BR102014022484A2 - processo de obtenção de um sistema híbrido, sistema híbrido e seu uso - Google Patents

Abstract

processo de obtenção de um sistema híbrido, sistema híbrido e seu uso. a presente invenção provê o processo de obtenção de um sistema híbrido à base de hidrogel de polímeros biocompatíveis e nanopartículas mesoporosas de sílica incorporadas com fármacos, bem como o sistema híbrido e seu uso no tratamento antitumoral. mais especificamente, o sistema híbrido desta invenção compreende a doxorrubicina (dox) e/ou sildenafila como fármacos incorporados nos poros das nanopartículas, com objetivo de produzir um novo material para tratamento antitumoral, em especial no tratamento do câncer de próstata.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UM SISTEMA HÍBRIDO, SISTEMA HÍBRIDO

E SEU USO

Campo da invenção: [1] Δ invenção ora descrita se insere no campo da nanotecnologia, particularmente aplicada à área médica, e descreve o processo de obtenção de um sistema hibrido à base de hidrogel de polímeros biocompatíveís e nanopartícuias raesoporosas de sílica incorporadas com fármacos antitumorais. [2] Adicionalmente, a invenção descreve o referido sistema hibrido e seu uso no tratamento antitumoral, em especial no tratamento do câncer de próstata.

Fundamentos da invenção: [3] 0 enorme potencial da nanotecnologia gerou uma competitividade entre paises de todo o mundo, alavancando a busca e a produção de novos nanomateriais nas mais diversas áreas, dentre elas, a medicina, no que diz respeito aos medicamentos em nanoescala. [4] Ά nanotecnologia engloba aspectos como o design, a caracterização, a produção e a aplicação de estruturas pelo controle da forma e do tamanho em escala nanométrica. Os chamados nanomateriais referem-se àqueles cujo tamanho varia na escala nanométrica e que apresentam propriedades e funções distintas de materiais de mesma composição com dimensões maiores. [5] Tais propriedades são resultado tanto dos efeitos quânticos, que passam a dominar o comportamento da matéria em dimensões muito pequenas (modificando, dessa forma, as propriedades ópticas, elétricas e magnéticas) quanto à alta razão área/volume das nanopartícuias. Além da elevada área superficial, nanomateriais apresentam alta reatividade de superfície em razão de seu menor número de coordenação e da maior exposição a espécies reativas. [6] O uso dos nanomateriais para liberação sustentada de fármacos apresenta inúmeras vantagens sobre o uso de fármacos livres. Esses sistemas melhoram a solubilidade de determinadas moléculas e previnem a degradação prematura do fármaco. Ainda, como podem ser alvo-específicos, aumentam a concentração do fármaco nos tecidos de interesse, fazendo com que sejam necessárias menores doses. [7] Um nanocarreador hipotético ideal deve atender aos seguintes critérios: ser composto de material biocompatível e biodegradável, ter alta capacidade de carregar fármacos, possuir mecanismo de liberação que seja sítio-específico, não liberar o fármaco de maneira prematura e, por fim, possuir um mecanismo de liberação controlada para atingir uma dose efetiva no sítio alvo. [8] Nanopartícuias porosas de sílíca possuem ótimas perspectivas de serem utilizadas como sistemas de liberação de fármacos e têm demonstrado alta biocompatibilidade e perfil de segurança, encorajando investigações que levem à pesquisa clínica. Essas partículas possuem elevada área superficial e grande volume dos poros, podendo carregar diversos fármacos simultaneamente, mesmo aqueles com propriedades físico-químicas distintas. Adicionalmente, são facilmente funcionalizadas e convenientes para carrear fármacos e biomoléculas. [9] Uma forma eficiente de sintetizar nanopartícuias porosas de sílica baseia-se em uma modificação do método de Stõber, um método sol-gel em que alcóxidos de silício são usados como precursores e, a partir de reações de hidrólise e condensação em meio amoniacal, forma-se uma nova fase sol em que as partículas coloidais são condensadas. O meio reacional ainda conta com a presença de etanol como agente homogeneizador e um surfactante catiônico (haletos de cetil trimetilamônio) que gera os poros. [10] Por meio de adaptações no método de Stõber, é possível produzir partículas porosas com alta estabilidade coloídal, diferentes tamanhos, bem como alto valor de área superficial. [11] Além de possibilitar a liberação de mais de um fãrmaco simultaneamente, as nanopartículas porosas de sílica apresentam baixa toxicidade, diferenciando-se da maioria dos nanomateriais inorgânicos, o que lhes confere uma gama versátil de aplicações biomédicas. [12] Embora bons resultados estejam sendo obtidos nas investigações desses nanomateriais para uso no tratamento antitumoral, são necessários mais estudos para determinar o comportamento dessas estruturas no sangue e outros ambientes biológicos. [13] Como a atividade biológica dos nanomateriais está diretamente relacionada à sua morfologia (tamanho e forma da partícula, tamanho dos poros, bem como propriedades da superfície), é possível modificar esses parâmetros de maneira a obter nanoestruturas mais biocompatíveis. [14] Nesse contexto, o Pluronic F-127 é um copolímero de bloco constituído por monômeros PEO-PPO-PEO, o qual tem propriedades biocompatíveis e termorreversíveis. [15] Sua temperatura de transição líquido-gel encontra-se próxima à temperatura ambiente, o que o torna excelente para formulações farmacêuticas com o objetivo de obter uma liberação prolongada de fármacos e gelificação in situ. Os hidrogéis representam uma alternativa promissora na liberação sustentada de fármacos, uma vez que são biocompativeis e podem ser administrados de maneira praticamente não invasiva. [16] A liberação sustentada pode ser controlada por meio de diversos estímulos, como temperatura ou pH, além da possibilidade de variar a estrutura química das cadeias poliméricas de maneira a controlar as propriedades físico-químicas do hídrogel, conforme a aplicação desejada. [17] Tendo em vista o potencial das nanoestruturas para liberação sustentada de fármacos, tratamentos contra vários tipos de câncer utilizando esses materiais têm sido amplamente considerados e o emprego da nanotecnologia para o desenvolvimento de variadas quimioterapias tornou-se uma opção terapêutica valiosa. [18] Dentre os vários tipos de câncer, o câncer de próstata possui alta probabilidade de incidência, sendo considerado uma doença epitelial que, frequentemente, se estende além dos limites normais do órgão. [19] Em face do papel estratégico dos quimioterápicos e da dificuldade de obtenção de novas terapias, destaca-se a associação de nanomateriais e fármacos já empregados neste tratamento, como a doxorrubicina (DOX). [20] A DOX é um antibiótico antitumoral de largo espectro, amplamente utilizado para o tratamento de vários cânceres, incluindo mama, ovário e próstata. A eficácia da DOX é limitada, devido à sua alta toxicidade e efeitos colaterais, os quais envolvem mielossupressão, alopécia, náuseas, vômitos, cardiotoxicidade e resistência após a administração de doses repetidas. [21] Ainda, a sildenafila desponta como alternativa para minimizar os efeitos colaterais causados pela DOX. Diferentes estudos demonstraram que a sildenafila promove efeito protetor contra a insuficiência e isquemia cardíaca induzida por DOX. [22] Em vista do exposto, a presente invenção provê o processo de obtenção de um sistema híbrido à base de hidrogéis de polímeros biocompatíveis e nanopartícuias mesoporosas de sílica incorporadas com fármacos com potencial antitumoral, bem como o referido sistema híbrido e seu uso no tratamento antitumoral. [23] Especificamente, o sistema híbrido desta invenção compreende o fármaco DOX, associado à sildenafila ou não, como fármacos incorporados nos poros das nanoparticulas, com objetivo de produzir um novo material biocompatível para tratamento de câncer de próstata.

Estado da técnica: [24] A tecnologia descrita na presente invenção se refere ao processo de obtenção de um sistema híbrido, em que o sistema híbrido é composto por um hidrogel de polímeros biocompatíveis e nanoparticulas mesoporosas de sílica compreendendo DOX e/ou sildenafila incorporada bem como o referido sistema híbrido e seu uso no tratamento antitumoral, preferencialmente do câncer de próstata. [25] Diversos documentos disponíveis no estado da técnica relatam a utilização de termogéis de polímeros biocompatíveis aplicados a procedimentos de liberação controlada de fármacos. [26] Além disso, também são conhecidos documentos que descrevem nanoparticulas mesoporosas de sílica contendo fármacos antitumorais incorporados, formando sistemas aplicados para tratamento do câncer. [27] Em US6369037B1, faz-se referência a um hidrogel composto de dextran-metacrilato como carreador, cujo processo de obtenção utiliza solventes orgânicos. No entanto, a invenção descrita não utiliza nanoparticulas para incorporação do fármaco, tal como proposto na presente invenção. [28] O documento US6632457B1 propõe a formação de compósitos de hidrogéis para a liberação controlada de fármacos. No entanto, nanoparticulas não fazem parte da invenção e surfactantes são propostos como agentes de transferência de fase e não como matriz do hidrogel. [29] O documento US20120207795A1 revela nanoparticulas TV» /‘ ' 'v V\ Λ ’V“v /*S y-N (—* ~1 1 -l y—«i —V γ-s s-y*' —X /“S —w ·*ν* yy' —s "L."» V" TV “"S y~--. y*-*i 4— y—s -ay* —. *ν~-χ y~s -5 -J 4— -i /s y\ y~x y“s illtíoUpUI Ubao Clc: olllOa pala balical IdlIUaCOoo L JL apcU LltUb Θ inclui o uso de polímero ou copolímero catiônico, não abrangendo o uso de copolímeros em bloco nem de hidrogel como matriz tal como proposto no presente pedido de patente. [30] O documento US2002076441 destaca um sistema de microparticulas ou nanoesferas em gel copolímero do tipo poliéster/polietilenoglicol para liberação controlada de agentes bioativos. Porém, não abrange o uso de nanoparticulas mesoporosas de sílica monodispersas. [31] Em US2007269488, são descritas nanoparticulas de sílica em hidrogel nanocompósito (produzido através de um processo de polimerização mediante utilização de agentes crosslinking) para aplicações oftálmicas. No entanto, as nanoparticulas usadas na invenção não atuam como carreadores de fármacos e não existe associação de fármacos com as nanoparticulas ou com o hidrogel. [32] A tecnologia proposta na presente invenção diferencia-se das demais por se referir-se a nanoparticulas de silica com perfil monodisperso e com características idênticas de porosidade e superfície, proporcionando estabilidade coloidal, característica essencial à aplicação anticâncer. [33] O hidrogel de polímeros biocompatíveis descrito na tecnologia proposta, diferentemente dos demais géis de copolímero, provê liberação controlada de fármacos e biocompatibilidade do sistema híbrido em sistemas biológicos - [34] Considerando o exposto, a liberação controlada de doxorrubicina e/ou sildenafila como fármacos antitumorais em sistema híbrido constituídos de nanoparticulas mesoporosas de silica e géis de copolímero é nova e inventiva frente os ensinamentos do estado da técnica.

Breve descrição da invenção: [35] A presente invenção provê o processo de obtenção de um sistema híbrido à base de hidrogel de polímeros biocompatíveis e nanoparticulas mesoporosas de silica incorporadas com fármacos compreendendo DOX e/ou sildenafila com potencial antitumoral, bem como o sistema híbrido e seu uso no tratamento antitumoral. [36] Mais especificamente, o sistema híbrido desta invenção compreende nanoparticulas mesoporosas de silica com os fármacos DOX e/ou sildenafila incorporaoas em seus poros, com objetivo de produzir um novo material biocompatível para tratamento de câncer de próstata.

Breve descrição d.a.s figuras: [37] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue. [38] A Figura 1 representa graficamente o termograma da amostra de nanoparticulas mesoporosas de silica em água deionizada. [39] As Figuras 2A-C representam as imagens de TEM das nanoparticulas mesoporosas de silica. [40] A Figura 3 representa a isoterma de adsorção-dessorção de nitrogênio das nanoparticulas mesoporosas de silica. [41] A Figura 4 representa graficamente a estabilidade coloidal das nanoparticulas mesoporosas de silica em solução de soro fisiológico (NaCl) 0,9% quando na presença de 0,01%; 0,10%; 0,50%; e 1,00% de copolímero. [42] As Figuras 5A e 5B representam graficamente o perfil de agregação das nanoparticulas mesoporosas de silica quando na presença de porcentagens de copolimero de 0,01% a 0,10% e de 0,50% a 1,00%, respectivamente. [43] As Figuras 6a, 6b e 6c representam graficamente o perfil de dissolução do hidrogel com concentração de copolímero de 18% e liberação de DOX quando na ausência de nanoparticulas e na presença de 1 mg/mL e 5 mg/mL de nanoparticulas mesoporosas de silica, respectivamente.

Descrição detalhada da invenção: [44] A presente invenção provê o processo de obtenção de um sistema híbrido à base de hidrogel de polímeros biocompatíveis e nanoparticulas mesoporosas de silica incorporadas com DOX e/ou sildenafila. [45] O processo compreende as etapas de: a) Síntese das nanopartícuias mesoporosas de sílica: al) dissolução do surfactante catiônico em solução alcalina em pH entre 10 e 12, preferencialmente 11; a2) homogeneização da solução por sonicação durante 1 a 30 minutos, preferencialmente 10 minutos; a3) adição de etanol absoluto na solução obtida na etapa a2 e agitação em 60 a 6000 rpm, preferencialmente 300 rpm, entre 5 a 30 minutos, preferencialmente 15 minutos; a4) adição de tetraetoxilisano na solução obtida na etapa a3 para reação química durante 1 a 3 horas, preferencialmente 2 horas, em temperatura entre 30 a 80°C, preferencialmente 60 °C; a5) centrifugação da solução obtida na etapa a4 em 500 a 19000 rcf, preferencialmente 18000 rcf, por 15 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos, em temperaturas entre 4 a 35°C, preferencialmente 4°C; a6) suspensão das nanopartículas centrifugadas na etapa a5 em etanol e seu estoque em geladeira em temperaturas de 1 a 15°C, preferencialmente 4°C; a7)extração do cetiltrimetilamônio das nanopartículas obtidas na etapa a6, através da adição de etanol absoluto, homogeneização em banho de ultrassom por 5 a 30 minutos, preferencialmente 5 minutos; e adição de ácido clorídrico de pureza analítica na solução, homogeneizando em banho de ultrassom por 5 a 60 minutos, preferencialmente 60 minutos; a8)centrifugação da solução obtida na etapa a7 por 15 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos, com a retirada do sobrenadante, lavagem com etanol absoluto por duas vezes, centrifugação da solução em 500 a 19000 rcf, preferencialmente 18000 rcf; e obtenção de uma suspensão de nanoparticulas mesoporosas de silica em etanol absoluto; b) Obtenção de solução de polímero biocompatível: bl) solubilizaçâo de copolímero em soro fisiológico para obtenção de uma solução 30% (m/m); bl.l) adição de soro fisiológico em um frasco, sob agitação, até alcançar o equilíbrio térmico, mantendo a temperatura em 0 a 35°C, preferencialmente 4°C; bl.2) adição do copolímero no soro fisiológico obtido na etapa bl.l e sua dissolução, mantendo a temperatura em 0 a 35°C, preferencialmente 4°C; para obtenção de solução de polímero biocompatível; c) Obtenção do sistema híbrido: cl) adição de fãrmaco à solução de polímero biocompatível obtido na etapa bl.2 de maneira a alcançar uma concentração entre 0,01 mg ml"1 a 10 mg ml"1, preferencialmente 1,25 mg ml"1, sob agitação, em banho de água com temperatura variável entre 0 e 35°C, preferencialmente 4°C; c2) adição cloreto de sódio ao sistema obtido na etapa cl, para obtenção de um sistema salino 0,9%; c3) suspensão das nanoparticulas mesoporosas de silica, obtidas na etapa a8, em água deionizada; c4) adição da suspensão de nanoparticulas mesoporosas de silica obtidas na etapa c3 no sistema salino obtido na etapa c2, sob agitação em 60 a 6000 rpm, preferencialmente 300 rpm, mantendo a temperatura em 0 a 35°C, preferencialmente 4°C, durante 0 a 72 horas, preferencialmente 48 horas, obtendo-se o sistema híbrido, e c5) gelificação do sistema híbrido, obtido na etapa c4, à temperatura ambiente. - Síntese das nanopartículas mesoporosas de silica: [46] As nanopartículas mesoporosas de silica são sintetizadas por meio do método de Stõber adaptado. Dessa forma, obtém-se nanopartículas porosas com alta estabilidade coloidal, tamanho definido, alto valor de área superficial e alto valor de volume de poros. [47] Sendo assim, para a síntese das nanopartículas, um surfactante catiônico com cadeias alquílicas lineares, preferencialmente o brometo de cetiItrimetilamônio, é dissolvido em uma solução alcalina compreendida preferencialmente de hidróxido de amônio, em pH entre 10 e 12, preferencialmente 11, e homogeneizado por sonicação durante 1 a 30 minutos, preferencialmente 10 minutos. [48] À essa solução, adiciona-se etanol absoluto. Após 5 a 30 minutos, preferencialmente 15 minutos, sob agitação em 60 a 6000 rpm, preferenciaimente 300 rpm, é adicionado tetraetoxisilano. A reação é mantida de 30 a 80°C, preferencialmente 60°C, durante 1 a 3 horas, preferencialmente 2 horas, sob sistema de refluxo, para evitar a evaporação do etanol. [49] Após o término desse período, os produtos são separados por centrifugação de 500 a 19000 rcf, preferencialmente 18000 rcf, por 15 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos, em temperaturas de 4 a 35°C, preferencialmente 4°C. [50] Em seguida, as nanopartícuias foram suspensas em etanol e estocadas na geladeira a temperaturas de 1 a 15°C, preferencialmente 4°C, para posterior retirada do cetiltrimetilamônio. [51] Para extrair o cetiltrimetilamônio, a suspensão é adicionada de etanol absoluto e homogeneizada em banho de ultrassom por 5 a 30 minutos, preferencialmente 5 minutos. Então, adiciona-se ácido clorídrico de pureza analítica, homogeneizando em banho de ultrassom, em seguida, por 5 a 60 minutos, preferencialmente 60 minutos. [52] Posteriormente, centrifuga-se por 15 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos, com a retirada do sobrenadante e, finalmente, lava-se com etanol absoluto por duas vezes, centrifugando em seguida. [53] As nanopartículas mesoporosas de sílica são monitoradas por espalhamento de luz dinâmico, apresentando formato esférico, tamanho de 30 a 100 nm (preferencialmente 60 nanômetros) e potencial zeta de -20 a -10 mV. [54] A área superficial das nanopartículas, calculada pelo método de BET (Brunauer-Emmet-Teller), varia entre 900 e 1000 cm2 g-1, enquanto o volume dos poros, calculado pelo método BJH (Barret-Joyner-Halenda) , varia de 1,0 a 2,0 cm3 g_1. O diâmetro dos poros varia entre 2,0 e 10,0 nm. [55] Outras modificações podem ser realizadas a fim de funcionalizar os poros internos com grupos fenil, enquanto a superfície externa é recoberta com grupos reativos e/ou ionizáveis (preferencialmente, com o propilmetilfosfonato ou propilamina). [56] Assim, é possível produzir regiões quimicaraente antagônicas na mesma partícula, com regiões hidrofóbicas (no interior) e hidrofílicas (no exterior), fornecendo a possibilidade de incorporar, simultaneamente, moléculas hidrofílicas e hidrofóbicas. [57] Ainda, há a possibilidade de aprisionamento de moléculas no interior dos poros por meio do recobrimento das nanopartículas com biomoléculas (tal como proteínas e carboidratos), que podem aumentar a estabilidade coloidal e a biocompatibilidade das nanopartículas mesoporosas de sílica. - Obtenção do hidrogel de biopolímero: [58] Um copolímero de bloco, preferencialmente um que seja constituído por monômeros PEO-PPO-PEO (como o Pluronic F-127), é solubilizado em soro fisiológico para obtenção de uma solução 30% (m/m). [59] Para isso, o soro fisiológico é colocado em um banho de água gelada, sob agitação, até que se alcance o equilíbrio térmico, sem que a temperatura ultrapasse 4°C a 35°C, preferencialmente 4°C. O copolímero é, então, adicionado vagarosamente sob agitação. - Obtenção do sistema híbrido: [60] O sistema híbrido é obtido ao adicionar-se, à solução do copolímero, a massa do fármaco de maneira a alcançar uma concentração entre em concentração de 0,01 mg ml-1 a 10 mg ml-1, preferencialmente 1,25 mg ml-1 para DOX e 4,16 mg ml-1 para sildenafila, sob agitação, em banho de água gelada. Mais especificamente, o fármaco antitumoral é a doxorrubicina, a qual pode estar associada à sildenafila ou não . [61] As nanopartículas mesoporosas de silica são suspensas em água deionizada e adicionadas por último, a fim de evitar agregação precoce e floculação. [62] Ainda, também adiciona-se ao sistema o volume correspondente de cloreto de sódio, para que se obtenha um sistema salino 0,9%. [63] 0 sistema salino é deixado em geladeira, em temperatura entre 0 e 35 °C, preferencialmente 4°C, sob agitação de um dia para o outro para a completa solubilização do copolimero. A temperatura de gelificaçâo dos sistemas variou de 9 a 23°C. [64] A estabilidade das nanopartículas na presença do copolimero de bloco foi testada por meio de um ensaio de estabilidade coloidal e pela avaliação do perfil de &CfIT0CJ3.ÇclO * [65] O primeiro ensaio consistiu em um estudo de centrifugação, misturando as nanoparticulas em sistemas com diferentes concentrações do copolimero. As suspensões foram centrifugadas em diferentes rotações durante 5 minutos. A quantificação das nanoparticulas deu-se retirando um volume do sobrenadante após a centrifugação e medindo sua absorbância em 300 nm em um espectrofotômetro UV-Visível. [66] O segundo ensaio consistiu em um monitoramento do tamanho das partículas em função do tempo por meio de DLS.

As nanoparticulas foram colocadas em contato com o copolimero e, então, mediu-se tamanho das nanoparticulas e o índice de polidispersividade em função do tempo em diferentes concentrações de copolimero. [67] Assim, o sistema híbrido descrito na invenção compreende : - um hidrogel reversível de polímero biocompatível em concentração de 5% a 25% (m:m), preferencialmente 18%; - nanopartícuias mesoporosas de sílica em concentração de 0,01 mg ml-1 a 10 mg ml-1, preferencialmente 5 mg ml-1; e - fármaco em concentração de 0,01 mg ml-1 a 10 mg ml-1, preferencialmente 1,25 mg ml"1 para DOX e 4,16 mg ml"1 para sildenafila. [68] 0 polímero biocompatível utilizado é um copolímero de bloco, preferencialmente um que seja constituído por monõmeros PEO-PPO-PEO, tal como o Pluronic F-127. Os fármacos compreendem a doxorrubicína ou sildenafíla, as quais podem estar presentes simultaneamente na nanopartícuia. [69] As nanopartículas mesoporosas de sílica tem formato esférico, tamanho de 30 a 100 nm (preferencialmente 60 nanômetros) e potencial zeta de -20 a -10 mV. A área superficial das nanopartículas varia entre 900 e 1000 cm2 g-1, enquanto o volume dos poros varia de 1,0 a 2,0 cm3 g"1 e o diâmetro dos poros varia entre 2,0 e 10,0 nm. [70] O sistema híbrido é aplicado no tratamento antítumoral, preferencialmente, no tratamento do câncer de próstata.

Testes realizados: - Caracterização das nanopartículas mesoporosas de sílica: [71] As nanopartículas foram caracterizadas por meio de análise termogravimétrica, Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM), isotermas de adsorção-dessorção de nitrogênio e espalhamento de luz dinâmico. [72] Após a síntese das nanopartículas, calculou-se a concentração das mesmas em suspensão por meio de seu termograma, ilustrado na Figura 1. [73] Para tal, levou-se em consideração a perda de massa em 300°C, ponto que garante a eliminação total de água do sistema. Nesse ponto, a massa restante é atribuída apenas à sílica presente. [74] Como pode ser visto na Figura 1, em 300°C, restou apenas 1,92% da massa inicial. Por cálculos comparativos com os valores iniciais de silica, pode-se concluir que a concentração de sílica na suspensão é de 17,79 mg ml"·1. Partindo dessa suspensão, foram obtidas novas concentrações de 5 mg ml-1 e 10 mg ml-1. [75] As micrografias das nanopartícuias mesoporosas de silica estão ilustradas nas Figuras 2A-C. Observa-se a morfologia esférica e a presença de poros. Por meio da análise do diâmetro das nanopartícuias, foi possível observar um faixa de distribuição de tamanhos de 50 e 80 nm, preferencialmente 60 nm. [76] De acordo com os resultados obtidos em equipamentos apropriados, a área superficial total é de 970 cm2 g_1, enquanto o volume dos poros é de 1,6 cm3 g-1. [77] A curva de adsorção-dessorção (vide Figura 3) assemelha-se a uma isoterma do tipo IV, típica de materiais mesoporosos, em que a adsorção inicial é seguida de condensação capilar. Também é característico desse tipo de isoterma o aparecimento de curvas de histerese que, no caso da isoterma da Figura 3, está associada à presença de mesoporos uniformes. [78] O raio hidrodinâmico das partículas obtido por DLS foi de 128,7 ± 4,718 nm, enquanto o índice de polidispersividade foi de 0,213 ± 0,03 e o potencial zeta foi de -19,0 ± 2,9 mV. - Interações das nanopartículas com fármaco antitumoral: [79] A capacidade de incorporação da doxorrubicina (DOX) nas nanoparticulas sob diferentes condições foi feita por meio do ensaio de incorporação, incubando as nanopartículas com o fármaco, centrifugando e, então, medindo-se a absorbância em 480 nm do sobrenadante. [80] A eficiência de incorporação foi calculada como mostra a Equação 1 e a capacidade de incorporação da sílica foi calculada como mostra a Equação 2. Os resultados estão ilustrados na Tabela 1.

Equação 2 Tabela 1. Resultados do ensaio de incorporação da DOX nas nanopartículas (NP) [81] Observando os resultados das amostras 1 a 5, que não contêm o copolímero, observa-se que, ao aumentar a quantidade de DOX no sistema, a porcentagem de DOX incorporada em relação à massa total de DOX existente em solução diminui, no entanto, a quantidade de DOX incorporada por partícula (representada pela capacidade da NP) aumenta. [82] Nas amostras com menor razão DOX:NP, existe maior superfície de nanoparticula disponível, fazendo com que a eficiência de adsorção de DOX por unidade de superfície diminua. Contrariamente, nas amostras com maior razão DOX:NP, há mais DOX incorporada por partícula. [83] Para avaliar a tendência da carga superficial das nanopartículas em contato com o fármaco, foram feitas medidas do potencial zeta em função da razão DOX:NP (m:m), cujos resultados encontram-se na Tabela 2. A amostra 6 consiste em nanopartícuias mesoporosas de sílica na ausência de doxorrubicina e PBS diluído 10 vezes como meio dispersante.

Tabela 2. Ensaio de potencial zeta das nanopartículas em função da razão DOXiNP [84] Observa-se que, ao aumentar a quantidade do antitumoral, cujo pKá é 9,2, o potencial zeta das nanopartículas mesoporosas de sílica fica cada vez mais positivo. Esses resultados, combinados aos resultados de incorporação, indicam que pode haver dois equilíbrios de sorção envolvendo o fármaco e a superfície das nanopartículas: um para os poros internos e outro para a superfície externa. Pode-se observar que, mesmo para grandes quantidades de DOX (razões mais altas de DOX:NP, como 1,00 e 1,25), o potencial zeta fica, ainda, negativo ou pouco positivo. Os resultados sugerem que parte da DOX presente encontra-se adsorvida na superfície externa das nanopartículas e parte nos poros internos, e essa adsorção é dependente da concentração do fármaco no sistema.

Comportamento das nanopartículas na presença do copolímero: [85] Foi decidido que as aplicações do ensaio in vivo seriam feitas em soro fisiológico para não induzir uma diferença significativa na pressão osmótica atuando sobre células peritoneais dos animais usados nos testes in vivo. [86] Dessa forma, era preciso saber se a presença do copolímero iria estabilizar as nanopartículas no sistema, garantindo sua integridade. [87] Para isso, foi feito um ensaio de estabilidade coloidal, cujos resultados estão ilustrados na Figura 4. [88] Uma vez que o copolímero apresenta uma pequena absorbância na região de 263 nm, o comprimento de onda escolhido para observar a presença de sílica para todos os sistemas contendo esse copolímero foi de 300 nm. [89] Observa-se que as concentrações acima de 1% de polímero já promovem a estabilização das nanopartículas, que aumenta com o aumento da concentração de copolímero. Com 10% de copolímero, ainda restam, aproximadamente, 70% de partículas em suspensão após 5 minutos de centrifugação a 18400 rcf. Esses resultados indicam que as nanoparticulas são estáveis em concentrações acima de 1% de copolimero. [90] Para avaliar a estabilidade das nanoparticulas na presença de copolimero em relação à taxa de agregação em função do tempo, mediu-se o raio hidrodinâmico e o indice de polidispersividade das nanoparticulas em diferentes concentrações do polimero em seis tempos (1, 5, 10, 15, 30 e 60 minutos). [91] As porcentagens (m:m) de copolimero utilizadas foram 0,01%, 0,05%, 0,10% e 1,00%. Os resultados do perfil de agregação estão ilustrados (Figuras 5A e 5B) por meio do aumento do tamanho de particula em cada tempo em relação ao tamanho de particula no tempo zero, que foi de 128,7 nm. [92] A estabilidade de nanoparticulas na presença de copolímeros acontece por um balanço de atração ou repulsão por depleção. A agregação das partículas ocorre quando a atração por depleção supera a repulsão. [93] Observa-se que, em concentrações baixas de copolimero (Figura 5a), ocorre um aumento do tamanho de partícula logo em t = 1, indicando a instabilidade nessas concentrações de copolimero. Todas as amostras da Figura 5a apresentaram um aumento de mais de 10 vezes ao final do ensaio. [94] Contrariamente, concentrações acima de 0,10% estabilizaram as nanoparticulas (Fig. 5b), mostrando pouco aumento do tamanho de partícula em função do tempo, variando de 0,2 a 0,5 vezes. - Dissolução do hidrogel e liberação do fármaco: [95] Para avaliar a taxa de liberação do fármaco pelo sistema híbrido, foi utilizado o método sem membrana de dissolução do hidrogel. Os resultados foram plotados e o coeficiente angular da reta foi tomado como a taxa de dissolução do hidrogel. O meio de liberação escolhido foi uma solução de BSA 1,0 mg ml-1, pois desejava-se observar o perfil de liberação da DOX em um meio contendo biomoléculas. [96] Pode-se observar, nos gráficos subsequentes (Figuras 6A, 6B e 6C) , que a DOX é liberada à medida que o gel dissolve. Particularmente, para o terceiro sistema hibrido descrito na figura 6C, é possivel observar maior diferença entre as curvas de dissolução do gel e liberação da DOX, sendo um indicativo de que as nanoparticulas promovem uma liberação sustentada do fármaco. - Aplicação in vivo: [97] Para que fosse possivel uma avaliação do potencial do copolímero na liberação prolongada dos fármacos, assim como do papel das nanoparticulas no transporte dos fármacos, foram desenvolvidos seis sistemas híbridos denominados:Gl-DOX relacionado ao sistema compreendendo 18% (m/m) de pluronic F-127 e 1,25 mg/mL de DOX; G2-D0X relacionado ao sistema hibrido compreendendo 18% (m/m) de pluronic F-127, 1,25 mg/mL de DOX e 1 mg/mL de nanopartícula mesoporosa de sílica; G3-DOX relacionado ao sistema híbrido compreendendo 18% (m/m) de pluronic F-127, 1,25 mg/mL de DOX e 5 mg/mL de nanopartícula mesoporosa de sílica; Gl-SIL relacionado ao sistema compreendendo 18% (m/m) de pluronic F-127 e 4,16 mg/mL de sildenafila; G2-SIL relacionado ao sistema híbrido compreendendo 18% (m/m) de pluronic F-127, 4,16 mg/mL de sildenafila e 1 mg/mL de nanopartícula mesoporosa de sílica; G3-SIL relacionado ao sistema híbrido compreendendo 18% (m/m) de pluronic F-127, 4,16 mg/mL de sildenafila e 5 mg/mL de nanoparticula mesoporosa de silica. [98] Assim, foi possível avaliar o potencial antitumoral dos sistemas híbridos, obtendo informações sobre o potencial de liberação prolongada do hidrogel com DOX e com SIL e sobre o papel das nanopartícuias mesoporosas de silica como carreadoras de fármacos. Análises histopatológicas do lobo ventral prostático dos animais mostraram que houve uma diminuição da frequência de tumores de grau alto e grau intermediário à medida que foram introduzidas as nanopart!cuias e com o aumento de sua concentração, tanto para os sistemas contendo DOX quanto para os sistemas contendo sildenafila. O resumo dos resultados das análises histopatológicas encontra-se na Tabela 3.

Tabela 3. Resultados das análises histopatológicas [99] Dessa forma, os sistemas híbridos propostos nesta invenção foram eficazes no tratamento de câncer de próstata quimicamente induzido em ratos e, no que se refere às observações macroscópicas, não foram encontradas cardiomegalia ou lesões macroscópicas no coração e outros efeitos colaterais usuais em tratamentos com doxorrubicina.

RE IVINDIC AÇÕE S

Claims (10)

1. Processo de obtenção de um sistema híbrido caracterizado por compreender as etapas de: a) Síntese das nanopartículas mesoporosas de sílica: al) dissolução do surfactante catiônico em solução alcalina em pH entre 10 e 12, preferencialmente 11; a2) homogeneização da solução por sonicação durante 1 a 30 minutos, preferencialmente 10 minutos; a3) adição de etanol absoluto na solução obtida na etapa a2 e agitação em 60 a 6000 rpm, preferencialmente 300 rpm, entre 5 a 30 minutos, preferencialmente 15 minutos; a4) adição de tetraetoxilisano na solução obtida na etapa a3 para reação química durante 1 a 3 horas, preferencialmente 2 horas, em temperatura entre 30 a 80°C, preferencialmente 60 °C; aS) centrifugação da solução obtida na etapa a4 em 500 a 19000 rcf, preferencialmente 18000 rcf, por 15 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos, em temperaturas entre 4 a 35°C, preferencialmente 4°C; a6) suspensão das nanopartículas centrifugadas na etapa a5 em etanol e seu estoque em geladeira em temperaturas de 1 a 15°C, preferencialmente 4°C; a7)extração do cetiltrimetilamônio das nanopartículas obtidas na etapa a6, através da adição de etanol absoluto, homogeneização em banho de ultrassom por 5 a 30 minutos, preferencialmente 5 minutos; e adição de ácido clorídrico de pureza analítica na solução, homogeneizando em banho de ultrassom por 5 a 60 minutos, preferencialmente 60 minutos; a8)centrifugação da solução obtida na etapa a7 por 15 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos, com a retirada do sobrenadante, lavagem com etanol absoluto por duas vezes, centrifugação da solução em 500 a 19000 rcf, preferencialmente 18000 rcf; e obtenção de uma suspensão de nanoparticulas mesoporosas de silica em etanol absoluto; b) Obtenção de solução de polímero biocompatível: bl) solubilização de copolímero em soro fisiológico para obtenção de uma solução 30% (m/m); bl.l) adição de soro fisiológico em um frasco, sob agitação, até alcançar o equilíbrio térmico, mantendo a temperatura em 0 a 35°C, preferencialmente 4°C; bl.2) adição do copolímero no soro fisiológico obtido na etapa bl.l e sua dissolução, mantendo a temperatura em 0 a 35°C, preferencialmente 4°C; para obtenção de solução de polímero biocompatível; c) Obtenção do sistema híbrido: cl) adição de fármaco à solução de polímero biocompatível obtido na etapa bl . 2 de maneira a alcançar uma concentração entre 0,01 mg ml-1 a 10 mg ml-1, preferencialmente 1,25 mg ml-1, sob agitação, em banho de água com temperatura variável entre 0 e 35°C, preferencialmente 4°C; c2) adição cloreto de sódio ao sistema obtido na etapa cl, para obtenção de um sistema salino 0,9%; c3) suspensão das nanoparticulas mesoporosas de sílica, obtidas na etapa a8, em água deionizada; c4) adição da suspensão de nanoparticulas mesoporosas de silica obtidas na etapa c3 no sistema salino obtido na etapa c2, sob agitação em 60 a 6000 rpm, preferencialmente 300 rpm, mantendo a temperatura em 0 a 35°C, preferencialmente 4°C, durante 0 a 72 horas, preferencialmente 48 horas, obtendo-se o sistema híbrido, e c5) gelificação do sistema híbrido, obtido na etapa c4, à temperatura ambiente.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o surfactante catiôníco compreender cadeias alquílicas lineares e compreender o brometo de cetiltrimetilamônio e a solução alcalina ser hidróxido de amônio.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de os poros internos da nanopartícula serem, alternativamente, funcionalizados com funções orgânicas hidrofóbicas do tipo fenil e a superfície externa ser recoberta com grupos reativos e/ou ionizáveis.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as nanoparticulas serem, alternativamente, recobertas com biomoléculas, tais como proteínas e carboidratos.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a temperatura de gelificação do variar entre 5 e 25°C.

6. Sistema híbrido, obtido conforme o processo definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender: - um hidrogel reversível de polímero biocompatível em concentração de 5% a 25% (m:m), preferencialmente 18%; - nanopartícuias mesoporosas de silica em concentração de 0,01 mg ml-1 a 10 mg ml-1, preferencialmente 5 mg ml-1; e - fármaco em concentração de 0,01 mg ml-1 a 10 mg ml-1,

7. Sistema hibrido, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o polimero biocompativel ser um copolimero de bloco, preferencialmente um copolimero de bloco constituído por PEO-PPO-PEO.

8. Sistema hibrido, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de as nanopartículas mesoporosas de silica apresentarem formato esférico; tamanho de 40 a 100 nm, preferencialmente 60 nanômetros; potencial zeta de -20 a -10 mV; área superficial entre 900 e 1000 cm2 g-1; volume de poros entre 1,0 e 2,0 cm3 g^1 e diâmetro de poros entre 2,0 e 10,0 nm.

9. Sistema hibrido, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o fármaco ser a doxorrubicina preferencialmente na concentração de 1,25 mg mLr1 e/ou sildenafila preferencialmente na concentração de 4,16 mg mLr x _

10. Uso do sistema híbrido, conforme definido nas reivindicações 6 a 9, caracterizado por ser no preparo de um medicamento para tratamento de câncer, preferencialmente câncer de próstata.