BR102014003033B1

BR102014003033B1 - processo, aparato ou sistema e kit de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta e uso dos genes do grupo de biomarcadores

Info

Publication number: BR102014003033B1
Application number: BR102014003033-6A
Authority: BR
Inventors: Marcos Tadeu Dos Santos; Bruno Feres De Souza; Flavio Mavignier Carcano; Ramon De Oliveira Vidal; Cristovam Scapulatempo Neto; Cristiano Ribeiro Viana; Andre Lopes Carvalho
Original assignee: Fleury S/A; Hospital Do Câncer De Barretos - Fundação Pio Xii; Marcos Tadeu Dos Santos; Ramon De Oliveira Vidal; Universidade Federal Do Maranhão
Priority date: 2014-02-07
Filing date: 2014-02-07
Publication date: 2020-12-08
Also published as: CA2975917A1; BR102014003033B8; BR102014003033A2; WO2015117210A1; EP3102695A1; US20170183738A1; EP3102695A4

Abstract

PROCESSO, APARATO OU SISTEMA E KIT DE CLASSIFICAÇÃO DE AMOSTRAS TUMORAIS DE ORIGEM DESCONHECIDA E/OU INCERTA E USO DOS GENES DO GRUPO DE BIOMARCADORES. A presente invenção refere-se a um processo de classificação de amostras tumorais de origem primária desconhecida e/ou incerta compreendendo especialmente a etapa de obter padrões de modulação da atividade biológica de tumores de origem primária desconhecida e/ou incerta e confrontar com um conjunto específico e único de biomarcadores que determinam os perfis de modulação da atividade biológica de tumores de origem conhecida. A presente invenção se situa no campo da biologia molecular e da genética.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, compreendendo especialmente a etapa de obtenção de perfis de modulação da atividade biológica de tumores de origem desconhecida e/ou incerta e o confrontamento destes, através de um conjunto específico e único de biomarcadores que determinam tais perfis moleculares, com tumores de origem conhecida. A presente invenção se situa no campo da biologia molecular e da genética.

Fundamentos da Invenção

[002] De acordo com o Instituto Nacional do Câncer Americano, do National Institute of Health (NIH), o câncer é um termo usado para “doenças nas quais há uma divisão descontrolada de células anormais, as quais tem habilidade para invadir outros tipos de tecido”. Outros termos como tumores malignos e neoplasias também são utilizados. Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO) através da Agência Internacional para a Pesquisa do Câncer (IARC), estima-se para 2014 cerca de 14 milhões de novos casos de câncer, tendo sido esta doença a causa de 8.2 milhões de mortes no mundo, em 2012. Trata-se de um problema de saúde pública cuja previsão para 2030 é de 27 milhões de novos casos, ainda segundo o IARC. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) prevê quase 580 mil novos casos de câncer para o ano de 2014 e uma taxa de crescimento de novos casos em 20% a cada ano.

[003] A classificação de um câncer é feita de acordo com o órgão onde ele se desenvolveu. O câncer de pulmão, por exemplo, é uma classificação que designa o órgão pulmão como a origem primária do câncer de um paciente, também chamado de sítio primário. Cerca de 30% de todos os tumores têm a capacidade de se alastrar, a partir de sua origem primária, para outras partes do organismo, causando o que chamamos de metástase ou câncer secundário. A classificação de um tumor metastático, a exemplo do primário, também é feita de acordo com o órgão onde ele se originou, isto é, sua origem primária. Por exemplo, um tumor metastático encontrado no fígado, mas que se desprendeu do intestino, é classificado como câncer colorretal e não como câncer hepático, uma vez que o órgão de origem deste tumor metastático foi o intestino.

[004] Não raramente, o tumor primário não pode ser encontrado, sendo possível encontrar apenas tumor metastático. Desta forma, a classificação de tumores metastáticos de acordo com sua origem primária é condição vital ao paciente oncológico, uma vez que o tratamento oncológico ideal é dependente desta origem primária. Cada tipo de câncer (ou seja, cada origem primária) possui um arsenal terapêutico próprio, portanto, definir a origem primária de um câncer é crucial para que o oncologista possa fazer a definição do tratamento.

[005] Existem uma série de motivos que impossibilitam a identificação e/ou a classificação da origem primária de um tumor, como por exemplo: i) o câncer secundário se alastrou rapidamente enquanto o câncer primário ainda é muito pequeno para ser detectado; ii) o câncer primário foi inibido pelo sistema imune, enquanto o câncer secundário ainda continua a crescer; iii) o câncer secundário possui elevado grau de indiferenciação celular e não exibe arquitetura tecidual típica.

[006] Atualmente a classificação de origem primária de tumores metastáticos se faz principalmente através de exames de imunohistopatologia. O médico patologista analisa uma amostra da biópsia do tumor, faz uso de alguns marcadores (anticorpos), pode recorrer a ferramentas de colorações típicas e então o classifica. Ferramentas de imagem também têm sido grandes aliados na classificação tumoral, como exames de mamografia, ultrassonografia, ressonância magnética, raios-x e mais recentemente, PET-CT.

[007] Tais técnicas são capazes de classificar 95% de todos os casos de câncer. O grande viés desta forma de classificação é o caráter subjetivo e dependente da experiência de cada patologista/radiologista. A literatura discute taxas de até 50% de não-concordância na classificação tumoral entre 2 ou mais médicos que analisam a mesma amostra/paciente. Portanto, em 5% de todos os casos de câncer, não é possível a determinação de sua origem primária. Algo por volta de 700.000 pessoas no mundo por ano. Para estes casos, o “tipo” de câncer atribuído a estes pacientes é o Tumor de Origem Primária Desconhecida e/ou Incerta (dentro da Classificação Internacional de Doenças (CID10) códigos de C76 a C80).

[008] A indefinição da origem primária do tumor tem como consequência um mau prognóstico para o paciente, com taxa de sobrevida média entre 6 a 9 meses apenas, uma vez que não há definições de tratamento para a maioria dos pacientes nessa situação. Os Tumores de Origem Primária Desconhecida e/ou Incerta são o 8° tipo de câncer mais frequente e o 4° mais letal. No momento, as abordagens relacionadas a este tipo tumoral estão voltadas principalmente para o entendimento da biologia que direciona a metástase.

[009] Muitos marcadores imunohistoquímicos tem sido sugeridos para predizer a origem de tumores. Conforme recentemente sugerido por alguns artigos científicos a respeito do tema, o painel de marcadores pode incluir citoqueratinas (CK-7; CK-20), TTF-1; marcadores de ovário/mama, HEPAR-1, de células renais, fosfatase alcanina placentária/OCT-4, WT- 1/PAX-8, sinatopsina e cromogranina. Marcadores imunohistoquímicos geralmente predizem acuradamente a origem primária em 35-40% de cânceres metastáticos precoces. Atualmente, a maioria dos casos são diagnosticados a partir de amostras de FFPE (amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina), derivadas de procedimentos de biópsia.

[010] No âmbito patentário, alguns documentos discorrem sobre a classificação de tumores, inclusive aqueles de origem desconhecida e/ou incerta.

[011] O documento US 7,622,260 descreve o uso de microarranjos como um método para análise de amostras de células metastáticas. Ele também descreve que deve-se medir biomarcadores associados com pelo menos dois tipos de carcinomas, descrevendo grupos específicos de marcadores que devem ser usados para classificar determinados tipos de tumores. De forma semelhante, o documento WO 2002/103320 descreve métodos de diagnóstico em câncer usando uma série de marcadores genéticos, onde o nível de expressão desses biomarcadores está relacionado com dados de pacientes com câncer. O documento US 2011/0230357 descreve um método para determinar a origem primária de tumores desconhecidos compreendendo a etapa de comparar o perfil de expressão de uma amostra com um parâmetro de classificação, sendo o parâmetro de classificação tecido- específico através de um conjunto de biomarcadores próprio. O documento WO 2013/002750 descreve um método de classificação de tumores de origem desconhecida. Nesse pedido, descreve-se etapas de produção e amplificação de moléculas de cDNA específicas com mais que 50 transcritos com a finalidade de comparar os níveis de amplificação com os níveis de expressão de genes em tumores. O documento descreve uma sequência de 87 sequências de mRNA correspondentes a genes relacionados a tumores.

[012] Dessa forma, podemos notar que existem documentos que discorrem sobre métodos de classificação de tumores. Entretanto, pode-se notar que uma das principais diferenças entre eles é o conjunto/subconjunto de biomarcadores que cada documento apresenta, uma vez que a escolha de determinados conjuntos/subconjuntos de biomarcadores será fundamental para determinar as diferentes sensibilidades na identificação e classificação de tumores. Sendo assim, a presente invenção difere de todos os documentos apontados por descrever um processo de classificação de tumores de origem desconhecida e/ou incerta por compreender um conjunto de 95 biomarcadores que difere dos conjuntos de biomarcadores apontados nos referidos pedidos do estado da arte. O processo de classificação de tumores da presente invenção compreende um conjunto novo e inventivo de biomarcadores, que devem ser vistos conjuntamente, e cuja combinação de genes permite termos um processo de classificação mais eficiente e apurado em relação ao estado da técnica. Deste modo, na opinião dos presentes inventores, o fato de também apresentar um conjunto novo de biomarcadores traz não somente novidade, como também atividade inventiva ao pedido em voga, uma vez que não seria óbvio para um técnico no assunto realizar a seleção e a combinação dos biomarcadores aqui apresentada e nem sequer correlacioná-los da mesma forma como aqui descrita. Dessa forma, com base no citado acima, é possível observar que o atual estado da técnica ainda carece de soluções técnicas e funcionais capazes de proporcionar a classificação de amostras tumorais desconhecidas e/ou de origem incertas de forma mais precisa, ou seja, de maneira mais efetiva e não subjetiva. Portanto, pode-se afirmar que as tecnologias do estado da técnica, apesar de serem particularmente úteis, não permitem que se possa realizar a obtenção de processos de classificação de tumores de origem desconhecida e/ou incerta, de forma eficiente, barata e rápida como o proporcionado pela presente invenção descrita em pormenores a seguir.

Objetivos da Invenção

[013] Considerando o exposto acima, é necessário o desenvolvimento de processos que auxiliem na identificação e classificação de tumores, principalmente os de origem desconhecida e/ou incerta, que proporcionem resultados menos subjetivos, de maior acurácia e especificidade. Dessa forma, a presente invenção vem resolver esses e outros problemas do estado da técnica, apresentando-se como uma forma rápida, de baixo custo e eficiente de também classificar tumores, através de um processo alternativo e inovador, cuja metodologia foi totalmente desenvolvida in house e com a prova de princípios testada e validada na prática. Nesse sentido, esta invenção também apresenta um conjunto novo e inventivo de biomarcadores que podem ser usados para classificar e ranquear os tipos mais prováveis de cânceres a que amostras de tumores possam pertencer.

[014] A invenção aqui descrita apresenta inicialmente um sistema de seleção de genes e dados referentes à modulação da atividade biológica em amostras de tumores cujo sítio primário é conhecido, de forma que essas informações possam ser utilizadas a posteriori para o confrontamento com dados referentes à modulação da atividade biológica de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta. A construção do sistema de seleção de genes foi especialmente desenhada com checkpoints de controle de qualidade para que sejam utilizadas apenas as amostras com significância biológica para o processo aqui apresentado.

[015] Adicionalmente, é apresentado um conjunto novo, inventivo e único de biomarcadores, conjunto esse fundamental para a geração de perfis e padrões de modulação da atividade biológica específicos para cada tipo tumoral, permitindo assim, a classificação das prováveis origens de um tumor.

[016] Ademais, é apresentado um processo de manipulação e purificação de mRNA de amostras biológicas tumorais que se mostra eficiente para que possam ser coletados dados a respeito das amostras tumorais, sejam elas de origem conhecida ou de origem desconhecida e/ou incerta. Após a geração e análise dos perfis da modulação da atividade biológica deste novo conjunto de biomarcadores aqui apresentado em amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, esses dados são confrontados com os dados do sistema. A partir deste confrontamento, é possível obtermos dados estatísticos que representam a similaridade, através de probabilidade estatística, de cada amostra interrogada estar associada a um ou mais tipos de tumores. Preferencialmente, o resultado é apresentado na forma de ranqueamento, mostrando as chances porcentuais de cada amostra estar associada a um ou mais tipos de tumores. Mais preferencialmente, são apresentadas as chances da amostra de tumor de origem desconhecida e/ou incerta estar associada a pelo menos três tipos de tumor. Esse conjunto de inovações representa não somente vantagens econômicas, mas também claros avanços tecnológicos.

[017] Assim, é um dos objetivos da presente invenção proporcionar um processo e sistema de classificação de tumores, especialmente tumores de origem desconhecida e/ou incertas, assim como um kit para classificação de tumores.

Sumário da Invenção

[018] Desta forma, com a finalidade de se atingir os objetivos e efeitos técnicos acima relatados, a presente invenção refere-se a um processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta compreendendo as etapas de: a) obter, a partir de amostras,preferencialmente virtuais, de tumores de origem conhecida, o nível de expressão mRNA de um conjunto pré-determinado de biomarcadores compreendendo:arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, raz, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3,fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga e stc2; b) determinar, a partir de amostras, preferencialmente reais, de tumores de origem desconhecida e/ou incerta, o nível de expressão mRNA do mesmo conjunto pré-determinado de biomarcadores utilizados na etapa a); c) normalizar o nível de expressão mRNA de biomarcadores de a) e b), obtendo- se a razão (“foldchange”) entre cada biomarcador discriminador com cada biomarcador normalizador; d) confrontar os perfis do nível de expressão mRNA a dos biomarcadores de amostras tumorais de origem conhecida com os perfis do nível de expressão mRNA de biomarcadores em amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, classificando, preferencialmente em forma de ranking, a amostra.

[019] De maneira preferencial, as amostras de tumores de origem conhecida são obtidas a partir da análise ou de experimentos de microarranjos de DNA ou de PCR em tempo real.

[020] Em uma realização preferencial, os tipos tumorais de câncer de mama e/ou útero e/ou ovário não são utilizados na obtenção dos perfis do nível de expressão mRNA de biomarcadores que serão comparados com amostras tumorais desconhecidas e/ou incertas obtidas de pacientes do sexo masculino.

[021] Em uma realização preferencial, o tipo tumoral de câncer de próstata não é utilizado na obtenção dos perfis do nível de expressão mRNA de biomarcadores que serão comparados com amostras tumorais desconhecidas e/ou incertas obtidas de pacientes do sexo feminino.

[022] Na etapa de normalização são utilizados biomarcadores normalizadores para realização da normalização da expressão mRNA de tumores de origem conhecida e de tumores de origem desconhecida e/ou incerta. Preferivelmente, os biomarcadores normalizadores são selecionados do grupo que compreende todo o conjunto de biomarcadores aqui descritos. Preferencialmente, são selecionados 4 biomarcadores normalizadores, sendo (1) arf5, (2) sp2, (3) vps33be um (4) adicional selecionado do grupo: kdelr2 ouly6eou panx1.

[023] Adicionalmente, em uma realização preferencial, a normalização é realizada através da obtenção da razão (“foldchange”) entre o valor relacionado a modulação da atividade de cada biomarcador discriminador e o valor relacionado a modulação da atividade de cada biomarcador normalizador.

[024] O confrontamento dos dados de amostras tumorais de origem conhecida com os dados de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, é realizada utilizando, de preferência, ferramentas computacionais. Mais preferencialmente, utiliza-se técnicas presentes em algoritmos de Aprendizado de Máquina (AM) como a técnica de “Random Forest” (RF) para relacionar os dados das amostras de origem conhecida para classificar as amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta. O “Random Forest” (RF), no português, “Floresta Aleatória” é um algoritmo de aprendizagem supervisionada, que cria uma combinação de árvores de decisão. Vide: Breiman, L. Machine Learning (2001) 45: 5. https://doi.org/10.1023/A:1010933404324.

[025] Em uma realização preferencial, o presente processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, utiliza como sub-etapa de a) um processo de controle de qualidade de amostras biológicas de origem conhecida, preferencialmente virtuais, para seleção das amostras de origem conhecida de alta qualidade que serão utilizadas na geração de perfis da modulação de sua atividade biológica.

[026] Também utiliza, como sub-etapa de b) um processo de controle de qualidade de amostras de tumores de origem desconhecidas e/ou incertas para determinar se o material biológico e/ou os resultados da análise da sua modulação da atividade biológica, possuem qualidade suficiente para fornecerem dados confiáveis durante sua análise.

[027] O citado processo de controle de qualidade de amostras biológicas de origem conhecida, preferencialmente virtuais, compreende as etapas de: A. submeter as amostras obtidas a uma pré-seleção pelo seguinte critério de avaliação: i. verificar se a amostra é de proveniência distinta de linhagens celulares laboratoriais ou dexenotransplantes; ii. verificar se a amostra está livre de qualquer tratamento relacionado a câncer; iii. verificar se a amostra é uma amostra tumoral; iv. verificar se a origem primária da amostra tumoral é conhecida; v. verificar se a amostra é uma amostra humana (Homo sapiens); onde a amostra que teve todas as questões dos critérios de avaliação respondidas positivamente, é pré-selecionada para ser utilizada como uma amostra biológica tumoral de origem conhecida de alta qualidade; B. selecionar novamente dentre as amostras selecionadas em a) aquelas amostras que contém dados disponíveis sobre o seguinte conjunto de biomarcadores: arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, raz, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3, fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga e stc2; C. selecionar dentre o grupo de biomarcadores descritos em b) pelo menos três biomarcadores que possuam baixos coeficientes de variação entre todas as amostras tumorais de origem conhecida de analisadas; D. utilizar os pelo menos três biomarcadores selecionados em c) como parâmetro de controle de qualidade, respeitando a seguinte relação entre eles: 0,01 < [(Biomarcador_1+ Biomarcador_2) / 2] / Biomarcador_3 <10,00; onde, caso os dados da amostra encontrem-se dentro da faixa acima indicada, ela é selecionada como sendo uma amostra tumoral de origem conhecida de alta qualidade.

[028] Assim, as amostras selecionadas poderão ser submetidas à etapa de normalização, para a classificação das amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta.

[029] Em uma realização preferencial, os pelo menos três biomarcadores desse controle de qualidade compreendem ly6e, kdelr2 e panx1.

[030] O citado processo de controle de qualidade de amostras biológicas de origem desconhecida e/ou incerta, preferencialmente reais, compreende as etapas de: I) processar as amostras obtidas para extração e purificação dos mRNA do material biológico; II) submeter os mRNA à amplificação, na qual é feita coleta de dados dos respectivos ciclos de amplificação (CycleThreshold - Ct); III) a amostra de II) deve ser submetida ao seguinte critério de avaliação: Ct 10,00 < Valor de Ct do biomarcador analisado < Ct 40,00; onde, caso a amostra encontre-se dentro da faixa acima indicada, ela é selecionada como sendo uma amostra tumoral de alta qualidade.

[031] Assim, as amostras selecionadas poderão ser submetidas à etapa de normalização, para a classificação das amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta.

[032] Em uma realização preferencial, o(s) biomarcador(es) utilizado(s) nesse controle de qualidade podem ser um ou mais genes escolhidos do grupo que compreende: arf5, sp2, vpss33b, tssc4, kdelr2, lye6, panx1.

Descrição Resumida dos Desenhos

[033] A figura 1 exemplifica, através de um fluxograma, uma concretização para o processo de geração de perfis de expressão gênica de amostras tumorais de origem conhecidas, preferencialmente virtuais.

[034] A figura 2 exemplifica, através de um fluxograma, uma concretização do processamento de amostras, controle de qualidade e geração de perfis de expressão gênica de amostras tumorais desconhecidas e/ou incertas, preferencialmente reais, para o confrontamento com os perfis de expressão de amostras tumorais de origem conhecidas, por exemplo, obtidas conforme ilustrado na figura 1.

[035] Destaca-se que os quadros, em ambas figuras, com preenchimento cinza revelam o ponto de interligação entre os dois fluxogramas.

Descrição Detalhada da Invenção

[036] A presente invenção apresenta uma série de detalhamentos que devem ser entendidos somente como exemplos de como a invenção pode ser aplicada e, não, como limitantes da aplicação da mesma.

Modulação da atividade biológica

[037] A “modulação da atividade biológica” da presente invenção compreende qualquer mensuração quantitativa da quantidade/expressão/regulação de elementos como, por exemplo, DNA, RNA e/ou proteínas em amostras biológicas. Em uma realização preferencial, o termo compreende a mensuração quantitativa da expressão gênica. Na presente invenção, o dito termo é relacionado a mensuração quantitativa da expressão mRNA. Diversos meios podem ser utilizados para verificar a expressão gênica.

Amostras biológicas

[038] As “amostras biológicas” da presente invenção compreendem quaisquer partes de seres vivos, preferencialmente mamíferos, ainda mais preferencialmente humanos que possam ser utilizadas para obtenção de informações biológicas de determinado organismo e/ou órgão e/ou tecido e/ou célula e/ou molécula. Na presente invenção, as amostras biológicas são principalmente elementos biológicos moleculares (MRNA) como, por exemplo, DNA, RNA e/ou proteínas, preferencialmente provenientes de tecidos de câncer primário ou metastático. Na presente invenção, são denominadas amostras biológicas reais aquelas que foram processadas experimentalmente, por exemplo, sendo submetidas a testes de bancada (wetlab) enquanto são denominadas amostras biológicas virtuais aquelas amostras que já foram processadas e que os dados são, por exemplo, disponibilizados em bancos de dados públicos e gratuitos via internet ou outros meios.

Biomarcadores

[039] Foram selecionados genes com diferentes funções para compor o grupo de biomarcadores da presente invenção. Esses “biomarcadores” compreendem quaisquer entidades que possam ter seus parâmetros físico-químico-biológicos mensurados por instrumentação analítica e/ou científica. Na presente invenção, a definição do conjunto de biomarcadores mostra-se como um aprimoramento do estado da arte, uma vez que apresenta um conjunto novo e inventivo de biomarcadores para classificação de tumores de origem desconhecida e/ou incertas. Em uma realização preferencial, o conjunto de biomarcadores da presente invenção compreende: arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, rax, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3, fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga,stc2, elfn2, slc45a3, fam167a, gjb6, capsl, cyorf15a (ver Tabela 1).

[040] Em algumas ocasiões, foram eleitos alguns biomarcadores para serem utilizados, por exemplo, como base para o cálculo de parâmetros de controle de qualidade ou como normalizadores das amostras. Preferencialmente, os biomarcadores sutilizados como base para o cálculo de parâmetros de controle de qualidade ou como normalizadores das amostras são eleitos do grupo que compreende: arf5, sp2, vpss33b, tssc4, kdelr2, lye6, panx1. No caso dos biomarcadores para normalização dos dados das amostras tumorais de origem conhecida e de origem desconhecida e/ou incerta, são preferencialmente utilizados 4 biomarcadores: (1)arf5, (2) sp2, (3) vps33b e (4) um dentre o grupo: kdelr2 ouly6e ou panx1. No caso dos biomarcadores utilizados como controle de qualidade para seleção das amostras de origem conhecida, preferencialmente virtuais, com alta qualidade são preferivelmente utilizados ly6e, kdelr2 e panx1. No caso dos biomarcadores como controle de qualidade para seleção das amostras de origem desconhecida e/ou incerta, preferencialmente reais, com alta qualidade é preferivelmente utilizado pelo menos um biomarcador do grupo que compreende arf5, sp2, vpss33b, tssc4, kdelr2, lye6, panx1.

Tumores de origem conhecida/desconhecida

[041] Os tumores primários ou metastáticos podem não ter sua origem definida, levando o paciente a ter um câncer de origem desconhecida e/ou incerta. O termo “tumor de origem desconhecida e/ou incerta” podem ser intercambiavelmente substituídos pela expressão “tumor de origem primária e/ou metastática desconhecida e/ou incerta” ou similares na presente invenção, sem causar prejuízo a mesma.

[042] Os termos “tumor de origem conhecida” ou “amostra tumoral de origem conhecida” usados na presente invenção, correspondem aos tumores em que foi possível determinar a origem primária e, consequentemente, foi possível estipular em qual tecido/órgão o tumor teve origem.

[043] Quanto ao processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, este compreende a etapa a) de obter, a partir de amostras, preferencialmente virtuais, de tumores de origem conhecida, o nível de modulação da atividade biológica de um conjunto pré-determinado de biomarcadores compreendendo: arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, rax, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3,fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga e stc2;onde, por exemplo, a dita obtenção a partir de amostras, preferencialmente virtuais, de tumores de origem conhecida, inclui a montagem de um repositório de arquivos com dados, preferencialmente de expressão gênica,com base em plataformas de microarranjos de DNA, obtidos e disponíveis onlinena plataforma Array Express do EMBL- EBI (www.ebi.ac.uk/arrayexpress), categorizada conforme mostrado na Tabela 2.

[044] Nessa plataforma, pública e gratuita, são disponibilizados diversos arquivos (brutos e processados) que contém dados diversos sobre a modulação da atividade biológica de amostras biológicas, incluindo amostras tumorais, a qual é constantemente atualizada e os arquivos e informações disponibilizados para o público.

[045] Devido ao tipo de informação disponibilizada e a qua idade das amostras, foram utilizados principalmente arquivos das seguintes plataformas de microarranjo: A-AFFY-33 - AffymetrixGeneChip Human Genome HG-U133A [HG-U133A/B] A-AFFY-37 - AffymetrixGeneChip Human Genome U133A 2.0 [HG-U133A_2] A-AFFY-44 - AffymetrixGeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 [HG-U133_Plus_2]

[046] Todas as plataformas e amostras utilizadas neste repositório de arquivos foram cuidadosamente selecionadas, o que permitiu com que fossem obtidos dados com maior qualidade e precisão do que aqueles que não sofrem qualquer tipo de análise prévia.

[047] Preferencialmente, as amostras biológicas tumorais de origem conhecida, preferencialmente virtuais, selecionadas, foram submetidas a critérios de inclusão e de qualidade de amostra, que estão descritos abaixo: A. submeter as amostras obtidas a uma pré-seleção pelo seguinte critério de avaliação: i. verificar se a amostra é de proveniência distinta de linhagens celulares laboratoriais ou de xenotransplantes; ii. verificar se a amostra está livre de qualquer tratamento relacionado a câncer; iii. verificar se a amostra é uma amostra tumoral; iv. verificar se a origem primária da amostra tumoral é conhecida; v. verificar se a amostra é uma amostra humana (Homo sapiens); onde a amostra que teve todas as questões dos critérios de avaliação respondidas positivamente, é pré-selecionada para ser utilizada como uma amostra biológica tumoral de origem conhecida de alta qualidade;

[048] O fato de somente serem escolhidas amostras com as características acima faz com que sejam utilizados somente dados de amostras de tumores humanos primárias ou metastáticos sem tratamento, o que auxilia ainda mais na classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta e aproxima o processo de classificação da realidade clínica dos pacientes.

[049] Na coluna 3 da Tabela 2, estão exemplificados números de acesso das plataformas que podem ser utilizadas para obtenção de amostras e sua correspondência com cada superclasse e subclasse de tecido tumoral. A partir desses arranjos, considerando os critérios listados acima, ao todo, podem ser selecionadas mais de 7.000 amostras para compor o repositório de arquivos de amostras tumorais virtuais de origem conhecida.

[050] Na etapa B., todos os arquivos de amostras obtidos que respeitaram os critérios de inclusão acima especificados são submetidos a uma seleção adicional para verificar a presença do conjunto de 95 biomarcadores pré-determinados, os quais foram cuidadosamente selecionados com base em dados experimentais que indicam a eficiência desse conjunto para a classificação de tumores de origem desconhecida e/ou incerta.

[051] Em seguida, na etapa C. é selecionado dentre o grupo de biomarcadores de B. pelo menos três biomarcadores que possuam baixos coeficientes de variação entre todas as amostras tumorais, preferencialmente virtuais, analisadas.

[052] Dessa forma, verificou-se que havia entre as amostras uma relação matemática ideal para determinar a qualidade das amostras tendo como base estes biomarcadores que exibem pouca variação de modulação da atividade biológica, mesmo quando são analisados em diferentes superclasses tumorais. Assim na etapa D. são utilizados os pelo menos três biomarcadores selecionados em C. como parâmetro de controle de qualidade, respeitando a seguinte relação entre eles: 0,01 < [(Biomarcador_1+ Biomarcador_2) / 2] / Biomarcador_3 < 10,00; onde, caso os dados da amostra encontram-se dentro da faixa acima indicada, ela é selecionada como sendo uma amostra tumoral de origem conhecida, preferencialmente virtual, de alta qualidade.

[053] Especificamente, os biomarcadores utilizados na fórmula acima tem que ser diferentes entre si. Mais preferencialmente, as amostras devem respeitar a seguinte condição: 0.01 < [(biomarcador_1 + biomarcador_2) / 2] / Biomarcador_3 < 8.2 0.07 < [(Biomarcador_1 + Biomarcador_3) / 2] / Biomarcador_2 < 1.5 0.61 < [(Biomarcador_2 + Biomarcador_3) / 2] / Biomarcador_1 < 8.85

[054] Ainda mais preferencialmente, as amostras devem considerar que os biomarcadores foram selecionados do grupo compreendendo ly6e, panx1, kdelr2. Ainda mais especificamente e de modo não limitante, foram usados como biomarcadores as seguintes Probeset_IDs da Affymetrix que representam e correspondem aos biomarcadores ly6e, panx1, kdelr2: 202145_at, 200700_s_at e 204715_at.

[055] Para fins da presente descrição, entende-se como amostra de alta qualidade qualquer amostra que tenha atendido aos critérios definidos nas etapas de A. a D. citadas.

[056] A título exemplificativo, após a aplicação do processo de controle de qualidade acima descrito, a partir das mais de 7.000 amostras do repositório de arquivos de amostras tumorais virtuais de origem conhecida, foram reduzidas a 4.429 amostras divididas em 25 Superclasses, compostas por 58 Subclasses (Tabela 2, colunas 1 e 2).

[057] As informações desse repositório de dados serão posteriormente utilizadas para classificar as possíveis origens tumorais, mais especificamente, os possíveis tecidos/órgãos de origem de amostras reais de tumores com origem desconhecida e/ou incerta.

[058] Com relação a etapa b) do processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, determina-se, a partir de amostras, preferencialmente reais, de tumores de origem desconhecida e/ou incerta, o nível de modulação da atividade biológica do mesmo conjunto de 95 biomarcadores pré-determinado utilizados na etapa a).

[059] A título informativo e não limitante, as amostras testadas nesta invenção foram principalmente obtidas de amostras de preservação FFPE (Formalin-fixed, paraffin- embedded).Entretanto, outras formas de preservação como criopreservação e até mesmo uso de amostras frescas recém biopsadas podem ser utilizadas.

[060] Com a finalidade de preparar a amostra para uma extração de RNA, idealmente são usados de 2 até 6 cortes com espessura de aproximadamente 10 micrometros cada, colocados em lâminas de vidro (a partir do bloco de parafina), onde uma das lâminas recebe coloração padrão e rotineira H&E (Hematoxilina & Eosina) e as demais não recebem a dita coloração.

[061] A região tumoral deve ser demarcada, preferencialmente por um patologista, na lâmina corada com H&E, para evitar que tecido não tumoral seja analisado. Em seguida, a região demarcada é utilizada como guia para a coleta nas lâminas não coradas (podendo ser feito uso de microdissecção a laser, sem prejuízos) e o material obtido transferido para um tubo contendo Xilol.

[062] Procede-se a extração de RNA, a qual pode ser conduzida pelo uso de um kit comercial como, por exemplo, o kit RecoverAll™ Total NucleicAcidIsolation Kit for FFPE (Ambion®- Cat. Num. AM1975). Ao final do processo de extração o RNA é eluído em água livre de D/RNAses.

[063] Quando necessário, a síntese de cDNA é feita a partir da amplificação total do transcriptoma, por exemplo, através da utilização do kit TransPlexWholeTranscriptomeAmplification Kit (Sigma® - Cat. Num WTA2-10RXN). Ao final da síntese o cDNA pode ser purificado, por exemplo, com auxílio do kit QIAquick PCR Purification Kit* (QIAGEN® - Cat. Num 28104).

[064] Para avaliação da modulação da atividade biológica dos biomarcadores nas amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, utiliza-se a PCR em Tempo Real. Por exemplo, todos os 95 biomarcadores possuem seus ensaios TaqMan® (par de primers e sonda FAM-NFQMGB específicos, pré-desenhados em formato de ensaios inventoriados e/ou madetoorder pelo fabricante) spotados de forma liofilizada em Array de Baixa Densidade customizados pela Life Technologies (TLDA Cards - TaqMan® LowDensityArray -Cat. Num. 4342259). O tampão mastermix misturado ao cDNA e adicionado nos TLDA Cards pode ser, por exemplo, o TaqMan® Gene Expression Master Mix (Life Technologies - Cat. Num. 4369016). O programa de ciclagem da reação no equipamento de PCR em tempo Real com o TLDA Card realiza de40 a 60 ciclos, preferencialmente 50.

[065] Após a ciclagem, a coleta de dados de Ct (CycleThreshold) é feita com o limiar fixo no valor de 0,01 a 0,10, preferencialmente 0,05. Todos os biomarcadores que não apresentam amplificação, que são marcados pelo equipamento como “Undetermined”, recebem arbitrariamente um valor de Ct que é igual ao número de ciclos usados, uma vez que se considera que a expressão deste biomarcador é praticamente nula.

[066] Para que a amostra seja considerada com qualidade suficiente para ser analisada, é feita a verificação do Ct de alguns biomarcadores, conforme demonstrado abaixo: Ct 10,00 < Valor de Ct do Biomarcador < Ct 40,00

[067] Preferencialmente, foram utilizadas faixas específicas e biomarcadores específicos para determinar o controle de qualidade da amostra tumoral, como pode ser visto abaixo: 1) Ct 18.00 < ARF5 < Ct 25.52; 2) Ct 15.63 < SP2 < Ct 31.63; 3) Ct 16.48 < KDELR2 < Ct 25.53; 4) Ct 19.58 < LYE6 < Ct 29.34; 5) Ct 18.16 < PANX1 <Ct 27.46; onde, caso a amostra esteja fora de qualquer uma das faixas acima, ela não será analisada.

[068] Para as amostras selecionadas pelos critérios acima, verifica-se adicionalmente os valores de Ct para os biomarcadoresvps33b e tssc4, conforme abaixo: 6) Ct 24.37 < VPS33B <Ct 35.76 - apenas se fora da faixa, substituir por Ct 27.52 7) Ct 25.53 < TSSC4 <Ct 34,90 - apenas se fora da faixa, substituir por Ct 29.40

[069] Se a amostra passar por todos critérios acima, após editada quando necessário, ela é selecionada como uma amostra biológica de origem desconhecida e/ou incerta de alta qualidade. Assim, as amostras biológicas de alta qualidade são selecionadas para seguirem no processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta.

[070] Para fins da presente descrição, entende-se como amostra de alta qualidade qualquer amostra que tenha atendido aos 7 critérios definidos acima.

[071] A título exemplificativo, após a aplicação do processo de controle de qualidade acima descrito para amostras biológicas de origem desconhecida e/ou incerta, a partir das 112 amostras tumorais metastáticas foram selecionadas 105 amostras, cuja origem primária foi previamente determinada pelo consenso de 2 médicos patologistas de forma independente, para realização de testes-cegos para prova de conceitos e validação da metodologia desenvolvida.

[072] Já na etapa c) ocorre a normalização do nível de modulação da atividade biológica dos biomarcadores de a) e b), obtendo-se a razão (“foldchange”) entre cada biomarcador discriminador com cada biomarcador normalizador. Preferencialmente os biomarcadores normalizadores são selecionados do grupo que compreende todo o conjunto de 95 biomarcadores aqui descritos. Prioritariamente, são selecionados4biomarcadores normalizadores do grupo que compreende (1) arf5, (2) sp2, (3) vps33b e (4) um dentre o grupo: kdelr2 ou ly6e ou panx1, sendo os demais 91 biomarcadores considerados biomarcadores discriminadores.

[073] Na presente invenção, a normalização é realizada tanto para as amostras tumorais conhecidas quanto para as desconhecidas e/ou incertas. No caso de amostras provenientes de microarranjos de DNA, os dados são referentes a intensidade de fluorescência, enquanto no caso de amostras provenientes de PCR em tempo real, os dados referem-se aos ciclos de amplificação que ultrapassaram o limiar fixo do ciclo (CycleThreshold - Ct), ou seja, ao nível de amplificação alcançado por cada biomarcador na amostra através de PCR em Tempo Real. Dessa forma, considerando, por exemplo, o conjunto total de 95 biomarcadores, sendo dentre eles91 discriminadores e 4 normalizadores, temos um total de 364 (91x4) atributos normalizados para amostra analisada pela presente invenção.

[074] Em uma realização preferencial, amostras tumorais desconhecidas e/ou incertas provenientes de pacientes do sexo masculino não são analisadas e confrontadas com amostras de câncer de mama, ovário e útero. Neste contexto, de forma ilustrativa, as amostras desconhecidas e/ou incertas de pacientes masculinos foram confrontadas com 3602 amostras tumorais conhecidas normalizadas divididas em 22 superclasses de tumores, cuja composição foi obtida a partir de 46 subclasses. No caso de amostras desconhecidas e/ou incertas provenientes de pacientes do sexo feminino, estas não foram analisadas e confrontadas com amostras de câncer de próstata. Neste mesmo contexto, as amostras desconhecidas e/ou incertas de pacientes femininos foram confrontadas com 4300 amostras tumorais conhecidas normalizadas divididas em 24 superclasses de tumores, cuja composição foi obtida a partir de 57 subclasses.

[075] Finalmente, na etapa d), é realizado o confrontamento entre os perfis normalizados do nível de modulação da atividade biológica dos biomarcadores em amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta com as superclasses obtidas a partir de perfis normalizados do nível de modulação da atividade biológica dos biomarcadores de amostras tumorais de origem conhecida, classificando, preferencialmente em forma de ranking, a amostra.

[076] Tal classificação é feita, basicamente, para averiguar o grau de similaridade, baseado em probabilidade estatística, entre os perfis normalizados do nível de modulação da atividade biológica dos biomarcadores em amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta com as superclasses obtidas a partir de perfis normalizados do nível de modulação da atividade biológica dos biomarcadores de amostras tumorais de origem conhecida.Neste sentido, em uma realização preferencial, o confrontamento entre os dados de amostras tumorais de origem conhecida e os dados de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta normalizadas é realizado utilizando-se ferramentas computacionais de Aprendizado de Máquina. Mais preferencialmente, utiliza-se a ferramenta de “Random Forest” que opera formando um comitê de árvores de decisão para relacionar os dados das amostras tumorais de origem conhecida com amostras tumorais desconhecidas e/ou incertas e classificá-las/ranqueá-las. Mais preferencialmente utiliza-se a implementação disponível do pacote "Random Forest" (RF) na ferramenta de análise estatística "R". Os parâmetros de RF mais significativos são o número de árvores de decisão (ntree), a quantidade de atributos utilizada para a construção das árvores (mtry=sqrt) e o tamanho das árvores (nodesize). Esses parâmetros foram utilizados, preferencialmente, com os seguintes valores de parâmetros: ntree=500, mtry=sqrt(364) e nodesize=1.

[077] Com a finalidade, meramente ilustrativa, de verificar a capacidade discriminatória do repositório obtido, utilizou-se como parâmetro de avaliação a compilação dos resultados em uma matriz de confusão (Tabela de Contingência - Tabela 3) a partir de uma validação cruzada em 10 pastas (10-fold Cross Validation) usada para gerar os perfis de expressão gênica de cada superclasse tumoral, onde a amostra tumoral de origem conhecida foi considerada corretamente classificada quando a sua classificação foi a mesma previamente conhecida. A linha diagonal central indica a quantidade de amostras que foram corretamente classificadas.

[078] Ainda com a finalidade meramente ilustrativa, foi verificada a acurácia do processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, também coma utilização de uma matriz de confusão (tabela de contingência - tabela 4) como parâmetro de avaliação pela compilação dos resultados obtidos de 105 amostras tumorais metastáticas reais de origem conhecida, em formato de teste cego. Neste caso, a amostra foi considerada corretamente classificada quando a sua classificação esperada esteve contida dentre as 3 primeiras superclasses de maior probabilidade estatística. A linha diagonal central indica a quantidade de amostras que foram corretamente classificadas.

[079] Adicionalmente, são apresentados parâmetros gerais observados nas 105 amostras metastáticas reias submetidas à classificação através do processo aqui apresentado (Tabela 5). A metodologia foi capaz de classificar mais de 80% das amostras de forma correta.

RIN = RNA IntegrityNumber fornecido pelo equipamento Bioanalyzer (Agilent Technologies).

[080] É relevante frisar que o processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta descrito e ilustrado na presente invenção, fornece como resultado ao seu final, uma classificação, em formato preferencial de ranking, baseada em similaridade entre a amostra interrogada e as superclasses de tumores de origem conhecida, a partir de probabilidades estatísticas. Estes dados não substituem os resultados obtidos por outros testes, exames e anamineses a que o paciente oncológico tenha se submetido ou irá se submeter. São dados que recomenda-se serem usados de forma complementar a todos os outros já coletados ou a serem coletados pelo médico oncologista responsável por cada paciente. Desta forma, os resultados obtidos por esta presente invenção não são suficientes para que, de forma isolada, possa-se definir a origem primária de um tumor de origem desconhecida e/ou incerta.

[081] A presente invenção adicionalmente compreende um sistema para classificação de amostras tumorais primárias ou metastáticas de origem desconhecida e/ou incerta compreendendo meios para executar o processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta aqui descrito. Em uma realização preferencial, o sistema da presente invenção pode compreender meios eletrônicos (computadores, hardwares, softwares) capazes de processar as informações geradas e analisadas pelo processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta.

[082] Adicionalmente, a presente invenção apresenta um kit de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta. Em uma realização preferencial, o kit compreende meios para detecção dos níveis de expressão de um ou mais biomarcadores da presente invenção. Opcionalmente, o kit compreende reagentes que especificamente se ligam aos biomarcadores aqui listados como, por exemplo, sondas de nucleotídeos. Adicionalmente, o kit ainda pode compreender meios eletrônicos de processamento da informação sobre a modulação da atividade biológica, de forma que o kit possa proporcionar dados referentes a similaridade da amostra com cada superclasse tumoral.

[083] A presente invenção compreende ainda o uso dos 95 biomarcadores determinados arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, rax, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3, fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga e stc2 para a produção de um kit de classificação, reagentes ou em um processo de classificação de amostras tumorais.

[084] Vale ressaltar que, embora tenham sido mostradas formas construtivas preferenciais da presente invenção, está entendido que eventuais omissões, substituições e alterações construtivas podem ser feitas por um técnico no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da proteção requerida. É também expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma modalidade descrita por outros são também totalmente pretendidos e contemplados.

Claims

1. Processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta obtidas a partir da análise ou de experimentos de microarranjos de DNA e/ou de PCR em tempo real CARACTERIZADO por compreender as etapas de: a) obter, a partir de amostras de tumores de origem conhecida, o nível de expressão mRNA sobre o seguinte conjunto pré-determinado de biomarcadores: arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, rax, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3, fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga e stc2; b) determinar, a partir de amostras de tumores de origem desconhecida e/ou incerta, o nível de expressão mRNA do mesmo conjunto pré- determinado de biomarcadores utilizados na etapa a); c) normalizar o nível de expressão mRNA de biomarcadores de a) e b), obtendo-se a razão entre cada biomarcador discriminador com cada biomarcador normalizador; d) confrontar os perfis do nível de expressão mRNA dos biomarcadores de amostras tumorais de origem conhecida com os perfis do nível de expressão mRNA de biomarcadores em amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta, classificando a amostra.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelas amostras de tumores de origem conhecida serem virtuais, em que amostras virtuais se referem a dados relativos à informação sobre nível de expressão mRNA de genes de interesse que é obtida em base de dados pré-estabelecidas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelas amostras de tumores de origem desconhecida e/ou incerta serem reais.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelos tipos tumorais de câncer de mama, útero e/ou ovário serem excluídos na obtenção dos perfis do nível de expressão mRNA de biomarcadores que serão comparados com amostras tumorais desconhecidas e/ou incertas obtidas de pacientes do sexo masculino.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo tipo tumoral de câncer de próstata ser excluído na obtenção dos perfis do nível de expressão mRNA de biomarcadores que serão comparados com amostras tumorais desconhecidas e/ou incertas obtidas de pacientes do sexo feminino.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por utilizar na etapa c) biomarcadores normalizadores para realização da normalização da modulação da atividade biológica de tumores de origem conhecida e de tumores de origem desconhecida e/ou incerta.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO por utilizar na etapa c) 4 biomarcadores normalizadores sendo (1) arf5, (2) sp2, (3) vps33b e, adicionalmente, um (4) biomarcador selecionado do grupo que compreende: kdelr2 ou ly6e ou panx1.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo confrontamento entre os dados de amostras tumorais de origem conhecida e os dados de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta ser realizado utilizando ferramentas computacionais.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO por utilizar o algoritmo “Random Forest” para relacionar os dados das amostras de origem conhecida com amostras de tumores primários ou metastáticos para classificar as amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelas amostras tumorais serem adicionalmente submetidas a um processo de controle de qualidade de amostras biológicas tumorais para seleção das amostras de alta qualidade que serão utilizadas na geração de perfis da modulação de sua atividade biológica.

11. Sistema para classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta CARACTERIZADO por compreender meios para executar o processo de classificação de amostras tumorais primárias ou metastáticas de origem desconhecida e/ou incerta descrito em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.

12. Processo de controle de qualidade de amostras biológicas tumorais de origem conhecida para obtenção de nível de expressão mRNA de biomarcadores de amostras tumorais de origem conhecida em um processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta CARACTERIZADO por compreender as etapas de: A. submeter as amostras obtidas a uma pré-seleção pelo seguinte critério de avaliação: i. verificar se a amostra é de proveniência distinta de linhagens celulares laboratoriais ou de xenotransplante; ii. verificar se a amostra está livre de qualquer tratamento relacionado a câncer; iii. verificar se a amostra é uma amostra tumoral; iv. verificar se a origem primária da amostra tumoral é conhecida; v. verificar se a amostra é uma amostra humana (Homo sapiens); onde a amostra que teve todas as questões do critério de avaliação respondidas positivamente, é pré-selecionada para ser utilizada como uma amostra biológica virtual de alta qualidade, em que amostras virtuais se referem a dados relativos à informação sobre nível de expressão mRNA de genes de interesse que é obtida em base de dados pré-estabelecidas; B. selecionar novamente dentre as amostras selecionadas em A. aquelas amostras que compreendem dados disponíveis sobre o seguinte conjunto de biomarcadores: arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, rax, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3, fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga e stc2; C. selecionar dentre o grupo de biomarcadores descritos em B. pelo menos três genes que possuam baixo coeficiente de variação entre todas as amostras tumorais analisadas; D. utilizar os pelo menos três biomarcadores selecionados em C. como parâmetro de controle de qualidade, respeitando a seguinte relação entre eles: 0,01 < [(Biomarcador + Biomarcador) / 2] / Biomarcador < 10,00; onde, caso os dados da amostra encontrem-se dentro da faixa acima indicada, ela é selecionada como sendo uma amostra de origem conhecida de alta qualidade.

13. Processo de controle, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo grupo de biomarcadores compreender a seguinte relação: 0.01 <[(Biomarcador_1 + Biomarcador_2) / 2] / Biomarcador_3 < 8.2; e/ou 0.07 <[(Biomarcador_1 + Biomarcador_3) / 2] / Biomarcador_2 < 1.5; e/ou 0.61 <[(Biomarcador_2 + Biomarcador_3) / 2] / Biomarcador_1 < 8.85.

14. Processo de controle, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelos biomarcadores serem: ly6e, kdelr2, panx1.

15. Processo de controle, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por ser utilizado para selecionar amostras para um processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.

16. Processo de controle de qualidade de amostras biológicas de origem desconhecida e/ou incerta para obtenção de nível de expressão MRNA de biomarcadores de amostras tumorais de origem conhecida em um processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta CARACTERIZADO pelo seguinte conjunto pré-determinado de biomarcadores: arf5, batf, c6, ca2, cadps, capn6, ccna1, cdca3, cdh16, cdh17, celsr2, chrm3, cox11, cped1, csf2rb, cx3cr1, elac2, elavl4, emx2, eps8l3, ern2, esr1, fgf9, foxa1, foxg1, hlf, hoxa9, hoxc10, hoxd11, hsdl2, htr3a, ibsp, kncj12, kdelr2, kif13a, kif15, kif2c, kldhc8a, ly6d, ly6e, ly6h, map2k6, meis1, nbla00301, odz1, panx1, pax8, pparg, prame, prdm5, prdm8, prkcq, prkra, pycr1, rax, rgs17, rtdr1, s100pbp, sdc1, selenbp1, slc35f2, slc35f5, slc43a1, slc6a1, slc7a5, sp2, spred2, stc1, tmprss3, tmprss4, traj17, trim15, tshr, tssc4, upk1b, vgll1, vps33b, wwc1, znf365, nkx2-1, bcl11b, sh2d1a, prm1, elfn2, slc45a3, fam167a, gjb6, rnls, lamp2, capsl, cyorf15a, c14orf105, gfap, fga e stc2; compreendendo as etapas de: I) processar as amostras obtidas para extração e purificação dos mRNA do material biológico; II) submeter os mRNA à amplificação, na qual é feita coleta de dados dos respectivos ciclos de amplificação (Ct); III) a amostra de II) deve ser submetida ao seguinte critério de avaliação: Ct 10,00 < Valor de Ct do biomarcador analisado < Ct 40,00; onde, caso a amostra encontre-se dentro da faixa acima indicada, a amostra é selecionada como sendo uma amostra real de alta qualidade.

17. Processo de controle, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelas amostras serem submetidas aos seguintes critérios de avaliação: 1) Ct 18.00 < ARF5 < Ct 25.52; 2) Ct 15.63 < SP2 < Ct 31.63; 3) Ct 16.48 < KDELR2 < Ct 25.53; 4) Ct 19.58 < LYE6 < Ct 29.34; 5) Ct 18.16 < PANX1 <Ct 27.46; e, adicionalmente, as amostras selecionadas de acordo com os critérios 1 a 5 serem submetidas aos seguintes critérios de avaliação: 6) Ct 24.37 < VPS33B < Ct 35.76 - apenas se fora da faixa, substituir por Ct 27.52; 7) Ct 25.53 < TSSC4 < Ct 34,90 - apenas se fora da faixa, substituir por Ct 29.40.

18. Processo de controle de qualidade, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO por ser utilizado para selecionar amostras para um processo de classificação de amostras tumorais de origem desconhecida e/ou incerta definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.