BR102014022854A2

BR102014022854A2 - freezing / cryopreservation process of epididymal semen and / or postmortem freezing

Info

Publication number: BR102014022854A2
Application number: BR102014022854A
Authority: BR
Inventors: Eduardo Gualtieri De Andrade Perez
Original assignee: Eduardo Gualtieri De Andrade Perez
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2014-09-15
Publication date: 2016-05-03
Also published as: WO2016041034A1

Abstract

processo de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem. trata-se a presente patente de invenção, de um processo de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem, proveniente da cabeça e cauda dos epidídimos de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, pertencente às áreas técnicas de biotecnologias aplicadas à reprodução animal e criobiologia. a sua importância refere-se à possibilidade de congelação de amostras de sêmen após a morte de reprodutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético o qual faz parte de um dos maiores bancos de germoplasma do mundo que é o brasileiro. a presente invenção apresenta um processo de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem, permitindo a congelação de amostras de sêmen após a morte de reprodutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético provenientes da cabeça e cauda dos epidídimos de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, através de oito etapas principais: 1.- acondicionamento dos testículos; 2.- lavagem e secagem dos testículos; 3.- extração dos espermatozóides; 4.- análise laboratorial; 5.- diluição; 6.- criopreservação; 7.- congelação e 8.- armazenamento.freezing / cryopreservation process of epididymal semen and / or postmortem freezing. This patent is a process for freezing / cryopreserving epididymal semen and / or postmortem freezing from the head and tail of the epididymis of bovine, buffalo, dog, goat, equine, ovine and porcine animals. to the technical areas of biotechnology applied to animal reproduction and cryobiology. Its importance refers to the possibility of freezing semen samples after the death of high zootechnical breeders in order to conserve genetic material which is part of one of the largest germplasm banks in the world which is the Brazilian. The present invention provides a process for freezing / cryopreserving epididymal semen and / or postmortem freezing, allowing freezing of semen samples after the death of high zootechnical breeders to conserve genetic material from the head and tail of cattle, buffalo, dogs, goats, horses, sheep and swine epididymis, through eight main stages: 1.- wrapping of the testicles; 2.- washing and drying of the testicles; 3.- sperm extraction; 4.- laboratory analysis; 5.- dilution; 6. cryopreservation; 7.- Freezing and 8.- Storage.

Description

PROCESSO DE CONGELAÇÃO/CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EPIDIDIMÁRIO E/OU CONGELAÇÃO PÓS-MORTEMFREEZING / CRYPRESERVATION PROCESS OF EPIDIDIMARY SEMEN AND / OR POST-DEATH FREEZING

[1] Trata-se a presente patente de invenção, de um processo de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem, proveniente da cabeça e cauda dos epidídimos de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, pertencente às áreas técnicas de Biotecnologias aplicadas à Reprodução Animal e Criobiologia.[1] The present invention is a process for freezing / cryopreserving epididymal semen and / or postmortem freezing from the head and tail of the epididymis of bovine, buffalo, dog, goat, equine, ovine and swine, belonging to the technical areas of Biotechnology applied to Animal Reproduction and Cryobiology.

[2] A sua importância refere-se à possibilidade de congelação de amostras de sêmen após a morte de reprodutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético o qual faz parte de um dos maiores bancos de germoplasma do mundo que é o brasileiro.[2] Its importance refers to the possibility of freezing of semen samples after the death of high zootechnical breeders in order to conserve genetic material which is part of one of the largest germplasm banks in the world which is the Brazilian. .

[3] O melhoramento animal com a utilização de material genético de qualidade superior impacta diretamente no desenvolvimento de rebanhos mais rentáveis corroborando a maior produção de alimentos por área. Ainda, em virtude do Brasil ser protagonista no cenário mundial de agropecuária, esta técnica promovería impacto econômico de grande peso na balança comercial. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA[3] Animal breeding using superior genetic material directly impacts the development of more profitable herds corroborating higher feed production per area. Also, because Brazil is a protagonist in the world agricultural scenario, this technique would promote a major economic impact on the trade balance. TECHNICAL BACKGROUNDS

[4] O procedimento de congelação de sêmen epididimário existe para fins únicos e exclusivos de pesquisa em virtude do espermatozóide proveniente dos epidídimos ser um excelente modelo experimental para se estudar a célula espermática de maneira isolada, livre de qualquer interação com o processo ejaculatório e com componentes do plasma seminal. Entretanto, neste caso, não há preocupação nenhuma com a capacidade fecundante dos espermatozóides descongelados, nem tão pouco são amostras preparadas para pronta utilização na inseminação artificial e fecundação in vitro.[4] Epididymal semen freezing procedure exists for sole and exclusive research purposes because epididymis sperm is an excellent experimental model for studying the sperm cell in isolation, free of any interaction with the ejaculatory process and with seminal plasma components. However, in this case, there is no concern about the fecundating capacity of thawed sperm, nor are samples prepared for ready use in artificial insemination and in vitro fertilization.

[5] O processo de congelação pós -mortem, objeto da presente patente, visa preservar material genético de reprodutores após sua morte e/ou castração com grande preocupação com a capacidade fecundante, a concentração de espermatozóide e acondicionamento das amostras provenientes de sêmen epididimário. Ainda, busca-se qualidade de amostras que permita comercialização das mesmas de maneira lucrativa e competitiva, no mercado interno e externo, de maneira a ser mais uma vertente da indústria do sêmen e da genética com elevado potencial de exploração pelo “agrobusiness [6] Assim, a presente patente de invenção tem como objetivo proporcionar facilidades técnicas e operacionais configurando um excelente modelo experimental para pesquisas na área de fisiologia espermática. DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO[5] The postmortem freezing process, object of the present patent, aims to preserve genetic material of breeders after their death and / or castration with great concern with the fecundating capacity, sperm concentration and conditioning of epididymal semen samples. Still, we seek quality samples that allow them to be profitably and competitively marketed, both domestically and abroad, in order to be another aspect of the semen industry and genetics with high exploitation potential by “agrobusiness” [6] Thus, the present invention aims to provide technical and operational facilities by configuring an excellent experimental model for research in the field of sperm physiology. BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

[7] A presente invenção apresenta um processo de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem, permitindo a congelação de amostras de sêmen após a morte de reprodutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético provenientes da cabeça e cauda dos epidídimos de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, através de oito etapas principais: 1.- Acondicionamento dos testículos; 2 - Lavagem e secagem dos testículos; 3. - Extração dos espermatozóides; 4. - Análise laboratorial; 5. - Diluição; 6. - Criopreservação; 7. - Congelação; e 8. - Armazenamento.[7] The present invention provides a process for freezing / cryopreserving epididymal semen and / or postmortem freezing, allowing the freezing of semen samples after the death of high zootechnical breeders to conserve genetic material from the head. and tail of bovine, buffalo, dog, goat, horse, sheep and pig epididymis, through eight main stages: 1. Wrapping of the testicles; 2 - Washing and drying of the testicles; 3. - Sperm extraction; 4. - Laboratory analysis; 5. - dilution; 6. - Cryopreservation; 7. - freezing; and 8. - Storage.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[8] O processo de congelaçao/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem, se inicia após a morte ou castração de um reprodutor do grupo que consiste em bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, onde os testículos são retirados por procedimento cirúrgico (no caso de óbito, os testículos podem ser removidos de 0 a 12 horas após a morte), de acordo com as seguintes etapas: 1. - Acondicionamento dos testículos: 1.1. - os testículos devem ser acondicionados em um saco plástico onde deverá conter o volume de 0,5 a 1 litro de Dullbeco’s Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS), Solução salina fisiológica -NaCl 0,9% - (soro fisiológico), Ringer Lactato, Agua de côco ou mesmo soro caseiro, para cada par de testículo; 1.2. - o saco deve ser lacrado retirando-se todo o volume de ar que for possível; 1.3. - coloca-se dentro de uma caixa de isopor cobre-se com uma camada de 20 centímetros de gelo em cubos comercial e o espaço vazio é preenchido com plástico bolha comercial; 1.4. - os testículos poderão permanecer neste sistema térmico de refrigeração por um tempo de 1 a 72 horas, durante o transporte para o laboratório; 2. - Lavagem e secagem dos testículos: 2.1. - após a recepção são retiradas as túnicas testiculares e os mesmos são submetidos à lavagem com álcool 70° GL; 2.2. - os testículos são então enxutos com papel toalha descartável comercial e estão prontos para o início do procedimento; 3. - Extração dos espermatozóides: 3.1. - A extração dos espermatozóides poderá ser realizada de duas maneiras: 3.1.1. - a primeira denominada “fatiamento”, onde a cabeça do epidídimo é pinçada e com o uso de um bisturi com lâmina descartável realiza-se cortes longitudinais e transversais em toda a área determinada evitando-se a ocorrência de ruptura dos pequenos vasos sanguíneos presentes; 3.1.2. - a segunda maneira consiste em se divulsionar o epidídimo e lavar o lúmen dos túbulos seminíferos com DMPBS, ou soro fisiológico ou Ringer Lactato, o lavado escorre para a superfície de uma placa de Petri e é recuperado por aspiração; 3.2. - a medida que os cortes são realizados e ou o lavado é obtido, colhe-se o conteúdo com o auxílio de uma pipeta e armazena-se o material em um tubo contendo lmL diluente Kenney simples ou acrescido de rafinose, ou DMPBS, ou soro fisiológico, ou Ringer Lactato ou Agua de côco; 4. - Análise laboratorial: 4.1. - todo material recolhido segue segue então para análise onde são avaliados os seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetória, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraestruturas tais como membrana, acrossoma, mitocôndrias e DNA; 5. - Diluição: 5.1. - uma vez estabelecidos estes parâmetros, as amostras são diluídas em meio comercial ou de fabricação própria para a criopreservação, podendo ser a base de: 1) Glicina-gema-leite (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%) 2) Tris-gema-citrato (2 - 20%) com glicerol(4 - 15%) 3) Tris-gema-frutose (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%) 4) Glicina-gema-leite (2 - 20%) com glicerol e Dimetil Formamida (2- 10%) 5) Tris-frutose-Dimetilsulfóxido (2 - 10%) 6) Tris-lecitina de soja-frutose (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%) a eleição do diluente depende das características inerentes à cada espécie (bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos, suínos) e particularidades individuais e a diluição visará a obtenção de alíquotas (doses de sêmen) com concentrações compreendidas entre 8,4x106 e 400x 106 espermatozóides por mL; 6. - Criopreservação: 6.1. - as doses de sêmen são envasadas em palhetas francesas de 0,25 e/ou 0,5 mL devidamente identificadas; 6.2. - as palhetas são obliteradas/lacradas com álcool polivinílico, ou esferas de metal, ou massa atóxica, ou à alta temperatura; 6.3, - após o envase e obliteração das palhetas, as doses são submetidas às curvas de resfriamento compreendidas entre -0,1 e -1°C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celcius); 6.4, - as doses serão mantidas à esta temperatura por um período de tempo compreendido entre 1 minuto e 10 minutos para estabilização e, quando diluídas com meios contendo glicerol, glicerolização das membranas, o tempo de estabilização/glicerolização será entre 15 minutos (mínimo) e 240 minutos (máximo) dependendo das características espécie-específicas e individuais; 7. - Congelação: Vencida esta etapa da biotecnologia da cri opreserv ação, segue a congelação a qual ocorre por curvas compreendidas entre -5 e -30°C por minuto até atingirem o patamar de -120°C (graus Celcius); e 8,- Armazenamento: uma vez congeladas as doses de sêmen serão acondicionadas em raques de crioarmazenamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogênio líquido à uma temperatura de -196°C (graus Celcius) por tempo indeterminado.[8] The freezing / cryopreservation process of epididymal semen and / or postmortem freezing begins after the death or castration of a breeder from the group consisting of cattle, buffaloes, dogs, goats, horses, sheep and pigs, where the testicles are removed by surgical procedure (in the event of death, the testicles may be removed from 0 to 12 hours after death) according to the following steps: 1. Conditioning of the testicles: 1.1. - the testicles shall be packed in a plastic bag in which the volume of 0,5 to 1 liter of Dullbeco's Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS), 0.9% NaCl (Saline), Ringer Lactate (saline), Coconut water or even homemade serum for each pair of testicles; 1.2. - the bag must be sealed by removing as much air as possible; 1.3. - It is placed inside a Styrofoam box, covered with a 20 cm layer of commercial cubed ice and the empty space is filled with commercial bubble wrap. 1.4. - the testicles may remain in this thermal refrigeration system for 1 to 72 hours during transport to the laboratory; 2. - Washing and drying of the testicles: 2.1. - Upon receipt, the testicular tunics are removed and rinsed with 70 ° GL alcohol; 2.2. - the testicles are then dried with commercial disposable paper towels and are ready for the start of the procedure; 3. - Extraction of sperm: 3.1. - Sperm extraction can be done in two ways: 3.1.1. - the first one called “slicing”, where the head of the epididymis is clamped and with the use of a disposable blade scalpel, longitudinal and transverse cuts are made throughout the determined area, avoiding the rupture of the small blood vessels present; 3.1.2. - the second way is to divulge the epididymis and wash the lumen of the seminiferous tubules with DMPBS, or saline or Ringer lactate, the wash drains to the surface of a petri dish and is recovered by aspiration; 3.2. - As cuts are made and or washed, the contents are collected with the aid of a pipette and the material is stored in a tube containing 1mL diluted Kenney or raffinose, or DMPBS, or serum. physiological, or Ringer Lactate or Coconut Water; 4. - Laboratory analysis: 4.1. - All collected material then follows for analysis where the following parameters are evaluated: concentration, motility, trajectory, movement type, range of motion, pathologies and damage to ultrastructures such as membrane, acrosome, mitochondria and DNA; 5. - Dilution: 5.1. - Once these parameters are established, the samples are diluted in commercial or cryopreservation medium and may be the basis of: 1) Glycine-yolk (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) 2 ) Tris-yolk citrate (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) 3) Tris-yolk citrate (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) 4) Glycine-yolk (2 - 20%) with glycerol and Dimethylformamide (2- 10%) 5) Tris-fructose-Dimethylsulfoxide (2 - 10%) 6) Soy-fructose tris-lecithin (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) ) The choice of diluent depends on the inherent characteristics of each species (cattle, buffalo, dogs, goats, horses, sheep, pigs) and individual characteristics and dilution will aim to obtain aliquots (semen doses) with concentrations between 8.4x106. and 400x10 6 sperm per mL; 6. - Cryopreservation: 6.1. - the semen doses are filled in properly identified 0.25 and / or 0.5 mL French straws; 6.2. - the blades are obliterated / sealed with polyvinyl alcohol or metal spheres or non-toxic mass or at high temperature; 6.3, - after filling and obliterating the blades, the doses are subjected to cooling curves between -0.1 and -1 ° C per minute until reaching the level of 5 ° C (degrees Celcius); 6.4, - the doses will be kept at this temperature for a period of time ranging from 1 minute to 10 minutes for stabilization and, when diluted with glycerol containing media, membrane glycerolization, the stabilization / glycerolization time will be between 15 minutes (minimum). and 240 minutes (maximum) depending on species-specific and individual characteristics; 7. Freezing: After this stage of cryopreservation biotechnology has been completed, it follows freezing which occurs by curves ranging from -5 to -30 ° C per minute until reaching a plateau of -120 ° C (degrees Celcius); and 8, - Storage: Once frozen, semen doses will be stored in cryopreservation racks and stored in cryogenic canisters containing liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C (degrees Celcius) indefinitely.

EXEMPLO DE OBTENÇÃOOBTAINING EXAMPLE

[9] A seguir será apresentado um exemplo de aplicação do invento realizado utilizando-se testículos de um Touro abatido, onde os testículos foram retirados por procedimento cirúrgico, de acordo com as seguintes etapas: E- Acondicionamento dos testículos: 1.1. - os testículos foram acondicionados em um saco plástico onde continha o volume de 1 litro de Dullbeco’s Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS), para o par de testículos; 1.2. - o saco foi lacrado retirando-se todo o volume de ar que foi possível; 1.3. - Colocou-se dentro de uma caixa de isopor cobriu-se com uma camada de 20 centímetros de gelo em cubos e o espaço vazio foi preenchido com plástico bolha comercial; 1.4. - Os testículos permaneceram neste sistema térmico de refrigeração por um tempo de 30 horas, durante o transporte para o laboratório; 2. - Lavagem e secagem dos testículos: 2.1, - após a recepção foram retiradas as túnicas testiculares e os mesmos foram submetidos à lavagem com álcool 70 GL; 2.2. - os testículos forma então enxutos com papel toalha descartável comercial e ficaram prontos para o início do procedimento; 3. - Extração dos espermatozóides: 3.1. - A extração dos espermatozóides foi realizada através de “fatiamento”, onde a cabeça do epidídimo foi pinçada e com o uso de um bisturi com lâmina descartável realizou-se cortes longitudinais e transversais em toda a área determinada evitando-se a ocorrência de ruptura dos pequenos vasos sanguíneos presentes; 3.2. - a medida que os cortes foram sendo realizados, colheu-se o conteúdo com o auxílio de uma pipeta e armazenou-se o material em um tubo contendo lmL diluente Kenney; 4. - Análise laboratorial: 4.1. - todo material recolhido seguiu então para análise onde foram avaliados os seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetória, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraestruturas tais como membrana, acrossoma, mitocôndrias e DNA; 5. - Diluição: 5.1. - uma vez estabelecidos estes parâmetros, as amostras foram diluídas em meio comercial para a criopreservação a base de gema de ovo (20%) com glicerol (7%); a diluição visou a obtenção de alíquotas (doses de sêmen) com concentrações de 20x106 espermatozóides por mL; 6. - Criopreservação: 6.1. - as doses de sêmen foram envasadas em palhetas francesas de 0,25cc devidamente identificadas; 6.2. - as palhetas foram obliteradas com álcool polivinílico; 6.3. - após o envase e obliteração das palhetas, as doses foram submetidas à curva de resfriamento de -0,25°C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celsius); 6.4. - as doses foram mantidas à esta temperatura por um período de tempo de 60 minutos para estabilização e glicerolização das membranas plasmática e acrossomais dos espermatozóides; 7, - Congelação: Vencida esta de resfriamento, seguiu-se a congelação a qual se deu por curva de -20°C por minuto até atingirem o patamar de -120°C (graus Celsius); 8. - Armazenamento: Uma vez congeladas à 120 °C as doses de sêmen foram acondicionadas em raques de crioarmazenamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogênio líquido à uma temperatura de -196°C (graus Celsius).[9] The following is an example of an application of the invention using testicles from a slaughtered bull, where the testicles were removed by surgical procedure according to the following steps: E-Conditioning of the testicles: 1.1. - the testicles were packed in a plastic bag containing the 1 liter volume of Dullbeco's Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS) for the testis pair; 1.2. - the bag was sealed by removing as much air as possible; 1.3. - Placed inside a Styrofoam box, covered with a 20 cm layer of diced ice and the empty space was filled with commercial bubble wrap; 1.4. - The testicles remained in this thermal cooling system for 30 hours during transport to the laboratory; 2. - Washing and drying of the testes: 2.1, - Upon receipt, the testicular tunics were removed and subjected to washing with alcohol 70 GL; 2.2. - the testicles then dried with commercial disposable paper towels and were ready for the start of the procedure; 3. - Extraction of sperm: 3.1. - Sperm extraction was performed through “slicing”, where the epididymis head was clamped and with the use of a disposable blade scalpel, longitudinal and transverse cuts were made throughout the determined area, avoiding the occurrence of rupture of the epididymis. small blood vessels present; 3.2. - As the cuts were made, the contents were collected with the aid of a pipette and the material stored in a tube containing 1mL Kenney diluent; 4. - Laboratory analysis: 4.1. - All collected material was then analyzed for the following parameters: concentration, motility, trajectory, type of movement, range of motion, pathologies and damage to ultrastructures such as membrane, acrosome, mitochondria and DNA; 5. - Dilution: 5.1. - Once these parameters were established, the samples were diluted in commercial medium for egg yolk cryopreservation (20%) with glycerol (7%); the dilution aimed to obtain aliquots (semen doses) with concentrations of 20x106 sperm per mL; 6. - Cryopreservation: 6.1. - the semen doses were filled in properly identified 0.25cc French straws; 6.2. - the blades were obliterated with polyvinyl alcohol; 6.3. - after filling and obliterating the blades, the doses were subjected to a cooling curve of -0.25 ° C per minute until reaching the level of 5 ° C (degrees Celsius); 6.4. - doses were maintained at this temperature for a period of 60 minutes for stabilization and glycerolization of sperm plasma and acrosomal membranes; 7, - Freezing: After cooling, this was followed by freezing, which was curved at -20 ° C per minute to -120 ° C (degrees Celsius); 8. - Storage: Once frozen at 120 ° C, semen doses were stored in cryopreservation racks and stored in cryogenic canisters containing liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C (degrees Celsius).

VANTAGENS OBTIDAS COM O INVENTOADVANTAGES OBTAINED FROM THE INVENTION

[10] O processo assim obtido, oferece as seguintes e extraordinárias vantagens: - Preservação de material genético de um dado animal tido como superior, mesmo após a morte; - Maior produção de descendentes; - Comercialização do material genético; - Melhor congelabilidade dos espermatozóides; - Maior facilidade de processamento para criopreservação; - Excelente modelo experimental para o desenvolvimento de biotecnologias com emprego de sêmen animal; e - Bloqueio de efeitos e interações nocivos e/ou indesejáveis inerentes ao plasma seminal.[10] The process thus obtained offers the following extraordinary advantages: - Preservation of genetic material of a given animal considered superior even after death; - Higher production of descendants; - Marketing of genetic material; - Better sperm freezability; - Easier processing for cryopreservation; - Excellent experimental model for the development of biotechnology using animal semen; and - Blocking harmful and / or undesirable effects and interactions inherent in seminal plasma.

[11] A abrangência da presente patente de invenção, não deve ser limitada ao exemplo, mas sim, aos termos definidos na reivindicação e seus equivalentes.[11] The scope of the present invention should not be limited to the example but to the terms defined in the claim and their equivalents.

REIVINDICAÇÃOCLAIM

Claims

1 POSITIVE EPIDIMARY SEMEN AND / OR FREEZING / CRIOPRESERVATION PROCESS, which begins upon the death or castration of a breeder from the group consisting of cattle, buffaloes, dogs, goats, horses, sheep and pigs, where Testicles are removed by surgical procedure (in the case of death, the testicles may be removed from 0 to 12 hours after death), characterized by the following steps: 1.

- Conditioning of the testicles: 1.1.

- the testicles shall be packed in a plastic bag in which the volume of 0,5 to 1 liter of Dullbeco's Modified Phosphate Buffered Solution (DMPBS), 0.9% NaCl (Saline), Ringer Lactate (saline), Coconut water or even homemade serum for each pair of testicles; 1.2.

- the bag must be sealed by removing as much air as possible; 1.3.

- It is placed inside a Styrofoam box, covered with a 20 cm layer of commercial cubed ice and the empty space is filled with commercial bubble wrap. 1.4.

- the testicles may remain in this thermal refrigeration system for 1 to 72 hours during transport to the laboratory; 2.

- Washing and drying of the testicles: 2.1.

- Upon receipt, the testicular tunics are removed and rinsed with 70 ° GL alcohol; 2.2. - the testicles are then dried with commercial disposable paper towels and are ready for the start of the procedure; 3. - Extraction of sperm: 3.1. - Sperm extraction can be done in two ways: 3.1.1. - the first one called “slicing”, where the head of the epididymis is clamped and with the use of a disposable blade scalpel, longitudinal and transverse cuts are made throughout the determined area, avoiding the rupture of the small blood vessels present; 3.1.2. - the second way is to divulge the epididymis and wash the lumen of the seminiferous tubules with DMPBS, or saline or Ringer lactate, the wash drains to the surface of a petri dish and is recovered by aspiration; 3.2. - As cuts are made and or washed, the contents are collected with the aid of a pipette and the material is stored in a tube containing 1mL diluted Kenney or raffinose, or DMPBS, or serum. physiological, or Ringer Lactate or Coconut Water; 4. - Laboratory analysis: 4.1. - evaluation of the following parameters: concentration, motility, trajectory, type of movement, range of motion, pathologies and damage to ultrastructures such as membrane, acrosome, mitochondria and DNA; 5. - Dilution: 5.1. - Once these parameters are established, the samples are diluted in commercial or cryopreservation medium and may be the basis of: 1) Glycine-yolk (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) 2 ) Tris-yolk citrate (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) 3) Tris-yolk citrate (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) 4) Glycine-yolk (2 - 20%) with glycerol and Dimethyl Formamide (2- 10%) 5) Tris-fructose-Dimethylsulfoxide (2 - 10%) 6) Soya-fmtose Tris-lecithin (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) ) The choice of diluent depends on the inherent characteristics of each species (cattle, buffalo, dogs, goats, horses, sheep, pigs) and individual characteristics and dilution will aim to obtain aliquots (semen doses) with concentrations between 8.4x106. and 400x10 6 sperm per mL; 6. - Cryopreservation: 6.1. - the semen doses are filled in properly identified 0.25 and / or 0.5 mL French straws; 6.2. - the blades are obliterated / sealed with polyvinyl alcohol or metal spheres or non-toxic mass or at high temperature; 6.3. - After filling and obliterating the blades, the doses are subjected to cooling curves between -0.1 and -1 ° C per minute until reaching the level of 5 ° C (degrees Celcius); 6.4. The doses will be kept at this temperature for a period of time ranging from 1 minute to 10 minutes for stabilization and, when diluted with glycerol containing media, membrane glycerolization, the stabilization / glycerolization time will be between 15 minutes (minimum). and 240 minutes (maximum) depending on species-specific and individual characteristics; 7. - Freezing: After this stage of cryopreservation biotechnology has been completed, it follows freezing which occurs by curves ranging from -5 to -30 ° C per minute until reaching a plateau of -120 ° C (degrees Celcius); and 8, - Storage: Once frozen, semen doses will be stored in cryopreservation racks and stored in cryogenic canisters containing liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C (degrees Celcius) indefinitely.