BR102014032012A2 - processo para obtenção de ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (artepelin c) em extrato de própolis verde utilizando dióxido de carbono supercrítico e co-solvente - Google Patents

Abstract

processo para obtenção de ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (artepelin c) em extrato de própolis verde utilizando dióxido de carbono supercrítico e co-solvente o objetivo da presente patente de invenção é revelar de forma detalhada e reivindicar proteção para as condições de processo e obtenção do extrato de própolis verde, produzida por abelhas no ápice dos arbustos da espécie vegetal alecrim-do-campo (baccharis dracunculifolia), utilizando a tecnologia de extração supercrítica, empregando o dióxido de carbono (co2) como fluído supercrítico extrator com a presença de co-solvente, preferencialmente o álcool etílico, em condições de pressão, temperatura, vazão de co2 e outros parâmetros, previamente estabelecidos, onde o dito extrato pode posteriormente ser utilizado para aplicação comercial em formulações de suplementos, alimentos funcionais, fitoterápicos, fitofármacos, nutracêuticos, cosméticos, entre outros, e contenha em sua composição o ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (artepelin c) além de outros compostos ativos, como compostos fenólicos e flavonoides. as condições de razão de massa de co2 sobre a massa de amostra s/f preferencial é de 110. a obtenção dos extratos com altas quantidades de artepelin c (ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico) podem ser obtidas em temperaturas de 40 a 50°c, pressões de 250 a 350 a 400bar e presença de 1 a 2% de etanol agindo como co-solvente.

Description

PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4-HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE

BREVE APRESENTAÇÃO [001] Trata a presente solicitação de Patente de Invenção (PI) de um inédito processo tecnológico e aplicação dos componentes obtidos do dito processo denominado de PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE, cuja proposta é o de revelar de forma detalhada e reivindicar proteção para as condições de processo e obtenção do extrato de própolis verde, produzida por abelhas no ápice dos arbustos da espécie vegetal alecrim-do-campo (Baccharis dracunculifolia), utilizando a tecnologia de extração supercrítica, empregando o dióxido de carbono (CO2) como fluído supercrítico extrator com a presença de co-solvente, preferencialmente o álcool etílico, em condições de pressão, temperatura, vazão de CO₂ e outros parâmetros, previamente estabelecidos, onde o dito extrato pode posteriormente ser utilizado para aplicação comercial em formulações de suplementos, alimentos funcionais, fitoterápicos, fitofármacos, nutracêuticos, cosméticos, entre outros, e contenha em sua composição o ácido 3,5-diprenyl-4hidroxicinâmico (Artepelin C) além de outros compostos ativos, como compostos fenólicos e flavonoides.

CAMPO DE APLICAÇÃO [002] A presente invenção se destina preferencialmente ao uso na área de alimentos, nutrição, cosmética e farmacêutica, através da disponibilização do componente ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) além de outros compostos ativos do extrato obtido por tecnologia de extração supercrítica da própolis verde, para a elaboração de novos alimentos funcionais, nutracêuticos, suplementos alimentares, produtos cosméticos e de higiene pessoal, ou aplicação em composições fitoterápicas e outros fármacos.

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FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [003] Extração com fluido supercrítico (EFS) é uma operação que explora o poder de solvatação dos fluidos à temperatura e pressão acima de seus valores críticos para extrair ou separar componentes de uma amostra. A aplicação de EFS está baseada na observação experimental de que muitos gases aumentam seu poder de dissolução, quando comprimidos acima do ponto crítico (BRUNNER, 2000; BUDICH & BRUNNER, 2003). O grande interesse da comunidade científica e do setor industrial pela EFS está diretamente relacionado às restrições ao uso de solventes orgânicos, tanto nos processos preparativos de amostras utilizados nas diversas indústrias, junto à maior consciência ecológica no uso destes em diferentes métodos de análise envolvendo extração. A EFS é uma tecnologia de interesse para as indústrias como uma alternativa aos processos convencionais de extração já que esta técnica elimina os problemas de solventes residuais, dispensa a etapa de separação solvente/extrato e permite o uso de baixas temperaturas proporcionando uma menor degradação de compostos termo sensíveis. Isto é fundamental para a extração de produtos naturais onde à qualidade do produto final é de grande importância.

[004] Durante o processo de extração supercrítica em matrizes sólidas, um fluído em seu estado supercrítico preenche o leito formado pelas partículas sólidas escoando de forma a solubilizar os compostos solúveis existentes na matriz. Segundo BRUNNER (1994), o processo de extração consiste de duas etapas bem distintas: extração e separação. Na etapa de extração o solvente em seu estado supercrítico flui através do leito formado pela matriz sólida dilatando sua estrutura celular, diminuindo sua resistência ao transporte de massa, dissolvendo os compostos extraíveis, formando uma fase fluída que é transportada até a saída do extrator por difusão. Durante a segunda etapa a mistura formada pelo extrato e pelo solvente é transferida para o separador que opera a uma pressão mais baixa que a utilizada no extrator. Devido à diminuição da pressão, ocorre uma diminuição na densidade do solvente o que acarreta na diminuição do seu poder de solubilização e por consequência a sua separação do extrato.

[005] A EFS utiliza um fluido supercrítico como solvente para a extração dos compostos de interesse a partir de uma matéria-prima. Um bom solvente supercrítico

3/23 deve apresentar algumas características para poder ser utilizado no processo EFS, deve ser atóxico, não inflamável, possuir baixo custo, ser quimicamente inerte, não deixar resíduo no produto final e possuir pressão (Pc) e temperatura (Tc) críticas moderadas. Dentre os diversos fluídos utilizados em pesquisas no processo supercrítico o dióxido de carbono (CO2) é o fluído mais utilizado por apresentar baixa temperatura crítica (304,2K) e pressão crítica (7,38MPa), condições relativamente fáceis de serem alcançadas (BRUNNER, 1994). O solvente dióxido de carbono supercrítico não é muito eficiente na remoção de substâncias polares de alta massa molecular, mesmo quando se trabalha a altas pressões (BRAGA, 2005). Mesmo com a disponibilidade de fluidos com diferentes poder solvente, é extremamente dispendioso atingir o ponto crítico de determinadas substâncias, como a água, por exemplo, que apesar de ser um solvente extremamente polar, ao contrário do CO2, apresenta temperatura e pressão críticas bastante elevadas. Além disso, alguns fluidos são tóxicos e outros apresentam alta inflamabilidade, tornando a utilização do CO2, puro ou em misturas com modificadores, como o mais atrativo. Uma forma de melhorar o desempenho do CO2 seria adicionar solventes orgânicos polares que possam atuar como co-solvente no processo de extração e que sejam classificados como GRAS (Generally Recognized As Safe - Produtos Reconhecidos como Seguros) de forma a conservar a vantagem ambiental do processo (LEAL et al., 2003), como a água, o etanol e o isopropanol. O uso de modificadores ou cosolventes como o etanol, aumentam o teor de compostos fenólicos nos extratos incrementando a atividade antioxidante dos mesmos.

[006] A EFS possui vantagens sobre as técnicas convencionais de extração: é um processo flexível devido à possibilidade de ajuste contínuo do poder de solvatação e seletividade do solvente; não utiliza solventes orgânicos poluentes; não necessita do dispendioso pós-processamento dos extratos para a eliminação do solvente; a degradação térmica e decomposição de compostos voláteis podem ser evitadas através do emprego de baixas temperaturas e a ausência de luz e oxigênio previne reações de oxidação (REVERCHON & DE MARCO, 2006; DÍAZ-REINOSO et al., 2006).

[007] Própolis é uma denominação genérica utilizada para descrever uma mistura complexa de substâncias resinosas, gomosas e balsâmicas colhidas por abelhas melíferas de brotos, flores e exsudatos de plantas, às quais as abelhas

4/23 acrescentam secreções salivares, cera e pólen para a elaboração do produto final (FUNARI & FERRO, 2006). É considerada uma das misturas mais heterogêneas encontradas em fontes naturais. Mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou caracterizados em diferentes amostras de própolis (RIGHI, 2008).

[008] A própolis do arbusto alecrim-do-campo (Baccharis dracunculifolia), conhecida também como própolis verde, é produzida dos ápices vegetativos desta planta (PARK et al., 2002) que é invasora em várias regiões do Brasil. Entretanto, por razões ainda desconhecidas, esta própolis é produzida fundamentalmente no sul, leste, centro e zona da mata de Minas Gerais, leste de São Paulo, norte do Paraná e em regiões serranas do Espírito Santo e Rio de Janeiro.

[009] A própolis verde de alecrim-do-campo constitui, portanto, um produto tipicamente brasileiro e, devido ao fato de ser altamente eficaz no combate a uma série de microrganismos (BASTOS, 2001; PARK et. al., 2000; MARCUCCI et al., SIMÕES et al., 2008), é altamente valorizada no mercado internacional, sendo que, somente no Japão, movimenta um mercado da ordem de setecentos milhões de dólares ao ano.

[010] A análise química da própolis é muito dificultada devido ao fato de se tratar de uma mistura de produtos que varia de acordo com a flora de cada região e da época do ano. Ultimamente, esta análise tem se concentrado nos extratos aquoso e etanólico porque são os mais usados nos diversos tipos de aplicações terapêuticas (BANKOVA et al. 1999, KUMAZAWA et al. 2003, PARK et al. 2004; SOARES et al., 2006; TAVARES et al., 2006). A técnica mais utilizada é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada a um detector UV/VIS para detectar as moléculas que estão solubilizadas nestes extratos, principalmente o Artepelin C que é característico de própolis verdes.

[011] Se tratando da matriz própolis, a patente chinesa CN 1258511 descreve a extração de compostos ativos da própolis por EFS, onde é demonstrado que os extratos obtidos por CO2 + etanol são ricos em diferentes compostos (polissacarídeos, flavonas e terpenos), sendo, portanto um método eficiente no rendimento e seletividade para o processo extrativo (WU & LUYU, 2000). Na Tabela 1 encontram-se listados os principais trabalhos utilizando a EFS como método para a obtenção de compostos bioativos da própolis de diferentes tipos, com condições de processo diferentes ao reivindicado no presente pedido de patente de invenção.

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Tabela 1. Principais trabalhos publicados sobre a recuperação de compostos bioativos da Própolis utilizando a EFS e condições do processo.

Composto funcional	Atividade funcional	Condições de Extração	Referência
Compostos Fenólicos	Antimicrobiana	CO2, 100-250 bar, 30,	BISCAIA &
Flavonoides	Anti-inflamatória	40 e 50°C	FERREIRA (2009)
Artepelin C (DHCA)	Anti-câncer	CO2 + etanol, 207 bar,	CHEN et al.,
		40,50 e 60°C	(2009a)
Flavonoides	Antioxidante	CO2 + etanol, 276-345	YOU et al., (2002)
		bar, 45°C
Compostos Fenólicos	Antioxidante	CO2, 200 bar, 60°C	WANG, LIEN & YU
			(2004)
Artepelin C (DHCA)	Antioxidante	CO2 + etanol, 50 bar,	LEE et al., (2007)
		50°C
Flavonoides	Antimicrobiana	CO2 + etanol, 300 bar,	CATCHPOLE et al.,
		60°C	(2004)
Artepelin C (DHCA)	Anti-câncer	CO2 + etanol, 200 bar,	CHEN et al.,
		55°C	(2009b)
Compostos Fenólicos	Antimicrobiana	CO2, 150 e 350 bar,	PAVIANI et al.,
	Antioxidante	60°C	(2010)

[012] BISCAIA & FERREIRA (2009) compararam os rendimentos obtidos do extrato de própolis utilizando diferentes procedimentos extrativos, como a EFS utilizando CO2 com e sem co-solvente, bem como por métodos convencionais, Soxhlet e Maceração. O método de EFS utilizando o etanol como co-solvente aumentou o rendimento de extração dos compostos bioativos em cerca de três vezes, em comparação com a extração utilizando apenas CO2. A tecnologia empregada, bem como, os compostos de interesse e aplicação dos extratos obtidos difere do que é solicitado proteção nesse pedido de patente de invenção.

[013] CHEN et al., 2009 avaliou a atividade anticâncer do extrato de própolis através da obtenção do composto ativo Artepelin C (DHCA - ácido 3,5-diprenyl-4hidroxicinâmicos) presente na matriz utilizando a EFS. Em outro estudo foi avaliada a atividade antioxidante sobre lipídios séricos de baixa densidade do Artepelin C

6/23 (DHCA) obtido por EFS (LEE et al., 2007). Apesar do componente de interesse ser semelhante, a aplicação do dito Artepelin C, bem como, os parâmetros de processos são bastante distintos do que é reivindicado proteção, e, portanto, não pode ser considerado como limitante para a solicitação de exclusividade do que é proposto neste documento de patente.

[014] Além do exposto, torna-se importante destacar que a etapa para o desenvolvimento do processo de extração com fluido supercrítico é a determinação das melhores condições de temperatura e pressão para maximizar o rendimento dos compostos de interesse, ou seja, do ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C), e, além disso, minimizar a co-extração de compostos indesejáveis. Para isso foi necessário identificar o comportamento da própolis durante o processo de extração. Os processos de extração serão descritos graficamente por curvas, denominadas curvas globais de extração ou simplesmente curvas de extração. Essa curva foi obtida analisando-se o rendimento do extrato coletado através de toda a cinética de extração. Uma informação importante que a curva fornece é o valor de S/F (massa de CO2/massa de própolis) ideal para extração. Dentro desse contexto foi determinado todas as condições ideais para o processo de extração supercrítica dos compostos bioativos da própolis verde, mais especificamente o ácido 3,5-diprenyl-4hidroxicinâmico (Artepelin C), utilizando dióxido de carbono como solvente extrator e preferencialmente o etanol como co-solvente do processo. Além disso, relata-se a aplicação do dito extrato obtido pela tecnologia de extração supercrítica para a elaboração de novos alimentos funcionais, nutracêuticos, suplementos alimentares, produtos cosméticos e de higiene pessoal, ou aplicação em composições fitoterápicas e outros fármacos.

LITERATURA TÉCNICA ESPECIALIZADA [015] A literatura técnica especializada revela alguns documentos de patentes que fazem referência à utilização da tecnologia de extração supercrítica para obtenção de compostos ativos de diferentes matrizes, como é o caso dos pedidos BR PI 07013418, CN 103859394, BR PI 06054250, BR PI 06040578, BR PI 06038336 e ainda, diferentes processos de obtenção de compostos bioativos da própolis, como PI BR PI 05062438, CN 102772433, BR PI 02027283, EP 2646041,

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BR PI 97063037, CN 102224892, CN 101683360, RU 2372928, RU 2185181, entre outros. Entretanto, é importante destacar que nenhum dos documentos de patente identificados diz respeito à tecnologia com os parâmetros definidos e empregados neste documento de patente, ou seja, a obtenção de extrato de própolis verde contendo o componente principal ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) em elevada quantidade, empregando-se os parâmetros globais de extração otimizados, bem como, a aplicação do dito extrato em diferentes produtos, incluindo, por exemplo, alimentos funcionais, suplementos alimentares, fitomedicamentos, entre outros.

[016] Ampliando o escopo da pesquisa, identificaram-se os documentos de patentes que fazem referência à extração da própolis pelo método de extração supercrítica. Os documentos de maior relevância serão descritos a seguir, entretanto, é importante deixar claro que nenhum deles fere o quesito de novidade da patente de invenção requerida nesse documento. A pesquisa de anterioridade para avaliação da novidade da tecnologia proposta foi realizada na base europeia de patentes, Espacenet, que compila um acervo de patentes depositadas em mais de 90 países.

[017] O documento de patente chinês CN 103611333 diz respeito a um método para a extração supercrítica de agentes naturais de própolis usando fluido de CO2 em combinação com enzimas de estado sólido. O método em questão compreende as etapas de pré-tratamento das matérias-primas (remoção de impurezas, congelamento e esmagamento), e ainda, aplicação de enzimas na matéria-prima, e por fim, a extração com fluido supercrítico utilizando CO2. Os agentes naturais extraídos no processo são basicamente flavonoides na forma de agliconas, como miricetina, quercetina, apigenina e pinocembrina. A invenção referese particularmente a um método de extração que utiliza o CO2 supercrítico e enzimas para a obtenção de alguns flavonoides, e apesar de se tratar da mesma tecnologia reivindicada proteção neste documento de patente, a concretização revelada no documento (CN 103611333) difere consideravelmente do que é solicitado proteção neste documento de patente, e, portanto, não pode ser considerado como limitante para a solicitação de exclusividade do que é proposto neste documento de patente, tendo em vista principalmente a não utilização de co

8/23 solvente, aplicar enzimas, realizar um pré-tratamento específico da própolis, e ainda, os compostos de interesse e os parâmetros do processo serem distintos.

[018] O documento de patente chinês CN 102429140 refere-se a um método de extração supercrítica da própolis com fluido de CO2. O método compreende como etapas a desparafinação, ultracongelação, moagem e granulação da própolis. A extração da própolis com CO2 supercrítico ocorre na presença de pó de cacau. No processo não é utilizado nenhum co-solvente. A invenção mencionada (CN 102429140) não revela a extração do Artepelin C, bem como, os parâmetros de processo são verdadeiramente distintos, e ainda, utiliza no processo o pó de cacau para enriquecimento do extrato, e por isso, não pode ser considerada como limitante, ou seja, como documento do estado da técnica que interfira no direito de exclusividade do que é solicitado nesta patente.

[019] O documento de patente chinês CN 102370667 tem por objetivo descrever um método para a separação da cera da própolis utilizando extração supercrítica com CO2. Ao utilizar o fluido supercrítico para extrair e separar o componente de cera da própolis a baixa pressão, o método preserva outros componentes ativos na matéria-prima, melhorando assim grandemente a qualidade do extrato de própolis. Apesar do documento em questão (CN 102370667) relatar a utilização da matriz própolis e a extração com CO2 supercrítico, os objetos de escopo de proteção são inteiramente distintos, e por isso não pode ser considerado como documento limitante do estado da técnica.

[020] O documento de patente chinês CN 102366098 faz referência ao desenvolvimento de cápsulas moles de própolis e o método de preparação dos mesmos. As cápsulas consistem de 30%-40% de extrato de própolis, 53%-67% de óleo de gérmen de trigo e vitamina E. É relatado ainda que o extrato que compõe a cápsula é elaborada a partir de extração com fluido supercrítico. Apesar do documento em questão (CN 102366098) revelar a tecnologia de extração supercrítica como método para obtenção do extrato, o desenvolvimento do mesmo, bem como, sua aplicação é completamente diferente do que é reivindicado nesta invenção, e, portanto, não é um documento de anterioridade relevante compreendido no estado da técnica.

[021] Com isso, o desenvolvimento e aplicação do dito “PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4-HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM

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EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE” proposto neste documento de patente de invenção possui o parâmetro de novidade, pois até o presente momento nenhum trabalho científico ou técnico compreendido no estado da técnica possui a tecnologia de desenvolvimento, obtenção e aplicação semelhantes. Destaca-se ainda que a tecnologia proposta neste documento de patente de invenção apresenta também os outros critérios de patenteabilidade, como atividade inventiva e aplicação industrial, requisitos estes necessários para a concessão da patente requerida.

VANTAGENS DA INVENÇÃO [022] Alto rendimento do composto de interesse, ou seja, o ácido 3,5-diprenyl-

4-hidroxicinâmico (Artepelin C) no extrato de própolis oriundo do processo requerido;

[023] Tecnologia que não gera solventes residuais, dispensa a etapa de separação solvente/extrato e permite o uso de baixas temperaturas proporcionando uma menor degradação de compostos termo sensíveis da matriz;

[024] Técnica permite a extração de produtos naturais, além do ácido 3,5diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C), com excelente qualidade do produto final;

[025] Processo com elevado rendimento nas condições otimizadas.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [026] A invenção será, a seguir, explicada em seus detalhes, sendo que, a título ilustrativo, são apresentados os seguintes desenhos:

[027] Figura 1 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se fluxograma das etapas para processo de obtenção das condições otimizadas dos extratos de própolis verde por extração supercrítica e aplicação (uso) do dito extrato.

[028] Figura 2 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se o gráfico que representa o quanto de extrato (g) (valores não acumulados) foi extraído em cada tempo na Etapa 1, ou seja, para a determinação do S/F (Perfil da extração em relação à massa de extrato).

10/23 [029] Figura 3 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se gráfico para a determinação da curva global de extração para rendimento em massa de extrato.

[030] Figura 4 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se gráfico para a determinação da curva global de extração para rendimento da atividade antioxidante.

[031] Figura 5 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se gráfico para a determinação da curva global de extração para rendimento em fenólicos totais.

[032] Figura 6 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se o perfil da extração em relação à atividade antioxidante e fenólicos totais (valores não acumulados).

[033] Figura 7 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se a isoterma de rendimento global.

[034] Figura 8 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se a isoterma para o teor de compostos fenólicos totais.

[035] Figura 9 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se a isoterma para o teor de flavonoides.

[036] Figura 10 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se a isoterma para o teor de atividade antioxidante (IC50).

[037] Figura 11 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se o cromatograma obtido para o padrão Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4hidroxicinâmico) avaliado por HPLC.

[038] Figura 12 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se o espectro de UV do padrão Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico) avaliado por HPLC.

[039] Figura 13 - Como forma ilustrativa, e não limitante, apresenta-se o cromatograma obtido para o extrato de própolis verde para identificação da presença de Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico) avaliado por HPLC.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [040] A presente invenção, denominada de “PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4-HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE”, diz respeito ao processo de obtenção de extrato de própolis verde contendo o ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) utilizando a tecnologia de extração supercrítica. No processo, o fluido supercrítico utilizado é o dióxido de carbono (CO₂), com a presença de etanol, utilizado no processo como co-solvente para aumentar o poder extrator. O extrato obtido, a partir das condições otimizadas de processo, possui elevadas concentrações de o ácido 3,5-diprenyl-4hidroxicinâmico (Artepelin C), além de outros componentes, como compostos fenólicos e flavonoides e pode ser utilizado para compor a formulação de alimentos funcionais, fitofármacos, cosméticos, nutracêuticos, entre outros.

[041] As condições de razão de massa de CO2 sobre a massa de amostra S/F preferencial é de 110. A obtenção dos extratos com altas quantidades de Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico) podem ser obtidas em temperaturas de 40 a 50°C, pressões de 250 a 350 a 400bar e presença de 1 a 2% de etanol agindo como co-solvente. Entretanto, destaca-se como condições preferenciais, consideradas como condições ótimas (otimizadas) para obtenção de concentração máxima de Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico), um S/F de 110, presença de 1% de etanol, temperatura de 50°C e pressão de 350bar utilizando dióxido de carbono supercrítico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [042] O “PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE”, objeto desta solicitação de Patente de Invenção (PI), consiste em um processo de obtenção do dito extrato, bem como, a aplicação do mesmo. O desenvolvimento e realização de todas as etapas do processo serão devidamente detalhadas para melhor entendimento da invenção, cujo objetivo final é obter o dito extrato de

12/23 própolis verde a partir da extração com fluido supercrítico na presença de um cosolvente com elevado teor de ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C).

[043] Com isso, para que o processo da invenção possa ser mais bem compreendido e avaliado, sua descrição detalhada será feita a seguir. O processo de obtenção de ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) por extração supercrítica utilizando dióxido de carbono supercrítico compreende as seguintes etapas: Determinação do valor de S/F, definido como a razão da massa de solvente (CO2) e massa de matéria-prima (própolis verde) (1), seguida pela determinação do percentual de co-solvente etanol para aumentar o poder extrativo (2), seguido pela determinação das isotermas de rendimento global (3) e finalizando com a identificação e quantificação de 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) (4). Com isso, é possível aplicar os extratos obtidos nas condições otimizadas (5), com elevado teor de ácido 3,5diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) para a elaboração de novos alimentos funcionais (6), nutracêuticos (7), suplementos alimentares (8), produtos cosméticos e de higiene pessoal (9), ou aplicação em composições fitoterápicas e outros fármacos (10) - Figura 1.

[044] É importante deixar claro que o tipo de equipamento de extração supercrítica utilizado no processo não irá influenciar no processo de extração, tendo em vista que a tecnologia de extração é a mesma para qualquer equipamento, ou seja, o princípio básico das condições supercríticas. Nessa invenção, é necessário para alcançar as condições ótimas desejadas que o fluido supercrítico seja o CO2 e na presença de etanol como co-solvente para melhorar as condições ótimas de extração. Entretanto, há a possibilidade da obtenção do composto de interesse (Artepelin C) sem a presença do co-solvente, não sendo, portanto uma limitação do processo. Para o alcance da otimização do processo de extração e consequente concretização da invenção para obtenção do composto de interesse na própolis (Artepelin C) as extrações foram realizadas na unidade de Extração supercrítica Supercritical Fluids SFT-110, equipada com bomba para dióxido de carbono líquido, rotâmetro, cilindro de CO2 (99% de pureza), totalímetro e uma célula de extração de 100 mL. Entretanto, ressalta-se que equipamentos com células maiores, bem como, a presença de outra bomba para alimentação do co-solvente também podem ser utilizados. O processo se inicia quando o CO2 sai do cilindro em direção à bomba,

13/23 onde o solvente líquido é comprimido para dentro da célula de extração até a pressão programada no experimento. A célula de extração está acoplada dentro do forno controlando-se a temperatura de operação. O solvente fluido percola a matéria-prima extraindo os compostos solúveis e quando atingir a válvula de expansão (micrométrica) terá sua pressão reduzida até pressão ambiente voltando à fase gasosa. Os compostos solúveis no solvente fluido precipitarão no frasco coletor e o solvente na fase gasosa passará por um rotâmetro e depois por um totalímetro, onde terá sua vazão quantificada.

[045] Etapa 1 - Determinação do S/F (1) [046] A fim de determinar a massa de solvente necessária para obter uma quantidade de extrato que fosse suficiente para a realização das análises de composição química realizou-se inicialmente uma cinética piloto utilizando uma condição de pressão branda às estudadas. A cinética piloto foi realizada com o intuito de determinar a quantidade de solvente e, consequentemente, o tempo de extração, necessários para que o período difusional fosse atingido, garantindo que os ensaios de rendimento global apresentassem resultados próximos do esgotamento real do leito de extração, maximizando a quantidade de extrato obtido.

[047] Na cinética piloto de extração foi utilizada a própolis verde obtida do Paraná e foi realizada nas condições de temperatura e pressão brandas (pressão de 100bar e temperatura de 40°C) utilizando 15g de amostra. Em períodos prédeterminados de extração, os frascos de coleta de extratos foram substituídos por outros limpos, e previamente tarados, até que não se percebesse mais a saída de extrato. A massa de extrato contida em cada frasco foram medidas usando balança analítica, e posteriormente foi plotado em gráfico o rendimento acumulado do extrato versus o S/F acumulado correspondente, a fim de se observar o comportamento do sistema. O rendimento global foi calculado através da razão entre a massa de extrato (M extrato) obtida e a massa de própolis (M própolis) utilizada para formar o leito. Analisando o gráfico obtido, foi determinado o S/F a ser adotado nas extrações seguintes. Em cada frasco de coleta além de ser determinado o rendimento de extração foi realizado o teor de fenólicos totais e a atividade antioxidante para o desenvolvimento da curva global de extração. Em relação ao empacotamento da

14/23 amostra e consequente preparo do leito de extração, sugere-se que em uma das extremidades da célula de extração fechada, deverá ser depositada uma camada de lã de vidro em sua base, ou qualquer outro material inerte, acrescentando-se aos poucos a matéria-prima moída empacotando-a com o auxilio de um bastão cilíndrico, para evitar a formação de caminhos preferenciais, e, posteriormente, depositada outra camada de lã de vidro por cima da matéria-prima e fecha-se a célula. Caso a matéria-prima não seja suficiente para ocupar todo o volume da célula, essa será preenchida com pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro.

[048] Etapa 2 - Otimização do uso de co-solvente (2) [049] As atividades biológicas da própolis são atribuídas principalmente à presença dos ácidos fenólicos e flavonoides (MARCUCCI et al., 2001; PEREIRA et al., 2002) os quais possuem característica polar. Devido à característica polar do etanol sua adição ao CO2 supercrítico promove a extração desses compostos que resulta em extratos com maior atividade antioxidante se comparados aos extratos obtidos com CO2 puro. Diversos solventes orgânicos podem ser utilizados como cosolventes na EFS. O etanol é o solvente mais empregado, pois atende as exigências legais para o uso de solventes orgânicos em insumos para a indústria de alimentos. Segundo YOU et al. (2002) os extratos de própolis obtidos com CO2 supercrítico puro são constituídos principalmente de compostos de baixa polaridade como materiais cerosos com poucos flavonoides presentes nestes extratos, pois este solvente apresenta característica apolar extraindo preferencialmente compostos cerosos como hidrocarbonetos e mono ésteres presentes na própolis deixando os compostos de interesse na matriz.

[050] Por isso, nessa etapa foi verificada qual a porcentagem de co-solvente etanol seria utilizado na extração. A partir de testes preliminares verificou-se que a porcentagem de 1 e 2% seriam as mais viáveis. Assim, foi realizada 2 extrações em duplicata utilizando 1% e 2% de etanol em relação à massa de CO₂ utilizada na extração. Esses experimentos foram realizados nas condições de 50°C, 250bar e vazão de 6g/min. O S/F adotado foi o obtido da cinética piloto da etapa anterior (110). A escolha da porcentagem de co-solvente a ser adotada na extração de

15/23 biocompostos da própolis foi feita fazendo-se a caracterização dos extratos (fenólicos totais, atividade antioxidante e flavonoides).

[051] Etapa 3 - Determinação das isotermas de rendimento global (3) [052] As isotermas de rendimento global servem para escolha da pressão e temperatura ideais de extração. Foram escolhidas 2 temperaturas (40 e 50° C) e 3 pressões (250, 350 e 400bar) para a obtenção das isotermas de rendimento global. As condições de extração (S/F e % de co-solvente) foram às escolhidas nas etapas anteriores, 110 e 1%, respectivamente. Ao final das extrações, as isotermas de rendimento global (GYI = Global Yield Isotherms) são apresentadas em gráficos a fim de se observar o comportamento do sistema em diferentes condições de temperatura e pressão. Os extratos de cada ensaio foram caracterizados analisando o teor de fenólicos totais, flavonoides totais e a atividade antioxidante (IC₅o).

[053] Etapa 4 - Determinação do Artepelin C por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência nos extratos de própolis verde [054] Os experimentos cromatográficos foram realizados com sistema HPLC EZChrom Elite, consistindo de bomba VRW HITACHI L-2130, equipado com injetor automático e detector de arranjo de diodo (DAD) VRW HITACHI L-2455 e forno VRW HITACHI L-2300. Foi utilizada coluna LiChroCART Purospher StaR® RP18-e (75 mm x 4 mm i.d.) (3pm) (Merck, Darmastad, Germany) combinado com précoluna LiChroCART 4-4 LiChrospher 100RP18 (5pm) da Merck. As condições de análise foram realizadas com gradiente de eluição conduzido com fase móvel de ácido acético 5% (fase aquosa) e metanol (fase orgânica) em diferentes proporções de acordo com a Tabela 2. O volume de injeção foi de 10 pL. O equipamento foi operado à temperatura ambiente (25 ± 2 °C).

[055] A leitura do detector de arranjo de diodo foi na faixa de 200 a 400 nm e a aquisição cromatográfica definida em 290 nm. A identificação dos compostos foi conduzida pela comparação dos tempos de retenção e do espectro de ultravioleta das amostras com os padrões.

16/23

Tabela 2. Sistema de gradiente da fase móvel para determinação do Artepelin C.

Tempo (min:seg)	Solução de ácido acético 5% (%)	Metanol (%)
0:00	80	20
10:00	70	30
15:00	60	40
30:00	50	50
45:00	40	60
65:00	30	70
65:01	0	100
70:00	80	20

[0561 Resultados para a concretização da Invenção - Determinação do S/F (Etapa 1) [057] Os resultados obtidos através da cinética piloto de extração estão apresentados na Tabela 3. Esses dados são extremamente importantes, pois através deles, pode-se verificar o comportamento da extração ao longo do tempo através da curva global de extração.

[058] Durante o experimento observou-se a necessidade de repetir a cinética piloto com menor quantidade de amostra, pois após 327 minutos de extração ainda observava-se a saída de grande quantidade de extrato, assim demandando um excesso de tempo para terminar a cinética. Adotou-se então 7,5g de própolis para uma nova cinética. O rendimento acumulado obtido e seus correspondentes S/F se encontram na Tabela 4. Na Figura 2 é apresentado quanto de extrato (g) (valores não acumulados) foi extraído em cada tempo.

17/23

Tabela 3. Cinética Piloto de extração de Própolis Verde nas condições de 40°C, 100bar, 6g/min e 15g de própolis.

Número do frasco	Tempo [min]	S/F [massa de CO2/massa de própolis]	Extrato acumulado [g]
1	4,19	3,6408	0,0695
2	13,32	7,2816	0,2142
3	25,26	10,9224	0,2895
4	41,48	16,3836	0,3445
5	57,58	21,8448	0,3716
6	76,00	29,1264	0,4001
7	92,00	36,4080	0,4165
8	111,00	43,6896	0,4303
9	140,00	54,6120	0,4627
10	170,00	65,5344	0,4831
11	197,00	76,4568	0,4990
12	226,00	87,3792	0,5223
13	262,00	98,3016	0,5455
14	297,00	109,224	0,5561
15	327,00	120,1464	0,5699

Tabela 4. Cinética piloto de extração de Própolis Verde nas condições de 40°C,

100bar, 6g/min e 7,5 g de própolis.

S/F

Número do Tempo Rendimento [massa de CO₂/massa de frasco [min] acumulado [%] própolis]

1	8,6800	7,2816	0,8346±0,065
2	18,3950	14,5632	1,2073±0,1329
3	29,4300	21,8448	1,4086±0,1404
4	45,6850	32,7672	1,6146±0,0678
5	58,6800	43,6896	1,7206±0,0329

18/23

6	78,5000	58,2528	1,8926±0,0782
7	100,5000	72,8160	2,0573±0,1989
8	121,5000	87,3792	2,1933±0,2564
9	150,5000	109,2240	2,3960±0,3661
10	187,5000	131,0688	2,5373±0,4091
11	224,5000	152,9136	2,6846±0,4440
12	252,5000	174,7584	2,8286±0,5383
13	288,5000	196,6032	2,9720±0,5977

[059] Os resultados da composição química em cada frasco de coleta encontram-se apresentados na Tabela 5, e as curvas globais de extração são apresentadas nas Figuras 3, 4 e 5.

Tabela 5. Resultados para as análises dos extratos obtidos na cinética piloto de extração utilizando 7,5g de Própolis Verde.

S/F [massa de CO2/massa de própolis]	Fenólicos totais [mgEAG/g de extrato]	Atividade antioxidante [% de capacidade antioxidante]
7,2816	16,619±4,14	25,1769±8,29
14,5632	24,883±3,74	24,5028±2,13
21,8448	15,255±6,69	23,9636±5,14
32,7672	24,401±0,62	31,4122±0,16
43,6896	20,952±10,15	32,1873±0,39
58,2528	22,155±7,14	31,5133±3,67
72,8160	27,530±9,02	38,3552±0,36
87,3792	23,439±22,80	33,3670±8,27
109,2240	18,063±18,9	32,8614±7,20
131,0688	19,588±14,35	24,7387±16,59
152,9136	32,103±6,29	35,3555±6,10
174,7584	31,141±15,33	28,8506±16,69
196,6032	27,771±16,79	38,7259±11,49

[060] Após análises do comportamento da extração via fluído supercrítico da própolis através das curvas globais de extração foi escolhido o S/F de 110. A

19/23 literatura considera sendo o melhor S/F de extração aquele que corresponde à etapa da curva global (do rendimento em massa de extrato) entre o final da taxa crescente de extração e o inicio da taxa decrescente. O período de taxa constante de extração (CER) é aquele no qual há presença de soluto facilmente acessível na superfície das partículas da matriz, estando, assim, a resistência à transferência de massa majoritariamente na região externa à partícula. Nesta situação o processo de transferência de massa é controlado pela convecção (escoamento do solvente). O período de taxa de extração decrescente (FER) é aquele no qual a camada de extrato facilmente acessível na superfície das partículas está se esgotando, uma vez que nem todas as partículas encontram-se revestidas pelo soluto ou a quantidade de células rompidas não é mais uniforme. A taxa de transferência de massa decresce rapidamente como resultado da diminuição da área efetiva de transferência de massa e passa a ser significativo o processo de transferência de massa por difusão. Nessa fase de transição, a resistência à transferência de massa encontra-se concomitantemente na fase sólida e na fase fluida e tanto a convecção quanto a difusão são importantes na extração. Ainda tem a etapa difusional, caracterizado pela ausência de soluto facilmente acessível na superfície das partículas. O Período de taxa constante de extração (CER = Constant Extraction Rate), onde a retirada de extrato da superfície externa da partícula ocorre a uma velocidade aproximadamente constante, por um fenômeno de convecção, geralmente corresponde à cerca de 50 % a 90 % do rendimento total da extração, sendo assim, o processo de otimização deve ser focado dessa região.

[061] Destaca-se ainda que as curvas globais de extração para rendimento em fenólicos totais e atividade antioxidante são elaboradas para a verificação de quanto desses compostos serão extraídos/identificados no S/F escolhido para a extração. Por exemplo, em relação a compostos fenólicos, no S/F de 110, teremos uma extração de 60% dos compostos fenólicos extraíveis, nessas condições, aumentando o S/F para 150, o rendimento de fenólicos não aumenta consideravelmente, tendo apenas um aumento de aproximadamente 8%, o que não justificaria o aumento do custo no processo. Na Figura 6 é apresentado o perfil da extração em relação à atividade antioxidante e fenólicos totais (valores não acumulados).

20/23 [0621 Resultados para a concretização da Invenção - Determinação do percentual de co-solvente - Otimização (Etapa 2) [063] Os resultados encontrados na extração via fluido supercrítico utilizando 1 e 2% de etanol em relação à massa de CO₂ são apresentados na Tabela 6.

[064] Verifica-se pela Tabela 6 que os resultados das análises utilizando 1% de etanol foram melhores que utilizando 2% de etanol, por essa razão escolheu 1% de etanol para dar continuidade aos experimentos. Uma possível explicação para isto é que o etanol possui em suas moléculas o grupo OH o que as torna capazes de formar ligações de hidrogênio entre si. Por outro lado, as moléculas dos compostos polares presentes na própolis também formam ligações de hidrogênio entre si. Então, para que o soluto seja solvatado pelo solvente é necessária à formação de novas ligações de hidrogênio, agora entre as moléculas de etanol e as moléculas dos compostos polares da própolis. A energia necessária para a formação dessas novas ligações é proveniente do rompimento das ligações de hidrogênio entre as moléculas do soluto. No entanto, quando a quantidade de co-solvente (% etanol) é muito alta não haverá energia suficiente para romper as ligações entre as moléculas de etanol e consequentemente menos compostos polares serão solubilizadas pelo solvente ocasionando uma diminuição do rendimento e da atividade antioxidante (MORRISON e BOYD, 1996).

Tabela 6. Caracterização dos extratos supercríticos da própolis utilizando 1 e 2% de etanol.

1% de etanol

2% de etanol

	Fenólicos Totais (mgEAG/g)	IC 50 (pg/mL)	Flavonoides (mg EQ/g)	Fenólicos Totais (mg EAG/g)	IC 50 (pg/mL)	Flavonoides (mg EQ/g)
T1	65,1	175	20,19	52,8	251	18,7
T1	66,9	168	21,92	61,4	197	20,67
T2	90,7	143	29,31	64,8	177	23,19
T2	98,5	95	34,71	87,9	150	29,53
Média	80,3±16,83	145,25±36,20 26,53±6,73	66,72±14,99	193,75±42,75	23,02±4,71

21/23 [0651 Resultados para a concretização da Invenção - Determinação das Isotermas de Rendimento Global (Etapa 3) [066] Foram obtidos diferentes extratos variando pressão (250, 350 e 400bar) e temperatura (40 e 50°C) para elaboração das isotermas de rendimento global, apresentada na Figura 7.

[067] Observa-se, pela Figura 7, que nas pressões de 250 e 350bar o rendimento de extratos é maior na temperatura de 50°C. Já na pressão de 400bar, o rendimento é parecido, mas salienta-se que na temperatura de 40°C ocorreu aumento de rendimento e na temperatura de 50° C houve declinação do rendimento (em relação a pressão anterior, 350bar).

[068] Desta forma, o aumento da densidade (que aumenta com a pressão) aumenta o poder de solvatação do fluído supercrítico, assim como o aumento da temperatura melhora a sua difusividade, e consequentemente a capacidade de extração. Entretanto, altas temperaturas nem sempre são vantajosas, já que elas resultam na redução da densidade do fluido, diminuindo o seu poder solvente (FATTORI et al., 1988). Por esta razão, a definição do binômio pressão/temperatura adequado, determina o sucesso ou não do processo extrativo. A importância da medida de rendimento global reside no fato desta ser uma metodologia eficiente utilizada para selecionar a melhor condição de pressão e temperatura em função do rendimento obtido em uma primeira etapa de desenvolvimento do processo EFS para uma matéria-prima cujo comportamento não está disponível na literatura (MEIRELES, 2003). Nas Figuras 8, 9 e 10 são apresentadas as Isotermas para o teor de compostos fenólicos totais, flavonoides e a atividade antioxidante (IC50).

[069] As isotermas para fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante apresentam o mesmo perfil da isoterma de rendimento global, no qual a extração com 50°C obteve os melhores resultados. Havendo uma melhora considerável na extração dos compostos bioativos quando aumenta-se a pressão de 250 para 350bar. Já ao aumentar a pressão para 450bar observa-se uma diminuição nos compostos fenólicos e na atividade antioxidante na isoterma de 50°C, e um aumento destes na temperatura de 40°C.

[070] Esses resultados apontam a temperatura de 50°C e a pressão de 350bar a ideal para a extração via fluido supercrítico dos compostos bioativos da

22/23 própolis. A solubilidade do soluto aumenta com a pressão de operação a uma temperatura constante devido ao aumento da densidade do solvente (REVERCHON & DE MARCO, 2006). O aumento da temperatura a uma pressão fixa reduz a densidade do SC-CO2 reduzindo então a solubilidade; mas ao mesmo tempo aumenta a pressão de vapor dos compostos a serem extraídos. Sendo assim, a tendência destes compostos passarem para a fase fluida é aumentada.

[071] Resultados para a concretização da invenção - Identificação e quantificação do Artepelin C (Etapa 4) [072] Através da comparação com os tempos de retenção e dos espectros de Ultravioleta (UV) do padrão e das amostras, realizou-se a análise qualitativa dos extratos de própolis, identificando a presença do Artepelin C. O cromatograma e espectro de UV do padrão estão representados nas Figuras 11 e 12.

[073] Na Tabela 7 são apresentados os valores quantificados de Artepelin C por Cromatografia Líquida de Alta eficiência (HPLC) nos extratos de própolis verde obtidos por extração supercrítica, utilizando dióxido de carbono (CO2) como fluido extrator, etanol como co-solvente e uma razão de S/F de 110. As condições de processo são variáveis, com temperaturas de 40 e 50°C, pressão de 250, 350 e 400bar e 1 e 2% de co-solvente (etanol).

Tabela 7. Identificação e quantificação de Artepelin C (média - análise em triplicata) por Cromatografia Líquida de Alta eficiência (HPLC) nos extratos de própolis verde obtidos em diferentes condições de processo, variando temperatura, pressão e percentual de co-solvente.

Pontos (extratos) e condições de Extração - S/F = 110, 5 g de própolis verde	Concentração do Artepelin C (pg/mL)	Concentração do Artepelin C (g/100g)
Pontos de otimização do co-solvente
1 % de Etanol T = 40°C, P = 250bar	546,89	5,47
2% de Etanol T = 40°C, P = 250bar	308,475	3,085
Pontos de otimização da T e P
1 % de Etanol T = 40°C, P = 250bar	649,1	6,49
1 % de Etanol T = 50°C, P = 250bar	799,325	7,995
1 % de Etanol T = 40°C, P = 350bar	778,04	7,78

23/23

1% de Etanol T = 50°C, P = 350bar	893,08	8,935
1 % de Etanol T = 40°C, P = 400bar	786,235	7,86
1 % de Etanol T = 50°C, P = 400bar	565,92	5,66

[074] A partir dos dados apresentados na Tabela 7, a técnica utilizada para verificar o teor de Artepelin C (principal marcador da própolis verde), composto de interesse da presente invenção, foi maior nas condições otimizadas, considerada, portanto como condições ótimas: S/F=110, 1% de etanol, 50°C e 350bar. O cromatograma encontrado é apresentando na Figura 13. Com isso, observa-se a presença média de 893,08 pg/ml no extrato, representado por 8,935g/100g de Artepelin C. Os valores identificados através da curva elaborada com o padrão Artepelin C neste invento comprova o alto teor do composto oriundo das condições empregadas.

[075] Comparando os resultados com de outros estudos que também avaliaram o teor de Artepelin C em amostras de própolis, observa-se que PAVIANE et al. 2012, fez extração supercrítica da própolis e encontrou apenas 0,0524mg de Artepelin/mg de extrato obtido numa pressão de 250bar e temperatura de 50°C e BISCAIA (2007) encontrou 0,0038mg de Artepelin/mg de extrato numa pressão de 150bar, temperatura de 40°C e 5% de co-solvente etanol.

[076] Após revelada com detalhes toda a invenção, bem como as vantagens apresentadas pela mesma, deve, entretanto, mais uma vez ficar claro, que a invenção não está limitada à concretização revelada, pois aqueles com habilidades na técnica irão imediatamente perceber que alterações e substituições podem ser feitas dentro deste conceito inventivo aqui descrito. Desta forma, não pode de forma alguma ser considerada como limitante da invenção, a qual está limitada ao escopo das reivindicações que seguem.

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES

1. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE, CARACTERIZADO POR realizar o processo e obtenção do extrato de própolis, utilizando a tecnologia de extração supercrítica, empregando o dióxido de carbono (CO₂) como fluído supercrítico extrator com a presença de co-solvente, preferencialmente o álcool etílico, onde o dito extrato contenha em sua composição o ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) além de outros compostos ativos, como compostos fenólicos e flavonoides.

2/2 ser obtidas em temperaturas de 40 a 50°C, pressões de 250 a 350 a 400bar e presença de 1 a 2% de etanol agindo como co-solvente, ou ainda, sem a presença de co-solvente.

2. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO POR a matéria-prima empregada para obtenção do produto ser preferencialmente a própolis verde, produzida por abelhas no ápice dos arbustos da espécie vegetal alecrim-do-campo (Baccharis dracunculifolia).

3. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE, de acordo com as reivindicações 1 e 2, CARACTERIZADO POR o processo de obtenção de ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) por extração supercrítica utilizando dióxido de carbono supercrítico compreender as seguintes etapas: Determinação do valor de S/F (1), seguida pela determinação do percentual de co-solvente etanol (2), seguido pela determinação das isotermas de rendimento global (3) e finalizando com a identificação e quantificação de 3,5-diprenyl-4hidroxicinâmico (Artepelin C) (4).

4. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, CARACTERIZADO POR a obtenção dos extratos com altas quantidades de Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico)

Petição 870180149545, de 08/11/2018, pág. 3/7

5. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 e 4, CARACTERIZADO POR as condições preferenciais, consideradas como condições ótimas (otimizadas) para obtenção de concentração máxima de Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico) serem as seguintes: as condições de razão de massa de CO2 sobre a massa de amostra S/F preferencial é de 110, presença de 1% de etanol, temperatura de 50°C e pressão de 350bar utilizando dióxido de carbono supercrítico.

6. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ÁCIDO 3,5-DIPRENYL-4HIDROXICINÂMICO (ARTEPELIN C) EM EXTRATO DE PRÓPOLIS VERDE UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO E CO-SOLVENTE, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, CARACTERIZADO POR o dito extrato obtido nas condições otimizadas (5), apresentar uma quantidade média mínima preferencial de 893,08 pg/ml no extrato de Artepelin C (ácido 3,5-diprenyl-4hidroxicinâmico), representado por 8,935g/100g.

7. PRODUTO, obtido pelo processo das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADO POR o dito extrato obtido nas condições otimizadas (5), com elevado teor de ácido 3,5-diprenyl-4-hidroxicinâmico (Artepelin C) poder ser utilizado para a elaboração de novos alimentos funcionais (6), nutracêuticos (7), suplementos alimentares (8), produtos cosméticos e de higiene pessoal (9), ou aplicação em composições fitoterápicas e outros fármacos (10).