BR102014033133B1 - nanoformulação contendo bioativos naturais para cicatrização de lesões cutâneas - Google Patents

Abstract

NANOFORMULAÇÃO CONTENDO BIOATIVOS NATURAIS PARA CICATRIZAÇÃO DE LESÕES CUTÂNEAS. A presente invenção, situada no campo da biotecnologia, refere-se a um sistema nanoestruturado, especificamente, uma nanoemulsão contendo componentes naturais, preferencialmente, óleo de copaíba (OC) veiculado em meio salinizado com água de coco em pó (ACP), na presença do tensoativo Tween® 80. Este formulado possibilitou a solubilização e doseamento de OC em uma concentração terapêutica eficaz, isenta de efeitos adversos. O objetivo do presente requerimento de patente consistiu na veiculação do princípio bioativo OC em uma nanoemulsão do tipo O/A (óleo-em-água), denominada de NEOCACP, contendo componentes biocompatíveis. Desta forma, OC foi solubilizado e veiculado, em uma proporção preferencial (0,51% a 2%) bioativa para tratamento específico de lesões cutâneas. O estudo químico possibilitou a obtenção de uma formulação nonoestruturada, com diâmetro médio de gotícula superior a 0,3 nm e inferior a 10 nm. A administração do formulado NEOCACP pode ser realizada por via tópica, com o uso de seringa ou spray; com liberação do biocomponente OC de forma gradual e prolongada.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção, situada no campo da biotecnologia de fármacos, refere-se ao biodesenvolvimento do nanoformulado denominado NEOCACP que contém componentes naturais, preferencialmente, óleo de copaíba (OC) veiculado em meio salinizado com água de coco em pó (ACP), para aplicação na área da saúde, especificamente, cicatrização cutânea.

Objeto da Invenção e Justificativa do Invento

[002] No presente estudo o óleo de copaíba (OC) foi veiculado em uma nanoemulsão contendo o princípio bioativo OC em baixa concentração, para aplicação medicinal em cicatrização cutânea. Especificamente, se propõem que NEOCACP tenha ação anti-infamatória e cicatrizante, com favorecimento adicional de neovascularização e ação fibrinogênica.

[003] De acordo com a literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo o uso de OC veiculado em baixa concentração, em uma nanoemulsão salinizada com água de coco em pó, na presença do tensoativo Tween® 80. Portanto, o nanoformulado NEOCACP possui novidade inventiva frente ao estado da técnica e pode ser patenteado para uso tópico em lesões cutâneas, sem ocorrência de efeitos adversos.

[004] O bioformulado NEOCACP contribui com o desenvolvimento de uma área de aplicação medicinal que carece de desenvolvimento tecnológico. A comercialização do NEOCACP pode ser facilitada pelo processo de obtenção proposto, que permitirá sua reprodução em escala industrial. A administração tópica de NEOCACP no tecido cutâneo, em uma embalagem comercial, pode ser realizada pelo uso de uma seringa ou spray.

Problema que a Invenção se Propõe a Resolver

[005] As propriedades medicinais do óleo de copaíba (OC) cientificamente comprovadas poderiam ter assegurado sua comercialização tópica para tratamento de lesões cutâneas. No entanto, a baixa solubilidade de OC vinculado aos seus efeitos adversos em uso tópico (agente agressivo em processo tópico inflamatório em função da característica resinosa), tornaram sua biodisponibilidade limitada.

[006] Apesar das propriedades farmacológicas eficazes de espécies do gênero Copaifera, até o momento, foram evidenciadas poucas formulações comerciais com fins terapêuticos. O óleo-resina OC por ser lipofílico, não apresenta boa solubilidade em água e apresenta baixa solubilidade em solventes orgânicos biologicamente compatíveis. Desta forma, o fator solubilidade de OC, dificulta sua administração em dosagens menos concentradas e também, seu uso tópico para as ações anti-inflamatória e cicatrizante de feridas cutâneas, justificando a lentidão no seu progresso biotecnológico.

[007] Na presente invenção, foi obtido um nanoformulado inédito denominado de NEOCACP, contendo OC veiculado em baixa concentração, com solubilização satisfatória em meio aquoso salino, para aplicação medicinal, como agente anti-inflamatório e cicatrizante de feridas cutâneas.

[008] Com relação a inventos anteriores diretamente correlacionados com processo biotecnológico para o uso tópico acima descrito, o documento WO2013084163A1 (2013) refere-se a composições contendo óleo-resina da Copaifera officinalis em mistura com um extrato de Chelidonium majus, para o tratamento de disfunções cutâneas que causam hiperproliferação epidérmica, estando, portanto, diferente do objetivo da presente invenção, que propõem o uso tópico de NEOCACP com favorecimento de neovascularização e ação fibroblástica.

Fundamentos da Invenção

[009] O óleo de copaíba, um exudado dos troncos de árvores do gênero Copaifera (Leguminoseae), é encontrado nas regiões tropicais da América Latina e África. No Brasil, foram descritas mais de vinte espécies de Copaifera, com destaque para C. officinalis L., C. guianensis Desf., C. reticulata Ducke, C. multijuga Hayne, C. confertiflora Bth., C. langsdorffii Desf., C. coriacea Mart. e C. cearensis Huber ex Ducke, por serem as mais abundantes (DWYER, 1951; MARTINS-DA-SILVA; PEREIRA; LIMA, 2008; PIO, 1931). Dentre as indicações etnofarmacológicas relatadas para este óleo-resina (popularmente conhecido como óleo de copaíba) encontram-se as seguintes atividades: anti-inflamatória, cicatrizante, antimicrobiana, leishmanicida, larvicida e antineoplásica (LEANDRO et al., 2012; MACIEL; PINTO; VEIGA-JUNIOR, 2002). O efeito cáustico do óleo de copaíba, foi relatado em pesquisas anteriores. A este efeito, vinculou-se a limitação do uso comercial do OC por via tópica, em processos de cicatrizações (BRITO et al., 1998; 1999).

[010] Alves (2013) ao analisar a utilização da copaíba nos últimos 20 anos, evidenciou o grande número de pedidos de patentes por empresas estrangeiras, dentre 17 encontradas em sua busca, 14 são requeridos por empresas japonesas, seguidos por uma francesa, uma americana e uma brasileira. Além das patentes foi apontado um único registro na ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) para uso comercial do óleo de copaíba.

[011] Composições contendo extrato de Chelidonium majus em mistura com o óleo-resina da Copaifera officinalis, para o tratamento de disfunções cutâneas que causam hiperproliferação epidérmica encontra-se patenteada e pode ser evidenciada no seguinte documento WO2013084163A1 (2013). Um outro documento WO2011120118A1 (2011) descreve o processo de obtenção de micropartículas matriciais das folhas de Copaifera langsdorffii, bem como de seus bioativos e suas atividades biológicas.

[012] Em estudo recente descreveu-se a validação do método SPME-GC (técnica de microextração em fase sólida-cromatografia gasosa) objetivando avaliar a estabilidade, para a análise de β-cariofileno presente em nanoemulsões obtidas com óleo de copaíba. No referido estudo, foram analisadas duas formulações, uma constituída por Span® 80 (1%), um co- tensoativo disperso no óleo resina de copaíba (10%); e outra, em que uma mistura de óleo-resina (10%) e o tensoativo Tween® 20 (2%) foi dispersa em meio aquoso neutro (DIAS et al., 2012).

[013] A formação de sistemas coloidais contendo óleo de copaíba para aplicação como veículo terapêutico anti-inflamatório também foi avaliada em pesquisas anteriores em que diferentes métodos foram utilizados para produzir regiões de microemulsão contendo óleo de copaíba, Span® 80 (co- tensoativo) e Tween® 20 (tensoativo) em meio aquoso neutro, bem como estudos analíticos para avaliação da estabilidade das formulações (XAVIER JUNIOR, 2011; XAVIER JUNIOR et al., 2010; 2009; SILVA et al., 2010; 2009). A microemulsão obtida foi avaliada em microorganismo e apresentou importante atividade antibacteriana contra S. epidermidis, para tratamento de infecções ocasionadas por este microrganismo, principalmente, em infecções causadas por dispositivos biomédicos, tais como: cateteres, próteses articulares e válvulas cardíacas (ALENCAR, 2011).

[014] Um estudo intitulado “Optimization of Copaiba oil-based nanoemulsions obtained by different preparation methods” descreve nanoemulsões apolares (do tipo A/O) elaboradas à base de óleo de copaíba (OC) encapsulado em elevado percentual (20%), obtidas em procedimento de homogenização em alta pressão, sob misturas de dois tensoativos Span 80 (3%) e Tween 20 (1%), na presença de triglicerídeos (10%) como agente fixador dos componentes voláteis de OC, durante o processo de preparo e estocagem (Dias et al., 2014, Industrial Crops and Products, 59:154-162). Outros inventos correlatos: BRPI8605738; BRPI0904577; JP8-12560; JP2001322941; WO204/036620; WO94/00105; BR102013030303; BR102014031459, apesar de terem sido precursores de investigações biotecnológicas envolvendo o uso do óleo de copaíba, não possuem as mesmas características inovadoras do presente invento, em que a nanoemulsão NEOCACP contento OC encontra-se otimizada pela redução dos percentuais deste princípio bioativo (0,5% a 2%), veiculado em sistema nanoemulsionado polar (O/A, rico em água) contendo água salinizada (com água de coco em pó) em elevado percentual (65% a 80%), sendo sistema nanoemulsionado isento de co-tensoativo, formado pela homogeneização das fases óleo/água por um único tensoativo (15% a 20% de Tween® 80), mediante processo de aquecimento moderado que formou sistema coloidal O/A resistente (estável) à diluições em água.

Descrição detalhada da invenção

[015] No presente invento foram investigados diversos óleos de copaíba comerciais, tendo sido observado que a composição de sesquiterpenos (S) e diterpenos (D) variou em diversas amostras. A relação S:D variou de 40:1 a 1:40 nos diversos óleos de copaíba avaliados. A pureza e a autenticidade dos óleos foi verificada por cromatografia em fase gasosa (CG) e desta forma foi possível fazer a escolha do óleo.

[016] A caracterização química deste óleo (Figura 1) foi realizada com utilização de equipamento CG-EM (Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectrofotômetro de Massa). Figura 1. Estrutura química dos sesquiterpenos identificados por CG-EM nos óleos de copaíbas analisados. O estudo físico-químico objetivando a bioveiculação de OC resultou na nanoemulsão NEOCACP que contém OC veiculado em baixa concentração, solubilizado em um meio aquoso salinizado com água de coco em pó (ACP). O biocomponente ACP foi adquirido na ACP Serviços Tecnológicos, Ltda, ACP Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil. A caracterização química/nutricional de ACP foi fornecida pela referida empresa e encontra-se de acordo com o descritivo mostrado na Tabela 1.

[017] A nanoemulsão NEOCACP (Figura 2) na presença do tensoativo Tween® 80 (15% - 25%) contém OC na proporção preferencial 0,5% a 2%, em meio aquoso rico em ACP, na proporção preferencial de 65% a 80%.

[018] Figura 2. Fotografia do bioformulado NEOCACP. O referido formulado foi balanceado com OC que exerce o controle do diâmetro das gotículas da fase dispersa da nanoemulsão.

[019] As caracterizações físico-químicas realizadas indicaram que houve formação de uma nanoemulsão do tipo O/A (óleo-em-água) com diâmetro médio das gotículas superior a 0,3 nm e inferior a 10 nm (com faixa entre 0,5 nm e 6 nm). O biodesenvolvimento de NEOCACP resultou em um método de preparo simples, contendo as seguintes etapas: (I) pesar e misturar os constituintes da composição, em balança de precisão; (II) aquecimento com temperatura inferior a 70 °C, por 5 minutos; (III) centrifugação a uma velocidade constante durante 10 minutos, resultando na nanoemulsão denominada NEOCACP. As Figuras 3 e 4 mostram parte das caracterizações que foram realizadas.

[020] Figura 3. Diagrama de fases do bioformulado NEOCACP.

[021] Figura 4. Descritivo da análise do diâmetro de gotículas do bioformulado NEOCACP.

[022] Com relação ao biocomponente ACP (água de coco em pó), seu processo de produção em escala industrial encontra-se patenteado (PI1002346-1A2, 2010).

[023] Especificamente, o fruto (coco verde) é selecionado e mediante rigoroso controle de processamento obtém-se o produto ACP. De acordo com o procedimento previamente publicado, o líquido endospérmico do coco, em sua forma processada denominada de ACP, possui estabilidade e longevidade de prateleira, mantendo as propriedades inerentes do produto original (NUNES; SALGUEIRO, 2005). Estudo da eficiência do sistema NEOCACP na cicatrização de feridas cutâneas em modelo experimental

[024] Em um aspecto específico de acondicionamento, a presente invenção descreve a composição NEOCACP contendo OC veiculado e estabilizado na presença de ACP, com ação farmacológica específica para processo de cicatrização. A avaliação do efeito cicatrizante deste bioproduto foi realizada em um período de 14 dias, em ratos Wistar machos, com 120 dias de vida, pesando em média 300g. O estudo in vivo, foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética para Uso Animal da Universidade Potiguar (CEUA/UnP sob registro 0019/240712).

[025] Os animais tratados com NEOCACP sofreram lesões cutâneas induzidas cirurgicamente. Diariamente, foi administrado por via tópica, 1 mL de NEOCACP, no leito da ferida. Ao final do período do estudo, foi realizada a ressecção do tecido cutâneo para biopsia, com encaminhamento para análise histopatológica e procedimento de eutanásia dos animais.

[026] Os resultados revelaram que o princípio bioativo OC nanoformulado acelerou o processo de cicatrização (Figuras 5 a 10), quando comparado aos resultados do grupo controle, com favorecimento de neovascularização e ação fibrinogênica.

[027] Após aplicação pré-clínica o óleo de copaíba encapsulado em nanoemulsão (produto NEOCACP) mostrou ser um agente anti-inflamatório e cicatrizante eficaz, isento de efeitos adversos, como por exemplo, o efeito cáustico, relatado em pesquisas anteriores. Ademais, a formulação NEOCACP mediante processo de aquecimento moderado forma nanoemulsão coloidal O/A resistente (estável) à diluições em água.

[028] A liberação do componente lipofílico OC acontece de forma gradual em tempo prolongado, em função do princípio bioativo OC está nanoemulsionado no formulado NEOCACP que pode ser administrado (no tecido cutâneo) com o uso de seringa ou spray. O formulado NEOCACP tem indicação medicinal fitoterápica para cicatrização de lesões cutâneas, sendo esta, uma área de aplicação medicinal que carece de desenvolvimento tecnológico.

[029] Figura 5. Ferida cirúrgica e o retalho cutâneo realizada no dorso dos animais.

[030] Figura 6. Ferida cirúrgica imediatamente após o procedimento operatório.

[031] Figura 7. Biopsia do tecido cutâneo após o período de tratamento com NEOCACP.

[032] Figura 8. Ferida cirúrgica de um animal do grupo tratado com NEOCACP por 7 dias, evidenciando a formação de tecido granulação e a ausência de crostas.

[033] Figura 9. Ferida cirúrgica do grupo controle após 7 dias do procedimento cirúrgico, evidenciando a formação de crosta grosseira e atraso do processo de reparação tecidual.

[034] Figura 10. Ferida cirúrgica do grupo tratado com NEOCACP após 14 dias do procedimento cirúrgico.

[035] Referências: i) BRITO et al., 1998. Efeitos do óleo de copaíba na cicatrização de feridas cutâneas abertas em ratos. Rev. Para. Med., 12(1), 28-32. ii) BRITO et al., 1999. Aspectos microscópicos da cicatrização de feridas cutâneas abertas tratadas com óleo de copaíba em ratos gr. Rev. Para. Med., 13(1), 12-17. iii) DIAS et al., 2012. Optimization of headspace solid-phase microextraction for analysis of β-caryophyllene in a nanoemulsion dosage form prepared with copaiba (Copaifera multijuga Hayne) oil. Anal. Chim. Acta. 721, 79-84. iv) DIAS et al., 2014. Optimization of Copaiba oil-based nanoemulsions obtained by different preparation methods. Ind. Crops Prodc. 59, 154-162.

Claims (4)

1. Nanoemulsão contendo bioativos naturais caracterizado por compreender formulação nanoemulsionada polar (O/A) resistente a diluições em água, contendo óleo de copaíba veiculado em baixa concentração (0,5% a 2%) em meio aquoso (65% a 80%) salinizado com água de coco em pó (ACP), bem como por estar solubilizado em nanoemulsão, isenta de co-tensoativo, contendo apenas um tensoativo não iônico (Tween® 80) na faixa 15% - 25%;

2. Nanoemulsão contendo bioativos naturais caracterizado por estar de acordo com a reivindicação 1 e conter qualquer tipo de tensoativo (podendo ser iônico ou não iônico) em concentração que compreende a faixa 15% - 25%, estando puro ou em mistura com Tween® 20, 40 ou 80;

3. Método de obtenção de nanoemulsão elaborada com óleo de copaíba caracterizado por estar de acordo com as reivindicações 1 e 2, por submeter os componentes à aquecimento moderado (70 °C - 80 °C) ou suas variações;

4. Método de obtenção da nanoemulsão caracterizado por estar de acordo com as reivindicações 1 e 2, por submeter os componentes a centrifugação sob velocidade constante, durante 5 a 10 minutos (ou suas variações).

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