BR102014013939A2 - processo de transfecção de células-tronco espermatogoniais de peixes mediado por eletroporação na presença de nanotubos de carbono funcionalizados complexados com dna e complexo nanotubo-dna - Google Patents

Abstract

processo de transfecção de células-tronco espermatogoniais de peixes mediado por eletroporação na presença de nanotubos de carbono funcionalizados complexados com dna e complexo nanotubo-dna. a presente invenção trata de um processo para transfecção de células espermatogoniais de peixes, preferencialmente de tilápia-nilótica (oreochromis niloticus), para promover nestas a inserção de genes de interesse. para tanto, são empregados nanotubos de carbono carboxilados, complexados com dna, como carreadores para a entrega gênica associados à eletroporação. as células de peixe transfectadas por meio desta tecnologia demonstraram uma eficiência de expressão do gene de interesse em níveis superiores aos induzidos por reagente comercial à base de lipídeos catiônico, pelo nanocomplexo na ausência de eletroporação e pela eletroporação, além de induzir níveis relativamente baixos de morte celular.

Description

PROCESSO DE TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO ESPERMATOGONIAIS DE PEIXES MEDIADO POR ELETROPORAÇÃO NA PRESENÇA DE NANOTUBOS DE CARBONO FUNCIONALIZADOS COMPLEXADOS COM DNA E COMPLEXO NANOTUBO-DNA

[001] A presente invenção trata de um processo para transfecção de células espermatogoniais de peixes, preferencialmente de tilápia-nilótica (Oreochromis niloticus), para promover nestas a inserção de genes de interesse. Para tanto, são empregados nanotubos de carbono carboxilados, complexados com DNA, como carreadores para a entrega gênica associados à eletroporação. As células de peixe transfectadas por meio desta tecnologia demonstraram uma eficiência de expressão do gene de interesse em níveis superiores aos induzidos por reagente comercial à base de lipídeos catiônico, pelo nanocomplexo na ausência de eletroporação e pela eletroporação, além de induzir níveis relativamente baixos de morte celular.

[002] Oreochromis niloticus, a tilápia do Nilo, é uma espécie de peixe comestível de água doce de importância mundialmente reconhecida para pesca e aquicultura (FARLORA, R. et al. Expression of GFP in transgenic tilapia under the control of the medaka β-actin promoter: establishment of a model system for germ cell transplantation. Animal Reproduction, v. 6, n. 3, p. 450-459, 2009; FUJIMURA, K.; KOCHERA, T. D. Tol2-mediated transgenesis in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture, v. 319, p.342-346, 2011; FAO. State of World Fisheries and Aquaculture (SOFIA). Rome, Italy, 2012. Disponível através do link: <http://www.fao.org/docrep/016/i2727e/i2727e.pdf>. Acesso em: 15/01/2012.). Desde a década de 80, esforços vêm sendo feitos para obtenção de tilápias-nilóticas transgênicas, bem como de outros peixes.

[003] Diversas técnicas já foram utilizadas para a entrega de genes a células-alvo de peixes, como eletroporação, lipídeos catiônicos, proteínas conjugadas à poliamina, microinjeção, elementos transponíveis e vetor retroviral. Destas técnicas, desde 1985 microinjeção e eletroporação tem permitido a geração de peixes transgênicos: a partir de ovos recém fertilizados destes organismos (CHEN, T. T. et al. Transgenic fish and its application in basic and applied research. Biotechnology Annual Review, v. 2, p. 205-236, 1996.) e/ou de gametas como veículos dos genes de interesse (INOUE, K. Expression of repórter genes introduced by microinjection and electroporation in fish embryos and fry. Molecular Marine Biology and Biotechnology, v. 1, n. (4-5), p. 266-270, 1992.).

[004] Existem tecnologias que, visando atender à demanda por peixes maiores para comercialização, se dedicam à expressão, em peixes, de hormônio de crescimento do próprio organismo ou de outros organismos de interesse.

[005] Eletroporação e microinjeção já foram empregadas para realização, com sucesso, da entrega do gene do hormônio do crescimento de truta a gametas de zebrafish, bagre e carpa (POWERS, D. A. et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Molecular Marine Biology and Biotechnology, v. 1, n. 4-5, p. 301-308, 1992.). Em Oryzias latipes foi possível, via microinjeção de ovos recém-fertilizados, a expressão do gene do fator de crescimento humano, o que foi também conseguido via eletroporação de embriões e integração da sequência utilizada no genoma dos peixes em estudo (LU, J. K. et al. Integration, expression and germ-line transmission of foreign growth hormone genes in medaka (Oryzias latipes). Molecular Marine Biology and Biotechnology, v. 1, n. 4-5, p. 366-375, 1992.).

[006] Apesar de ser uma metodologia usada desde a década de 80, novos protocolos de microinjeção continuam a ser propostos, como por exemplo aquele utilizado por Hartmann e Englert para produção de killifish transgênico em 2012, e o de Ge e colaboradores para a produção de bagre e zebrafish transgênicos (HARTMANN, N.; ENGLERT, C. A microinjection protocol for the generation of transgenic killifish (Species: Nothobranchius furzeri). Developmental Dynamics, v. 241, n. 6, p. 1133-1141, 2012; GE, J. et al. Isolation of yellow catfish β-actin promoter and generation of transgenic yellow catfish expressing enhanced yellow fluorescent protein. Transgenic Research, v. 21, n. 5, p. 995-1004, 2012).

[007] Quanto à eletroporação, a utilização desta técnica já foi descrita para introduzir o gene exógeno da enzima cloranfenicol acetiltransferase, em embriões de zebrafish (BUONO, R. J.; LINSER, P. J. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Molecular Marine Biology and Biotechnology, v. 1, n. 4-5, p. 271-275, 1992.) e em espermatozóides de dojô ou cobra d’água (Misgurnus anguillicaudatus) (TSAI, H. J. Electroporated sperm mediation of a gene transfer system for finfish and shellfish, Molecular Reproduction and Development, v. 56, n. 2, p. 281- 284, 2000), aumentar a taxa de entrega de plasmídeos com marcação radioativa em espermatozóides maduros de zebrafish (PATIL, J. G.; KHOO, H. W. Nuclear internalization of foreign DNA by zebrafish spermatozoa and its enhancement by electroporation. Journal of Experimental Zoology, v. 274, n. 2, p. 121-129, 1996.), internalizar o gene da luciferase em ovos fertilizados de medaka (MURAKAMI, Y. et al. Micromachined electroporation system for transgenic fish. Journal of Biotechnology, v. 34, n. 1, p. 35-42, 1994) e até mesmo em zebrafish adulto após injeção intramuscular do DNA de interesse (RAO, N. M. et al. Electroporation of adult zebrafish. Methods in Molecular Biology, v. 423, p. 289-298, 2008) ou após adição deste DNA de interesse diretamente na cubeta com solução salina (RAMBABU, K. M. et al. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology, v. 5, ρ, 29-36, 2005). Foi também utilizada para introdução do gene do hormônio de crescimento de truta em ovos fertilizados de medaka (INOUE, K. et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differentiation and Development, v. 29, n. 2, p. 123-128, 1990), de genes de resistência a antibióticos em células-tronco embrionárias de medaka (HONG, Y. et al. Retention of the developmental pluripotency in medaka embryonic stem cells after gene transfer and long-term drug selection for gene targeting in fish. Transgenic Research, v. 13, n. 1, p. 41-50, 2004), do gene da proteína fluorescente verde e da beta-galactosidase em embriões de medaka (HOSTETLER, Η. A. et al. High efficiency production of germ-line transgenic Japanese medaka (Oryzias latipes) by electroporation with direct current-shifted radio frequency pulses. Transgenic Research, v. 12, n. 4, p. 413-424, 2003.), do gene da proteína fluorescente em espermatozóides de bagre (COLLARES, T. et al. Transgene transmission in South American catfish (Rhamdia quelen) larvae by sperm-mediated gene transfer. Journal of Biosciences, v. 35, n. 1, p. 39-47, 2010), dos genes da pré-pró-cecropina B, pró-cecropina B, cecropina B, e cecropina P1 de suínos em ovos recém fertilizados de medaka (SARMASIK, A. et al. Production of transgenic medaka with increased resistance to bacterial pathogens. Marine Biotechnology (NY), v. 4, n. 3, p. 310-322, 2002), e do gene da tirosinase de camundongo em ovos fertilizados de medaka (ONO, H. et al. Transgenic medaka fish bearing the mouse tyrosinase gene: expression and transmission of the transgene following electroporation of the orange-colored variant. Pigment Cell Research, v. 10, p. 168-175, 1997).

[008] Os elementos transponíveis, quando utilizados, costumam ser também injetados, em ovos fertilizados, em forma de plasmídeo conjugado ao mRNA sintético de uma transposase. O elemento Tol2, por exemplo, já foi utilizado em 2007 juntamente com uma transposase para geração de zebrafish transgênico (KAWAKAMI, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biology, v. 8, n. 1, p. 7-11, 2007).

[009] Quanto aos materiais de caráter lipídico, a Lipofectamina, um reagente comercial que consiste em um arranjo de lipídeos catiônicos, já foi utilizada para, por exemplo, internalização de gene de peptídeos antimicrobianos em células embrionárias de salmão (SARMASIK, A. et al. Production of transgenic medaka with increased resistance to bacterial pathogens. Marine Biotechnology (NY), v. 4, n. 3, p. 310-322, 2002) e o gene da luciferase nas células A2 de plati (Xiphophorus xiphidium) (RAMBABU, K. M. et al. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology, v. 5, p. 29-36, 2005).

[010] Em trabalhos mais recentes, formulações de proteínas celulares não tóxicas e poliamina também têm sido utilizadas. O GeneJuice da Novagen®, por exemplo, já foi empregado na entrega de genes de resistência a antibióticos a células-tronco embrionárias de medaka (HONG, Y. et al. Retention of the developmental pluripotency in medaka embryonic stem cells after gene transfer and long-term drug selection for gene targeting in fish. Transgenic Research, v. 13, n. 1, p. 41-50, 2004), de vetor baculoviral a estas mesmas células de medaka (YAN, Y. et al. Establishment of medakafish as a model for stem cell-based gene therapy: Efficient gene delivery and potential chromosomal integration by baculoviral vectors. Experimental Cell Research, v. 315, n. 13, p. 2322-2331, 2009), e de gene da proteína fluorescente verde a células imortalizadas OLME-104 de melanoma amelanótico de medaka (HASEGAWA, S. et al. A medaka model of câncer allowing direct observation of transplanted tumor cells in vivo at a cellular-level resolution. PNAS, v. 106, n. 33, p. 13832-13837, 2009).

[011] No caso específico da espécie O. niloticus, desde 1988 há um crescente esforço na tentativa de produção de tilápias transgênicas com a principal finalidade de aumentar a taxa de crescimento desta espécie.

[012] O método mais comumente utilizado para a entrega do gene de interesse é a integração aleatória de plasmídeos no DNA genômico da tilápia, subsequentemente à introdução dos mesmos no organismo deste peixe por meio de microinjeção de ovos recém-fertilizados (BREM, G. et al. Gene transfer in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture, v. 68, p. 209-219, 1998). A microinjeção em estágio de uma célula de ovos recém-fertilizados foi também realizada nesta espécie, por exemplo, para a introdução dos genes do hormônio de crescimento (RAHMAN, Μ. A.; MACLEAN, N. Production of transgenic tilapia (Oreochromis niloticus) by one-cell-stage microinjection. Aquaculture, v. 105, n. 3-4, p. 219- 232, 1992; MARTÍNEZ, R. et al. Growth enhancement in transgenic tilapia by ectopic expression of tilapia growth hormone. Molecular Marine Biology and Biotechnology, v. 5, n. 1, p. 62-70, 1996; RAHMAN, Μ. A. et al. Expression of a novel piscine growth hormone gene results in growth enhancement in transgenic tilapia (Oreochromis niloticus). Transgenic Research, v. 7, p. 357- 369, 1998; KOBAYASHI, S. et al. Transgenic Nile tilapia (Oreochromis niloticus) overexpressing growth hormone show reduced ammonia excretion. Aquaculture, v. 270, p. 427-435, 2007), da insulina humana (POHAJDAK, B. et al. Production of transgenic tilapia with Brockmann bodies secreting [desThrB30] human insulin. Transgenic Research, v. 13, p. 313- 323, 2004.) e da proteína fluorescente verde (FARLORA, R. et al. Expression of GFP in transgenic tilapia under the control of the medaka β-actin promoter: establishment of a model system for germ cell transplantation. Animal Reproduction, v. 6, n. 3, p. 450-459, 2009).

[013] O método de microinjeção, apesar de comumente utilizado em O. niloticus e outras espécies, apresenta baixa porcentagem de peixes efetivamente expressando o gene de interesse de forma não transitória (MACLEAN, N. et al. Transgenic tilapia and the tilapia genome. Gene, v. 295, p. 265-277, 2002.). Além disso, as taxas de integração da sequência de interesse são menores que as taxas observadas em mamíferos (BREM, G. et al. Gene transfer in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture, v. 68, p. 209-219, 1998).

[014] Na tentativa de aumentar a integração do gene de interesse no DNA genômico, o elemento transponível Tol2 unido à proteína fluorescente verde (GFP) e também sua transposase foram microinjetados em ovos recém-fertilizados de O. niloticus, o que permitiu a obtenção de 30% de sobreviventes expressando a GFP (FUJIMURA, K.; KOCHERA, T. D. Tol2-mediated transgenesis in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture, v. 319, p.342—346, 2011).

[015] Foi ainda possível obtenção de peixes transgênicos desta espécie utilizando-se espermatozóides como carreadores gênicos, após eletroporação dos mesmos (MÜLLER, F. et al. Introducing foreign genes into fish eggs with electroporated sperm as a carrier. Molecular Marine Biology and Biotechnology, v. 1, n. 4-5, p. 276-281, 1992). Em 2002, Hwang e colaboradores observaram que, ao se utilizar sequências promotoras para dirigir uma expressão otimizada de gene repórter em células somáticas de tilápia, a melhor sequência regulatória consistia em uma sequência promotora própria do organismo, sendo a escolhida o promotor da β-actina: que permitiu a geração eficiente de tilápia autotransgênica (HWANG, G. C. et al. Exploiting transgenic tilapia and the tilapia genome. In: SHIMIZU, N.; AOKI, T., et al (Ed.). Aquatic Genomics. Tokyo: Springer-Verlag, 2002. p.524).

[016] Os nanomateriais, como os nanotubos de carbono, ainda não são veículos comuns de entrega de genes a células de peixes. O relato que existe em literatura é do uso de nanotubos de carbono de paredes múltiplas conjugados à albumina sérica bovina (BSA) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) para determinação de sua toxicidade in vivo em zebrafish (CHENG, J. et al. Acute and long-term effects after single loading of functionalized multi-walled carbon nanotubes into zebrafish (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology, v. 235, n. 2, p. 216-225, 2009). O uso de nanotubo ligado ao DNA para fazer a entrega de genes de interesse a células de peixes em cultura, associado ou não à técnica de eletroporação, ainda não foi relatado.

[017] Foram encontrados, no estado da técnica, documentos que tratam do uso de nanotubos de carbono associados à técnica de eletroporação para a entrega de genes a células de interesse, bem como documentos que tratam de produção de células-tronco espermatogoniais transgênicas.

[018] O pedido de patente WO 0069257 A2, intitulado “Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies”, descreve uma metodologia de entrega de genes in vitro a espermatozóides ou a suas células precursoras, como as células tronco espermatogoniais, empregando um vetor viral. A tecnologia inclui a produção de gametas recombinantes a fim de gerar uma prole transgênica. Neste método, entretanto, não emprega nanotubos de carbono ou eletroporação para a entrega gênica às células espermatogoniais.

[019] O artigo científico “Highly efficient molecular delivery into mammalian cells using carbon nanotube spearing” descreve uma metodologia para entrega de plasmídeos contendo o gene da proteína fluorescente verde aderidos a nanotubos de carbono em células de mamíferos. Nesta técnica, os nanotubos são associados a níquel e são lançados para o interior da célula por meio da ação de um campo magnético. Esta técnica difere da presente tecnologia por empregar nanotubos associados a níquel e um campo magnético para entrega, e não eletroporação (CAI, D. et al. Highly efficient molecular delivery into mammalian cells using carbon nanotube spearing. Nature Methods, v.2, p,449 - 454, 2005) [020] O pedido de patente WO 2008062378 A2, intitulado “Non invasive method of electroporation mediated by carbon nanotubes and device for putting the method into practice” trata de um método não invasivo para eletroporação de células, adequado para aplicação in vivo e in vitro, que permite a abertura de poros na célula reversivelmente sem causa danos às mesmas, com a finalidade de introduzir-se macromoléculas. Neste método, as células devem ser colocadas em contato com nanotubos de carbono, que atuam como mediadores da eletroporação, e então submetidas à ação de dois campos elétricos pulsados ortogonais. A invenção visa, particularmente, a aplicação de campos elétricos cuja intensidade seja suficientemente baixa para evitar danos às células tratadas.

[021] O pedido de patente US 20110091974 A1, intitulado “Conductive Substrate and Method for Introducing Nucieic Acid”, descreve um método para introdução de ácidos nucleicos em células por eletroporação, com eficiência de transfecção aumentada. Em tal método, à superfície dos eletrodos empregados para a eletroporação são aderidos nanotubos de carbono carboxilados e ácidos nucleicos e, então, adere-se as células a tais eletrodos e aplicam-se pulsos elétricos.

[022] O artigo científico intitulado “Carbon nanotube-enhanced cell electropermeabilisation” descreve um método para eletropermeabilização de células na presença de nanotubos de carbono e aplicação de um campo elétrico estático externo. Segundo os autores, a presença dos nanotubos de carbono acarreta em diminuição na voltagem requerida para permeabilização das células, o que é desejável para utilização da técnica em práticas clínicas (RAFFA, V. et al. Carbon nanotube-enhanced cell electropermeabilisation. Bioelectrochemistry, v. 79, n,1, p.136-41,2010).

[023] Os documentos encontrados no estado da técnica diferem da presente tecnologia por tratarem apenas de métodos de eletroporação realizados na presença de nanotubos de carbono e não empregarem estas nanoestruturas efetivamente como carreadores do material genético para o interior da célula. Além disto, as técnicas descritas não são empregadas em células de peixe, incluindo células-tronco espermatogoniais.

[024] Levando em consideração que uma única célula-tronco espermatogonial pode gerar cerca de 4000 espermatozóides em ratos, camundongos e suínos, logo, como estas promovem a espermatogênese de forma contínua, a manipulação de uma única célula permitiría a obtenção de número bastante elevado de gametas geneticamente modificados, o que viabilizaria a geração rápida e eficiente de prole transgênica.

[025] O uso das células-tronco espermatogoniais possibilita uma ampla futura gama de aplicações biotecnológicas como: a obtenção de animal transgênico de maneira mais rápida, o enriquecimento de alimentos de origem animal com moléculas de interesse, o aumento de taxa de produção do animal transgênico podendo fazer-se com que este seja, por exemplo, resistente a doenças, e utilização de transgênicos como biorreatores e biossensores.

[026] Neste contexto, a presente invenção consiste em um processo para entrega gênica por eletroporação em células-tronco espermatogoniais de peixe, mais precisamente em tilápias do Nilo, empregando como carreadores nanotubos de carbono de parede múltipla, carboxilados, associados ao plasmídeo que contenha o gene de interesse. A entrega gênica neste invento associa o nanomaterial, que atua como carreador, à eletroporação. Por meio desta tecnologia, é possível promover entrega gênica com baixa taxa de morte celular, sendo tal taxa comparável às observadas em procedimentos previamente descritos no estado da técnica, além de ser observada produção do mRNA do gene veiculado em níveis significativamente maiores que os da β-actina (gene endógeno) e também maiores que as obtidas por meio de processos descritos no estado da técnica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[027] Figura 1 - Na Figura 1, demonstra-se que, a partir do DNA de tilápia do Nilo, conseguiu-se inserir em vetor de clonagem o promotor endógeno do gene da β-actina. A Figura 1A é um exemplo de resultado do sequenciamento da região amplificada pelo par de iniciadores e clonada em pGEM-T Easy. A Figura 1B representa o alinhamento do resultado do sequenciamento com a sequência contendo o promotor de interesse depositada no banco de dados.

[028] Figura 2 - A Figura 2 é a imagem de um gel de agarose 0,8%, com marcador de peso molecular 1kb Fermentas (à extrema esquerda) e com as seguintes amostras: 1 - pAmCyan1-N1 com a sequência promotora de interesse, com um valor em par de bases (pb) esperado de aproximadamente 6000 pb (4681 pb do pAmCyan1-N1 adicionado a 1440 pb do promotor de interesse, resultando 6121 pb); 2 - pAmCyan1-N1 com a sequência de interesse, após digestão com Saci e Sacll, originando um fragmento de cerca de 1440 pb - da sequência promotora - e um de -4000 pb - oriundo do pAmCyan1-N1; 3- pAmCyan1-N1 fechado.

[029] Figura 3 - A Figura 3 representa o espectro obtido pela análise por FTIR da amostra de nanotubos de carbono de parede múltipla utilizada na presente tecnologia, e confirma a funcionalização dos mesmos por carboxilação. As bandas mais proeminentes são as localizadas: a cerca de 1770 cm'1, que se deve a estiramento do grupo funcional carbonila (SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X. Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. 6 ed. Nova Iorque: John Wiley & Sons, 2000. 460 p.; KIM, U. J. et al. Infrared-Active Vibrational Modes of Single-Walled Carbon Nanotubes. Physical Review Letters, v. 95, p. 402-406, 2005; ABUILAIWI, F. A. et al. Modification and functionalization of multiwalled carbon nanotube (MWCNT) via Fischer esterification. The Arabian Journal for Science and Engineering, v. 35, n. 1C, p. 37-48, 2010), a banda de deformação devido á hidroxila a -1000 cm'1 (SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X. Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. 6 ed. Nova Iorque: John Wiley & Sons, 2000. 460 p.) e as bandas fundidas localizadas a cerca de 1500 cm”1 relacionadas ao estiramento do ânion carboxilato, e a cerca de 1600 cm”1 que é geralmente atribuída ao estiramento do esqueleto do nanotubo de carbono (ABUILAIWI, F. A. et al. Modification and functionalization of multiwalled carbon nanotube (MWCNT) via Fischer esterification. The Arabian Journal for Science and Engineering, v. 35, n. 1C, p. 37-48, 2010). Esta banda da região de -1600 cm'1 é considerada indicativo de estiramento de ligação C=C da estrutura do nanotubo de carbono (MARTIS, P. et al. Infrared irradiation controlled decoration of multiwalled carbon nanotubes with copper/copper oxide nanocrystals. Acta Materialia, v. 59, n. 12, p. 5040-5047, 2011.), mas também pode ser atribuída à ligação C=0 (SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X. Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. 6 ed. Nova Iorque: John Wiley & Sons, 2000. 460 p.).

[030] Figura 4 - A Figura 4 representa o Espectro Raman para os nanotubos de carbono de parede múltipla na ausência de DNA complexado (A), na presença de DNA complexado seguindo o processo que envolve repouso de 10 minutos em gelo (B) e na presença de DNA complexado sem repouso de 10 minutos no gelo (C). Nota-se que ambos os métodos empregados resultam em deslocamento da banda G, evidenciado pela linha tracejada, o que é indicativo da interação entre o DNA e os nanotubos de carbono. Contudo, o deslocamento é maior quando há a etapa de repouso em gelo (8 cm'1) quando comparado ao deslocamento observado no espectro do nanotubo submetido ao processo sem repouso (2 cm'1).

[031] Figura 5 - A Figura 5 representa os compósitos obtidos após análise das imagens de microscopia de fluorescência no software ImageJ: a -controle, b - nanotubos de carbono de parede múltipla funcionalizados, c -células na presença de pAmCyan1-N1 na concentração de 20 nM sem nanotubos de carbono, d - nanotubos complexados ao plasmídeo na concentração de 20 nM com a sequência promotora submetidos à etapa de repouso no gelo, e - nanotubos complexados ao plasmídeo na concentração de 20 nM com a sequência promotora e não submetidos à etapa de repouso no gelo. Observa-se que o número de células fluorescentes obtido após a transfecção das células empregando os nanotubos submetidos à etapa de repouso no gelo foi maior que o obtido sem esta etapa.

[032] Figura 6 - Compósitos obtidos após análise das imagens de microscopia de fluorescência no software ImageJ: A) Controle; B) Células-DNA; C) Lipo; D) Lipo-DNA; E) Eletro; F) Eletro-DNA 20 nM; G) Eletro-DNA 15 nM; H) Nano eletro; I) Nano-DNA eletro 20 nM; J) Nano-DNA eletro 15 nM; K) Nano; L) Nano-DNA 20 nM; M) Nano-DNA 15 nM.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[033] A presente invenção descreve um método para transfecção de células de peixes, mais precisamente células-tronco espermatogoniais, o qual consiste de uma associação entre a eletroporação e o uso de nanotubos de carbono de parede múltipla carboxilados como carreadores dos plasmídeos contendo o gene de interesse.

[034] O processo de transfecção de células-tronco espermatogoniais de peixes compreende as seguintes etapas: a) esterilização de nanotubos de carbono de parede múltipla carboxilados em luz UV; b) dispersão dos nanotubos de carbono de parede múltipla carboxilados em água ultrapura pela ação de ultrassom a uma frequência de 20-30 kHz, 80-120W por 2-4 horas; c) centrifugação do material durante 10-20 minutos a 12000-14000 rpm e 20-28°C, para remoção dos grumos; d) associação do nanomaterial com o DNA de interesse, através da adição do DNA ao sobrenadante obtido na etapa anterior e ultrassonicação por 15-45 minutos em banho de gelo na frequência de 20-30 kHz, para a formação do complexo DNA-nanotubos de carbono; e) repouso da suspensão contendo o complexo em gelo durante 0-20 minutos; f) adição do complexo à suspensão de células-tronco espermatogoniais do peixe; g) eletroporação das células com o complexo através de pulso de 200-250V e 25-75 pF; h) homogeneização e incubação do material a 20-33°C em incubadora com 4-7% de C02por 18-26 horas.

[035] A avaliação da expressão gênica pelas células transfectadas indicou que o processo descrito na presente tecnologia promove eficiência de expressão do gene em níveis superiores aos induzidos pelo reagente comercial Lipofectamina 2000, pelo nanocomplexo na ausência de eletroporação e pela eletroporação convencional. Além disto, os níveis de morte celular observados com o emprego da presente tecnologia foram relativamente baixos quando comparados a outros métodos. Esta tecnologia, que envolve o uso de células-tronco espermatogoniais, possibilita uma ampla futura gama de aplicações biotecnológicas, como a obtenção de animal transgênico, visto que a integração genômica é passível de ocorrer e que uma única célula desta linhagem produz numerosos espermatozóides e promove espermatogênese de forma contínua.

[036] A invenção pode ser mais bem compreendida, de forma não limitante, pelos exemplos que seguem.

[037] Exemplo 1 - Obtenção dos nanotubos de carbono funcionalizados ligados a plasmídeo contendo o gene da proteína fluorescente ciano, acrescido do promotor do gene da β-actina de Oreochromis niloticus [038] Primeiramente, obteve-se a sequência de nucleotídeos do promotor do gene da β-actina de Oreochromis niloticus, que é um gene onipresente nas células desta espécie, além de ter expressão constitutiva. A sequência foi obtida no site do National Center for Biotechnology Information (NCBI -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e amplificada a partir do DNA de O. niloticus por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) com o uso de iniciadores adequados.

[039] A sequencia reguladora foi então inserida no vetor pGEM-T Easy de acordo com as recomendações do fabricante do kit do vetor (pGEM®-T Easy Vector System), foi realizada clonagem em Escherichia coli XL-1, extração de DNA e sequenciamento para confirmação da sequência, por meio da análise via “Basic Local Alingment Search Tool” (BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cqi). Na Figura 1, observa-se que o promotor amplificado foi devidamente incorporado ao vetor pGEM-T Easy no processo de clonagem.

[040] Após a confirmação, a sequência foi removida do vetor pGEM-T Easy e inserida no plasmídeo pAmCyan1-N1 (Clontech). Este plasmídeo contém o gene da proteína fluorescente ciano, uma proteína que, por ser fluorescente, permite bioimageamento de moléculas, células e até mesmo organismos inteiros (STEPANENKO, Ο. V. et al. Fluorescent Proteins as Biomarkers and Biosensors: Throwing Color Lights on Molecular and Cellular Processes. Current Protein & Peptide Science, v. 9, n. 4, p. 338-369, 2008). A sequência de 1440 pb foi excisada do pGEM-T Easy utilizando-se as endonucleases de restrição Sacll e Saci. O vetor pAmCyan1-N1 foi então submetido à digestão com estas mesmas enzimas de restrição. Os produtos da digestão foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e, em seguida, a sequencia de interesse foi removida do gel com o GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas). O promotor da β-actina foi inserido ao plasmídeo contendo o gene da proteína fluorescente ciano por meio da ação da enzima T4 DNA ligase. O sucesso do procedimento de ligação foi evidenciado por eletroforese em gel de agarose (Figura 2).

[041] O plasmídeo obtido foi inserido em bactérias E. coli XL-1 por eletroporação e as colônias transformadas, selecionadas devido ao crescimento em meio contendo kanamicina (50 pg/mL), foram crescidas em meio LB líquido e submetidas a maxi-prep para obtenção de quantidade suficiente de DNA recombinante.

[042] Em seguida, o plasmídeo pAmCyan1-N1 contendo o promotor do gene da β-actina de Oreochromis niloticus, e também o mesmo plasmídeo sem este promotor, foram aderidos à superfície dos nanotubos de carbono conforme descrito a seguir.

[043] Os nanotubos de carbono (CNTs) utilizados eram de parede múltipla (multiwall), carboxilados e purificados (para remoção de resíduos potencialmente citotóxicos do catalisador). Sua funcionalização foi confirmada através de espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier, em espectrômetro de FTIR Nicolet 6700 equipado com microscópio óptico. Na Figura 3, que representa o espectro obtido, nota-se a presença de bandas típicas do próprio nanotubo de carbono bem como de bandas que se devem à presença de grupos inseridos por funcionalização.

[044] Os CNTs foram submetidos a 15 minutos de exposição à luz UV no ambiente estéril da capela de fluxo laminar e, em seguida, dispersos em água ultrapura (Phoneutria) para uma concentração final de 0,25 mg/mL (LADEIRA, M. S. et al. Highly efficient siRNA delivery system into human and murine cells using single-wall carbon nanotubes. Nanotechnology, v. 21, n. 38, p. 101-113, 2010). Prosseguiu-se, então, com exposição a ultrassom de banho com frequência de 25 kHz e potência de 100 W por 3 horas. Centrifugou-se em seguida o material durante 15 minutos a 13000 rpm e 25°C, para remoção dos grumos. O sobrenadante foi coletado e 100 pL do mesmo foi adicionado ao vetor contendo a sequência codificante para a proteína fluorescente com a sequência promotora endógena na concentração de 15 nM (Pantarotto et al., 2004) e 100 pL ao plasmídeo comercial com a sequência promotora inserida na concentração de 20 nM (concentração de teste superior aos 15 nM).

[045] Ultrassonicou-se por 30 minutos em banho de gelo e, em seguida, o complexo foi submetido a repouso no gelo por 10 minutos. Além disto, foi realizado o procedimento de complexação dos nanotubos com o DNA sem a etapa adicional de repouso no gelo, para fins de verificação da melhor condição de formação do nanocomplexo e, subsequentemente, da eficiência de transfecção.

[046] A espectroscopia Raman ressonante assistida por microscopia ótica, que é uma espectroscopia do tipo vibracional, foi realizada com a finalidade de se observar as bandas típicas de um nanotubo de carbono de parede múltipla: bandas D, G1 e G2 (partes integrantes da banda G) e, ainda, detectar a interação do DNA com este nanotubo (para confirmação de que a ligação entre ambos, para formação do complexo usado na transfecção, foi bem sucedida). Esta técnica é capaz de permitir a identificação de materiais de maneira não invasiva e não destrutiva, através de excitação do alvo por um laser e obtenção dos dados do perfil de deslocamento de energia (energy-shifting) em número de onda; estes são como impressão digital do material em análise (WHITE, S. N. Laser Raman spectroscopy as a technique for Identification of seafloor hydrothermal and cold seep minerais. Chemical Geology, v. 58, p. 22- 35, 2008.). Utilizou-se o espectrômetro AndorTM Tecnology-sharmrock sr-303i. Para excitação, fez-se uso de laser He-Ne de comprimento de onda 632,8 nm (1.96 eV) e obteve-se a leitura de comprimentos de onda e intensidade de espalhamento Raman. Os comprimentos de onda experimentais obtidos em nanômetros foram então convertidos em Raman Shift (cm'1) através da fórmula abaixo, sendo o comprimento de onda experimental obtido: [047] Estes dados foram então plotados no eixo x, versus a intensidade do sinal (em unidades arbitrárias) no eixo y, gerando os espectros Raman apresentados na Figura 4. Ao observar-se a Figura, percebe-se grande semelhança entre os espectros dos complexos e do nanotubo não associado ao DNA, tendo-se como diferença mais marcante o posicionamento das bandas G1 e G2. A banda G encontra-se deslocada após a funcionalização, como esperado (em destaque pelo tracejado na Figura 4). Isso se atribui principalmente à transferência de carga entre os átomos de oxigênio presentes na superfície do nanotubo de carbono funcionalizado e os grupos doadores de elétron presentes no DNA, como por exemplo os grupos amina (LI, Z. et al. The high dispersion of DNA-multiwalled carbon nanotubes and their properties. Analytical Biochemistry, v. 387, p. 267-270, 2009). O deslocamento da banda G no complexo formado pelo processo que inclui a etapa de repouso no gelo é de 8 cm"1, ou seja, é bem mais pronunciado que aquele observado para o complexo formado sem a inclusão desta etapa, que foi de 2 cm'1. Além disso, a banda D é mais intensa no espectro do complexo formado sem repouso no gelo. Como esta banda é uma assinatura de defeitos ou desordem na estrutura do nanomaterial devido ao processo de purificação (que cria em sua superfície irregularidades), e o DNA se enrola na superfícies do tubo durante a complexação, uma banda D mais intensa revela que se encontra disponível para leitura pelo Raman uma maior superfície com estas irregularidades. Ou seja, houve uma menor interação de DNA com a superfície dos tubos, deixando por conseqüência uma maior área de nanotubo exposta. Em conjunto, estes dados sugerem que em ambos os casos houve formação do complexo entre nanotubos de carbono e o DNA, e que a interação entre a nanopartícula e o ácido nucleico foi maior quando houve a etapa de repouso no gelo.

[048] Exemplo 2 - Avaliação da entrega gênica por complexos nanotubo-DNA obtidos com ou sem etapa de repouso em gelo [049] Para avaliar o efeito da etapa de repouso no gelo após ultrassom na formação do complexo entre nanotubos de carbono de parede múltipla e plasmídeo pAmCyan1-N1, ainda sem a sequência promotora ligada, foi realizada a transfecção das células-tronco espermatogoniais de tilápia do Nilo e a expressão da proteína ciano foi avaliada.

[050] As células-tronco espermatogoniais foram obtidas por meio do protocolo desenvolvido por Lacerda e colaboradores em 2006 (LACERDA, S. M. S. N. et al. Germ cells transplantation in fish: the Nile-tilapia model. Animal Reproduction, v. 3, n. 2, p. 146-159, 2006). Para a transfecção, foram adicionados 100 pL de complexo nanotubos de carbono e plasmídeo, submetidos ou não à etapa de repouso no gelo por 10 minutos após ultrassonicação, ao poço da placa de seis poços contendo as células. Adicionou-se às células, ainda, 100 pL dos nanotubos de carbono de parede múltipla na ausência de DNA ligado; 20 nM de plasmídeo pAmCyan1-N1 na ausência de nanotubos de carbono e houve, ainda, células sem adição de qualquer componente (controle). Homogeneizou-se o conteúdo da placa e esta foi incubada a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas.

[051] As células nas placas de seis poços foram observadas após 24 horas do procedimento de entrega do vetor com a sequência de interesse. Para isto, foi utilizado microscópio de fluorescência Nikon Eclipse Ti (Nikon), observando-se em comprimento de onda de excitação e emissão adequados à proteína fluorescente usada. A faixa de absorção e emissão de proteína ciano (com comprimentos de onda ótimos de excitação 458 nm e emissão 489 nm) permitiu sua visualização nos filtros CFP e FITC do microscópio mencionado. As imagens obtidas do modo dicroico e dos filtros de fluorescência citados foram convertidas em compósitos com o auxílio do software Image J1.46 r.

[052] Observa-se, na Figura 5, que o grupo controle, com células incubadas sem tratamento (Figura 5a), e o grupo de células incubadas apenas com nanotubos de carbono (Figura 5b) não apresentaram fluorescência, como era esperado. Entre os grupos nos quais foi adicionado o plasmídeo, aquele no qual o complexo foi produzido com a etapa de repouso no gelo foi o que apresentou maior número de células fluorescentes (Figura 5d), o que indica maior eficiência de transfecção em consequência da maior interação entre o nanotubo de carbono e o DNA de interesse.

[053] Exemplo 3 - Entrega gênica às células-tronco espermatogoniais de tilápia nilótica [054] Para fins de comparação da presente tecnologia com algumas das demais descritas no estado da técnica, a entrega do vetor contendo a sequência codificante da proteína fluorescente acrescido do promotor da β-actina de tilápia do Nilo foi realizada por meio de eletroporação na presença ou ausência de nanotubos de carbono, via nanotubos de carbono como carreadores ou através do reagente comercial Lipofectamina® 2000 (Invitrogen). Nesta etapa de avaliação, foi adotado o procedimento de síntese do complexo nanotubo-DNA que inclui a etapa de 10 minutos de repouso no gelo, por ter sido demonstrada sua maior eficiência.

[055] Os grupos experimentais para avaliação dos diferentes tratamentos de transfecção nas células-tronco espermatogoniais foram os seguintes: A) Controle: controle negativo de células sem tratamento, apenas incubadas a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas; B) Células-DNA: controle negativo de células com plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo sem qualquer carreador ou tratamento para transfecção, incubadas a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas; C) Lipo: Reagente comercial Lipofectamina® 2000 sem adição de DNA, utilizado conforme o protocolo do fabricante. A metodologia empregada é semelhante à descrita no item a seguir, todavia, sem adição de DNA; D) Lipo-DNA: Plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo transfectado por Lipofectamina® 2000. O reagente comercial Lipofectamina® 2000 (Invitrogen) foi utilizado conforme o protocolo do fabricante, com 4 pg de DNA e 10 pL do reagente. Ambos foram adicionados, separadamente, a 50 pL de meio DMEM sem soro, homogeneizados e incubados a 25°C por 5 minutos. Em seguida, foram reunidos em um mesmo recipiente e misturados gentilmente. Após incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, o conteúdo foi adicionado ao respectivo poço da placa de cultura de seis poços contendo as células em meio FSM. Homogeneizou-se o conteúdo da placa e esta foi incubada a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas. E) Eletro: Eletroporação das células sem DNA, para fins de controle. Para eletroporação, foi utilizado o sistema Gene Pulser MXcellTM (Bio-Rad). Adicionou-se à cubeta de 4 mm o conteúdo de células de um poço da placa de 6 poços em PBS. As células foram submetidas, então, a um pulso de 225 V e 50 pF e, em seguida, adicionou-se 500 pL de meio FSM à cubeta. As células foram então transferidas para um poço da placa de 6 poços com FSM, para volume final de 2 mL/poço. O conteúdo da placa foi homogeneizado e esta foi incubada a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas. F) Eletro-DNA 20 nM: 20 nM do plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo transfectado por eletroporação. A eletroporação foi realizada nas condições descritas no item E, com adição às células do vetor contendo o gene da proteína fluorescente com a sequência da região promotora do gene da β-actina na concentração de 20 nM. G) Eletro-DNA 15 nM: 15 nM do plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo transfectado por eletroporação. A eletroporação foi realizada nas condições descritas no item E, com adição às células do vetor contendo o gene da proteína fluorescente com a sequência da região promotora do gene da β-actina na concentração de 15 nM. H) Nano eletro: Nanotubos de carbono de parede múltipla mais eletroporação. A eletroporação foi realizada nas condições descritas no item E, com adição às células de nanotubos de carbono de parede múltipla carboxilados sem DNA; I) Nano-DNA eletro 20 nM: 20 nM do plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo associado a nanotubos de carbono de parede múltipla, mais eletroporação para transfecção. A eletroporação foi realizada nas condições descritas no item E, com adição às células do complexo entre nanotubos de carbono e vetor contendo o gene da proteína fluorescente com a sequência da região promotora do gene da β-actina na concentração de 20 nM; J) Nano-DNA eletro 15 nM: 15 nM do plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo associado a nanotubos de carbono de parede múltipla, mais eletroporação para transfecção. A eletroporação foi realizada nas condições descritas no item E, com adição às células do complexo entre nanotubos de carbono e vetor contendo o gene da proteína fluorescente com a sequência da região promotora do gene da β-actina na concentração de 15 nM. K) Nano: controle com nanotubos de carbono. Foram adicionados 100 pL dos nanotubos de carbono de parede múltipla, na ausência de DNA ligado, às células. Homogeneizou-se o conteúdo da placa e esta foi incubada a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas; L) Nano-DNA 20 nM: 20 nM do plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo associado a nanotubos de carbono de parede múltipla. Foram adicionados 100 pL de complexo nanotubos de carbono e plasmídeo ao poço da placa de 6 poços contendo as células. Homogeneizou-se o conteúdo da placa e esta foi incubada a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas; M) Nano-DNA 15 nM: 15 nM do plasmídeo contendo o gene da proteína ciano mais o promotor do gene da β-actina de tilápia do Nilo associado a nanotubos de carbono de parede múltipla. Foram adicionados 100 pL de complexo nanotubos de carbono e plasmídeo ao poço da placa de 6 poços contendo as células. Homogeneizou-se o conteúdo da placa e esta foi incubada a 28°C em incubadora com 5% de C02 por 24 horas;

[056] As células nas placas de seis poços foram observadas após 24 horas do procedimento de entrega do vetor com a sequência de interesse, sendo realizadas a detecção da expressão da proteína ciano por fluorescência, dosagem de morte celular e determinação da taxa de expressão da proteína ciano em relação à expressão da β-actina.

[057] Para detecção da expressão do gene da proteína fluorescente ciano, foi utilizado microscópio de fluorescência como descrito anteriormente. Através da análise por microscopia após 24 horas de entrega dos plasmídeos às espermatogônias tronco, a fluorescência foi visível em todos os grupos contendo o plasmídeo com gene codificante da proteína fluorescente acrescido de um veículo para sua entrega. No controle de células sem tratamento (Figura 6A) não foi observada fluorescência, como esperado, assim como no controle Células-DNA (Figura 6B), o que também era esperado visto que o plasmídeo não adentra a célula espontaneamente.

[058] Para a Lipofectamina® 2000, observou-se ausência de fluorescência quando as células foram tratadas apenas com este reagente de transfecção (Figura 6C), assim como no grupo controle. A fluorescência foi notada apenas no grupo experimental com lipofectamina e pAmCyan1-N1 acrescido da sequência promotora do gene da β-actina de tilápia do Nilo (Figura 6D). Nota-se que o tratamento com a Lipofectamina® 2000 resulta, na concentração utilizada, em uma distribuição celular semelhante ao controle, o que sugere baixa toxicidade para as células, ocasionando baixa taxa de morte.

[059] Quanto à eletroporação, também se observa a ausência de fluorescência no grupo Eletro (Figura 6E). A fluorescência foi evidenciada, como esperado, nos demais grupos contendo o pAmCyan1-N1 com a sequência promotora nas concentrações de 20 nM (Figura 6F) e 15 nM (Figura 6G). Observando-se a distribuição das células pode-se notar, em comparação com o controle, que a eletroporação das células-tronco induziu um maior grau de agrupamento entre as células, o que sugere maior grau de morte celular.

[060] No que diz respeito à eletroporação na presença dos nanotubos de carbono de parede múltipla funcionalizados (Figura 6H), também não se evidenciou, como esperado, fluorescência. Esta foi percebida apenas nos grupos experimentais contendo pAmCyan1-N1 com a sequência promotora complexado aos nanotubos anteriormente à eletroporação (Figuras 6I e 6J). A distribuição celular sugere que, na presença dos nanotubos, a eletroporação ainda induza morte celular em taxas semelhantes a quando efetuada na ausência dos mesmos, exceto no grupo no qual a eletroporação ocorreu na presença dos nanotubos ligados ao plasmídeo na concentração 15 nM com a sequência promotora (Figura 6J), no qual a confluência celular se assemelha ao do grupo controle (Figura 6A).

[061] Nos grupos que empregaram nanotubos de carbono, como se esperava, a fluorescência estava ausente quando apenas os nanotubos de carbono de parede múltipla foram adicionados às células (Figura 6K). Apenas se notou a fluorescência nos grupos experimentais com pAmCyan1-N1 com a sequência promotora complexado aos nanotubos (Figura 6L e 6M). Como o plasmídeo não adentra a célula espontaneamente (Figura 6B), realizou-se pela primeira vez a transfecção de células-tronco espermatogoniais utilizando-se como veículo os nanotubos de carbono de parede múltipla. Este nanomaterial não havia ainda sido utilizado como veículo para entrega de DNA às células de peixes.

[062] Foi realizada também a dosagem da taxa de morte celular por citometria de fluxo. Para realização da citometria de fluxo, as células foram tripsinizadas e transferidas da placa de 6 poços a tubos Falcon para centrifugação a 2000 g por 10 minutos a 25°C, com descarte do sobrenadante. O pellet foi ressuspenso em PBS e centrifugado a 200 g por 5 minutos a 25°C. Em seguida ressuspendeu-se as células em 100 pl_ de solução de marcação do Annexin-V-FLUOS staining kit (Roche), consistindo em uma mistura de anexina V, iodeto de propídio e tampão de incubação nas proporções descritas pelo fabricante. Incubou-se as células por 15 minutos à temperatura ambiente na ausência de luz, e procedeu-se a leitura de morte celular em duplicata no citômetro de fluxo FACS Canto II (BD Biosciences). Os resultados foram analisados no software FlowJo 10.0.6, sendo o grupo controle aquele com taxa de morte celular nula.

[063] Os dados de morte celular estão reunidos na Tabela 1.

[064] A transfecção empregando lipofectamina resultou em baixas taxas de morte celular, enquanto que a eletroporação convencional foi a técnica que apresentou as maiores taxas de morte celular observadas, fato que pode ser atribuído marjoritariamente ao efeito do campo elétrico sobre as células, o que também pode alterar sua distribuição espacial e grau de agregação (Hendricks e Jesuthasan, 2007). A eletroporação em associação com os complexos de nanotubos e DNA, por sua vez, apresentou baixas taxas de morte celular quando empregado o complexo com DNA na concentração de 15 nM. Logo, a utilização do nanocomplexo não é citotóxica às células e, quando na presença de eletroporação, não exacerba-se de maneira significativa a morte celular induzida por esta. Assim sendo, visto que para utilizações futuras das células tranfectadas (por exemplo para geração de animal transgênico) é interessante que se tenha não só a expressão da proteína de interesse, mas que esta aconteça em um maior número de células possíveis, a invenção possibilita que se realize a transfecção sem no entanto ocasionar-se a perda significativa em número de células.

[065] Foi realizada, ainda, a dosagem da expressão gênica da proteína fluorescente ciano relativa à expressão do gene da β-actina. Para isto, foram obtidas amostras de RNA dos grupos experimentais. O RNA obtido foi primeiramente tratado com DNAse e, então, submetido à transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). As amostras de cDNA obtidas foram então submetidas a q-PCR para determinação da expressão relativa do gene da proteína fluorescente ciano em relação à β-actina. Os resultados estão reunidos na Tabela 2.

[066] Em todos os grupos experimentais foi possível obter-se a transcrição do gene da proteína fluorescente ciano, exceto nos grupos controle (como esperado).

[067] O reagente comercial Lipofectamina® 2000, apesar de resultar em baixas taxas de morte celular, foi o método de transfecção que gerou a menor taxa de expressão relativa do gene da proteína ciano entre todas as metodologias comparadas, ainda que o uso deste reagente tenha se dado na proporção descrita para otimização de eficiência de transfecção em fibroblastos de zebrafish. Os grupos experimentais nos quais houve a associação entre o complexo nanotubo-DNA e eletroporação foram os que apresentaram as maiores taxas de expressão relativa do gene transfectado, sendo que estes valores foram aproximadamente de 10 e 20 vezes a taxa da expressão da β-actina para os grupos Nano-DNA eletro 20 nM e Nano-DNA eletro 15 nM, respectivamente.

[068] Desta forma, o conjunto de dados demonstra que a tecnologia proposta, principalmente nas condições avaliadas no grupo Nano-DNA eletro 15 nM, alia altas taxas de expressão gênica a baixas taxas de morte celular, o que é extremamente desejável no processo de transfecção de genes.

Claims (4)

1. PROCESSO DE TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO ESPERMATOGONIAIS DE PEIXES caracterizado por conter as seguintes etapas: a) esterilização de nanotubos de carbono de parede múltipla carboxilados em luz UV; b) dispersão dos nanotubos de carbono de parede múltipla carboxilados, na concentração de 0,10-0,40 mg/mL, em água ultrapura pela ação de ultrassom a uma frequência de 20-30 kHz, 80-120W por 2-4 horas; c) centrifugação do material durante 10-20 minutos a 12000-14000 rpm e 20-28°C, para remoção dos grumos; d) associação do nanomaterial com o DNA de interesse, através da adição do DNA, na concentração de 5-30 nM, ao sobrenadante obtido na etapa anterior e ultrassonicação por 15-45 minutos em banho de gelo na frequência de 20-30 kHz, para a formação do complexo DNA-nanotubos de carbono; e) repouso da suspensão contendo o complexo em gelo durante 0-20 minutos; f) adição do complexo à suspensão de células-tronco espermatogoniais do peixe; g) eletroporação das células com o complexo através de pulso de 200-250V e 25-75 pF; h) homogeneização e incubação do material a 20-33°C em incubadora com 4-7% de C02por 18-26 horas.

2, PROCESSO DE TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO ESPERMATOGONIAIS DE PEIXES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas células-tronco espermatogoniais empregadas serem, preferencialmente, de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).

3. PROCESSO DE TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO ESPERMATOGONIAIS DE PEIXES, de acordo com a reivindicação 1, etapa “d”, e reivindicação 2, caracterizado pelo DNA ser adicionado na concentração entre 15 a 20 nM.

4. NANOTUBO DE CARBONO DE PAREDE MÚLTIPLA CARBOXILADO E COMPLEXADO AO DNA caracterizado por ser obtido através do processo descrito na reivindicação 1, etapas “a” a “e”.