BR102014007923B1

BR102014007923B1 - POLYMERIC NANOSTRUCTURED SYSTEM AND ITS USE

Info

Publication number: BR102014007923B1
Application number: BR102014007923-8A
Authority: BR
Inventors: Lis Marie Monteiro; Elizabeth Igne Ferreira; Paulo Cesar Cotrim; Chung Man Chin; Nádia Araci Bou-Chacra
Original assignee: Universidade De São Paulo-Usp
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2020-05-12
Also published as: BR102014007923A8; BR102014007923A2

Abstract

sistema nanoestruturado polimérico e seu uso - a presente invenção descreve um sistema nanoestruturado polimérico compreendendo hidroximetilnitrofural, bem como seu uso no preparo de medicamento para tratar leishmaniose.polymeric nanostructured system and its use - the present invention describes a polymeric nanostructured system comprising hydroxymethylnitrofural, as well as its use in the preparation of medication to treat leishmaniasis.

Description

SISTEMA NANOESTRUTURADO POLIMÉRICO E SEU USOPOLYMERIC NANOSTRUCTURED SYSTEM AND ITS USE

Campo da invenção:Field of the invention:

[001] A invenção é aplicada no campo da nanotecnologia, mais especificamente, no ramo da nanotecnologia aplicada à área farmacêutica, e descreve um sistema nanoestruturado polimérico compreendendo hidroximetilnitrofural, bem como seu uso no preparo de medicamento para tratar leishmaniose.[001] The invention is applied in the field of nanotechnology, more specifically, in the field of nanotechnology applied to the pharmaceutical area, and describes a polymeric nanostructured system comprising hydroxymethylnitrofural, as well as its use in the preparation of medication to treat leishmaniasis.

Fundamentos da invenção:Fundamentals of the invention:

[002] Doenças tropicais negligenciadas (acrônimo DTN) compartilham várias características em comum, sendo a mais marcante delas o fato de que a população afetada é assolada pela pobreza.[002] Neglected tropical diseases (acronym DTN) share several characteristics in common, the most striking of which is the fact that the affected population is plagued by poverty.

[003] Essas doenças antigas são endêmicas na África, Ásia e Américas e estima-se que, anualmente, causam a morte de cerca de um milhão de pessoas.[003] These old diseases are endemic in Africa, Asia and the Americas and are estimated to cause the death of around one million people annually.

[004] Ainda, as DTN não só sobrevivem e espalham-se nessas condições, como também podem exacerbar e perpetuar a pobreza das comunidades afetadas.[004] Still, NTDs not only survive and spread under these conditions, they can also exacerbate and perpetuate the poverty of the affected communities.

[005] O programa em DTN do Ministério da Saúde definiu, por meio de dados epidemiológicos, demográficos e impacto da doença, sete doenças que necessitam de prioridade de atuação: a dengue, a doença de Chagas, a leishmaniose, a hanseníase, a malária, a esquistossomose e a tuberculose.[005] The Ministry of Health's NTD program defined, through epidemiological, demographic and disease impact data, seven diseases that need priority action: dengue, Chagas disease, leishmaniasis, leprosy, malaria , schistosomiasis and tuberculosis.

[006] Embora exista financiamento para pesquisas, o conhecimento obtido através das mesmas não é revertido em avanços terapêuticos. Uma das razões para esse quadro é o baixo interesse da indústria farmacêutica, justificado pelo reduzido potencial de retorno lucrativo, uma vez que a população atingida é de baixa renda e presente, em sua maioria, nos países em desenvolvimento.[006] Although there is funding for research, the knowledge obtained through it is not reversed in therapeutic advances. One of the reasons for this situation is the low interest of the pharmaceutical industry, justified by the reduced potential for profitable return, since the affected population is of low income and present, mostly, in developing countries.

2/25 [007] A leishmaniose está em 2^o lugar em mortalidade e 4^o lugar em morbidade entre as doenças tropicais, sendo classificada como uma das doenças mais negligenciadas, com base nos limitados recursos investidos no diagnóstico, tratamento e controle, bem como sua forte associação com a pobreza.2/25 [007] Leishmaniasis is in second place in mortality and morbidity in fourth place among the tropical diseases, classified as one of the most neglected diseases, based on the limited resources invested in the diagnosis, treatment and control, as well as its strong association with poverty.

[008] Os agentes etiológicos da leishmaniose são protozoários tripanosomatideos do gênero Leishmania, um parasito intracelular obrigatório das células do sistema fagocitico mononuclear, o qual apresenta uma forma flagelada (promastigota), encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, e outra aflagelada intracelular (amastigota) (Figuras 1A e 1B, respectivamente).[008] The etiologic agents of leishmaniasis are Leishmania trypanosomatid protozoa, a mandatory intracellular parasite of the cells of the mononuclear phagocytic system, which has a flagellate (promastigote) form, found in the digestive tract of the vector insect, and another intracellular afflagellate (amastigote). ) (Figures 1A and 1B, respectively).

[009] As leishmanioses são caracterizadas pela sua diversidade e complexidade, sendo transmitidas ao homem por mais de 20 espécies de parasito e por aproximadamente 30 diferentes tipos de vetores flebotomideos.[009] Leishmaniasis are characterized by their diversity and complexity, being transmitted to man by more than 20 species of parasite and by approximately 30 different types of phlebotomide vectors.

[010] As leishmanioses podem, ainda, ser divididas em duas principais formas clínicas, de acordo com a espécie do parasito transmitido: a leishmaniose visceral (ou Kalazar) e a cutânea. A evolução e a resolução de cada uma são determinadas também pelas interações parasito/sistema imune do indivíduo afetado.[010] Leishmaniasis can also be divided into two main clinical forms, according to the species of the parasite transmitted: visceral (or Kalazar) and cutaneous leishmaniasis. The evolution and resolution of each is also determined by the parasite / immune system interactions of the affected individual.

[011] A leishmaniose visceral é uma doença sistêmica e fatal se não tratada, podendo ser caracterizada como doença endêmica, esporádica ou epidêmica, apresentando diferentes características clínicas em cada situação.[011] Visceral leishmaniasis is a systemic and fatal disease if left untreated, and can be characterized as an endemic, sporadic or epidemic disease, presenting different clinical characteristics in each situation.

[012] A leishmaniose cutânea é uma doença infecciosa, não contagiosa, que acomete pele e mucosas e é causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania.[012] Cutaneous leishmaniasis is an infectious, non-contagious disease that affects skin and mucous membranes and is caused by different species of protozoa of the genus Leishmania.

3/253/25

Primariamente, é uma infecção zoonótica, afetando outros animais que não o ser humano, o qual pode ser envolvido secundariamente. A leishmaniose cutânea é um problema de saúde pública mundial e, apesar de não letal, compromete a fisiologia, vida social e capacidade de trabalho dos afetados.Primarily, it is a zoonotic infection, affecting animals other than humans, which can be involved secondarily. Cutaneous leishmaniasis is a worldwide public health problem and, although not lethal, it compromises the physiology, social life and work capacity of those affected.

[013] O nitrofural é um agente antimicrobiano ativo contra micro-organismos Gram-positivos e tem mostrado ação tripanomicida e leishmanicida por produzir inativação irreversível da tripanotiona redutase (TR), responsável pela remoção de peróxidos e manutenção do nível de tiol intracelular.[013] Nitrofural is an antimicrobial agent active against Gram-positive microorganisms and has shown a trypanomycin and leishmanicidal action for producing irreversible inactivation of trypanothione reductase (TR), responsible for removing peroxides and maintaining the level of intracellular thiol.

[014] O grupamento nitro na molécula do nitrofural é responsável pela ação farmacológica, entretanto, também provoca toxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade: durante o metabolismo do fármaco, são produzidas espécies eletrofílicas reativas que podem alterar e danificar o DNA, logo seu uso é restrito a formulações tópicas.[014] The nitro group in the nitrofural molecule is responsible for the pharmacological action, however, it also causes toxicity, mutagenicity and carcinogenicity: during the metabolism of the drug, reactive electrophilic species are produced that can alter and damage DNA, so its use is restricted to topical formulations.

[015] A mutagenicidade do hidroximetilnitrofural (NFOH) foi avaliada empregando o teste de Ames em linhagens de Salmonella typhimurium.[015] Hydroxymethylnitrofural (NFOH) mutagenicity was assessed using the Ames test on Salmonella typhimurium strains.

[016] Os resultados mostraram que o processo de latenciação diminuiu em quatro vezes a atividade mutagênica do composto, quando comparado ao nitrofural.[016] The results showed that the latency process decreased the compound's mutagenic activity by four times, when compared to nitrofural.

[017] Ainda, os resultados de dose letal mediana (DL₅o) foram maiores em relação ao fármaco de partida, caracterizando o NFOH como pouco tóxico.[017] Still, the results of median lethal dose (DL ₅ o) were higher in relation to the starting drug, characterizing the NFOH as low toxic.

[018] Em teste de micronúcleo, que permite identificar aumento de mutação, a frequência de células micronucleadas nos animais tratados com NFOH foi quatro vezes menor que[018] In a micronucleus test, which allows an increase in mutation to be identified, the frequency of micronucleated cells in animals treated with NFOH was four times less than

4/25 nos animais tratados com nitrofural.4/25 in animals treated with nitrofural.

[019] O uso de nanoparticulas poliméricas biodegradáveis como carreadores para sistemas de liberação modificada de fármacos tem se destacado devido ao aumento da biodisponibilidade. Esses sistemas exibem potencial uso pela modificação da superfície por meio de transformações químicas e, ainda, podem fornecer adequado controle farmacocinético e ser utilizados para o encapsulamento de vasta gama de agentes terapêuticos.[019] The use of biodegradable polymeric nanoparticles as carriers for modified drug delivery systems has stood out due to the increase in bioavailability. These systems exhibit potential use for modifying the surface through chemical transformations and, furthermore, they can provide adequate pharmacokinetic control and be used for the encapsulation of a wide range of therapeutic agents.

[020] Os principais polímeros naturais e sintéticos utilizados são gelatina, quitosana, poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA), copolímero de ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), poli alquil cianoacrilato (PACA), polimetacrilato de metila (PMMA), e poli (n-Butil cianoacrilato) (PBCA).[020] The main natural and synthetic polymers used are gelatin, chitosan, poly (lactic-coglycolic acid) (PLGA), polylactic acid copolymer (PLA), polyglycolic acid (PGA), poly cyanoacrylate (PACA), methyl polymethacrylate (PMMA), and poly (n-Butyl cyanoacrylate) (PBCA).

[021] Entre as nanoparticulas poliméricas, destaca-se o uso daquelas obtidas via polimerização em meio aquoso, empregando n-butil cianoacrilato (PBCA).[021] Among the polymeric nanoparticles, the use of those obtained via polymerization in aqueous media, using n-butyl cyanoacrylate (PBCA), stands out.

[022] Carreadores de fármacos de PBCA demonstraram resultados significativos em numerosas patologias como câncer, infecções graves (virais, bacteriológicas e parasitárias), bem como várias doenças metabólicas e autoimunes.[022] PBCA drug carriers have shown significant results in numerous pathologies such as cancer, serious infections (viral, bacteriological and parasitic), as well as several metabolic and autoimmune diseases.

[023] A aceitabilidade de polímeros sintéticos no desenvolvimento de nanoparticulas depende da sua degradação pelos sistemas biológicos. A interação do polímero com o conteúdo lisossomal é de extrema importância para assegurar a liberação do fármaco e evitar a acumulação do material no organismo, o que pode conduzir a efeitos tóxicos. O PBCA é degradado intracelularmente, isto é, os grupos alquil são[023] The acceptability of synthetic polymers in the development of nanoparticles depends on their degradation by biological systems. The interaction of the polymer with the lysosomal content is extremely important to ensure the release of the drug and prevent the accumulation of material in the body, which can lead to toxic effects. PBCA is degraded intracellularly, that is, alkyl groups are

5/25 hidrolisados por esterases, o que aumenta a hidrofilicidade da cadeia de polímero até que se torne totalmente solúvel em água.5/25 hydrolyzed by esterases, which increases the hydrophilicity of the polymer chain until it becomes totally soluble in water.

[024] Nanopartículas de PBCA podem ser sintetizadas de acordo com três tipos distintos de polimerização: (A) aniônica, (B) zwitteriônica e (C) por radical, a partir de monômeros de n-butil-2-cianoacrilato (NBCA), composto utilizado como adesivo de tecidos biológicos e que tem sido aplicado clinicamente na oclusão de incisões cirúrgicas e para embolizar malformações arteriovenosas cerebrais.[024] PBCA nanoparticles can be synthesized according to three different types of polymerization: (A) anionic, (B) zwitterionic and (C) by radical, from n-butyl-2-cyanoacrylate (NBCA) monomers, compound used as an adhesive for biological tissues and which has been applied clinically to occlusion of surgical incisions and to embolize cerebral arteriovenous malformations.

[025] Tem sido demonstrado que as propriedades de superfície são um fator chave na modulação e biodistribuição dos sistemas nanoestruturados. Por essa razão as nanopartículas de PBCA são bastante versáteis, pois é possível modificar suas propriedades aplicando revestimentos de diversos compostos, como polietilenoglicol, quitosana, pectina e ácido hialurônico.[025] Surface properties have been shown to be a key factor in the modulation and biodistribution of nanostructured systems. For this reason, PBCA nanoparticles are quite versatile, as it is possible to modify their properties by applying coatings of various compounds, such as polyethylene glycol, chitosan, pectin and hyaluronic acid.

[026] Os macrófagos são predominantemente envolvidos na depuração da corrente sanguínea e degradação das nanopartículas. In vitro, a captação de nanopartículas por macrófagos ocorre por meio de processo de endocitose e as partículas se localizaram no compartimento lisossomal.[026] Macrophages are predominantly involved in the clearance of the bloodstream and degradation of nanoparticles. In vitro, the uptake of nanoparticles by macrophages occurs through an endocytosis process and the particles are located in the lysosomal compartment.

[027] Considerando tal característica, a utilização de nanopartículas em sistemas de liberação modificada direcionada a macrófagos é particularmente atraente, especialmente no caso de tratamento de doenças em que os macrófagos atuam como células hospedeiras para parasitos e bactérias, como a leishmaniose.[027] Considering this characteristic, the use of nanoparticles in modified release systems directed at macrophages is particularly attractive, especially in the case of treating diseases in which macrophages act as host cells for parasites and bacteria, such as leishmaniasis.

[028] Os parasitos causadores da leishmaniose se localizam nos vacúolos lisossomais de macrófagos[028] Leishmaniasis-causing parasites are located in lysosomal vacuoles of macrophages

6/25 reticuloendoteliais (células do SFM), fator que dificulta ο acesso dos ativos leishmanicidas.6/25 reticuloendothelial (SFM cells), a factor that hinders the access of leishmanicidal assets.

[029] Esse fato motivou a busca por nanocarreadores para a liberação do fármaco diretamente nos macrófagos, de modo a aumentar a sua biodisponibilidade. Além disso, o encapsulamento dos fármacos com ação leishmanicida é adequado para minimizar os seus efeitos adversos.[029] This fact motivated the search for nanocarriers for the release of the drug directly in the macrophages, in order to increase its bioavailability. In addition, the encapsulation of drugs with leishmanicidal action is adequate to minimize their adverse effects.

[030] Em vista do acima exposto, a presente invenção propõe um sistema nanoestruturado polimérico compreendendo um estabilizante, hidroximetilnitrofural como componente ativo e um polímero, para uso no preparo de medicamento para tratar leishmaniose.[030] In view of the above, the present invention proposes a polymeric nanostructured system comprising a stabilizer, hydroxymethylnitrofural as an active component and a polymer, for use in the preparation of medication to treat leishmaniasis.

[031] A atividade leishmanicida em formas amastigotas de L. amazonensis do sistema nanoestruturado polimérico desta invenção foi superior à atividade observada em nanopartículas isentas do fármaco (placebo - controle) e para o componente ativo livre, mostrando, dessa forma, uma potencial aplicação para liberação sítio-específica em macrófagos.[031] The leishmanicidal activity in amastigote forms of L. amazonensis of the polymeric nanostructured system of this invention was superior to the activity observed in drug-free nanoparticles (placebo - control) and for the free active component, thus showing a potential application for site-specific release in macrophages.

Estado da técnica;State of the art;

[032] Inúmeros documentos disponíveis no estado da técnica descrevem a nanoestruturação de fármacos amplamente conhecidos. No entanto, nenhum documento de anterioridade prevê a nanoestruturação do hidroximetilnitrofural utilizando o polímero n(butil)cianoacrilato, o qual resulta em uma propriedade inovadora e excepcional quando comparada ao mesmo composto em sua forma livre, além de mostrar proeminente atividade leishmanicida.[032] Numerous documents available in the state of the art describe the nanostructuring of widely known drugs. However, no previous document provides for the nanostructuring of hydroxymethylnitrofural using the n (butyl) cyanoacrylate polymer, which results in an innovative and exceptional property when compared to the same compound in its free form, in addition to showing prominent leishmanicidal activity.

[033] No documento americano US 20140079785, descrevese o preparo de nanopartículas lipídicas compostas de[033] The American document US 20140079785 describes the preparation of lipid nanoparticles composed of

7/25 matérias-primas e compostos bioativos muito utilizados pela indústria farmacêutica, tais como triglicerideos dos ácidos cáprico e caprilico, miristato de isopropila e palmitato de isopropila, visando à encapsulação de corticosteroides e derivados de vitamina D.7/25 raw materials and bioactive compounds widely used by the pharmaceutical industry, such as triglycerides of capric and caprylic acids, isopropyl myristate and isopropyl palmitate, aiming at the encapsulation of corticosteroids and vitamin D derivatives.

[034] No PI 0904083-8, acetato de dexametasona e sulfato de polimixina B, fármacos amplamente conhecidos, são nanoestruturados para aperfeiçoamento da atividade terapêutica.[034] In PI 0904083-8, dexamethasone acetate and polymyxin B sulfate, widely known drugs, are nanostructured to improve therapeutic activity.

[035] No artigo Leishmanicidas potenciais: estudo da síntese de fármacos dirigidos dendriméricos de primeira geração com hidroximetilnitrofural, dendrimeros dirigidos de manose e de inositol são obtidos, embora impuros e sem o agente bioativo incorporado.[035] In the article Potential leishmanicides: study of the synthesis of first generation dendrimeric drugs with hydroxymethylnitrofural, mannose and inositol directed dendrimers are obtained, although impure and without the incorporated bioactive agent.

[036] O sistema nanoestruturado polimérico da presente invenção apresenta mecanismos de ação diferentes, métodos de obtenção diferentes e materiais diferentes.[036] The polymeric nanostructured system of the present invention has different mechanisms of action, different methods of production and different materials.

[037] Nos Estudos de síntese de fármacos dirigidos formadores de micelas de hidroximetilnitrofural e helenalina potencialmente antichagásicos e leishmanicidas, descreve-se a síntese de pró-fármacos de micelas ligadas a um composto bioativo. Tanto os materiais quanto a técnica utilizada são completamente diferentes daqueles descritos na presente invenção.[037] In the synthesis studies of drugs directed to form hydroxymethylnitrofural and helenaline micelles potentially antichagásicos and leishmanicidas, the synthesis of prodrugs of micelles linked to a bioactive compound is described. Both the materials and the technique used are completely different from those described in the present invention.

[038] As nanopartículas de n(butilcianoacrilato) ora prospostas não são micelas: são estruturas reticulares contendo o composto bioativo distribuído na rede e estabilizados no meio aquoso por meio de tensoativos.[038] The nanoparticles of n (butylcyanoacrylate) now proposed are not micelles: they are reticular structures containing the bioactive compound distributed in the network and stabilized in the aqueous medium by means of surfactants.

[039] No estudo mostrado em Long-term stability of PBCA nanoparticle suspensions, faz-se referência à[039] In the study shown in Long-term stability of PBCA nanoparticle suspensions, reference is made to

8/25 estabilidade de nanoparticulas de PBCA. No documento PI 1002601-0 A2, descreve-se o produto e o processo de preparo e de nanocápsulas poliméricas contendo cloxacilina.8/25 stability of PBCA nanoparticles. In PI 1002601-0 A2, the product and the preparation process and polymeric nanocapsules containing cloxacillin are described.

[040] Tendo em vista as características inovadoras do sistema nanoparticulado polimérico ora proposto nesta invenção e as diferenças significativas em relação às técnicas apontadas no estado da técnica, a invenção aqui proposta apresenta substancial inovação.[040] In view of the innovative characteristics of the polymeric nanoparticulate system now proposed in this invention and the significant differences in relation to the techniques pointed out in the state of the art, the invention proposed here presents substantial innovation.

[041] A presente invenção propõe a nanoestruturação do hidroximetilnitrofural e a atividade leishmanicida observada no sistema nanoestruturado obtido não se deve apenas à soma das atividades do composto bioativo e da nanopartícula isolada: ela provém da interação desses componentes entre si com o sistema bioquímico célulaparasito.[041] The present invention proposes the nanostructuring of hydroxymethylnitrofural and the leishmanicidal activity observed in the nanostructured system obtained is not only due to the sum of the activities of the bioactive compound and the isolated nanoparticle: it comes from the interaction of these components with the cell-parasitic biochemical system.

Breve descrição da invenção:Brief description of the invention:

[042] A presente invenção faz referência a um sistema nanoestruturado polimérico, o qual compreende, como componente ativo, o hidroximetilnitrofural.[042] The present invention makes reference to a polymeric nanostructured system, which comprises, as an active component, hydroxymethylnitrofural.

[043] Ainda, a invenção provê o uso deste sistema no preparo de medicamento para tratar leishmaniose.[043] In addition, the invention provides the use of this system in the preparation of medication to treat leishmaniasis.

Breve descrição das figuras:Brief description of the figures:

[044] As Figuras IA e 1B representam, respectivamente, as formas promastigota e amastigota intracelular da Leishmania.[044] Figures IA and 1B represent, respectively, the promastigote and intracellular amastigote forms of Leishmania.

[045] A Figura 2 representa o tamanho médio do sistema nanoestruturado polimérico da invenção.[045] Figure 2 represents the average size of the polymeric nanostructured system of the invention.

[046] A Figura 3 representa o tamanho médio das nanoparticulas isentas de fármaco (placebo).[046] Figure 3 represents the average size of the drug-free nanoparticles (placebo).

[047] A Figura 4 representa a distribuição do potencial[047] Figure 4 represents the distribution of potential

9/25 zeta relativo ao sistema nanoestruturado polimérico da invenção.9/25 zeta concerning the polymeric nanostructured system of the invention.

[048] A Figura 5 representa a distribuição do potencial zeta relativo às nanoparticulas isentas de fármaco.[048] Figure 5 represents the distribution of zeta potential relative to drug-free nanoparticles.

[049] As Figuras 6A, 6B, 6C e 6D são micrografias de amostras do teste de atividade leishmanicida em macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis, em que A representa o controle (isento de composto ativo ou nanoparticulas) , B representa o hidroximetilnitrofural livre, C representa as nanoparticulas isentas de composto ativo (placebo) e D representa o sistema nanoestruturado polimérico da invenção, todos na concentração de 15 μΜ.[049] Figures 6A, 6B, 6C and 6D are micrographs of samples from the leishmanicidal activity test on macrophages infected by L. amazonensis amastigotes, where A represents the control (free of active compound or nanoparticles), B represents hydroxymethylnitrofural free, C represents nanoparticles free of active compound (placebo) and D represents the polymeric nanostructured system of the invention, all at the concentration of 15 μΜ.

Descrição detalhada da invenção:Detailed description of the invention:

[050] O sistema nanoestruturado polimérico da invenção compreende um estabilizante, um componente ativo e um polímero na proporção de 10:1:14.[050] The polymeric nanostructured system of the invention comprises a stabilizer, an active component and a polymer in the ratio of 10: 1: 14.

[051] Em uma modalidade preferida desta invenção, o estabilizante é o dextran, o qual consiste em compostos polissacarídeos com peso molecular igual ou maior que 1000 Dalton, contendo unidades repetidas de α-D-glucopiranosil.[051] In a preferred embodiment of this invention, the stabilizer is dextran, which consists of polysaccharide compounds with a molecular weight equal to or greater than 1000 Dalton, containing repeated units of α-D-glucopyranosyl.

[052] O componente ativo é selecionado dentre compostos nitroheterocíclicos. Mais especificamente, o componente ativo é o nitrofural, hidroximetilnitrofural, megazol, benzonidazol, nifurtimox, benznidazol, furazolidona, metronidazol, compostos nitroheterocíclicos isoxazólicos e 5-nitro-heterocíclicos derivados da nifuroxazida. Em uma modalidade preferida da invenção, o componente ativo é o hidroximetilnitrofural - NFOH.[052] The active component is selected from nitroheterocyclic compounds. More specifically, the active component is nitrofural, hydroxymethylnitrofural, megazol, benzonidazole, nifurtimox, benznidazole, furazolidone, metronidazole, isoxazolic nitroheterocyclic compounds and 5-nitroheterocyclic derivatives of nifuroxazide. In a preferred embodiment of the invention, the active component is hydroxymethylnitrofural - NFOH.

[053] O monômero é um derivado do cianoacrilato selecionado dentre n-butil cianoacrilato, metil-2[053] The monomer is a derivative of cyanoacrylate selected from n-butyl cyanoacrylate, methyl-2

10/25 cianoacrilato, etil cianoacrilato e propil cianoacrilato. Em uma modalidade preferida desta invenção, o monômero é o n-butil cianoacrilato.10/25 cyanoacrylate, ethyl cyanoacrylate and propyl cyanoacrylate. In a preferred embodiment of this invention, the monomer is n-butyl cyanoacrylate.

[054] O sistema nanoestruturado polimérico descrito é preparado de acordo com um método de polimerização em solução aquosa, conforme conhecimentos descritos no estado da técnica.[054] The polymeric nanostructured system described is prepared according to a polymerization method in aqueous solution, according to knowledge described in the prior art.

[055] Para tal, a uma solução de ácido clorídrico 0,1 N com pH igual a 2,5, adiciona-se o estabilizante dextran na razão de 10:1 do componente ativo.[055] For this, to a 0.1 N hydrochloric acid solution with a pH equal to 2.5, the dextran stabilizer is added in a 10: 1 ratio of the active component.

[056] Os compostos polissacarídeos do dextran podem ser divididos em três classes.[056] Dextran polysaccharide compounds can be divided into three classes.

[057] A primeira classe contém unidades repetidas de Dglucopiranosil com cadeias laterais de D-glucose, podendo estas ser substituídas por isomaltose e isomaltotriose.[057] The first class contains repeated units of Dglucopyrananosyl with side chains of D-glucose, which can be replaced by isomaltose and isomaltotriosis.

[058] A segunda classe refere-se a dextrans que contêm uma estrutura de espinha dorsal de α alternada (1 -» 3) e α (1 -► 6), ligada a unidades de D-glucopiranosil, com ramificação de α (1 -» 3) ligados.[058] The second class refers to dextrans that contain an alternating α (1 - »3) and α (1 -► 6) backbone structure, linked to D-glucopyranosyl units, with α (1 branching) - »3) connected.

[059] A terceira classe (dextrans mutans) têm uma estrutura de espinha dorsal de α consecutivo (1 -> 3) , ligada a unidades de D-glucopiranosil com ramificação de α (1 -► 6) ligados.[059] The third class (dextrans mutans) have a consecutive α backbone structure (1 -> 3), linked to linked D-glucopyranosyl units with α (1 -► 6) branches.

[060] Após a dispersão dos componentes, é adicionado o monômero em uma razão de 14:1 em relação ao componente ativo.[060] After dispersing the components, the monomer is added in a ratio of 14: 1 to the active component.

[061] O sistema formado (estabilizante, 0,1 HC1 pH 2,5, componente ativo e monômero) é mantido à agitação constante entre 200 a 1000 rpm, preferencialmente 800 rpm, em temperatura ambiente (em torno de 25°C).[061] The system formed (stabilizer, 0.1 HCl pH 2.5, active component and monomer) is kept under constant stirring between 200 to 1000 rpm, preferably 800 rpm, at room temperature (around 25 ° C).

11/25 [062] Após um intervalo que varia de 1 a 8 horas, preferencialmente 4 horas, de agitação, a reação de polimerização é interrompida pela adição de NaOH O,1N até que se obtenha pH entre 7,0 e 7,5.11/25 [062] After an interval ranging from 1 to 8 hours, preferably 4 hours, of agitation, the polymerization reaction is interrupted by the addition of NaOH O, 1N until a pH between 7.0 and 7.5 is obtained .

[063] A dispersão obtida, a qual compreende o sistema nanoestruturado polimérico da invenção, é filtrada em papel de filtro quantitativo.[063] The obtained dispersion, which comprises the polymeric nanostructured system of the invention, is filtered on quantitative filter paper.

Caracterização do sistema nanoestruturado polimérico obtido:Characterization of the polymeric nanostructured system obtained:

- Tamanho médio e índice de polidispersividade:- Average size and polydispersity index:

[064] 0 diâmetro do sistema nanoestruturado polimérico obtido e seu índice de polidispersividade em suspensão foram determinados por espalhamento de luz dinâmica.[064] The diameter of the polymeric nanostructured system obtained and its suspended polydispersity index were determined by dynamic light scattering.

[065] Para isto, as amostras foram diluídas e a luz espalhada em ângulo de 90° foi observada, empregando equipamentos apropriados para tal. As amostras foram medidas em suspensão, imediatamente após seu preparo.[065] For this, the samples were diluted and the light spread at an angle of 90 ° was observed, using appropriate equipment for this. The samples were measured in suspension, immediately after their preparation.

- Potencial zeta:- Zeta potential:

[066] Para avaliação do potencial zeta, as amostras foram diluídas em água destilada estéril e medidas em equipamento apropriado. A diluição antes da medição visa a otimização da intensidade do sinal.[066] To evaluate the zeta potential, the samples were diluted in sterile distilled water and measured in appropriate equipment. The dilution before measurement aims at optimizing the signal strength.

Avaliação da atividade leishmanicida do NFOH livre e do sistema nanoestruturado polimérico da invenção em promastigotas de L. amazonensis:Evaluation of the leishmanicidal activity of free NFOH and the polymeric nanostructured system of the invention in L. amazonensis promastigotes:

[067] A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT (brometo de 3-metíl-[4-5-dimetiltiazol-2-il] - 2,5 difeniltetrazólio), como descrito na literatura. Nesse método, o MTT é reduzido em células metabolicamente ativas por desidrogenases mitocondriais e, no interior das[067] Cell viability was determined by the MTT method (3-methyl- [4-5-dimethylthiazol-2-yl] - 2,5 diphenyltetrazolium bromide), as described in the literature. In this method, MTT is reduced in metabolically active cells by mitochondrial dehydrogenases and, within

12/25 células, formam-se cristais de formazan, facilmente visualizados em vista da sua coloração púrpura.12/25 cells, formazan crystals are formed, easily visualized in view of their purple color.

[068] Para realização do teste, as promastigotas de L. amazonensis são cultivadas empregando meio M199 contendo sais de Hanks, suplementado com urina humana, em estufa BOD a 26°C, até que estas atinjam o inicio da fase estacionária (aproximadamente 3 dias).[068] To perform the test, L. amazonensis promastigotes are grown using M199 medium containing Hanks salts, supplemented with human urine, in a BOD oven at 26 ° C, until they reach the beginning of the stationary phase (approximately 3 days) ).

[069] Os parasitos são, então, transferidos para placas de cultura contendo 96 poços (lxlO⁶ viáveis por poço). Para cada poço, são adicionadas concentrações crescentes de placebo, fármaco livre e do sistema nanoestruturado polimérico da invenção.[069] The parasites are then transferred to culture plates containing 96 wells (1 x ¹⁰ viable per well). For each well, increasing concentrations of placebo, free drug and the polymeric nanostructured system of the invention are added.

[070] Após 72 horas de incubação a 26°C, são adicionados 30 pL de MTT (5 mg/mL) em cada poço. A placa é novamente incubada em estufa 37°C por 4 horas e, após esse período, 50 pL de laurilsulfato de sódio a 20% (p/v) foram transferidos para os poços com a finalidade de interromper a reação.[070] After 72 hours of incubation at 26 ° C, 30 µl MTT (5 mg / ml) is added to each well. The plate is again incubated in a 37 ° C oven for 4 hours and, after that period, 50 pL of 20% (w / v) sodium lauryl sulfate was transferred to the wells in order to stop the reaction.

[071] A leitura é realizada imediatamente após esse procedimento, em comprimento de onda igual a 595 nm.[071] The reading is performed immediately after this procedure, at a wavelength equal to 595 nm.

[072] A porcentagem de sobrevivência foi calculada empregando a equação abaixo. Os resultados foram, ainda, analisados estatisticamente.[072] The percentage of survival was calculated using the equation below. The results were also analyzed statistically.

% sobrevivência = (Doam - Docn) x 100 (DOcp - Docn) [073] Em que:% survival = (Donate - Docn) x 100 (DOcp - Docn) [073] Where:

DOam = densidade óptica da amostraDOam = optical density of the sample

DOcp = densidade óptica do controle positivoDOcp = optical density of the positive control

DOcn = densidade óptica do controle negativoDOcn = optical density of the negative control

Avaliação da citotoxicidade do NFOH livre e do sistemaCytotoxicity assessment of free NFOH and system

13/25 nanoestruturado polimérico da invenção:13/25 polymeric nanostructured of the invention:

[074] Para a realização desse teste, foi utilizado um método descrito na literatura, utilizando macrófagos de peritônio de camundongo.[074] To perform this test, a method described in the literature was used, using mouse peritoneum macrophages.

[075] A contagem do número de células viáveis foi realizada empregando corante biológico adequado.[075] The counting of the number of viable cells was performed using an appropriate biological dye.

[076] Para isto, 4 x 10⁵ células são transferidas em cada um dos poços de uma placa contendo 96 poços. Em cada poço, adicionou-se 50 μ!> de concentrações crescentes de fármaco livre, placebo e do sistema nanoestruturado polimérico da invenção, dispersos em meio RPMI 1640.[076] For this, 4 x 10 ⁵ cells are transferred in each well of a plate containing 96 wells. In each well, 50 µl of increasing concentrations of free drug, placebo and the polymeric nanostructured system of the invention were added, dispersed in RPMI 1640 medium.

[077] Após 24 horas, são adicionados 20 pL de solução de MTT (5mg/mL) e a placa é incubada em estufa a 37°C por 4 horas. Após esse período, são adicionados 100 pL de laurilsulfato de sódio a 10% (p/v) , com a finalidade de interromper a reação da formação do cristal de formazan.[077] After 24 hours, 20 pL of MTT solution (5mg / mL) are added and the plate is incubated in an oven at 37 ° C for 4 hours. After this period, 100 pL of sodium lauryl sulfate 10% (w / v) are added, in order to interrupt the reaction of formazan crystal formation.

[078] A leitura é realizada em comprimento de onda igual a 595 nm, após período de 24 horas de adição do laurilsulfato de sódio.[078] The reading is performed at a wavelength equal to 595 nm, after a 24-hour period of addition of sodium lauryl sulfate.

[079] A porcentagem de sobrevivência foi calculada empregando a equação abaixo. Os resultados foram, ainda, analisados estatisticamente.[079] The survival percentage was calculated using the equation below. The results were also analyzed statistically.

% sobrevivência = (DOam - DOcn) x 100% survival = (DOam - DOcn) x 100

(DOcp - (DOcp - DOcn) DOcn) [080] Em que: [080] Where: DOam = DOam = densidade density óptica optics da gives amostra sample DOcp = DOcp = densidade density óptica optics do of controle control positivo positive DOcn = DOcn = densidade density óptica optics do of controle control negativo negative Avaliação da Evaluation of atividade activity leishmanicida do NFOH livre e do leishmanicide of free NFOH and

sistema nanoestruturado polimérico da invenção empolymeric nanostructured system of the invention in

14/25 macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis:14/25 macrophages infected by L. amazonensis amastigotes:

[081] Para avaliação da atividade leishmanicida em amastigotas, foram utilizados macrófagos de peritônio de camundongos infectados pelo parasito L. amazonensis.[081] To assess leishmanicidal activity in amastigotes, peritoneum macrophages from mice infected with the parasite L. amazonensis were used.

[082] Para a infecção, os macrófagos foram suspensos em meio de cultura de tecidos RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal inativado por calor, 100 UI/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina.[082] For infection, macrophages were suspended in RPMI 1640 tissue culture medium supplemented with 10% (v / v) heat-inactivated fetal bovine serum, 100 IU / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin.

[083] A quantidade de 1 mL da suspensão de macrófagos (lxlO⁶ células) foi transferida para placas (24 poços) contendo laminulas de 13 mm e incubadas a 37 °C por 24 horas.[083] The amount of 1 mL of the macrophage suspension (1x10 ⁶ cells) was transferred to plates (24 wells) containing 13 mm coverslips and incubated at 37 ° C for 24 hours.

[084] Após esse período, os macrófagos foram infectados com a forma promastigota de L. amazonensis na proporção de cinco parasitos por célula e incubados em estufa a 32°C e 5% CO₂ por 4 h.[084] After that period, the macrophages were infected with the promastigote form of L. amazonensis in the proportion of five parasites per cell and incubated in an oven at 32 ° C and 5% CO ₂ for 4 h.

[085] Imediatamente após esse período, os parasitos que não sofreram fagocitose foram removidos por meio de lavagens vigorosas. As células infectadas foram cultivadas por mais 24 horas com adição de placebo, composto ativo livre e o sistema nanoestruturado polimérico da invenção.[085] Immediately after this period, parasites that did not undergo phagocytosis were removed by vigorous washing. The infected cells were cultured for another 24 hours with the addition of placebo, free active compound and the polymeric nanostructured system of the invention.

[086] Após a incubação, as células foram lavadas com meio RPMI 1640, fixadas nas laminulas com metanol e coradas com Giemsa. A contagem do número de células infectadas e não infectadas, bem como a contagem do número de amastigotas por célula, foi efetuada visualmente por exame microscópico das preparações coradas.[086] After incubation, the cells were washed with RPMI 1640 medium, fixed to the slides with methanol and stained with Giemsa. Counting the number of infected and uninfected cells, as well as counting the number of amastigotes per cell, was performed visually by microscopic examination of the stained preparations.

[087] O índice de infecção (li) foi calculado empregando a equação abaixo.[087] The infection rate (li) was calculated using the equation below.

li = XAm x % Minfli = XAm x% Minf

15/25 [088] Em que:15/25 [088] Where:

X Am = média amastigotas por célula na amostra % Minf = porcentagem de macrófagos infectados na amostra.X Am = average amastigotes per cell in the sample% Minf = percentage of infected macrophages in the sample.

Resultados obtidos:Results obtained:

[089] O êxito do preparo do sistema nanoestruturado polimérico da invenção foi avaliado de acordo com suas características físico-químicas.[089] The success of preparing the polymeric nanostructured system of the invention was evaluated according to its physical-chemical characteristics.

[090] [090] As At mesmas same estão They are resumidamente apresentadas a briefly presented to seguir: follow: - Tamanho - Size médio e medium and índice index de in polidispersividade: polydispersity: [091] [091] As At Figuras Figures 2 e 2 and 3 3 apresentam os resultados present the results

relativos ao tamanho médio do sistema nanoestruturado polimérico da invenção e nanopartículas isentas do fármaco (placebo).relative to the average size of the polymeric nanostructured system of the invention and drug-free nanoparticles (placebo).

[092] Como é possível observar, o tamanho de partícula do sistema nanoestruturado polimérico da invenção variou entre 80 a 400 nm, preferencialmente 151,5 nm. Para as nanopartículas isentas do fármaco (placebo), o tamanho médio foi 143,8 nm.[092] As can be seen, the particle size of the polymeric nanostructured system of the invention varied between 80 to 400 nm, preferably 151.5 nm. For the drug-free nanoparticles (placebo), the average size was 143.8 nm.

[093] No que se refere ao índice de polidispersividade, o sistema nanoestruturado polimérico da invenção apresentou índices inferiores a 0,5, preferencialmente 0,104. Para as nanopartículas isentas do fármaco (placebo), foram obtidos valores em torno de 0,065 (ambos mostrados a seguir, na Tabela 1).[093] Regarding the polydispersity index, the polymeric nanostructured system of the invention showed indexes below 0.5, preferably 0.104. For the drug-free nanoparticles (placebo), values around 0.065 were obtained (both shown below, in Table 1).

[094] Além disso, foi observada uma distribuição unimodal do tamanho de partículas.[094] In addition, a unimodal particle size distribution was observed.

16/2516/25

- Potencial Zeta:- Zeta potential:

[095] As Figuras 4 e 5 apresentam os resultados relativos do potencial zeta do sistema nanoestruturado polimérico da invenção e das nanoparticulas isentas do fármaco (placebo).[095] Figures 4 and 5 show the relative results of the zeta potential of the polymeric nanostructured system of the invention and of the drug-free nanoparticles (placebo).

[096] Os valores de potencial zeta para o sistema nanoestruturado polimérico da invenção foram entre -5,0 e 50,0, preferencialmente -10,1 mV. As nanoparticulas isentas do fármaco (placebo) obtiveram potencial zeta de -11,6 mV (ambos os dados estão mostrados a seguir, na Tabela 1).[096] The zeta potential values for the polymeric nanostructured system of the invention were between -5.0 and 50.0, preferably -10.1 mV. The drug-free nanoparticles (placebo) obtained a zeta potential of -11.6 mV (both data are shown below, in Table 1).

[097] Quanto maior o valor absoluto do potencial zeta, maior é a carga de superfície, a qual produz elevada repulsão entre as partículas dispersas gerando, portanto, maior estabilidade e maior uniformidade das partículas na suspensão.[097] The greater the absolute value of the zeta potential, the greater the surface charge, which produces high repulsion between the dispersed particles, thus generating greater stability and greater uniformity of the particles in the suspension.

Tabela 1 - Tamanho médio, índice de polidispersividade e potencial zeta do sistema nanoestruturado polimérico da invenção e das nanoparticulas isentas do fármaco (placebo)Table 1 - Average size, polydispersity index and zeta potential of the polymeric nanostructured system of the invention and the drug-free nanoparticles (placebo)

Teste test Sistema nanoestruturado polimérico Polymeric nanostructured system Nanoparticulas isentas do fármaco Drug-free nanoparticles Tamanho médio Average size 151,5 nm 151.5 nm 143,8 nm 143.8 nm Polidispersividade Polydispersity 0,104 0.104 0,065 0.065 Potencial zeta Zeta potential - 10,1 mV - 10.1 mV - 11,6 mV - 11.6 mV Distribuição Distribution Unimodal Unimodal Unimodal Unimodal

Determinação da eficiência de encapsulação de NFOH:Determination of NFOH encapsulation efficiency:

[098] Os resultados obtidos para a eficiência de encapsulação do sistema nanoestruturado polimérico estão apresentados na Tabela 2.[098] The results obtained for the encapsulation efficiency of the polymeric nanostructured system are shown in Table 2.

Tabela 2 - Quantidade de componente ativo encapsulado eTable 2 - Quantity of encapsulated active component and

17/25 eficiência de encapsulação do sistema nanoestruturado polimérico da invenção17/25 encapsulation efficiency of the polymeric nanostructured system of the invention

Amostra Sample Total (mg) Total (mg) Sobrenadante (mg) Supernatant (mg) Eficiência de encapsulação (%) Encapsulation efficiency (%) 1 1 9, 95 9, 95 3, 58 3.58 64,02 64.02 2 2 10,00 10.00 3,55 3.55 64,50 64.50 3 3 9, 91 9, 91 3, 48 3.48 64,88 64.88

[099] A eficiência de encapsulação do componente ativo foi de 64,47 ± 0,43%, conforme apresentado na Tabela 2. Esse resultado revelou que aproximadamente 36% do fármaco permaneceu livre na suspensão obtida.[099] The encapsulation efficiency of the active component was 64.47 ± 0.43%, as shown in Table 2. This result revealed that approximately 36% of the drug remained free in the obtained suspension.

[100] Sendo assim, o método de polimerização em solução aquosa empregando PBCA se mostrou adequado para a obtenção de sistema nanoestruturado polimérico contendo NFOH.[100] Therefore, the polymerization method in aqueous solution using PBCA proved to be suitable for obtaining a polymeric nanostructured system containing NFOH.

[101] A eficiência de encapsulação foi determinada empregando método validado por CLAE.[101] The encapsulation efficiency was determined using a method validated by HPLC.

[102] Os resultados do teste de atividade leishmanicida de NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico da invenção e das nanoparticulas isentas do fármaco (placebo controle) em promastigotas de L. amazonensis estão apresentados na Tabela 3 a seguir.[102] The results of the free NFOH leishmanicidal activity test, the polymeric nanostructured system of the invention and the drug-free nanoparticles (control placebo) in L. amazonensis promastigotes are shown in Table 3 below.

Tabela 3 - Porcentagem de sobrevivência no teste da avaliação da atividade leishmanicida do NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico e das nanoparticulas isentas do fármaco (placebo) em promastigotas de L. amazonensisTable 3 - Percentage of survival in the test to evaluate the leishmanicidal activity of free NFOH, the polymeric nanostructured system and the drug-free nanoparticles (placebo) in L. amazonensis promastigotes

T T c ç Réplicas Replicas

18/2518/25

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 X ± DP X ± SD 88, 88, 86, 86, 89, 89, 87, 87, 90, 90, 88, 88, 89, 89, 89, 89, 90, 90, 89, 89, 89,2 89.2 PLA PLA 3 3 9 9 5 5 8 8 8 8 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 ±1,2 ± 1.2 Nano- Nano- 4 4 21, 21, 23, 23, 25, 25, 23, 23, 26, 26, 21, 21, 25, 25, 22, 22, 23, 23, 21, 21, 23, 6 23, 6 NFOH NFOH 1 1 2 2 3 3 8 8 9 9 0 0 9 9 7 7 8 8 8 8 ±2,0 ± 2.0 94, 94, 96, 96, 95, 95, 93, 93, 94, 94, 95, 95, 96, 96, 90, 90, 90, 90, 96, 96, 94,4 94.4 NFOH NFOH 0 0 6 6 7 7 0 0 9 9 5 5 7 7 4 4 8 8 7 7 ± 2,3 ± 2.3 80, 80, 78, 78, 80, 80, 80, 80, 79, 79, 77, 77, 78, 78, 80, 80, 79, 79, 79, 79, 79, 4 79, 4 PLA PLA 8 8 0 0 5 5 7 7 8 8 3 3 1 1 7 7 2 2 5 5 ±1,3 ± 1.3 Nano- Nano- 6 6 16, 16, 19, 19, 19, 19, 16, 16, 17, 17, 19, 19, 19, 19, 17, 17, 15, 15, 17, 17, 17, 6 17, 6 NFOH NFOH 6 6 2 2 0 0 2 2 5 5 3 3 1 1 1 1 1 1 2 2 ±1,5 ± 1.5 85, 85, 86, 86, 87, 87, 84, 84, 85, 85, 87, 87, 86, 86, 86, 86, 87, 87, 83, 83, 86, 1 86, 1 NFOH NFOH 3 3 1 1 3 3 4 4 8 8 5 5 1 1 8 8 9 9 5 5 ± 1,4 ± 1.4 70, 70, 71, 71, 68, 68, 68, 68, 69, 69, 70, 70, 70, 70, 71, 71, 70, 70, 68, 68, 70,0 70.0 PLA PLA 0 0 7 7 3 3 8 8 9 9 5 5 5 5 2 2 5 5 3 3 ±2,3 ± 2.3 Nano- Nano- 10, 10, 11, 11, 13, 13, 13, 13, 13, 13, 11, 11, 10, 10, 10, 10, 11, 11, 12, 12, 11, 9 11, 9 NFOH NFOH 3 3 6 6 3 3 2 2 3 3 9 9 4 4 7 7 2 2 7 7 ±1,2 ± 1.2 8 8 79, 8 79, 8 NFOH NFOH 79, 79, 80, 80, 80, 80, 78, 78, 80, 80, 81, 81, 80, 80, 80, 80, 77, 77, 79, 79, ±1,3 ± 1.3 2 2 1 1 8 8 3 3 2 2 7 7 2 2 8 8 5 5 2 2 62, 62, 61, 61, 62, 62, 62, 62, 62, 62, 61, 61, 62, 62, 63, 63, 63, 63, 62, 62, 62,6 62.6 PLA PLA 6 6 8 8 3 3 7 7 6 6 4 4 5 5 6 6 6 6 7 7 ±2,3 ± 2.3 Nano- Nano- 10 10 1, 9 1, 9 5, 7 5, 7 4,5 4.5 3, 7 3, 7 2,4 2.4 4,9 4.9 2, 9 2, 9 2,2 2.2 3, 1 3, 1 2,7 2.7 3, 4 3, 4 NFOH NFOH ±1,3 ± 1.3 73, 73, 74, 74, 73, 73, 72, 72, 74, 74, 75, 75, 74, 74, 72, 72, 74, 74, 71, 71, 73, 6 73, 6 NFOH NFOH 1 1 4 4 1 1 9 9 9 9 6 6 2 2 2 2 0 0 4 4 ± 1,3 ± 1.3 53, 53, 53, 53, 57, 57, 55, 55, 50, 50, 54, 54, 53, 53, 58, 58, 53, 53, 54, 54, 54,4 54.4 PLA PLA 12 12 6 6 1 1 5 5 0 0 5 5 0 0 2 2 0 0 9 9 6 6 ±2,3 ± 2.3 Nano- Nano- 0,1 0.1 3, 3 3, 3 0, 0 0, 0 0,0 0.0 0, 1 0, 1 0, 5 0, 5 0, 6 0, 6 1,5 1.5 0, 5 0, 5 0,1 0.1 0,7 0.7

19/2519/25

NFOH NFOH ±1,0 ± 1.0 NFOH NFOH 71, 71, 68, 68, 68, 68, 69, 69, 68, 68, 71, 71, 69, 69, 67, 67, 66, 66, 68, 68, 68,9 68.9 2 2 8 8 3 3 2 2 0 0 4 4 1 1 9 9 3 3 5 5 ±1,5 ± 1.5

[103] Em que T corresponde aos tratamentos, C corresponde à concentração em μΜ, DP corresponde ao desvio padrão, PLA corresponde às nanoparticulas isentas de fármaco, Nano-NFOH corresponde ao sistema nanoestruturado polimérico da invenção e NFOH corresponde ao hidroximetilnitrofural livre.[103] Where T corresponds to treatments, C corresponds to the concentration in μΜ, DP corresponds to standard deviation, PLA corresponds to drug-free nanoparticles, Nano-NFOH corresponds to the polymeric nanostructured system of the invention and NFOH corresponds to free hydroxymethylnitrofural.

[104] Os resultados obtidos para o valor médio de porcentagem de sobrevivência das promastigotas (L. amazonensis) para o sistema nanoestruturado polimérico da invenção foi significativamente menor, quando comparado aos valores observados para o placebo e para o NFOH livre, em todas as concentrações utilizadas, conforme observado na Tabela 6.[104] The results obtained for the average percentage of survival of promastigotes (L. amazonensis) for the polymeric nanostructured system of the invention was significantly lower when compared to the values observed for placebo and free NFOH, in all concentrations used, as seen in Table 6.

[105] Essa redução foi 77,7 vezes maior na concentração de 12 μΜ para o sistema nanoestruturado polimérico da invenção, quando comparada às nanoparticulas isentas de fármaco em relação ao composto ativo livre, a redução foi de 98 vezes.[105] This reduction was 77.7 times greater in the 12 μΜ concentration for the polymeric nanostructured system of the invention, when compared to drug-free nanoparticles in relation to the free active compound, the reduction was 98 times.

[106] A análise estatística dos resultados obtidos no ensaio para avaliação da atividade leishmanicida revelou os tratamentos apresentam atividades distintas.[106] Statistical analysis of the results obtained in the trial to assess leishmanicidal activity revealed that the treatments present different activities.

[107] Sendo assim, a atividade leishmanicida do sistema nanoestruturado polimérico da invenção foi significativamente superior à atividade do hidroximetilnitrofural livre e do nanoparticulas isentas do composto (placebo - controle), em todas as concentrações testadas.[107] Thus, the leishmanicidal activity of the polymeric nanostructured system of the invention was significantly superior to the activity of free hydroxymethylnitrofural and nanoparticles free from the compound (placebo - control), in all tested concentrations.

20/2520/25

Avaliação da citotoxicidade do NFOH livre e do sistema nanoestruturado polimérico da invenção:Cytotoxicity assessment of free NFOH and the polymeric nanostructured system of the invention:

[108] Os resultados do teste de citotoxicidade do NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico da invenção e das nanopartículas isentas do composto ativo (placebo controle) em promastigotas de L. amazonensis estão apresentados na Tabela 4.[108] The results of the cytotoxicity test of free NFOH, the polymeric nanostructured system of the invention and nanoparticles free from the active compound (control placebo) in L. amazonensis promastigotes are shown in Table 4.

Tabela 4 - Porcentagem de sobrevivência no teste da avaliação da citotoxidade do NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico e das nanopartículas isentas do composto ativo (placebo) .Table 4 - Percentage of survival in the test for assessing the cytotoxicity of free NFOH, the polymeric nanostructured system and nanoparticles free from the active compound (placebo).

T T c ç Réplicas Replicas 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 X ±DP X ± SD Placebo Placebo 5 5 97,8 97.8 104,7 104.7 110, 8 110, 8 90,4 90.4 109, 8 109, 8 102,7±8,4 102.7 ± 8.4 Nano-NFOH Nano-NFOH 106, 7 106.7 102,2 102.2 110, 8 110, 8 104,9 104.9 100, 4 100, 4 105,0±3,9 105.0 ± 3.9 NFOH NFOH 106, 7 106.7 102,7 102.7 103, 5 103.5 110, 4 110, 4 93,5 93.5 103,3±6,1 103.3 ± 6.1 Placebo Placebo 10 10 102,2 102.2 95, 7 95, 7 104,1 104.1 95, 9 95, 9 93,3 93.3 98,2±4,7 98.2 ± 4.7 Nano-NFOH Nano-NFOH 106, 3 106, 3 109, 0 109, 0 104,1 104.1 93, 3 93.3 113, 1 113, 1 105,1±7,1 105.1 ± 7.1 NFOH NFOH 93, 3 93.3 110,2 110.2 92, 9 92, 9 111,4 111.4 108,2 108.2 103,2±9,0 103.2 ± 9.0 Placebo Placebo 15 15 99,8 99.8 95,3 95.3 100, 0 100, 0 88,0 88.0 101, 0 101, 0 96,8±5,6 96.8 ± 5.6 Nano-NFOH Nano-NFOH 15 15 104,3 104.3 101,2 101.2 88,0 88.0 106, 9 106, 9 107,8 107.8 101,6±7,9 101.6 ± 7.9 NFOH NFOH 106, 9 106, 9 95, 3 95, 3 109,4 109.4 92,0 92.0 109, 4 109, 4 102,6±8,1 102.6 ± 8.1 Placebo Placebo 20 20 91,0 91.0 95, 9 95, 9 100,0 100.0 102,0 102.0 93, 3 93.3 96,4±4,7 96.4 ± 4.7 Nano-NFOH Nano-NFOH 98,2 98.2 93, 5 93.5 106, 1 106, 1 95,7 95.7 102,0 102.0 99,1±5,1 99.1 ± 5.1 NFOH NFOH 99,8 99.8 91,8 91.8 99, 8 99, 8 108,2 108.2 87, 1 87, 1 97,3±8,3 97.3 ± 8.3 Placebo Placebo 25 25 93,3 93.3 97,8 97.8 87,8 87.8 96, 9 96, 9 98,0 98.0 94,7±4,6 94.7 ± 4.6 Nano-NFOH Nano-NFOH 92, 9 92, 9 98,0 98.0 86,5 86.5 102,4 102.4 86, 1 86, 1 93,2±7,6 93.2 ± 7.6 NFOH NFOH 107, 6 107.6 93,3 93.3 100, 4 100, 4 87, 6 87.6 96, 3 96, 3 97,0±7,8 97.0 ± 7.8

[109] Em que T corresponde aos tratamentos, C corresponde à concentração em μΜ, DP corresponde ao desvio[109] Where T corresponds to treatments, C corresponds to the concentration in μΜ, DP corresponds to the deviation

21/25 padrão, PLA corresponde às nanoparticulas isentas de NFOH, Nano-NFOH corresponde ao sistema nanoestruturado polimérico da invenção e NFOH corresponde ao hidroximetilnitrofural livre.21/25 standard, PLA corresponds to NFOH-free nanoparticles, Nano-NFOH corresponds to the polymeric nanostructured system of the invention and NFOH corresponds to free hydroxymethylnitrofural.

[110] Os valores médios de porcentagem de sobrevivência, apresentados na Tabela 4, indicaram que esses valores são similares para todos os tratamentos e concentrações. Na faixa testada, os valores de sobrevivência médios foram de 100,7 ±3,2; 100,8±4,9 e 97,8± 3,0% para o NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico e das nanoparticulas isentas do NFOH (placebo), respectivamente.[110] The average values of percentage of survival, shown in Table 4, indicated that these values are similar for all treatments and concentrations. In the tested range, the average survival values were 100.7 ± 3.2; 100.8 ± 4.9 and 97.8 ± 3.0% for free NFOH, the polymeric nanostructured system and NFOH-free nanoparticles (placebo), respectively.

[111] Esses valores são considerados satisfatórios, pois indicaram que a atividade leishmanicida de NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico e das nanoparticulas isentas do NFOH (placebo) em amastigotas de L. amazonensis é referente a sua ação nos parasitos intracelulares e não pela destruição dos macrófagos.[111] These values are considered satisfactory, as they indicated that the leishmanicidal activity of free NFOH, the polymeric nanostructured system and NFOH-free nanoparticles (placebo) in L. amazonensis amastigotes is related to their action on intracellular parasites and not by destruction macrophages.

[112] A análise estatística dos resultados obtidos para a avaliação da citotoxicidade de NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico e das nanoparticulas isentas de NFOH (placebo) revelou que os tratamentos não apresentaram diferenças significativas de citotoxicidade.[112] Statistical analysis of the results obtained for the evaluation of the cytotoxicity of free NFOH, the polymeric nanostructured system and NFOH-free nanoparticles (placebo) revealed that the treatments did not show significant differences in cytotoxicity.

Avaliação da atividade leishmanicida do NFOH livre e do sistema nanoestruturado polimérico da invenção em macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis:Evaluation of the leishmanicidal activity of free NFOH and the polymeric nanostructured system of the invention in macrophages infected by L. amazonensis amastigotes:

[113] Os resultados do teste de atividade leishmanicida do NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico da invenção e das nanoparticulas isentas de NFOH (placebo controle) em promastigotas de L. amazonensis estão[113] The results of the free NFOH leishmanicidal activity test, the polymeric nanostructured system of the invention and the NFOH-free nanoparticles (control placebo) in L. amazonensis promastigotes are

22/25 apresentados na Tabela 5.22/25 shown in Table 5.

Tabela 5- índice de infecção da avaliação de atividade leishmanicida do NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico e das nanoparticulas isentas de NFOH (placebo).Table 5- infection index of the evaluation of leishmanicidal activity of free NFOH, of the polymeric nanostructured system and of NFOH-free nanoparticles (placebo).

T T C Ç Réplicas Replicas 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 X±DP X ± SD Contro Contro 156, 156, 161 161 151, 151, 156 156 159 159 150, 150, 159 159 153, 153, 158 158 153 153 155, 8 155.8 le le 0 0 , 0 , 0 5 5 , 5 , 5 , 5 , 5 0 0 ,0 , 0 0 0 , o , O , 5 , 5 ±2,4 ± 2.4 127, 127, 122 122 133, 133, 133 133 134 134 130, 130, 134 134 136, 136, 130 130 132 132 131,4 131.4 PLA PLA 5 5 , o , O 5 5 , o , O ,5 , 5 5 5 , 5 , 5 5 5 , o , O , 5 , 5 ±4,2 ± 4.2 Nano- Nano- 9 9 25, 5 25, 5 20, 20, 24,5 24.5 22, 22, 18, 18, 18, 5 18, 5 26, 26, 14,0 14.0 21, 21, 14, 14, 20, 5 20, 5 NFOH NFOH 0 0 5 5 5 5 0 0 0 0 5 5 ±4,2 ± 4.2 153, 153, 154 154 150, 150, 144 144 151 151 140, 140, 154 154 156, 156, 145 145 148 148 150, 6 150, 6 NFOH NFOH 0 0 , o , O 6 6 , 5 , 5 , 5 , 5 0 0 , o , O 5 5 , 0 , 0 , 5 , 5 ±5, 9 ± 5, 9 104, 104, 106 106 106, 106, 104 104 111 111 107, 107, 108 108 113, 113, 107 107 109 109 107,8 107.8 PLA PLA 5 5 ,0 , 0 5 5 ,0 , 0 , 5 , 5 5 5 , 5 , 5 0 0 , 5 , 5 ,5 , 5 ±2, 9 ± 2, 9 Nano- Nano- 12 12 13, 0 13, 0 12, 12, 12,0 12.0 8,0 8.0 8,0 8.0 9, 0 9, 0 7,0 7.0 8,5 8.5 10, 10, 9, 5 9, 5 9, ±2, 9, ± 2, NFOH NFOH 5 5 0 0 1 1 139, 139, 135 135 132, 132, 139 139 139 139 132, 132, 133 133 129, 129, 126 126 136 136 134,3 134.3 NFOH NFOH 5 5 , o , O 5 5 ,0 , 0 , 0 , 0 0 0 , 5 , 5 0 0 , 5 , 5 , 5 , 5 ±4,4 ± 4.4 114, 114, 114 114 114, 114, 116 116 122 122 118, 118, 123 123 112, 112, 120 120 121 121 117,7 117.7 PLA PLA 0 0 , 5 , 5 5 5 , o , O ,5 , 5 0 0 , 5 , 5 5 5 , o , O , o , O ±3, 9 ± 3, 9 Nano- Nano- 15 15 5,5 5.5 3, 0 3.0 5,0 5.0 5, 5 5, 5 6,0 6.0 0, 5 0, 5 4,5 4.5 3, 5 3, 5 2,0 2.0 0,0 0.0 3, 6 3, 6 NFOH NFOH ±2, 1 ± 2, 1 121, 121, 126 126 120, 120, 120 120 123 123 125, 125, 124 124 128, 128, 125 125 125 125 123, 9 123, 9 NFOH NFOH 0 0 ,5 , 5 0 0 , 5 , 5 ,0 , 0 0 0 ,5 , 5 0 0 ,0 , 0 , 5 , 5 ±2,7 ± 2.7

[114] Em que T corresponde aos tratamentos, C corresponde à concentração em μΜ, DP corresponde ao desvio padrão, PLA corresponde às nanoparticulas isentas de NFOH,[114] Where T corresponds to treatments, C corresponds to μΜ concentration, DP corresponds to standard deviation, PLA corresponds to NFOH-free nanoparticles,

23/2523/25

Nano-NFOH corresponde ao sistema nanoestruturado polimérico da invenção e NFOH corresponde ao hidroximetilnitrofural livre.Nano-NFOH corresponds to the polymeric nanostructured system of the invention and NFOH corresponds to free hydroxymethylnitrofural.

[115] Os índices de infecção de macrófagos por amastigotas (L. amazonensis) para o sistema nanoestruturado polimérico da invenção foram menores quando comparado aos observados para nanoparticulas isentas de NFOH (placebo controle) e para o NFOH livre, em todas as concentrações utilizadas, conforme observado na Tabela 5.[115] The rates of macrophage infection by amastigotes (L. amazonensis) for the polymeric nanostructured system of the invention were lower when compared to those observed for NFOH-free nanoparticles (control placebo) and for free NFOH, in all concentrations used, as seen in Table 5.

[116] Quando comparado ao controle, observou-se a redução de 43 vezes do índice de infecção de macrófago por amastigota, na concentração de 15 μΜ para o sistema nanoestruturado polimérico da invenção.[116] When compared to the control, there was a 43-fold reduction in the rate of macrophage infection by amastigote, in the concentration of 15 μΜ for the polymeric nanostructured system of the invention.

[117] Quando comparado ao placebo e ao NFOH livre, observou-se uma redução de 33 e 34 vezes, respectivamente.[117] When compared to placebo and free NFOH, a reduction of 33 and 34 times was observed, respectively.

[118] A análise estatística dos resultados obtidos para o índice de infecção de macrófagos infectados por amastigotas (L. amazonensis) revelou que os tratamentos apresentam atividades leishmanicida distintas.[118] The statistical analysis of the results obtained for the infection rate of macrophages infected by amastigotes (L. amazonensis) revealed that the treatments have distinct leishmanicidal activities.

[119] Tendo em vista o objetivo do teste, a atividade leishmanicida do sistema nanoestruturado polimérico da invenção foi significativamente superior à atividade do NFOH livre e do placebo, em todas as concentrações.[119] In view of the purpose of the test, the leishmanicidal activity of the polymeric nanostructured system of the invention was significantly superior to the activity of free NFOH and placebo, at all concentrations.

[120] A atividade leishmanicida em formas amastigotas de L. amazonensis do NFOH livre, do sistema nanoestruturado polimérico da invenção e das nanoparticulas isentas de NFOH (placebo - controle), apresentados na Tabela 5, pode ser visualmente comprovada pela Figura 5.[120] The leishmanicidal activity in amastigote forms of L. amazonensis from free NFOH, from the polymeric nanostructured system of the invention and from NFOH-free nanoparticles (placebo - control), shown in Table 5, can be visually proved by Figure 5.

[121] Nessa microscopia observou-se claramente que na concentração de 15 μΜ, o sistema nanoestruturado contendo[121] In this microscopy it was clearly observed that at a concentration of 15 μΜ, the nanostructured system containing

24/2524/25

NFOH possui atividade leishmanicida superior ao composto ativo livre e ao placebo. Tal fato deve-se à ausência de parasitos intracelulares (Figura 6D) . 0 aspecto do citoplasma dos macrófagos indicou que existem diversos vacúolos, os quais foram gerados pela internalização das nanoparticulas. 0 mesmo aspecto pode ser observado naNFOH has leishmanicidal activity superior to the free active compound and the placebo. This is due to the absence of intracellular parasites (Figure 6D). The aspect of the macrophage cytoplasm indicated that there are several vacuoles, which were generated by the internalization of the nanoparticles. The same aspect can be observed in the

Figura 6C na qual o tratamento são nanoparticulas isentas de NFOH (placebo), porém sem eliminação de todos os parasitos. Em contraste, nas Figuras 6A (controle) e 6B (NFOH 15 μΜ) , o citoplasma apresenta somente os vacúolos referentes à infecção por L. amazonensis.Figure 6C in which the treatment is nanoparticles free of NFOH (placebo), but without eliminating all parasites. In contrast, in Figures 6A (control) and 6B (NFOH 15 μΜ), the cytoplasm presents only the vacuoles related to infection by L. amazonensis.

[122] Em vista dos resultados obtidos, a atividade leishmanicida em promastigotas de L. amazonensis revelou que o sistema nanoestruturado polimérico desta invenção apresentou atividade 78 vezes superior ao placebo e 98 vezes superior ao NFOH livre.[122] In view of the results obtained, the leishmanicidal activity in L. amazonensis promastigotes revealed that the polymeric nanostructured system of this invention showed an activity 78 times higher than placebo and 98 times higher than free NFOH.

[123] A citotoxicidade revelou que não houve diferença significativa entre os tratamentos, o que comprova que a atividade leishmanicida não tem origem na destruição dos macrófagos contendo os parasitos e sim na interação dos tratamentos com os processos bioquímicos celulares.[123] Cytotoxicity revealed that there was no significant difference between treatments, which proves that leishmanicidal activity does not originate from the destruction of macrophages containing the parasites, but from the interaction of treatments with cellular biochemical processes.

[124] Por fim, a atividade leishmanicida em formas amastigotas de L. amazonensis do sistema nanoestruturado contendo hidroximetilnitrofural apresenta potencial aplicação para liberação sítio-específica em macrófagos.[124] Finally, leishmanicidal activity in amastigote forms of L. amazonensis of the nanostructured system containing hydroxymethylnitrofural presents potential application for site-specific release in macrophages.

[125] Ainda, ressalta-se que o sistema nanoestruturado polimérico descrito na presente invenção não se limita às aplicações aqui mencionadas.[125] Still, it is emphasized that the polymeric nanostructured system described in the present invention is not limited to the applications mentioned here.

[126] Assim, é óbvio para aqueles versados na técnica que alterações e modificações podem ser implementadas[126] Thus, it is obvious to those skilled in the art that changes and modifications can be implemented

25/25 visando o aprimoramento do projeto, sem que tais alterações não estejam cobertas pelo escopo da presente invenção.25/25 with a view to improving the project, without these changes not being covered by the scope of the present invention.

Claims

1. Polymeric nanostructured system characterized by the fact that it comprises a stabilizer, an active component and a polymer in the proportion of 10: 1: 14, in which the stabilizer is dextran, the active component is a nitroheterocyclic compound and the monomer is a derivative of cyanoacrylate.

2. Polymeric nanostructured system, according to claim 1, characterized by the fact that the nitroheterocyclic compound is selected from nitrofural, hydroxymethylnitrofural, megazol, benzonidazole, nifurtimox, benznidazole, furazolidone, metronidazole, heterocyclic heterocyclic compounds isoxazolic and 5-nit-heterocyclic derivatives of nifuroxazide, preferably hydroxymethylnitrofural.

3. Polymeric nanostructured system, according to claim 1, characterized by the fact that the monomer is selected from n-butyl cyanoacrylate, methyl-2 cyanoacrylate, ethyl cyanoacrylate and propyl cyanoacrylate, preferably n-butyl cyanoacrylate.

4. Polymeric nanostructured system, according to claims 1, 2 or 3, characterized by the fact that it has a particle size between 80 to 400 nm, preferably 151.5 nm.

5. Polymeric nanostructured system, according to claims 1, 2 or 3, characterized by the fact that it presents polydispersity below 0.5, preferably 0.104.

6. Polymeric nanostructured system, according to claims 1, 2 or 3, characterized by the fact that

2/2 present zeta potential between -5.0 and -50.0, preferably -10.1 mV.

7. Use of the polymeric nanostructured system as defined in any one of claims 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, characterized by the fact that it is in the preparation of a medication to treat leishmaniasis.