitope protein;

Process for obtaining the recombinant multipoint protein according to claim 11, characterized in that the cloning takes place by the incorporation of histidine tail from the heterologous expression vector used.

The process of obtaining the recombinant multipoint protein according to claim 11 or 12, characterized in that the induction of the protein of interest occurs within a period of 1 to 10 hours.

A process for obtaining the recombinant multipeptide protein according to one of claims 11 to 13, characterized in that the microorganisms are preferably bacteria of the genus Escherichia, such as Escherichia colí, and genus Bacillus sp.

Method of cytomegalovirus DIAGNOSIS or detection of positive or negative serology in individuals with Cytomegalovirus comprising the use of a recombinant multiepitope protein as defined in one of claims 1 to 7.

DIAGNOSTIC METHOD according to claim 15, characterized in that it preferably comprises the recombinant multiepitope protein represented by SEQ ID NO: 14.

IMMUNOGENIC COMPOSITION characterized in that it comprises a recombinant multiepitope protein as defined in one of claims 1 to 7 and a pharmaceutically acceptable carrier.

IMMUNOGENIC COMPOSITION according to claim 17, characterized in that it preferably comprises the recombinant multiepitope protein represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 14.

DIAGNOSTIC KIT characterized in that it comprises a recombinant multiepitope protein as defined in one of claims 1 to 7 and a secondary anti-human IgG antibody labeled with a viable substance or enzyme for the detection of anti-CMV antibodies.

DIAGNOSTIC KIT according to claim 19, characterized in that it preferably comprises the recombinant multiepitope protein represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 14.

DIAGNOSTIC KIT according to claim 19 or 20, characterized in that it comprises the use of physiological samples from humans, preferably blood.

Use of the recombinant multiepitope protein as defined in one of claims 1 to 7, characterized in that it is in the preparation of a diagnostic kit for detection of cytomegalovirus.

Use of the recombinant multiepitope protein according to claim 22, characterized in that it is in the preparation of monoclonal antibodies.

Use of the recombinant multiepitope protein according to claim 22 or 23, characterized in that it is in the preparation of an anti-CMV vaccine.

Use of the immunogenic composition as defined in claim 17 or 18, characterized in that it is in the preparation of a medicament or biopharmaceutical to prevent or treat cytomegalovirus.

Use of the immunogenic composition according to claim 25, characterized in that it is in the preparation of an anti-CMV vaccine.