BR102015007391A2 - biomarkers for acute leukemia classification - Google Patents

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Abstract

biomarcadores para classificação de leucemias agudas. a presente patente de invenção é destinada à área de saúde, mais especificamente à área de oncohematologia. trata-se da detecção de biomarcadores (genes) e da utilização do padrão da expressão desses genes para classificação de subtipos de leucemias agudas. os biomarcadores descritos na presente patente podem ser utilizados para definir o grupo de risco dos pacientes com leucemia aguda visto que as alterações genéticas detectadas por eles têm impacto prognóstico.biomarkers for classification of acute leukemias. The present patent is intended for healthcare, more specifically for oncohematology. It is the detection of biomarkers (genes) and the use of the expression pattern of these genes for classification of acute leukemia subtypes. The biomarkers described in the present patent can be used to define the risk group of patients with acute leukemia since the genetic changes detected by them have a prognostic impact.

Description

“BIOMARCADORES PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS” [01] A presente patente de invenção é destinada à área de saúde, mais especificamente à área de oncohematologia. Trata-se da detecção de biomarcadores (genes) e da utilização do padrão da expressão desses genes para classificação de subtipos de leucemias agudas.“BIOMARKERS FOR ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION” [01] This patent is intended for healthcare, more specifically for oncohematology. It is the detection of biomarkers (genes) and the use of the pattern of expression of these genes for classification of acute leukemia subtypes.

[02] O termo leucemia compreende um grupo de doenças heterogêneas, pois o processo neoplásico que dá origem ao clone leucêmico pode surgir em diversas fases do desenvolvimento das diferentes linhagens celulares da medula óssea (Lusis; 2000). De acordo com a célula de origem são classificadas como mieloides ou linfoides, e de acordo com seu progresso, como agudas ou crônicas. As leucemias agudas são divididas em dois grandes grupos: leucemia mieloide aguda (LMA) e leucemia linfoblástica aguda (LLA). Cada grande grupo é ainda dividido em várias categorias que diferem quanto ás alterações genéticas que apresentam, as quais tem grande impacto no tratamento e no prognóstico.[02] The term leukemia encompasses a group of heterogeneous diseases, as the neoplastic process that gives rise to the leukemic clone may arise at various stages of the development of different bone marrow cell lines (Lusis; 2000). According to the source cell they are classified as myeloid or lymphoid, and according to their progress as acute or chronic. Acute leukemias are divided into two major groups: acute myeloid leukemia (AML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL). Each large group is further divided into several categories that differ in their genetic alterations, which have a major impact on treatment and prognosis.

[03] Em 1997, um grupo de hematologistas patrocinados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) se reuniu para atualizar a classificação das doenças hematológicas, as quais até então eram divididas de acordo com critérios baseados somente em morfologia e citoquímica (classificação FAB). A nova classificação incorporou as análises de imunofenotipagem e citogenética, além de critérios clínicos anteriores ao diagnóstico, tais como mielodisplasia e leucemia decorrente de tratamento (classificação WHO) (Vardiman et al., 2002). Em 2008 a OMS incorporou também categorias provisórias baseadas na presença de mutações genéticas detectadas por biologia molecular, tais como NPM1 e CEBPA em LMA (Swerdiow et al., 2009; Vardiman et al., 2009).[03] In 1997, a group of hematologists sponsored by the World Health Organization (WHO) met to update the classification of hematologic diseases, which until then were divided according to criteria based only on morphology and cytochemistry (FAB classification). The new classification incorporated immunophenotyping and cytogenetic analyzes, as well as clinical criteria prior to diagnosis, such as myelodysplasia and treatment-induced leukemia (WHO classification) (Vardiman et al., 2002). In 2008 WHO also incorporated provisional categories based on the presence of genetic mutations detected by molecular biology such as NPM1 and CEBPA in AML (Swerdiow et al., 2009; Vardiman et al., 2009).

[04] À medida que se conhece melhor a biologia das leucemias, novos marcadores são incorporados ao sistema de classificação. Os testes moleculares adotados para a classificação atualmente estão se tornando obsoletos visto que eles avaliam individualmente cada alteração genética, ou seja, para cada gene é necessário um teste. A tendência é que num futuro próximo sejam utilizadas tecnologias genômicas, de forma que um único teste forneça todas as informações necessárias para classificar a doença e estratificar o paciente em grupos de risco de recaída.[04] As the biology of leukemia becomes better known, new markers are incorporated into the classification system. The molecular tests adopted for classification are currently becoming obsolete as they individually evaluate each genetic change, ie for each gene a test is required. The tendency is that genomic technologies will be used in the near future, so that a single test will provide all the information needed to classify the disease and stratify the patient into relapse risk groups.

[05] Na presente invenção foi utilizada a tecnologia de microarranjos de expressão gênica. Esse teste permite a análise simultânea de praticamente todos os genes do genoma humano. Foram realizados microarranjos em material genético de amostras de medula óssea e sangue obtidas de 254 pacientes com leucemia aguda. Através de análise bioinformática, foram selecionados genes diferencialmente expressos entre os subtipos de leucemia de forma a definir uma “assinatura gênica” para cada categoria. Ou seja, para cada subtipo foram selecionados um conjunto de genes cuja expressão é característica daquele grupo.[05] In the present invention the technology of microarray of gene expression was used. This test allows simultaneous analysis of virtually all genes in the human genome. Microarrays were performed on genetic material from bone marrow and blood samples obtained from 254 patients with acute leukemia. Through bioinformatic analysis, differentially expressed genes were selected among the leukemia subtypes in order to define a “gene signature” for each category. That is, for each subtype were selected a set of genes whose expression is characteristic of that group.

[06] Descrição do estado da técnica [07] A utilização do perfil de expressão gênica de um paciente (GEP= gene expression profile) para classificar o grupo de leucemia foi descrita pela primeira vez por Golub et al. (1999). Este grupo de pesquisadores utilizou microarranjos de expressão gênica para selecionar genes importantes na diferenciação de LMA e LLA, a seguir desenvolveu um algoritmo baseado na expressão destes genes para predizer a classe de novos pacientes com leucemia.[06] Description of the state of the art [07] The use of a patient's gene expression profile (GEP) to classify the leukemia group was first described by Golub et al. (1999). This group of researchers used gene expression microarrays to select genes important in the differentiation of AML and ALL, then developed an algorithm based on the expression of these genes to predict the class of new leukemia patients.

[08] Em LLA, o primeiro trabalho a publicar a detecção de assinaturas gênicas por microarranjos características de subtipos portadores de determinadas alterações genéticas foi o de Yeoh et al. (2002). Foram identificados padrões de expressão em subtipos de LLA incluindo LLA-T, LLA com E2A-PBX1 (TCF3-PBX1), BCR-ABL, TEL-AML1, MLL rearranjado e hiperdiploidia com mais de 50 cromossomos. Em LMA, o primeiro trabalho a identificar os subtipos com rearranjos gênicos recorrentes [t(15;17) PML-RARa, t(8;21) RUNX1-RUNX1T1 e inv(16) CBFB-MYH11] através de microarranjos foi o de Schoch et al. (2002).[08] In ALL, the first paper to publish the detection of gene signatures by characteristic microarray of subtypes carrying certain genetic alterations was that of Yeoh et al. (2002). Expression patterns have been identified in ALL subtypes including T-ALL, E2A-PBX1 ALL (TCF3-PBX1), BCR-ABL, TEL-AML1, rearranged MLL and hyperdiploidy with more than 50 chromosomes. In AML, the first work to identify subtypes with recurrent gene rearrangements [t (15; 17) PML-RARa, t (8; 21) RUNX1-RUNX1T1 and inv (16) CBFB-MYH11] was by Schoch et al. (2002).

[09] Nos anos que se seguiram, uma série de trabalhos realizados por grupos de pesquisa europeus e americanos mostraram que a análise da expressão gênica em larga escala em pacientes com Leucemia Aguda é viável e permite a identificação dos principais subtipos da doença (Kohimann et al., 2003; Ross et al., 2004; Rozovskaia et al., 2003; Marasca et al., 2006;[09] In the following years, a series of studies by European and American research groups showed that large-scale gene expression analysis in patients with acute leukemia is feasible and allows the identification of major subtypes of the disease (Kohimann et al. al., 2003; Ross et al., 2004; Rozovskaia et al., 2003; Marasca et al., 2006;

Andersson et al., 2007; Kohimann et al., 2008; Haferlach et al., 2010; lacobucci et al., 2012). Grupos com alterações genéticas características, como por exemplo, as t(15;17), t(8;21), inv(16), ou rearranjos no gene MLL, foram confirmados não somente através do uso de diferentes desenhos de oligos (Schoch et al, 2002; Valk et al., 2004), mas também pela aplicação de diferentes plataformas de microarranjos (Bullinger et al., 2004; Radmacher et al., 2006).Andersson et al., 2007; Kohimann et al., 2008; Haferlach et al., 2010; lacobucci et al., 2012). Groups with characteristic genetic alterations, such as t (15; 17), t (8; 21), inv (16), or rearrangements in the MLL gene, were confirmed not only through the use of different oligo designs (Schoch et al, 2002; Valk et al., 2004), but also by applying different microarray platforms (Bullinger et al., 2004; Radmacher et al., 2006).

[010] o primeiro grupo a validar prospectivamente seus dados foi o do estudo europeu MILE {Microarray Innovations in Leukemia), financiado pela Roche {Roche Molecular Systems Inc., Pleasanton, CA; Haferlach et al., 2010). Este trabalho consiste no maior estudo de microarranjos já realizado em amostras de pacientes com doenças oncohematológicas e inclui 3.334 pacientes. A precisão do algoritmo classificador gerado por essa análise alcançou 91,5% para as leucemias agudas.[010] The first group to prospectively validate their data was the European MILE study (Microarray Innovations in Leukemia), funded by Roche {Roche Molecular Systems Inc., Pleasanton, CA; Haferlach et al., 2010). This work is the largest microarray study ever performed on samples of patients with oncohematological diseases and includes 3,334 patients. The accuracy of the classifying algorithm generated by this analysis reached 91.5% for acute leukemias.

[011] Além dos artigos científicos publicados em periódicos internacionais, foram também depositados pedidos de patentes envolvendo o uso de microarranjos de expressão gênica para classificar leucemias agudas conforme descritos abaixo.[011] In addition to scientific articles published in international journals, patent applications involving the use of gene expression microarrays to classify acute leukemias as described below have also been filed.

[012] A US2004018513 - Methods of assigning a subject affected by leukemia to a leukemia risk group, predicting whether a subject affected by leukemia has an increased risk of relapse, increased risk of developing secondary acute myeloid leukemia; kits - trata-se apenas de LLA (não inclui LMA), a lista de genes selecionados como biomarcadores difere da presente invenção.[012] A US2004018513 - Methods of assigning a subject affected by leukemia to a leukemia risk group, predicting whether a subject affected by leukemia has an increased risk of relapse, increased risk of developing secondary acute myeloid leukemia; kits - this is only ALL (does not include AML), the list of genes selected as biomarkers differs from the present invention.

[013] A CN203021568- Combined parallel detection and diagnosis kit of leukemia-fused gene - inclui as LLA e LMA, mas nas LMA não inclui biomarcadores para FLT3 e NPM1. A lista de genes selecionados como biomarcadores difere da presente invenção.CN203021568 - Combined parallel detection and diagnosis kit of leukemia-fused gene - includes ALL and AML, but in AML does not include biomarkers for FLT3 and NPM1. The list of genes selected as biomarkers differs from the present invention.

[014] A CN202558869 - Gene chip for leukemia diagnosis - inclui as LLA e LMA, diz respeito especificamente a um chip para classificação de leucemias, e não a biomarcadores. As sondas presentes no chip são para genes de fusão, não detectam mutações FLT3 e NPM1, e não coincidem com os genes selecionados na presente invenção.[014] CN202558869 - Gene chip for leukemia diagnosis - includes the ALL and LMA, specifically concerns a chip for leukemia classification, not biomarkers. The probes on the chip are for fusion genes, do not detect FLT3 and NPM1 mutations, and do not match the genes selected in the present invention.

[015] A CN102676648- Gene chip for leukemia diagnosis and treatment -inclui as LLA e LMA, inclui também a detecção de várias mutações gênicas, inclusive FLT3 e NPM1, porém, a lista de biomarcadores difere da presente invenção.[015] CN102676648 - Gene chip for leukemia diagnosis and treatment - including ALL and AML, also includes detection of several gene mutations, including FLT3 and NPM1, but the list of biomarkers differs from the present invention.

[016] A US20100055686 - Methods for diagnosis of pediatric common acute lymphoblastic leukemia by determining the levei of gene expression - trata-se apenas de LLA-B pediátrica, não inclui LMA, não inclui LLA-T, não inclui adultos. A lista de biomarcadores difere da presente invenção.[016] US20100055686 - Methods for diagnosis of pediatric common acute lymphoblastic leukemia by determining the level of gene expression - these are pediatric ALL only, do not include AML, do not include T-ALL, do not include adults. The list of biomarkers differs from the present invention.

[017] A WO2013090419 - Signatures d'expression génique destinées á Ia détection d'événements analogues au chromosome philadelphie (ph-like) sous-jacents et ciblage thérapeutique de Ia leucémie - trata-se apenas de LLA, mais especificamente da distinção entre pacientes que respondem ou não ao tratamento com inibidores de tirosina quinase. A lista de biomarcadores difere da presente invenção.[017] A WO2013090419 - Signatures of gene expression for the detection of analogous chromosome philadelphie (ph-like) sous-jacents and thérapeutique de la leukemia - these are only ALL, specifically the distinction between patients respond or not to treatment with tyrosine kinase inhibitors. The list of biomarkers differs from the present invention.

[018] A CN102758006- Kit for detecting relative expression of leukemia BCR/ABL (b3a2, b2a2) fusion gene - trata-se apenas das leucemias portadoras de gene de fusão BCR-ABL. Os biomarcadores são exclusivos para BCR-ABL e diferem da presente invenção.The CN102758006 - Kit for detecting relative expression of BCR / ABL leukemia (b3a2, b2a2) fusion gene - these are only leukemias carrying the BCR-ABL fusion gene. Biomarkers are unique to BCR-ABL and differ from the present invention.

[019] A US2006057630 - MLL translocations specify a distinct gene expression profile, distinguishing a unique leukemia - trata-se apenas das leucemias portadores de rearranjos no gene MLL. Os biomarcadores são exclusivos para rearranjos MLL e diferem da presente invenção.[019] US2006057630 - MLL translocations specify a distinct gene expression profile, distinguishing a unique leukemia - these are only leukemias carrying rearrangements in the MLL gene. Biomarkers are unique to MLL rearrangements and differ from the present invention.

[020] A W02006048264 - Gene expression profiling in acute lymphoblastic leukemia (all), biphenotypic acute leukemia (bal), and acute myeloid leukemia (ami) mO - inclui LLA, Leucemia aguda bifenotípica, e LMA subtipo MO, não inclui os outros subtipos de LMA. A lista de biomarcadores difere da presente invenção.[020] A W02006048264 - Gene expression profiling in acute lymphoblastic leukemia (all), biphenotypic acute leukemia (bal), and acute myeloid leukemia (ami) mO - includes ALL, biphenotypic acute leukemia, and AML subtype MO, does not include other subtypes of AML. The list of biomarkers differs from the present invention.

[021] W02006048263 - Gene expression profiling in acute promyelocytic leukemia - trata-se apenas de LPA (=LMA subtipo M3). Não inclui LLA e os outros subtipos de LMA. A lista de biomarcadores difere da presente invenção.[021] W02006048263 - Gene expression profiling in acute promyelocytic leukemia - this is only LPA (= AML subtype M3). Does not include ALL and other AML subtypes. The list of biomarkers differs from the present invention.

[022] São três as principais diferenças entre a presente invenção e outros descritos em publicações científicas ou depósitos de patentes anteriores, incluídos no estado da técnica.There are three main differences between the present invention and others described in prior scientific publications or patent filings, included in the prior art.

[023] A primeira diferença diz respeito à população de indivíduos estudados. Todos os trabalhos realizados anteriormente envolveram populações de países desenvolvidos. Não há nenhum trabalho que tenha baseado suas assinaturas gênicas para classificação de leucemias agudas na população brasileira. A distribuição dos subtipos de leucemias na população da América Latina difere daquela dos países desenvolvidos, conforme observado por Douer et al., (1996). Não existe um conjunto de biomarcadores publicado em leucemias que tenha sido identificado na população brasileira.[023] The first difference concerns the population of individuals studied. All previous work involved populations from developed countries. There are no studies that have based their genetic signatures for the classification of acute leukemia in the Brazilian population. The distribution of leukemia subtypes in the Latin American population differs from that in developed countries, as noted by Douer et al. (1996). There is no set of biomarkers published in leukemia that has been identified in the Brazilian population.

[024] A segunda diferença está no conjunto de biomarcadores encontrados. Em função da genética da população avaliada, e também da plataforma de microarranjos escolhida, foram detectados alguns biomarcadores que não haviam sido relacionados com leucemias aguda. A associação entre subtipos de leucemia e alguns poucos genes da presente assinatura gênica já havia sido descrita, porém a maior parte dos genes selecionados é inédita.[024] The second difference is in the set of biomarkers found. Due to the genetics of the population evaluated, and also the microarray platform chosen, some biomarkers that had not been related to acute leukemia were detected. The association between leukemia subtypes and a few genes of this gene signature has already been described, but most of the selected genes are unpublished.

[025] A terceira diferença é a identificação de uma categoria especial de genes não codificantes como importantes marcadores de subtipos de leucemias. Em função das plataformas e chips utilizados nos demais trabalhos, foram determinados previamente assinaturas gênicas contendo genes que codificam proteínas ou a genes de microRNAs (miRNAs). Não há referência específica nas assinaturas gênicas aos RNAs longos não codificantes, conhecidos como IncRNAs {“long non-coding RNAs").[025] The third difference is the identification of a special category of noncoding genes as important markers of leukemia subtypes. Due to the platforms and chips used in the other works, gene signatures containing genes encoding proteins or microRNA genes (miRNAs) were previously determined. There is no specific reference in gene signatures to non-coding long RNAs, known as IncRNAs (“long non-coding RNAs”).

[026] Os resultados da presente patente mostram que cerca de 8% dos biomarcadores detectados nas assinaturas gênicas são IncRNAs. A maior parte deles consiste em RNAs intergênicos (“lincRNAs, long intergenic RNAs”). Os demais são RNAs transcritos a partir da fita antisense de algum gene que codifica proteína (“aRNA, antisense RNA” ou “NAT, natural antisense transcript”), além de alguns poucos transcritos de genes classificados como pseudogenes.[026] The results of the present patent show that about 8% of the biomarkers detected in gene signatures are IncRNAs. Most of them consist of intergenic RNAs (“lincRNAs, long intergenic RNAs”). The others are RNAs transcribed from the antisense strand of some protein-encoding gene (“aRNA, antisense RNA” or “NAT, natural antisense transcript”), and a few gene transcripts classified as pseudogenes.

[027] Os IncRNas são uma categoria pouco estudada de RNAs com função regulatória. Sua importância só foi reconhecida a partir do projeto Transcriptoma Humano, e portanto quase toda a literatura a esse respeito é bastante recente (revisto por Pointing et al., 2009).[027] IncRNas are a poorly studied category of regulatory function RNAs. Its importance has only been recognized from the Human Transcriptome project, and therefore almost all literature on this subject is quite recent (reviewed by Pointing et al., 2009).

[028] Os mecanismos de interação dos IncRNAs no controle da expressão de genes específicos estão começando a ser desvendados. A expressão alterada dos IncRNAs tem sido observada numa série de doenças e pode fornecer dados sobre sua etiologia. Particularmente em leucemias, alguns trabalhos mostram o envolvimento da desregulação dos IncRNAs com a doença (Yu et al., 2008; lacobucci et al., 2011. Benetatos et al., 2010; Khoury et al., 2010; Garding et al., 2013; Hajjari et al., 2013). Estes trabalhos, contudo, não indicam a utilização de IncRNAs para classificar leucemias, nem sequer descrevem os mesmos IncRNAs que estão incluímos nas assinaturas gênicas da presente invenção.[028] The mechanisms of interaction of IncRNAs in controlling the expression of specific genes are beginning to be unraveled. Altered expression of IncRNAs has been observed in a number of diseases and may provide data on their etiology. Particularly in leukemias, some studies show the involvement of IncRNAs deregulation with the disease (Yu et al., 2008; lacobucci et al., 2011. Benetatos et al., 2010; Khoury et al., 2010; Garding et al., 2013; Hajjari et al., 2013). These works, however, do not indicate the use of IncRNAs to classify leukemias, nor do they even describe the same IncRNAs that are included in the gene signatures of the present invention.

[029] Os trabalhos acima descritos mostram que o conjunto de marcadores da presente invenção é inovador e poderá ser utilizado para obter uma classificação precisa do subtipo de leucemia.The works described above show that the set of markers of the present invention is innovative and could be used to obtain an accurate classification of the leukemia subtype.

[030] Metodologia - Microarranjos de Expressão Gênica [031] A metodologia abaixo descrita faz parte do estado da técnica e não apresenta atividade inventiva.[030] Methodology - Gene Expression Microarray [031] The methodology described below is part of the state of the art and has no inventive activity.

[032] A extração do RNA foi feita entre 6 e 24 hs após a coleta utilizando kits PAXgene Blood RNA e PAXgene Bone Marrow RNA (QIAGEN), seguindo as instruções do fabricante. A qualidade das amostras de RNA foi determinada utilizando-se o espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), para quantificação e determinação das razões 260/230 e 260/280, e o equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer, para determinação da integridade do RNA. Foram consideradas adequadas para a análise de microarranjo amostras com concentração de RNA superior a 6,6 ng/μΙ, com razões 260/230 e 260/280 acima de 1,5 e 1,8 respectivamente, e com RIN {RNA Integrity Number) superior a 6,0.RNA extraction was done between 6 and 24 hours after collection using PAXgene Blood RNA and PAXgene Bone Marrow RNA (QIAGEN) kits, following the manufacturer's instructions. The quality of RNA samples was determined using the NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific) for quantification and determination of ratios 260/230 and 260/280, and the Agilent 2100 Bioanalyzer for determination of RNA integrity. Samples with an RNA concentration higher than 6.6 ng / μΙ, with ratios 260/230 and 260/280 above 1.5 and 1.8 respectively, and with RIN {RNA Integrity Number), were considered suitable for microarray analysis. greater than 6,0.

[033] Para se identificar uma possível diferença na expressão gênica entre os subtipos de leucemia aguda utilizamos a plataforma da Agilent Technologies com lâminas no formato 8 x 60k (G4851 A-Agilent Technologies) preparadas pelo processo SurePrint. Para a aquisição das imagens utilizou-se o SureScan Microarray Scanner System (Agilent Technologies) com os parâmetros ajustados para o canal da cianina Cy3. Os dados foram extraídos com o programa Agilent Feature Extraction (versão 11.0.1.1, protocolo Agilent one-color GE1_1100_Jul11) e normalizados utilizando-se o programa Gene Spring (versão 12.5, Agilent Technologies).[033] To identify a possible difference in gene expression between acute leukemia subtypes we used the Agilent Technologies platform with 8 x 60k format slides (G4851 A-Agilent Technologies) prepared by the SurePrint process. For image acquisition, the SureScan Microarray Scanner System (Agilent Technologies) with the parameters adjusted for the Cy3 cyanine channel was used. Data were extracted with the Agilent Feature Extraction program (version 11.0.1.1, Agilent one-color protocol GE1_1100_Jul11) and normalized using the Gene Spring program (version 12.5, Agilent Technologies).

[034] Foram hibridizadas 66 lâminas (com 8 amostras cada). 467 (88%) amostras de sangue periférico e medula óssea passaram em todos os critérios de qualidade e tiveram os dados de expressão extraídos. No total, 254 pacientes com leucemia aguda foram analisados. Para construção do modelo foram usadas inicialmente amostras de medula óssea (MO), sendo 110 pacientes com LMA e 97 com LLA.66 slides were hybridized (with 8 samples each). 467 (88%) peripheral blood and bone marrow samples passed all quality criteria and had expression data extracted. In total, 254 patients with acute leukemia were analyzed. For the construction of the model, bone marrow (OM) samples were initially used, 110 patients with AML and 97 with ALL.

[035] Análise Bioinformática dos dados de Expressão Gênica [036] Foram realizadas análises supervisionadas e não supervisionadas dos dados. Na primeira, foram informados ao programa os subtipos de leucemia de cada paciente (os quais foram determinados a partir dos exames clássicos de imunofenotipagem, citogenética e biologia molecular), a seguir o programa utilizou os padrões de expressão gênica de cada subtipo para definir os marcadores gênicos mais importantes para o algoritmo de classificação. No outro tipo de análise, não foi informado ao programa o subtipo de leucemia e o agrupamento dos pacientes (“clusterização”) foi feito com base na semelhança de padrões de expressão gênica. Na análise não supervisionada foi feito um Agrupamento Hierárquico utilizando as 60 melhores sondas de cada grupo testado na análise supervisionada.[035] Bioinformatic Analysis of Gene Expression Data [036] Supervised and unsupervised analyzes of the data were performed. In the first, the program was informed of the leukemia subtypes of each patient (which were determined from the classic immunophenotyping, cytogenetics and molecular biology exams), then the program used the gene expression patterns of each subtype to define the markers. most important for the classification algorithm. In the other type of analysis, the leukemia subtype was not informed to the program and the grouping of patients (“clustering”) was based on the similarity of gene expression patterns. In the unsupervised analysis, a hierarchical cluster was made using the best 60 probes from each group tested in the supervised analysis.

[037] As análises dos dados de expressão gênica foram realizadas utilizando algoritmos presentes na plataforma GenePattern (Broad Institute, EUA). Os perfis de expressão gênica dos pacientes foram avaliados por programas de classificação como o Suport Vector Machine, o Weighted Voting e o K-nearest Neighbors.[037] Analysis of gene expression data was performed using algorithms present on the GenePattern platform (Broad Institute, USA). Patients' gene expression profiles were evaluated by rating programs such as Suport Vector Machine, Weighted Voting and K-nearest Neighbors.

[038] O objetivo principal do classificador gerado foi o de determinar um painel mínimo de genes informativos (correspondentes ás sondas testadas pelo microarranjo), capazes de classificar amostras de origem desconhecida conforme treinamento prévio com amostras de medula óssea.[038] The main objective of the generated classifier was to determine a minimal panel of informative genes (corresponding to probes tested by the microarray), capable of classifying samples of unknown origin according to previous training with bone marrow samples.

[039] Preferencialmente os programas foram utilizados no modo de validação cruzada do tipo leave-one-out. Neste modo, todo o banco de dados {dataset n) de entrada é utilizado para compor o treinamento da máquina com exceção de uma amostra. Essa amostra única compõe o dataset de teste, sendo então reclassificada (pois a sua classificação a priori já é conhecida) com base no modelo criado a partir do treinamento. Na ausência do modo de validação cruzada, o dataset foi dividido entre treinamento e teste de forma aleatória, sendo 75% do dataset total para treinamento e os 25% restantes para teste.Preferably the programs were used in leave-one-out cross-validation mode. In this mode, the entire {dataset n) input database is used to compose machine training except one sample. This single sample composes the test dataset and is then reclassified (since its a priori classification is already known) based on the model created from the training. In the absence of cross-validation mode, the dataset was randomly divided between training and testing, with 75% of the total training dataset and the remaining 25% for testing.

[040] Os parâmetros inseridos no K-nearest A/e/g/?jbor foram: num features = “60”, feature selection statistic = “T-Test”, num neighbors = “3”, weighting type = “distance” e distance measure = “Euclidean distance”. Os parâmetros inseridos no Weighted Voting foram: num features = 60 e feature selection statistic = “T-Test”. O programa Suport Vector Machine não requer escolha de parâmetros para funcionar.[040] The parameters entered in K-nearest A / e / g /? Jbor were: num features = “60”, feature selection statistic = “T-Test”, num neighbors = “3”, weighting type = “distance” and distance measure = "Euclidean distance". The parameters entered in Weighted Voting were: num features = 60 and feature selection statistic = “T-Test”. The Suport Vector Machine program does not require a choice of parameters to function.

[041] As medidas de sensibilidade, especificidade, precisão e acurácia foram calculadas a partir da informação de classificação obtida com os exames clássicos, segundo as fórmulas abaixo: [042] Sensibilidade = Positivos verdadeiros / (Positivos verdadeiros + Falso negativos) [043] Especificidade = Negativos verdadeiros / (Negativos verdadeiros +Falso positivos) [044] Precisão = Positivos verdadeiros / (Positivos verdadeiros + Falso positivos) [045] Acurácia = (Positivos verdadeiros +TN) / (Positivos verdadeiros + Negativos verdadeiros + Falso positivos + Falso negativos) [046] Validação de biomarcadores por RT-RQ-PCR[041] Measurements of sensitivity, specificity, accuracy and accuracy were calculated from the classification information obtained with classical examinations according to the formulas below: [042] Sensitivity = True positives / (True positives + False negatives) [043] Specificity = True negatives / (True negatives + False positives) [044] Accuracy = True positives / (True positives + False positives) [045] Accuracy = (True positives + TN) / (True positives + True negatives + False positives + False negative) [046] Validation of biomarkers by RT-RQ-PCR

[047] Para ter certeza de que a expressão dos biomarcadores (genes) selecionados pela análise de bioinformática está de fato associada aos subtipos de leucemia, é necessário confirmar essa expressão diferencial por outra técnica. Utilizamos o RT-PCR quantitativo (RT-RQ-PCR) com sondas TaqMan (Taqman Gene Expression Assays, Applied Biosystems). Para a síntese de cDNA, foi utilizada a transcriptase reversa Improm II (Promega) e ο protocolo foi realizado segundo instruções do fabricante. Foram selecionados 7 genes para os quais foram desenhados primers e sonda específicos.[047] To be sure that the expression of biomarkers (genes) selected by bioinformatics analysis is indeed associated with leukemia subtypes, it is necessary to confirm this differential expression by another technique. We used quantitative RT-PCR (RT-RQ-PCR) with TaqMan probes (Taqman Gene Expression Assays, Applied Biosystems). For cDNA synthesis, Improm II reverse transcriptase (Promega) was used and the protocol was performed according to the manufacturer's instructions. Seven genes were selected for which specific primers and probe were designed.

[048] Foram feitas duas normalizações utilizando o método de 2- ΔΔΟΤ. Em primeiro lugar usamos genes controles (ABL1 e GAPDH) para normalizar a variação de expressão em cada indivíduo, de acordo com as seguintes fórmulas.[048] Two normalizations were made using the 2- ΔΔΟΤ method. First we use control genes (ABL1 and GAPDH) to normalize the variation of expression in each individual, according to the following formulas.

[049] ACt Paciente com Leucemia: Ct Alvo - Ct Gene Controle [050] ACt Indivíduo sem doença: Ct Alvo - Ct Gene Controle [051] Em segundo lugar comparou-se a expressão dos genes nos pacientes com a expressão em indivíduos sem doença hematológica utilizando a seguinte fórmula: [052] AACt Pacientes com Leucemia: ACt Paciente - ACt Médio dos indivíduos sem doença.[049] ACt Leukemia Patient: Ct Target - Ct Gene Control [050] ACt Disease-Free Individual: Ct Target - Ct Gene Control [051] Second, we compared gene expression in patients with expression in individuals without disease hematologic using the following formula: [052] AACt Leukemia Patients: ACt Patient - Average ACt of individuals without disease.

[053] A seguir o valor da mediana de um grupo de pacientes de um mesmo subtipo foi comparado com o valor da mediana de um grupo de outro subtipo.[053] Then the median value of a group of patients of the same subtype was compared with the median value of a group of another subtype.

[054] Resultados - Amostras incluídas [055] Foram coletadas amostras de medula e sangue de indivíduos com leucemia aguda de novo, além amostras de 17 pacientes com doenças hematológicas relacionadas e de 14 indivíduos sem doença hematológica. Os dados das amostras de medula óssea que passaram pelos critérios de qualidade do microarranjo (n=231) tiveram os dados de expressão utilizados para construção do classificador. As amostras de medula óssea foram divididas em categorias de acordo com a presença de translocação ou alteração genética preconizada pelo sistema de classificação WHO, conforme descrito na tabela 1 abaixo, que representa: diagnóstico dos pacientes cujos padrões de expressão gênica das amostras de medula óssea foram submetidos à análise bioinformática. *Leucemia Linfoide Crônica; Leucemia Mieloide Crônica; Síndrome Mielodisplásica sem t(8;21) **Alterações genéticas com poucos representantes, para esses grupos não foram selecionados biomarcadores [056] Biomarcadores (Genes) selecionados [057] A atividade inventiva da presente patente está relacionada ao grupo de biomarcadores selecionados e sua utilização na classificação de leucemias agudas. Pela análise supervisionada, as 60 melhores sondas para diferenciação de dois subgrupos foram selecionadas.[054] Results - Included samples [055] Marrow and blood samples were collected from individuals with de novo acute leukemia, as well as samples from 17 patients with related hematologic diseases and 14 subjects without hematological disease. Data from bone marrow samples that met the microarray quality criteria (n = 231) had the expression data used to construct the classifier. Bone marrow samples were divided into categories according to the presence of translocation or genetic alteration recommended by the WHO classification system, as described in table 1 below, which represents: diagnosis of patients whose patterns of gene expression of bone marrow samples were submitted to bioinformatic analysis. * Chronic lymphoid leukemia; Chronic myeloid leukemia; Myelodysplastic Syndrome without t (8; 21) ** Genetic changes with few representatives, for these groups no biomarkers were selected [056] Selected biomarkers (Genes) [057] The inventive activity of the present patent is related to the group of selected biomarkers and their use in the classification of acute leukemia. By supervised analysis, the 60 best probes for differentiation of two subgroups were selected.

[058] Para distinção entre os grupos LLA e outros pacientes (incluindo LMA, leucemias crônicas e doenças não-hematológicas) as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 1 a 60.[058] To distinguish between ALL groups and other patients (including AML, chronic leukemias and non-hematologic diseases) the 60 best probes found detect the genes described in Seq Id 1 to 60.

[059] Para distinção entre os grupos LMA e outros pacientes (incluindo LLA, leucemias crônicas e doenças não-hematológicas) as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 1,6,7,10, 11, 14,15,19, 23, 26, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 45, 44, 47, 49, 51, 52, 54, 55, 57 e 61 a 88.[059] To distinguish between AML groups and other patients (including ALL, chronic leukemias and non-hematologic diseases) the 60 best probes found detect the genes described in Seq Id 1,6,7,10, 11, 14,15, 19, 23, 26, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 45, 44, 47, 49, 51, 52, 54, 55, 57 and 61 to 88.

[060] Para distinção entre os grupos LLA de linhagem B e LLA de linhagem T as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 11,40, 44, 61,69 e 89 a 140.[060] To distinguish between lineage B ALL groups and T lineage ALL groups the 60 best probes found detect the genes described in Seq Id 11,40, 44, 61,69 and 89 to 140.

[061] Para distinção entre os grupos LLA portador do gene de fusão BCR-ABL e LLA não portadores de BCR-ABL as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 110 e 141 a 195.To distinguish between the LLA groups carrying the BCR-ABL fusion gene and the non-BCR-ABL fusion gene the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 110 and 141 to 195.

[062] Para distinção entre os grupos LLA portador do gene de fusão ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) e LLA não portadores de ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 185 e 196 a 254.To distinguish between the ELA6-RUNX1 (TEL-AML1) and ELA-non-ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) fusion gene carriers ALL the 60 best probes found detect the genes described in Seq Id 185 and 196 at 254.

[063] Para distinção entre os grupos LLA portador do gene de fusão TCF3-PBX1 e LLA não portadores de TCF3-PBX1 as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 145, 154, 190 e 255 a 309.To distinguish between the ALL groups carrying the TCF3-PBX1 fusion gene and the non-TCF3-PBX1 fusion gene the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 145, 154, 190 and 255 to 309.

[064] Para distinção entre os grupos LMA portador do gene de fusão PML-RARA, também chamada Leucemia Promielocítica Aguda, e LMA não portadores de PML-RARA as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 5, 59, 232 e 310 a 361.[064] To distinguish between LMA groups carrying the PML-RARA fusion gene, also called Acute Promyelocytic Leukemia, and non-PML-RARA LMA groups, the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 5, 59, 232 and 310 to 361.

[065] Para distinção entre os grupos LMA portador do gene de fusão RUNX1-RUNX1T1 e LMA não portadores de RUNX1-RUNX1T1 as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 16, 24, 113, 166, 231,352 e 362 a 412.To distinguish between the LMA groups carrying the RUNX1-RUNX1T1 fusion gene and the non-RUNX1-RUNX1T1 fusion gene the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 16, 24, 113, 166, 231,352 and 362 to 412. .

[066] Para distinção entre os grupos LMA portador de inv16 CBFB-MYH11 e LMA não portadores de CBFB-MYH11 as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 200, 367, 388 e 413 a 469.To distinguish between the inv16-bearing LMA groups CBFB-MYH11 and non-CBFB-MYH11-bearing LMA groups the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 200, 367, 388 and 413 to 469.

[067] Para distinção entre os grupos LMA portador de MLLT3-MLL e LMA não portadores de MLLT3-MLL as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 269, 302, 311,332, 464 e 470 a 523.To distinguish between the MLLT3-MLL-bearing LMA and non-MLLT3-MLL-bearing LMA groups the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 269, 302, 311,332, 464 and 470 to 523.

[068] Para distinção entre os grupos LMA portador de duplicação interna em tandem no gene FLT3 (FLT3-DIT) sem outra translocação e LMA não portadores de FLT3-DIT as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 122, 321, 333, 360, 361, 393, 448, 483 e 524 a 573.[068] To distinguish between tandem internal duplication LMA groups in the FLT3 gene (FLT3-DIT) without other translocation and non-FLT3-DIT LMA groups the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 122, 321, 333, 360, 361, 393, 448, 483 and 524 to 573.

[069] Para distinção entre os grupos LMA portador de duplicação interna em tandem no gene FLT3 (FLT3-DIT) com ou sem outra translocação e LMA não portadores de FLT3-DIT as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 138, 448, 460, 527, 529, 530, 538, 540, 542, 555, 557 e 574 a 621.[069] To distinguish between the tandem internal duplication LMA groups in the FLT3 gene (FLT3-DIT) with or without other translocation and non-FLT3-DIT LMA the best 60 probes found detect the genes described in Seq Id 138, 448, 460, 527, 529, 530, 538, 540, 542, 555, 557 and 574 to 621.

[070] Para distinção entre os grupos LMA portador de inserção no exon 12 do gene NPM1 e LMA não portadores de inserção no exon 12 do gene NPM1 as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 64, 328, 350, 374, 461,486, 500 e 622 a 674.[070] To distinguish between the LMA groups carrying the NPM1 exon 12 insertion and the non-NPM1 exon 12 insertion LMA groups the 60 best probes found detect the genes described in Seq Id 64, 328, 350, 374, 461,486, 500 and 622 to 674.

[071] Para distinção entre os grupos LMA portador do gene de fusão PML-RARA isoformas longa e variável (bcr 1 e bcr2) de LMA portador do gene de fusão PML-RARA isoforma curta (bcr3) as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 154, 258, 626 e 675 a 729.To distinguish between LMA groups carrying the PML-RARA long and variable isoform fusion gene carrier PML-RARA (bcr 1 and bcr2) LMA carrier isoform PML-RARA short fusion gene carrier the best 60 probes found detect the genes Seq Id 154, 258, 626 and 675 to 729.

[072] Para distinção entre os grupos LMA portador do gene de fusão PML-RARA e de duplicação interna em tandem no gene FLT3 (FLT3-DÍT) de LMA portador do gene de fusão PML-RARA sem duplicação interna em tandem no gene FLT3 as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 132, 209, 249, 258, 386, 440, 448, 454, 529, 677, 681, 689, 697, 701 e 730 a 774.[072] To distinguish between LMA groups carrying the PML-RARA fusion gene and tandem internal duplication in the FLT3 (FLT3-DÍT) LMA gene carrying the PML-RARA fusion gene without internal tandem duplication in the FLT3 gene as 60 best probes found detect the genes described in Seq Id 132, 209, 249, 258, 386, 440, 448, 454, 529, 677, 681, 689, 697, 701 and 730 to 774.

[073] Para distinção entre os grupos: LLA e LMA as 60 melhores sondas encontradas detectam os genes descritos nas Seq Id 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19, 23, 33, 34, 36, 37, 40, 41, 42, 44, 45, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 60, 64, 66, 70, 71, 75, 78, 80, 84, 85, 88, e 775 a 793.To distinguish between the groups: ALL and AML the 60 best probes found detect the genes described in Seq Id 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19, 23, 33, 34, 36, 37, 40, 41, 42, 44, 45, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 60, 64, 66, 70, 71, 75, 78, 80, 84, 85, 88, and 775 to 793.

[074] Uma importante parte da invenção diz respeito ao fato de que uma parte considerável dos biomarcadores detectados são RNAs não codificantes descritos nas Seq Id 1, 12, 16, 37, 89, 92, 105, 107, 110, 114, 128, 129, 135, 143, 150, 176, 216, 253, 258, 275, 328, 329, 331, 339, 359, 380, 395, 442, 488, 503, 506, 525, 529, 532, 548, 559, 568, 585, 647, 653, 654, 675, 680, 691,695, 696, 709, 728, 750, 765, 771,787.An important part of the invention concerns the fact that a considerable part of the detected biomarkers are non-coding RNAs described in Seq Id 1, 12, 16, 37, 89, 92, 105, 107, 110, 114, 128, 129, 135, 143, 150, 176, 216, 253, 258, 275, 328, 329, 331, 339, 359, 380, 395, 442, 488, 503, 506, 525, 529, 532, 548, 559, 568, 585, 647, 653, 654, 675, 680, 691,695, 696, 709, 728, 750, 765, 771,787.

[075] A presente patente é descrita em detalhes de acordo com as figuras anexas, onde: [076] Na figura 1 o Heatmap ilustra a separação entre os sub-grupos de leucemia. As 60 melhores sondas são mostradas na vertical e os pacientes na horizontal. Os quadrados vermelhos referem-se a genes mais expressos que a média e os quadrados azuis indicam os genes menos expressos. Separação entre LLA-B e LLA-T; são identificados dois clusteres principais de pacientes: LLA-T (em marrom) e LLA-B (em cinza).[075] The present patent is described in detail according to the accompanying figures, where: [076] In Figure 1 the Heatmap illustrates the separation between leukemia subgroups. The 60 best probes are shown vertically and the patients horizontally. Red squares refer to more expressed than average genes and blue squares indicate less expressed genes. Separation between ALL-B and ALL-T; Two main patient clusters are identified: T-ALL (in brown) and All-B (in gray).

[077] A figura 2 o Heatmap ilustra a separação entre os sub-grupos de leucemia. As 60 melhores sondas são mostradas na vertical e os pacientes na horizontal. Os quadrados vermelhos referem-se a genes mais expressos que a média e os quadrados azuis indicam os genes menos expressos. Separação entre LLA-B com t(1;19) e LLA-B sem t(1;19): são identificados dois clusteres principais de pacientes: LLA-B com t(1;19) (em marrom) e LLA-B sem essa translocação (em cinza)..[077] Figure 2 The Heatmap illustrates the separation between the leukemia subgroups. The 60 best probes are shown vertically and the patients horizontally. Red squares refer to more expressed than average genes and blue squares indicate less expressed genes. Separation between ALL-B with t (1; 19) and ALL-B without t (1; 19): Two main patient clusters are identified: ALL-B with t (1; 19) (brown) and ALL-B without this translocation (in gray) ..

[078] Na figura 3 o Heatmap ilustra a separação entre os sub-grupos de leucemia. As 60 melhores sondas são mostradas na vertical e os pacientes na horizontal. Os quadrados vermelhos referem-se a genes mais expressos que a média e os quadrados azuis indicam os genes menos expressos. Separação entre LMA com t(15;17) e LMA sem t(15;17); são identificados dois clusteres principais de pacientes: LMA com t(15;17) (em marrom) e LMA sem essa translocação (em cinza).[078] In Figure 3 the Heatmap illustrates the separation between the leukemia subgroups. The 60 best probes are shown vertically and the patients horizontally. Red squares refer to more expressed than average genes and blue squares indicate less expressed genes. Separation between AML with t (15; 17) and AML without t (15; 17); Two main clusters of patients are identified: AML with t (15; 17) (in brown) and AML without this translocation (in gray).

[079] Na figura 4 o Heatmap ilustra a separação entre os sub-grupos de leucemia. As 60 melhores sondas são mostradas na vertical e os pacientes na horizontal. Os quadrados vermelhos referem-se a genes mais expressos que a média e os quadrados azuis indicam os genes menos expressos. Separação entre LLA e LMA; são identificados dois clusteres principais de pacientes: LMA (em marrom) e LLA (em cinza).[079] In Figure 4 the Heatmap illustrates the separation between the leukemia subgroups. The 60 best probes are shown vertically and the patients horizontally. Red squares refer to more expressed than average genes and blue squares indicate less expressed genes. Separation between ALL and AML; Two main patient clusters are identified: AML (brown) and ALL (gray).

[080] A figura 5 ilustra Parte do Agrupamento Hierárquico resultante da análise não supervisionada de pacientes com LMA. Dois “clusteres” principais são visualizados. O primeiro (I), marcado em verde, agrupa pacientes portadores do gene de fusão PML-RARa, seja com isoforma S (códigos GX e GL) ou com isoforma L (código FX). Os pacientes portadores do gene de fusão PML-RARa e da mutação FLT3-DIT encontram-se num único subcluster (código GL) dentro desse grupo. O segundo grande cluster (II) é dividido em dois subclusters, sendo um deles composto pelos pacientes portadores do rearranjo RUNX1-RUNX1T1 [t(8;21)], marcado em vermelho..[080] Figure 5 illustrates Part of the Hierarchical Cluster resulting from unsupervised analysis of AML patients. Two main clusters are displayed. The first (I), marked in green, groups patients with the PML-RARa fusion gene, either with S isoform (GX and GL codes) or L isoform (FX code). Patients with the PML-RARa fusion gene and FLT3-DIT mutation are in a single subcluster (GL code) within this group. The second large cluster (II) is divided into two subclusters, one of which is composed of patients with the RUNX1-RUNX1T1 [t (8; 21)] rearrangement, marked in red.

[081] Na figura 6 o RT-RQ-PCR ilustra a expressão diferencial de genes selecionados como biomarcadores. Validação do biomarcador LOC728743 (pseudogene) mais expresso em LLA do que em LMA., [082] Na figura 7 o RT-RQ-PCR 7 ilustra a expressão diferencial de genes selecionados como biomarcadores. Validação do biomarcador XLOC_009378 (lincRNA) mais expresso em pacientes com LMA portadores de t(8;21) do que nos não portadores.[081] In Figure 6 RT-RQ-PCR illustrates the differential expression of genes selected as biomarkers. Validation of LOC728743 (pseudogene) biomarker more expressed in ALL than in AML., [082] In Figure 7 RT-RQ-PCR 7 illustrates the differential expression of genes selected as biomarkers. Validation of XLOC_009378 (lincRNA) biomarker more expressed in patients with AML with t (8; 21) than in non-carriers.

[083] Na figura 8 o RT-RQ-PCR ilustra a expressão diferencial de genes selecionados como biomarcadores. Validação do biomarcador UBL7-AS1 (aRNA) mais expresso em LLA-T do que em LLA-B.[083] In Figure 8 RT-RQ-PCR illustrates the differential expression of genes selected as biomarkers. Validation of the UBL7-AS1 (aRNA) biomarker more expressed in T-ALL than in ALL.

[084] Na figura 9 o RT-RQ-PCR ilustra a expressão diferencial de genes selecionados como biomarcadores. Validação do biomarcador não caracterizado cuja sonda se localiza na posição cromossômica chrll :017366661-017366720 e é mais expresso em LPA [leucemia promielocítica aguda, o mesmo que LMA M3, caracterizado pelo gene de fusão PML-RARa/t(15;17)] do que nas LMA não portadoras de PML-RARa.[084] In Figure 9 RT-RQ-PCR illustrates the differential expression of genes selected as biomarkers. Validation of uncharacterized biomarker whose probe is located at chromosomal position chrll: 017366661-017366720 and is more expressed in APL [acute promyelocytic leukemia, same as AML M3, characterized by the PML-RARa / t fusion gene (15; 17)] than in non-PML-RARa AML.

[085] Na figura 10 o RT-RQ-PCR ilustra a expressão diferencial de genes selecionados como biomarcadores. Validação do biomarcador MARCH3 mais expresso em pacientes com LPA [leucemia promielocítica aguda, o mesmo que LMA M3, caracterizado pelo gene de fusão PML-RARa/t(15;17)] sem mutação do tipo duplicação interna em tandem no gene FLT3 (FLT3-DIT) do que nos pacientes com LPA com FLT3-DIT.[085] In Figure 10 RT-RQ-PCR illustrates the differential expression of genes selected as biomarkers. Validation of the most expressed MARCH3 biomarker in patients with APL [acute promyelocytic leukemia, same as AML M3, characterized by the PML-RARa / t fusion gene (15; 17)] without tandem internal duplication mutation in the FLT3 gene (FLT3 -DIT) than in patients with ALP with FLT3-DIT.

[086] As figuras 1 a 4 mostram a separação entre grupos de leucemias baseada em 60 sondas.Figures 1 to 4 show the separation between leukemia groups based on 60 probes.

[087] Validação cruzada MO[087] Cross Validation MO

[088] A seguir, utilizando a lista com 60 sondas para cada modelo foi feita a reclassificação de amostras retiradas aleatoriamente do grupo total. Os resultados obtidos na análise supervisionada para classificação de subtipos de leucemias, comparando-se subtipos dois a dois, encontram-se descritos na tabela 2.[088] Next, using the 60 probe list for each model, samples were randomly reclassified from the total group. The results obtained in the supervised analysis for classification of leukemia subtypes, comparing subtypes two by two, are described in table 2.

[089] Tabela 2: Resultados de Sensibilidade, Especificidade, Precisão e Acurácia obtidos com o classificador construído. LLA, Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA, Leucemia Mieloide Aguda; LPA, Leucemia Promieiocítica Aguda, o mesmo que LMA subtipo M3.[089] Table 2: Sensitivity, Specificity, Accuracy, and Accuracy Results obtained with the constructed classifier. ALL, Acute Lymphoblastic Leukemia; AML, Acute Myeloid Leukemia; ALI, Acute Promieocytic Leukemia, same as AML subtype M3.

[090] Considerando que a re-classificação baseada em dados de expressão gênica foi bem sucedida para os grupos nos quais encontraram-se medidas de acerto acima de 95%. Quando testa-se aos pares os grandes grupos de linhagem celular que dão origem à leucemia (ex; LMA x LLA e LLA-B x LLA-T) consegui-se alcançar uma precisão e acurácia altíssimas, superiores a 96%, na reclassificação. Também para alguns subgrupos caracterizados pela presença de translocações cromossômicas, foi possível obter precisão e acurácias ótimas quando comparada a presença versus a ausência dessa alteração dentro da sua linhagem (mieloide ou linfoide) [(ex: t(15;17) ou t(8;21)em LMAet(1;19) em LLA], [091] Dentre as translocações cromossômicas, a t(9;22) apresentou o pior desempenho utilizando o classificador desenvolvido. Seis portadores desta translocação foram classificados como não portadores e 4 não portadores foram classificados como portadores. Já foi descrito na literatura que alguns pacientes negativos para t(9;22) apresentam um padrão de expressão gênica que mimetiza aquele dos pacientes positivos. Esse padrão mimético pode estar associado a um subtipo chamado “BCR-ABL like” (Den Boer et al., 2009; Muilighan et al., 2009).[090] Considering that re-classification based on gene expression data was successful for groups in which corrective measures were found above 95%. By pairwise testing the large groups of cell lines that give rise to leukemia (eg, AML x ALL and ALL-B x ALL-T), very high accuracy and accuracy of over 96% was achieved in reclassification. Also for some subgroups characterized by the presence of chromosomal translocations, it was possible to obtain optimal precision and accuracy when compared to the presence versus absence of this change within their lineage (myeloid or lymphoid) [(eg, t (15; 17) or t (8 ; 21) in LMAet (1; 19) in ALL], [091] Among the chromosomal translocations, at (9, 22) presented the worst performance using the developed classifier: 6 carriers of this translocation were classified as non-carriers and 4 non-carriers. As described in the literature, it has been described in the literature that some patients negative for t (9; 22) have a gene expression pattern that mimics that of positive patients.This mimetic pattern may be associated with a subtype called “BCR-ABL like”. (Den Boer et al., 2009; Muilighan et al., 2009).

[092] A questão dos portadores da t(9;22) classificados erroneamente é mais difícil de resolver e será necessário usar outra metodologia bioinformática (em fase de avaliação) para abordar essa questão. Em um trabalho anterior, Haferlach et al. (2005) obtiveram a mesma acurácia para esse grupo e hipotetizaram que mutações em outros genes podem ativar a mesma via ativada pela proteína BCR-ABL. A solução será incorporar aos kits de classificação, sondas que detectem diretamente o transcrito de fusão BCR-ABL.[092] The issue of misclassified t (9; 22) carriers is more difficult to resolve and another bioinformatic methodology (under evaluation) will be needed to address this issue. In a previous paper, Haferlach et al. (2005) obtained the same accuracy for this group and hypothesized that mutations in other genes may activate the same pathway activated by the BCR-ABL protein. The solution will be to incorporate into the classification kits probes that directly detect the BCR-ABL fusion transcript.

[093] No que diz respeito às mutações FLT3-ITD e NPM1-A associadas à LMA, ocorreram casos falso positivos e falso negativos em nosso sistema de classificação. Verifica-se então na literatura mundial, uma baixa precisão nesses grupos. O perfil de expressão de pacientes com mutações gênicas em FLT3, NPM1 e CEBPa foi descrito num trabalho recente (Balgobind et al., 2011) e foi observado que os classificadores obtidos para essas mutações são menos precisos do que nos casos das translocações, assim como no nosso trabalho.[093] With regard to AML-associated FLT3-ITD and NPM1-A mutations, false positive and false negative cases have occurred in our classification system. In the world literature, there is a low precision in these groups. The expression profile of patients with FLT3, NPM1 and CEBPa gene mutations has been described in a recent paper (Balgobind et al., 2011) and it has been observed that the classifiers obtained for these mutations are less accurate than in the case of translocations, as well as in our work.

[094] Validação cruzada SP[094] SP cross validation

[095] Um dos objetivos é verificar se o teste que esta sendo desenvolvido pode ser aplicado em amostras de sangue periférico (SP), de forma a evitar a punção para obtenção de medula óssea que é dolorosa e traumática.[095] One of the goals is to verify whether the test being developed can be applied to peripheral blood (SP) samples in order to avoid puncture to obtain painful and traumatic bone marrow.

[096] Ao todo 236 pacientes com leucemia aguda tiveram amostras de SP analisadas por microarranjos de expressão gênica. As amostras de SP foram submetidas ao classificador desenvolvido a partir dos dados de medula óssea. O resultado da re-classificação das amostras de SP encontra-se descrito na tabela 3.[096] Altogether 236 patients with acute leukemia had SP samples analyzed by gene-expressing microarrays. The SP samples were submitted to the classifier developed from the bone marrow data. The result of the re-classification of SP samples is described in table 3.

[097] Tabela 3: Resultados de Sensibilidade, Especificidade, Precisão e Acurácia obtidos com o classificador construído com MO e testado com SP[097] Table 3: Sensitivity, Specificity, Accuracy, and Accuracy Results Obtained with the MO-Classified and SP-Tested Classifier

[098] Para a definição de linhagem celular (LLA versus resto, LMA versus resto, LLA-B versus LLA-T) e para as translocações cromossômicas os parâmetros ficaram aquém daqueles testados com amostras de medula óssea. Isso mostra que para classificar os portadores de genes de fusão resultantes das translocações recorrentes em leucemias agudas, a medula óssea é o material ideal para o teste baseado em expressão gênica. Para as mutações FLT3-DIT e NPM1 os parâmetros obtidos na reclassificação com SP ficaram melhores que os de MO.[098] For the definition of cell line (ALL versus remainder, AML versus remainder, ALL-B versus ALL-T) and for chromosomal translocations the parameters fell short of those tested with bone marrow samples. This shows that to classify fusion gene carriers resulting from recurrent translocations into acute leukemias, bone marrow is the ideal material for gene expression-based testing. For FLT3-DIT and NPM1 mutations, the parameters obtained in the SP reclassification were better than those of MO.

[099] É importante notar que a precisão de algumas categorias foi positiva, sugerindo que na ausência de material de MO como acontece quando o médico não consegue realizar a punção de medula (“medula seca”), os testes de expressão podem ajudar na classificação e estratificação do paciente utilizando o sangue periférico.[099] It is important to note that the accuracy of some categories was positive, suggesting that in the absence of MO material such as when the physician cannot perform puncture (“dry marrow”) punctuation, expression tests may help in classification. and patient stratification using peripheral blood.

[0100] Análise não supervisionada [0101] Para verificar como as amostras estudadas se agrupam baseada na expressão gênica, independente dos exames clássicos realizados, foi feito um Agrupamento Hierárquico. Foram utilizadas as 60 melhores sondas de cada grupo testado na análise supervisionada. A análise não supervisionada mostrou que os principais subgrupos de LLA e de LMA agruparam-se corretamente, com poucas exceções. Assim como na análise supervisionada, os erros de agrupamento ocorreram em grupos geneticamente heterogêneos (BCR-ABL, FLT3-ITD e NPM1). A figura 5 mostra um exemplo de separação em grupos (“clusterização”) resultante da análise não supervisionada.[0100] Unsupervised analysis [0101] In order to verify how the studied samples are grouped based on gene expression, regardless of the classic exams performed, a Hierarchical Clustering was performed. The 60 best probes from each group tested were used in the supervised analysis. Unsupervised analysis showed that the main ALL and AML subgroups grouped correctly, with few exceptions. As in supervised analysis, clustering errors occurred in genetically heterogeneous groups (BCR-ABL, FLT3-ITD, and NPM1). Figure 5 shows an example of group separation (“clustering”) resulting from unsupervised analysis.

[0102] Validação RT-RQ-PCR[0102] RT-RQ-PCR Validation

[0103] Foram realizados testes de PCR quantitativo com 7 genes selecionados nas assinaturas gênicas descritas acima.[0103] Quantitative PCR tests were performed with 7 selected genes in the gene signatures described above.

[0104] O primeiro teste realizado foi para um IncRNA (UBL7-AS1) identificado como diferencialmente expresso entre LLA-B e LLA-T. Os dados mostram que, considerando os 20 pacientes testados, de fato esse gene é mais expresso nas LLA-T (mediana 2''-AACt = 2,2945) do que nas LLA-B (mediana 2'^-AACt = 0,0853) (tabela 4).[0104] The first test performed was for an IncRNA (UBL7-AS1) identified as differentially expressed between ALL-B and ALL-T. The data show that, considering the 20 patients tested, in fact this gene is more expressed in T-ALL (median 2 '' - AACt = 2.2945) than in ALL-B (median 2 '^ - AACt = 0, 0853) (table 4).

[0105] Tabela 4: 2'^AACt do gene UBL7-AS1 calculado para pacientes com LLA-T e LLA-B.[0105] Table 4: 2 '^ AACt of the UBL7-AS1 gene calculated for patients with ALL-T and ALL-B.

[0106] Em 6 dos 7 genes testados os resultados de Q-PCR confirmam a expressão diferencial dos genes selecionados por microarranjos de expressão gênica. As figuras 6 a 10 mostram a expressão diferencial entre os genes validados por subtipo de leucemia.In 6 of the 7 genes tested the Q-PCR results confirm the differential expression of the genes selected by gene expression microarrays. Figures 6 to 10 show the differential expression between genes validated by leukemia subtype.

[0107] Outras aplicações [0108] Os biomarcadores descritos na presente patente podem ser utilizados para o diagnóstico dos pacientes com suspeita de leucemia aguda.Other Applications [0108] The biomarkers described in this patent may be used for the diagnosis of patients with suspected acute leukemia.

[0109] Os biomarcadores descritos na presente patente podem ser usados para confirmar a presença de translocações ou mutações gênicas quando outras metodologias utilizadas atualmente falharem ou gerarem resultados dúbios.The biomarkers described in the present patent may be used to confirm the presence of translocations or gene mutations when other currently used methodologies fail or generate dubious results.

[0110] Os biomarcadores descritos na presente patente podem ser utilizados para definir o grupo de risco dos pacientes com leucemia aguda visto que as alterações genéticas detectadas por eles têm impacto prognóstico.[0110] The biomarkers described in this patent can be used to define the risk group of patients with acute leukemia as the genetic changes detected by them have a prognostic impact.

[0111] A presente invenção pode ser aplicada na elaboração de um kit baseado em expressão gênica para classificação das leucemias agudas.The present invention can be applied in the elaboration of a gene expression based kit for the classification of acute leukemias.

REIVINDICAÇÕES

Claims (25)

1. “CONJUNTO DE BIOMARCADORES PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por conter a combinação de pelo menos dez dos genes descritos nas sequências de Seq ID 1 a 787.1. "SET OF BIOMARKERS FOR ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION", characterized in that it contains a combination of at least ten of the genes described in the sequences of Seq ID 1 to 787. 2. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica dos biomarcadores da reivindicação 1.2. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", characterized by the determination of the gene expression of the biomarkers of claim 1. 3. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por classificar os seguintes subtipos de leucemia aguda: LLA, LLA-B, LLA-T, LLA-B BCR-ABL, LLA-B ETV6-RUNX1 (TEL-AML1), LLA-B TCF3-PBX1, LMA, LMA PML-RARA (LPA), LMA PML-RARA com FLT3-DIT, LMA PML-RARA sem FLT3-DIT, LMA RUNX1-RUNX1T1, LMA CBFB-MYH11, LMA FLT3-DIT, LMA NPMImut.3. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS" according to claim 2, characterized in that it classifies the following acute leukemia subtypes: ALL, BLA-T, ALL-BCR-ABL, ALL-B ETV6- RUNX1 (TEL-AML1), LLA-B TCF3-PBX1, LMA, PML-RARA LMA (LPA), PML-RARA LMA with FLT3-DIT, LMA PML-RARA without FLT3-DIT, LMA RUNX1-RUNX1T1, LMA CBFB- MYH11, LMA FLT3-DIT, LMA NPMImut. 4. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por avaliar a expressão gênica pela hibridização do RNA do paciente com sondas imobilizadas.4. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS" according to claim 2, characterized in that it evaluates gene expression by hybridizing the patient's RNA with immobilized probes. 5. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por avaliar a expressão gênica pela hibridização do cDNA do paciente com sondas imobilizadas.5. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS" according to claim 2, characterized in that it evaluates gene expression by hybridizing the patient's cDNA with immobilized probes. 6. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por avaliar a expressão gênica pela amplificação do cDNA do paciente utilizando PCR em tempo real.6. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS" according to claim 2, characterized in that it evaluates gene expression by amplifying the patient's cDNA using real-time PCR. 7. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por avaliar a expressão gênica a partir de RNA extraído de células da medula óssea.7. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS" according to claim 2, characterized in that it evaluates gene expression from RNA extracted from bone marrow cells. 8. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por avaliar a expressão gênica a partir de RNA extraído de células do sangue periférico.8. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS" according to claim 2, characterized in that it evaluates gene expression from RNA extracted from peripheral blood cells. 9. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 1 a 60 para distinguir Leucemia Linfoide Aguda de outras doenças hematológicas e indivíduos sem doença.9. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", which uses the determination of gene expression of at least three of the genes of Seq ID 1 to 60 to distinguish Acute Lymphoid Leukemia from other haematological diseases and individuals without disease. 10. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 1,6,7,10, 11, 14,15,19, 23, 26, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 45, 44, 47, 49, 51, 52, 54, 55, 57 e 61 a 88 para distinguir Leucemia Mieloide Aguda de outras doenças hematológicas e indivíduos sem doença.10. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, characterized by the determination of gene expression of at least three of the genes of Seq ID 1,6,7,10, 11, 14,15,19, 23, 26, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 45, 44, 47, 49, 51, 52, 54, 55, 57 and 61 to 88 to distinguish Acute Myeloid Leukemia from other hematologic diseases and individuals without disease. 11. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID Id 11, 40, 44, 61, 69 e 89 a 140 para distinguir Leucemia Linfoide Aguda de linhagem B de Leucemia Linfoide Aguda de linhagem T.11. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", characterized by determining the gene expression of at least three of the genes of Seq ID Id 11, 40, 44, 61, 69 and 89 to 140 to distinguish Acute Lymphoid Leukemia from strain B T-line acute lymphoid leukemia disease 12. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 110 e 141 a 195 para distinguir pacientes com Leucemia Linfoide Aguda de linhagem B portadores do gene de fusão BCR-ABL dos demais pacientes com Leucemia Linfoide Aguda de linhagem B.12. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", characterized by the use of gene expression determination of at least three of the genes of Seq ID 110 and 141 to 195 to distinguish patients with lineage acute lymphoid leukemia BCR-fusion gene carriers GLA of other patients with acute lymphoid leukemia B. 13. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 185 e 196 a 254 para distinguir pacientes com Leucemia Linfoide Aguda de linhagem B portadores do gene de fusão ETV6-RUNX1 dos demais pacientes com Leucemia Linfoide Aguda de linhagem B.13. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, characterized by the determination of gene expression of at least three of the genes of Seq ID 185 and 196 to 254 to distinguish patients with strain B acute lymphoid leukemia bearing the ETV6-fusion gene. RUNX1 of the other patients with acute strain B lymphoid leukemia. 14. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 145, 154, 190 e 255 a 309 para distinguir pacientes com Leucemia Linfoide Aguda de linhagem B portadores do gene de fusão TCF3-PBX1 dos demais pacientes com Leucemia Linfoide Aguda de linhagem B.14. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", characterized by determining the gene expression of at least three of the genes of Seq ID 145, 154, 190 and 255 to 309 to distinguish patients with Gene-bearing acute lymphoid leukemia gene of TCF3-PBX1 fusion of the remaining patients with strain B acute lymphoid leukemia 15. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 5, 59, 232 e 310 a 361 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão PML-RARA dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda.15. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", characterized by determining the gene expression of at least three of the genes of Seq ID 5, 59, 232 and 310 to 361 to distinguish Acute Myeloid Leukemia patients carrying the PML fusion gene. Of other patients with acute myeloid leukemia. 16. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 16, 24, 113, 166, 231, 352 e 362 a 412 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão RUNX1-RUNX1T1 dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda.16. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, which uses the determination of gene expression of at least three of the genes of Seq ID 16, 24, 113, 166, 231, 352 and 362 to 412 to distinguish Acute Myeloid Leukemia patients carriers of the RUNX1-RUNX1T1 fusion gene from other patients with acute myeloid leukemia. 17. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 200, 367, 388 e 413 a 469 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão CBFB-MYHII dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda.17. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, characterized by determining the gene expression of at least three of the genes of Seq ID 200, 367, 388 and 413 to 469 to distinguish Acute Myeloid Leukemia patients carrying the CBFB fusion gene. -MYHII of the other patients with Acute Myeloid Leukemia. 18. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 269, 302, 311, 332, 464 e 470 a 523 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão MLL-AF9 dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda.18. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, which uses the determination of gene expression of at least three of the genes of Seq ID 269, 302, 311, 332, 464 and 470 to 523 to distinguish Acute Myeloid Leukemia patients fusion gene MLL-AF9 of the other patients with acute myeloid leukemia. 19. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 122, 321, 333, 360, 361,393, 448, 483 e 524 a 573 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores da mutação FLT3-ITD sem genes de fusão associados dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda.19. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, characterized by using the gene expression determination of at least three of the genes of Seq ID 122, 321, 333, 360, 361,393, 448, 483 and 524 to 573 to distinguish leukemia patients Acute Myeloid carriers of the FLT3-ITD mutation without associated fusion genes from other Acute Myeloid Leukemia patients. 20. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 138, 448, 460, 527, 529, 530, 538, 540, 542, 555, 557, 574 a 621 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores da mutação FLT3-ITD dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda.20. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, characterized in that the gene expression determination of at least three of the genes of Seq ID 138, 448, 460, 527, 529, 530, 538, 540, 542, 555, 557 is used; 574 to 621 to distinguish patients with acute myeloid leukemia carrying the FLT3-ITD mutation from other patients with acute myeloid leukemia. 21. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 64, 328, 350, 374, 461,486, 500 e 622 a 674para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores de mutação no exon 12 do gene NPM1 dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda21. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, characterized by determining the gene expression of at least three of the genes of Seq ID 64, 328, 350, 374, 461,486, 500 and 622 to 674 to distinguish patients with acute myeloid leukemia. of mutation in exon 12 of NPM1 gene of other Acute Myeloid Leukemia patients 22. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 154, 258, 626 e 675 a 729 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão PML-RARA isoforma S dos pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão PML-RARA isoforma L ou V.22. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", characterized by determining the gene expression of at least three of the genes of Seq ID 154, 258, 626 and 675 to 729 to distinguish Acute Myeloid Leukemia patients carrying the PML fusion gene. -SRARE S isoform of Acute Myeloid Leukemia patients carrying the PML-RARA isoform L or V fusion gene. 23. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 132, 209, 249, 258, 386, 440, 448, 454, 529, 677, 681, 689, 697, 701 e 730 a 774 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão PML-RARA e mutação FLT3-ITD dos demais pacientes com Leucemia Mieloide Aguda portadores do gene de fusão PML-RARA.23. “ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS”, characterized by the determination of gene expression of at least three of the genes of Seq ID 132, 209, 249, 258, 386, 440, 448, 454, 529, 677, 681, 689, 697, 701, and 730 to 774 to distinguish Acute Myeloid Leukemia patients carrying the PML-RARA fusion gene and FLT3-ITD mutation from other Acute Myeloid Leukemia patients carrying the PML-RARA fusion gene. 24. PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizado por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos genes das Seq ID 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19, 23, 33, 34, 36, 37, 40, 41, 42, 44, 45, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 60, 64, 66, 70, 71, 75, 78, 80, 84, 85, 88, e 775 a 793 para distinguir pacientes com Leucemia Mieloide Aguda de pacientes com Leucemia Linfoide Aguda,24. ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS ”, characterized in that the determination of gene expression of at least three of the genes of Seq ID 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19, 23, 33 is used. , 34, 36, 37, 40, 41, 42, 44, 45, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 60, 64, 66, 70, 71, 75, 78, 80, 84, 85 , 88, and 775 to 793 to distinguish Acute Myeloid Leukemia patients from Acute Lymphoid Leukemia patients, 25. “PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCEMIAS AGUDAS”, caracterizados por utilizar a determinação da expressão gênica de pelo menos três dos RNAs não codificantes descritos nas Seq ID 1, 12, 16, 37, 89, 92, 105, 107, 110, 114, 128, 129, 135, 143, 150, 176, 216, 253, 258, 275, 328, 329, 331, 339, 359, 380, 395, 442, 488, 503, 506, 525, 529, 532, 548, 559, 568, 585, 647, 653, 654, 675, 680, 691, 695, 696, 709, 728, 750, 765, 771,787 para classificação de leucemias agudas25. "ACUTE LEUKEMIA CLASSIFICATION PROCESS", characterized by using the determination of gene expression of at least three of the non-coding RNAs described in Seq ID 1, 12, 16, 37, 89, 92, 105, 107, 110, 114 , 128, 129, 135, 143, 150, 176, 216, 253, 258, 275, 328, 329, 331, 339, 359, 380, 395, 442, 488, 503, 506, 525, 529, 532, 548 , 559, 568, 585, 647, 653, 654, 675, 680, 691, 695, 696, 709, 728, 750, 765, 771,787 for classification of acute leukemias
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