BR102013029251B1

BR102013029251B1 - Prognostic method for predicting recurrence of cancer in a patient, use of gene sets, use of ck-19 and/or cerb-b2 epithelial antigens, use of a primer, use of an amplicon, method for predicting survival time of a patient with breast cancer without recurrence, prognostic model to predict the survival time of a patient with breast cancer without recurrence and method of obtaining data for targeting breast cancer treatment

Info

Publication number: BR102013029251B1
Application number: BR102013029251-6A
Authority: BR
Inventors: Auro Del Giglio; Fernando Luiz Affonso Fonseca; Beatriz Da Costa Aguiar Alves Reis; Flávia De Sousa Gehrke; Renata Kelly Kuniyoshi
Original assignee: Cepho - Centro De Estudos E Pesquisas De Hematologia E Oncologia; Sociedade Beneficiente Israelita Brasileira Hospital Albert Einstein
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2022-02-01
Also published as: BR102013029251A2

Abstract

MÉTODOS PROGNÓSTICOS PARA PREDIZER A RECORRÊNCIA DE CÂNCER EM UM PACIENTE, INICIADOR, AMPLICON, ENSAIOS, USOS, MÉTODO PARA PREDIZER O TEMPO DE SOBREVIVÊNCIA DE UM PACIENTE COM CANCÊR DE MAMA SEM RECIDIVA, MODELO PROGNÓSTICO PARA PREDIZER O TEMPO DE SOBREVIVÊNCIA DE UM PACIENTE DE CANCÊR DE MAMA SEM RECIDIVA, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE DADOS PARA DIRECIONAMENTO DO TRATAMENTO DE CÂNCER DE MAMA, CONJUNTO DE GENES E KIT LABORATORIAL. A presente invenção refere-se a métodos prognósticos relacionados aos cânceres de mama e próstata partir da avaliação da expressão de conjuntos de genes em amostras tumorais e/ou de marcadores no sangue periférico de pacientes, bem como conjunto de genes, iniciadores, amplicons, kit e seus usosPROGNOSTIC METHODS TO PREDICT THE RECURRENCE OF CANCER IN A PATIENT, INITIATOR, AMPLICON, TESTS, USES, METHOD TO PREDICT THE SURVIVAL TIME OF A BREAST CANCER PATIENT WITHOUT RECURRENCE, PROGNOSTIC MODEL TO PREDICT THE SURVIVAL TIME OF A CANCER PATIENT OF BREAST CANCER WITHOUT RECURRENCE, METHOD OF OBTAINING DATA FOR TARGETING THE TREATMENT OF BREAST CANCER, SET OF GENES AND LABORATORY KIT. The present invention relates to prognostic methods related to breast and prostate cancers from the evaluation of the expression of sets of genes in tumor samples and/or markers in the peripheral blood of patients, as well as a set of genes, primers, amplicons, kit and its uses

Description

Field of Invention

[001] A presente invenção refere-se a métodos prognósticos relacionados aos cânceres de mama e próstata partir da avaliação da expressão de conjuntos de genes em amostras tumorais e/ou de marcadores no sangue periférico de pacientes, bem como conjunto de genes, iniciadores, amplicons, kit e seus usos.[001] The present invention relates to prognostic methods related to breast and prostate cancers from the evaluation of the expression of sets of genes in tumor samples and/or markers in the peripheral blood of patients, as well as a set of genes, primers, amplicons, kit and their uses.

Fundamentals of Invention

[002] As neoplasias representam causa de mortalidade significativa entre mulheres e homens. Entre as mulheres, O câncer de mama é a principal causa de mortalidade por câncer. Já entre os homens, o câncer de próstata é a segunda maior causa de morte por câncer.[002] Neoplasms represent a significant cause of mortality among women and men. Among women, breast cancer is the leading cause of cancer mortality. Among men, prostate cancer is the second leading cause of cancer death.

[003] Carcinomas dessa natureza são heterogêneos do ponto de vista molecular, por esse motivo uma visão ampla do processo tumoral pode ser dada com a avaliação conjunta do perfilamento gênico do tumor primário, de marcadores diretamente relacionados ao processo metastático (células tumorais circulantes - CTC) e da inter-relação entre o hospedeiro e o tumor primário.[003] Carcinomas of this nature are heterogeneous from a molecular point of view, for this reason a broad view of the tumor process can be given with the joint evaluation of the gene profiling of the primary tumor, of markers directly related to the metastatic process (circulating tumor cells - CTC ) and the interrelationship between the host and the primary tumor.

[004] A criação de painéis de biomarcadores acessíveis, precisos e rápidos que permitam refinar o prognóstico destas pacientes para melhor alocar os recursos terapêuticos é fundamental para aumento da curabilidade dessas doenças em seus estadios iniciais, antes do desenvolvimento de metástases detectáveis por métodos de imagem.[004] The creation of accessible, accurate and fast biomarker panels that allow to refine the prognosis of these patients to better allocate therapeutic resources is fundamental to increase the curability of these diseases in their initial stages, before the development of metastases detectable by imaging methods. .

[005] Modelos ou métodos prognósticos podem ser definidos como uma predição do curso futuro de uma doença após sua instalação, bem como após a identificação da mesma através do diagnóstico. É uma medida estimada, comumente exemplificada por uma taxa ou variação de uma escala (escore ou pontuação), que pode indicar a evolução, a duração e/ou o termo da condição patológica, para buscar o direcionamento e melhor aproveitamento do tratamento a ser realizado, não propiciando conclusões quanto à condição patológica de um paciente, pois as mesmas necessariamente devem ter sido realizadas previamente. A partir das conclusões obtidas pelo diagnóstico, modelos prognósticos podem ofertar ferramentas para que o tratamento a ser realizado seja mais eficiente.[005] Models or prognostic methods can be defined as a prediction of the future course of a disease after its installation, as well as after its identification through diagnosis. It is an estimated measure, commonly exemplified by a rate or variation of a scale (score or score), which can indicate the evolution, duration and/or term of the pathological condition, in order to seek direction and better use of the treatment to be performed. , not providing conclusions regarding the pathological condition of a patient, as they must necessarily have been carried out previously. From the conclusions obtained by the diagnosis, prognostic models can offer tools so that the treatment to be performed is more efficient.

[006] O prognóstico difere do diagnóstico, pois o diagnóstico se caracteriza por apresentar três etapas distintas, que englobam (i) o exame no paciente observando, apalpando e auscultando várias partes do seu corpo, (ii) a submissão do paciente a diversos testes clínicos, e a (iii) comparação dos dados obtidos nestes testes com valores normais, observando os desvios significativos e concluindo sobre a condição patológica instalada. Adicionalmente, além de não concluir sobre a condição patológica do paciente, modelos ou métodos prognósticos não são realizados no corpo humano, mas sim através de análises e reações in vitro.[006] The prognosis differs from the diagnosis, as the diagnosis is characterized by having three distinct stages, which include (i) the examination of the patient observing, palpating and listening to various parts of his body, (ii) the submission of the patient to various tests clinical trials, and (iii) comparison of the data obtained in these tests with normal values, observing significant deviations and concluding on the pathological condition installed. Additionally, in addition to not concluding on the pathological condition of the patient, models or prognostic methods are not performed in the human body, but through in vitro analyzes and reactions.

[007] Para uma avaliação prognóstica do paciente, pode-se tanto realizar um estudo do perfilamento gênico do tumor primário, através da análise da expressão de um conjunto de genes de interesse prognóstico, ligados à proliferação celular, capacidade metastática e expressão hormonal, como de seu potencial metastático e quimiossensibilidade, medido pela presença ou não de células tumorais circulantes no sangue periférico destas pacientes, que caracterizam a Doença Residual Mínima (DRM).[007] For a prognostic evaluation of the patient, a study of the gene profiling of the primary tumor can be carried out, through the analysis of the expression of a set of genes of prognostic interest, linked to cell proliferation, metastatic capacity and hormonal expression, as well as of its metastatic potential and chemosensitivity, measured by the presence or absence of circulating tumor cells in the peripheral blood of these patients, which characterize the Minimal Residual Disease (MRD).

[008] A determinação de DRM é uma análise molecular de caráter prognóstico na qual algumas células de origem tumoral (de 1 a 6 milhões de células/ grama de tumor) permanecem circulantes no organismo após a retirada do tumor.[008] The determination of DRM is a molecular analysis of prognostic character in which some cells of tumor origin (from 1 to 6 million cells/gram of tumor) remain circulating in the body after removal of the tumor.

[009] Os níveis de células epiteliais circulantes no sangue periférico de pacientes com câncer de mama metastático são considerados como fator preditivo mais significativo para intervalo livre de progressão, assim como para sobrevida global.[009] The levels of circulating epithelial cells in the peripheral blood of patients with metastatic breast cancer are considered to be the most significant predictive factor for progression-free interval, as well as for overall survival.

[0010] Assim, a pesquisa de DRM em pacientes com câncer de mama através da avaliação de células tumorais circulantes no sangue periférico tem como objetivo refinar o prognóstico da doença e definir novas estratégias terapêuticas, além de prover conhecimentos acerca do início do processo de metastização da neoplasia.[0010] Thus, the research of MRD in patients with breast cancer through the evaluation of tumor cells circulating in the peripheral blood aims to refine the prognosis of the disease and define new therapeutic strategies, in addition to providing knowledge about the beginning of the metastasis process. of the neoplasm.

[0011] Em neoplasias sólidas, células latentes podem disseminar a partir do tumor primário em um determinado momento da sua evolução. Essas células residuais que permanecem no organismo após a remoção do tumor e que não são factíveis de serem detectáveis por meio de metodologias propedêuticas convencionais caracterizam a DRM.[0011] In solid neoplasms, latent cells may disseminate from the primary tumor at a certain point in its evolution. These residual cells that remain in the body after tumor removal and that are not detectable through conventional workup methodologies characterize MRD.

[0012] A medula óssea (MO) é um sítio facilmente acessível e normalmente não contaminado por células epiteliais. Suas células, tanto as hematopoiéticas como as do estroma, são de origem mesenquimal, podendo ser distinguidas das células malignas epiteliais por várias técnicas como, por exemplo, as técnicas de imunohistoquímica e moleculares.[0012] The bone marrow (BM) is an easily accessible site and normally not contaminated by epithelial cells. Its cells, both hematopoietic and stromal, are of mesenchymal origin, and can be distinguished from malignant epithelial cells by various techniques, such as immunohistochemistry and molecular techniques.

[0013] Da mesma forma, a fração mononuclear do sangue periférico (FMNSP) pode se prestar à detecção de células epiteliais circulantes oriundas de tumores epiteliais já que, à semelhança da MO, as células normalmente presentes na FMNSP também têm origem mesenquimal. A FMNSP é idealmente preferível a MO, pois é de muito mais fácil obtenção e maior aceitação para os pacientes, especialmente para estudos seriados.[0013] Likewise, the peripheral blood mononuclear fraction (FMNSP) can be used to detect circulating epithelial cells from epithelial tumors since, like OM, the cells normally present in the FMNSP also have a mesenchymal origin. FMNSP is ideally preferable to MO as it is much easier to obtain and more acceptable to patients, especially for serial studies.

[0014] As células epiteliais presentes tanto na MO como na FMNSP de pacientes com câncer de mama são neoplásicas e albergam alterações cromossômicas (aneussomias e amplificações) comumente presentes nos tumores primários dos quais se originaram. Assim como no tumor primário, estão submetidas a uma pressão seletiva que, associada à instabilidade genética inerente ao processo neoplásico, podem conferir independência de crescimento que favorece o desenvolvimento de metástases.[0014] The epithelial cells present in both the BM and the FMNSP of patients with breast cancer are neoplastic and harbor chromosomal alterations (aneusomies and amplifications) commonly present in the primary tumors from which they originated. As in the primary tumor, they are subjected to a selective pressure that, associated with the genetic instability inherent to the neoplastic process, can confer growth independence that favors the development of metastases.

[0015] Atualmente, as duas técnicas mais utilizadas para detecção de células epiteliais em pacientes com câncer de mama descritas na literatura são a (1) imunohistoquímica e (2) técnicas moleculares, como a reação da polimerase em cadeia (PCR). A evolução da técnica de RT- PCR (PCR quantitativo) nos permite hoje avaliar quantitativamente a presença de cópias de RNA mensageiro presentes em um dado tecido ou fluido.[0015] Currently, the two most used techniques for detecting epithelial cells in breast cancer patients described in the literature are (1) immunohistochemistry and (2) molecular techniques, such as the polymerase chain reaction (PCR). The evolution of the RT-PCR technique (quantitative PCR) today allows us to quantitatively assess the presence of messenger RNA copies present in a given tissue or fluid.

[0016] O CK-19 e o CERB-B2 foram identificados como marcadores epiteliais que refletem diretamente a presença de células tumorais circulantes. Pacientes que apresentam células epiteliais circulantes por RT-PCR, assim como doença mensurável clinicamente, e que respondem à quimioterapia de forma objetiva pela diminuição das dimensões de seus tumores primários, apresentam taxa significativamente maior de desaparecimento da expressão de células epiteliais circulantes.[0016] CK-19 and CERB-B2 have been identified as epithelial markers that directly reflect the presence of circulating tumor cells. Patients who have circulating epithelial cells by RT-PCR, as well as clinically measurable disease, and who objectively respond to chemotherapy by decreasing the size of their primary tumors, have a significantly higher rate of disappearance of circulating epithelial cell expression.

[0017] Portanto, a pesquisa de células circulantes por RT-PCR pode se constituir em um marcador molecular de resposta à quimioterapia mesmo em situações nas quais não existe doença mensurável, como é o caso de pacientes submetidas à quimioterapia adjuvante.[0017] Therefore, the investigation of circulating cells by RT-PCR can constitute a molecular marker of response to chemotherapy even in situations in which there is no measurable disease, as is the case of patients undergoing adjuvant chemotherapy.

[0018] Assim, pode-se, utilizando o estudo da DRM, caracterizar molecular e imunofenotipicamente as células tumorais em trânsito (circulantes) pelos tecidos normais antes que estas se convertam em metástases detectáveis pelos métodos de rastreamento usuais. A pesquisa de DRM em pacientes com câncer de mama por avaliação de células tumorais circulantes no sangue periférico ou presentes na medula óssea tem como objetivo, portanto, avaliar se existe a possibilidade de refinar o prognóstico da doença e otimizar estratégias terapêuticas, além de prover conhecimentos acerca do início do processo de metastização da neoplasia.[0018] Thus, using the study of DRM, it is possible to molecularly and immunophenotypically characterize the tumor cells in transit (circulating) through normal tissues before they convert into detectable metastases by the usual screening methods. Research on MRD in breast cancer patients by evaluating tumor cells circulating in the peripheral blood or present in the bone marrow aims, therefore, to assess whether there is a possibility of refining the prognosis of the disease and optimizing therapeutic strategies, in addition to providing knowledge about the beginning of the process of metastasis of the neoplasm.

[0019] Biomarcadores do câncer de mama em pacientes sem doença sistêmica clinicamente mensurável podem derivar: 1) das próprias características genéticas do tumor primário, como é o caso do seu perfilamento envolvendo a avaliação da expressão de vários de seus genes; 2) de seu potencial metastático, medido pela presença ou não de células tumorais circulantes no sangue periférico destas pacientes; 3) da quimiossensibilidade destas células tumorais circulantes frente à quimioterapia antineoplásica, ou seja, se a quimioterapia pode diminuir seu número na circulação ou mesmo eliminá-las.[0019] Biomarkers of breast cancer in patients without clinically measurable systemic disease can derive: 1) from the genetic characteristics of the primary tumor, as is the case of its profiling involving the evaluation of the expression of several of its genes; 2) its metastatic potential, measured by the presence or absence of circulating tumor cells in the peripheral blood of these patients; 3) the chemosensitivity of these circulating tumor cells against antineoplastic chemotherapy, that is, whether chemotherapy can reduce their number in the circulation or even eliminate them.

[0020] Métodos que se baseiam em análise de expressão de genes-alvo para a geração de escala prognóstica que auxilia a conduta médica já estão disponíveis no mercado. Para o estudo do perfilamento gênico do tumor primário, existem atualmente três plataformas de perfilamento gênico com potencial utilidade prognóstica para mulheres com carcinomas: a plataforma de Rotterdam, a plataforma Mammaprint e o Oncotype. Destas, a plataforma Oncotype tem a vantagem de poder ser empregada em material armazenado em blocos de parafina.[0020] Methods that are based on target gene expression analysis for the generation of a prognostic scale that aids medical management are already available on the market. For the study of gene profiling of the primary tumor, there are currently three gene profiling platforms with potential prognostic utility for women with carcinomas: the Rotterdam platform, the Mammaprint platform and the Oncotype. Of these, the Oncotype platform has the advantage of being able to be used in material stored in paraffin blocks.

[0021] Os 21 genes que compõem a plataforma Oncotype estão envolvidos em importantes processos ligados a carcinogênese mamária, como invasão tumoral, proliferação celular e vias relacionadas a receptores hormonais e sinalização de c-erb-B2 (mais comumente chamado de HER2).[0021] The 21 genes that make up the Oncotype platform are involved in important processes linked to breast carcinogenesis, such as tumor invasion, cell proliferation and pathways related to hormone receptors and c-erb-B2 (more commonly called HER2) signaling.

[0022] Entre os 21 genes constituintes da plataforma, cinco são genes de referência (ACTB, GAPDH, GUS, RPLPO e TFRC) e dezesseis são genes-alvo associados a importantes processos ligados a carcinogênese mamária, tais como invasão (MMP11-stromolisina 3 e CTSL2 (catepsina L2), proliferação (Ki-67, STK15, Survivina, CCNB1, MYBL2) e vias relacionadas a receptores hormonais (ER, PGR, BCL2 e SCUBE2) e sinalização de HER2 (GRB7 e HER2), além de GSTM1, CD68 e BAG1. A expressão destes genes é medida por RT-PCR quantitativo.[0022] Among the 21 genes constituting the platform, five are reference genes (ACTB, GAPDH, GUS, RPLPO and TFRC) and sixteen are target genes associated with important processes linked to breast carcinogenesis, such as invasion (MMP11-stromolysin 3 and CTSL2 (cathepsin L2), proliferation (Ki-67, STK15, Survivin, CCNB1, MYBL2) and hormone receptor-related pathways (ER, PGR, BCL2 and SCUBE2) and HER2 signaling (GRB7 and HER2), in addition to GSTM1, CD68 and BAG1 The expression of these genes is measured by quantitative RT-PCR.

[0023] O estudo da expressão destes genes gera uma pontuação (score) que varia de 0 a 100, sendo que entre 0 e 18 considera-se uma pontuação de bom prognóstico, entre 18 e 31 como de prognóstico intermediário e acima de 31 como de prognóstico pior.[0023] The study of the expression of these genes generates a score (score) that varies from 0 to 100, with between 0 and 18 considered a good prognosis score, between 18 and 31 as an intermediate prognosis and above 31 as a good prognosis. worse prognosis.

[0024] A pontuação oriunda da aplicação desta plataforma de 21 genes demonstrou correlação significativa com a taxa de resposta patológica completa, após quimioterapia neoadjuvante. Pacientes com pontuações de mau prognóstico (alto risco) foram as que mais se beneficiaram, enquanto a quimioterapia não beneficiou as pacientes com pontuações de bom prognóstico (baixo risco).[0024] The score derived from the application of this 21-gene platform demonstrated a significant correlation with the pathological complete response rate after neoadjuvant chemotherapy. Patients with poor prognosis (high risk) scores benefited the most, while chemotherapy did not benefit patients with good prognosis (low risk) scores.

[0025] A validação externa desta plataforma de21 genes ocorreu com material oriundo de 668 blocos parafinados de pacientes envolvidas no estudo do grupo cooperativo americano NSABP (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project) B14. Esse estudo se restringiu à utilização de pacientes com linfonodos axilares não comprometidos e tumores com expressão de receptores hormonais e incluiu 2892 pacientes que foram aleatorizadas para receber placebo ou Tamoxifeno entre janeiro de 1982 e janeiro de 1988. Posteriormente, 1.235 pacientes adicionais foram incluídas de janeiro de 1988 a outubro de 1988, tendo todas estas últimas recebido tamoxifeno (Fisher e col., 2004). Nesse estudo de validação externa da plataforma de 21 genes, observou-se que 51% das pacientes tinham pontuações de bom prognóstico, enquanto que 22% tinham pontuações de prognóstico intermediário e 27%, de prognóstico ruim. Para estes grupos, as taxas de recidiva à distância em 10 anos foram respectivamente de 6,8%, 14,3% e de 30,5%, respectivamente (p<0,001 para a comparação dos grupos de prognóstico bom e ruim). Em uma análise multivariada, a pontuação obtida com o uso desta plataforma de perfilamento foi independentemente e significativamente relacionado à recidiva a distância e sobrevida global (p< 0,001 para ambas análises). A pontuação oriunda da aplicação desta plataforma se revelou independente de variáveis prognósticas clássicas neste estudo tais como idade e tamanho do tumor (Paik et al: A multigene assay to predict recurrence of Tamoxifen-treated, node-negative breast cancr. The New England Journal of Medicine, 2004.).[0025] The external validation of this platform of 21 genes occurred with material from 668 paraffin blocks of patients involved in the study of the American cooperative group NSABP (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project) B14. This study was restricted to the use of patients with uninvolved axillary lymph nodes and hormone receptor-expressing tumors and included 2892 patients who were randomized to receive placebo or tamoxifen between January 1982 and January 1988. Subsequently, an additional 1235 patients were enrolled from January 1988 to 1988. from 1988 to October 1988, all of the latter receiving tamoxifen (Fisher et al., 2004). In this external validation study of the 21-gene platform, it was observed that 51% of patients had good prognosis scores, while 22% had intermediate prognosis scores and 27% had poor prognosis scores. For these groups, the 10-year distant relapse rates were 6.8%, 14.3%, and 30.5%, respectively (p<0.001 for the comparison of good and bad prognosis groups). In a multivariate analysis, the score obtained using this profiling platform was independently and significantly related to distant relapse and overall survival (p<0.001 for both analyses). The score resulting from the application of this platform proved to be independent of classic prognostic variables in this study, such as age and tumor size (Paik et al: A multigene assay to predict recurrence of Tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. The New England Journal of Medicine, 2004.).

[0026] Embora a plataforma Oncotype® DX esteja comercialmente disponível e com valor prognóstico de grande valor para a clínica, seu elevado custo torna a mesma inacessível para a maioria das pacientes com câncer de mama.[0026] Although the Oncotype® DX platform is commercially available and has great prognostic value for the clinic, its high cost makes it inaccessible to most breast cancer patients.

[0027] Além do elevado custo, o material biológico - biópsia - deve ser enviado às unidades específicas e restritas que realizarão o exame, o que torna o teste moroso (de 10 a 14 dias ou mais).[0027] In addition to the high cost, the biological material - biopsy - must be sent to specific and restricted units that will perform the exam, which makes the test time consuming (from 10 to 14 days or more).

[0028] Assim, embora alguns poucos testes moleculares de avaliação prognóstica estejam disponíveis, o seu alto custo e demora na realização da avaliação acabam por impossibilitar o amplo acesso dos pacientes e encarecer exacerbadamente os gastos com saúde.[0028] Thus, although a few molecular tests for prognostic evaluation are available, their high cost and delay in carrying out the evaluation end up making it impossible for patients to have broad access and exacerbate health costs.

[0029] Logo, persiste a necessidade do desenvolvimento de novos testes moleculares de avaliação prognóstica que sejam mais precisos, mais baratos e mais rápidos.[0029] Therefore, there is still a need to develop new molecular tests for prognostic evaluation that are more accurate, cheaper and faster.

Brief Description of Figures

[0030] Para confecção das figuras foi realizada uma análise descritiva na qual as variáveis categóricas foram expressas em frequências absolutas e relativas e as variáveis quantitativas foram resumidas em médias, desvios-padrão, valores mínimos e máximos. Correlações com intervalo livre de progressão (ILP) foram estudadas através de modelos de riscos proporcionais de Cox e representadas graficamente por curvas de Kaplan-Meier. Além disso, foram utilizados os testes qui-quadrado e exato de Fisher para relacionar variáveis discretas entre si e o de análise de variância (ANOVA) para avaliar correlações entre variáveis contínuas e discretas entre si. Também foram realizadas análises multivariadas. Os cálculos estatísticos foram realizados com o programa NCSS.[0030] To make the figures, a descriptive analysis was performed in which the categorical variables were expressed in absolute and relative frequencies and the quantitative variables were summarized in means, standard deviations, minimum and maximum values. Progression-free interval (ILP) correlations were studied using Cox proportional hazards models and plotted by Kaplan-Meier curves. In addition, the chi-square and Fisher's exact tests were used to relate discrete variables to each other and the analysis of variance (ANOVA) to assess correlations between continuous and discrete variables. Multivariate analyzes were also performed. Statistical calculations were performed using the NCSS program.

[0031] A figura 1 apresenta a curva de sobrevida demonstrando a sobrevida dos pacientes com pontuações de seus perfilamentos tumorais no quartil superior (75%) na curva inferior e os demais com pontuações inferiores na curva superior.[0031] Figure 1 presents the survival curve demonstrating the survival of patients with scores of their tumor profiles in the upper quartile (75%) in the lower curve and the others with lower scores in the upper curve.

[0032] A figura 2 apresenta a curva de pacientes com estadio 2 e pontuações de seus perfilamentos tumorais no quartil superior (curva inferior) e demais quartis (curva inferior).[0032] Figure 2 shows the curve of patients with stage 2 and their tumor profiling scores in the upper quartile (lower curve) and other quartiles (lower curve).

[0033] A figura 3 apresenta curva se Intervalo livre de doença (ILD) de todas as pacientes.[0033] Figure 3 shows the disease-free interval (ILD) curve for all patients.

[0034] A figura 4 apresenta ILD e Her2 da segunda coleta em pacientes cuja primeira medida de Her2 foi positiva.[0034] Figure 4 shows ILD and Her2 from the second collection in patients whose first Her2 measurement was positive.

Description of the Invention

[0035] Buscando prover resultados prognósticos de maneira mais eficientes, mais rápidos, mais precisos e de menor custo, melhorando assim a acessibilidade, desenvolveram-se novos métodos prognósticos para predizer a recorrência de câncer em um paciente, particularmente câncer de mama ou próstata.[0035] Seeking to provide prognostic results in a more efficient, faster, more accurate and lower cost way, thus improving accessibility, new prognostic methods have been developed to predict the recurrence of cancer in a patient, particularly breast or prostate cancer.

[0036] Em uma primeira realização, o método foi desenvolvido a partir dos 21 genes previamente identificados como envolvidos nos processos ligados à carcinogênese, como invasão tumoral, proliferação celular e vias relacionadas a receptores hormonais e sinalização de Her2.[0036] In a first realization, the method was developed from the 21 genes previously identified as involved in processes linked to carcinogenesis, such as tumor invasion, cell proliferation and pathways related to hormone receptors and Her2 signaling.

[0037] Dos 21 genes, cinco são constitutivos e servem para normalizar a expressão dos demais alvos (B- actina, GAPDH, GUSB, RPLPO e TRFC), cinco estão relacionados à proliferação (Ki-67, STK15, Survinina, CCNB1, MYBL2), dois estão relacionados à invasão (MMP11 e CTSL2), dois são relacionados ao Her2 (GRB7 e Her2), quatro são relacionados à via estrogênica (ER, PGR, BCL2 e SCUBE2) e três são associados a outras vias (GSTM1, CD68 e BAG1).[0037] Of the 21 genes, five are constitutive and serve to normalize the expression of the other targets (B-actin, GAPDH, GUSB, RPLPO and TRFC), five are related to proliferation (Ki-67, STK15, Survinin, CCNB1, MYBL2 ), two are related to invasion (MMP11 and CTSL2), two are related to Her2 (GRB7 and Her2), four are related to the estrogenic pathway (ER, PGR, BCL2 and SCUBE2) and three are associated to other pathways (GSTM1, CD68 and BAG1).

[0038] Ditos genes foram selecionados e agrupados de acordo com o equipamento a ser utilizado para as reações de amplificação e compatibilidade de suas marcações e, de maneira surpreendente, propiciando conjunto de genes específico que permite a realização do teste de maneira otimizada.[0038] Said genes were selected and grouped according to the equipment to be used for the amplification and compatibility reactions of their markings and, surprisingly, providing a specific set of genes that allows the test to be carried out in an optimized way.

[0039] Assim, o método prognóstico para predizer a recorrência de câncer em um paciente de acordo com presente invenção compreende, em uma primeira modalidade, em submeter uma amostra tumoral do paciente à técnica de detecção molecular quantitativa que utiliza, para reações de amplificação, um ou mais dentre os conjuntos de genes (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA- ACTINA, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININA.[0039] Thus, the prognostic method for predicting the recurrence of cancer in a patient according to the present invention comprises, in a first embodiment, subjecting a tumor sample from the patient to the quantitative molecular detection technique that uses, for amplification reactions, one or more of (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININ.

[0040] A técnica de detecção molecular quantitativa preferida de acordo com a presente invenção é reação da polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR).[0040] The preferred quantitative molecular detection technique according to the present invention is real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

[0041] Nessa modalidade particular, o modelo prognóstico para predizer o tempo de sobrevivência de um paciente de câncer sem recidiva é constituído das seguintes etapas:(i) cortes em fatias de uma amostra tumoral fresca, parafinada ou congelada, de maneira a ter uma espessura de 8 a 12 μm, preferivelmente cerca de 10 μm, sendo que o número de cortes utilizados é de 5 a 15, preferivelmente cerca de 10.(ii) opcionalmente desparafinamento ou descongelamento das fatias,(iii) extração do RNA, (iv) transcrição reversa, (v) realização de RT-PCR quantitativo utilizando-se, para reações de amplificação, um ou mais dentre os conjuntos de genes (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTINA, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININA.[0041] In this particular modality, the prognostic model to predict the survival time of a cancer patient without recurrence consists of the following steps: (i) slices of a fresh, paraffinized or frozen tumor sample, in order to have a thickness of 8 to 12 μm, preferably about 10 μm, the number of slices used being from 5 to 15, preferably about 10.(ii) optionally dewaxing or thawing the slices,(iii) RNA extraction, (iv) ) reverse transcription, (v) performance of quantitative RT-PCR using, for amplification reactions, one or more among the gene sets (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii ) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININ.

[0042] Para tanto, foram também desenvolvidos iniciadores (primers) adequados às reações de amplificação em conjunto, definidos nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 38. Cada gene apresenta um par de iniciadores (primers) senso (forward) ou antisenso (reverse), que de maneira particular incluem um resíduo 5-metil-isocitosina (iso-dC) na extremidade 5’ e um ou mais marcadores fluoróforos na extremidade 5’, os quais são emitentes em comprimento de onda variando entre 100 e 800 nm, particularmente selecionados de FAM, VIC ou ROX.[0042] For this purpose, primers suitable for the joint amplification reactions were also developed, defined in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 38. Each gene has a pair of sense (forward) or forward primers. antisense (reverse), which in particular include a 5-methyl-isocytosine (iso-dC) residue at the 5' end and one or more fluorophore labels at the 5' end, which are emitted at wavelengths ranging from 100 to 800 nm, particularly selected from FAM, VIC or ROX.

[0043] Nessa modalidade, a presente invenção contempla ainda amplicons definidos por uma das SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 57.[0043] In that embodiment, the present invention further contemplates amplicons defined by one of SEQ ID NO: 39 to SEQ ID NO: 57.

[0044] Assim, em outras modalidades, a presente invenção contempla ensaios que utilizam um ou mais dos iniciadores definidos nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 38 ou um ou mais dos amplicons definidos nas SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 57.[0044] Thus, in other embodiments, the present invention contemplates assays that utilize one or more of the primers defined in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 38 or one or more of the amplicons defined in SEQ ID NO: 39 to SEQ ID NO: 57.

[0045] Em uma segunda realização, o modelo prognóstico de acordo com a presente invenção foi desenvolvido a partir da avaliação da expressão dos marcadores de quimiossensibilidade e progressão tumoral CK- 19 e Her2 no sangue periférico.[0045] In a second embodiment, the prognostic model according to the present invention was developed from the evaluation of the expression of chemosensitivity and tumor progression markers CK-19 and Her2 in peripheral blood.

[0046] Nessa realização, a pesquisa de células tumorais circulantes é realizada por amplificação do seu DNA complementar (cDNA), pela técnica RT-PCR. Nesta técnica, após a extração do RNA, este sofre a ação da enzima transcriptase reversa, sendo então obtido o cDNA que é amplificado utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos para antígenos epiteliais da citoqueratina 19 (CK-19) e Her-2.[0046] In this realization, the search for circulating tumor cells is performed by amplification of their complementary DNA (cDNA), by the RT-PCR technique. In this technique, after RNA extraction, it undergoes the action of the reverse transcriptase enzyme, and then the cDNA is obtained, which is amplified using specific primers for cytokeratin 19 (CK-19) and Her-2 epithelial antigens.

[0047] O método de acordo com essa modalidade particular é constituído das seguintes etapas: (i) hemólise do sangue periférico, (ii) extração do RNA na fração mononuclear do sangue periférico, (iii) transcrição reversa, (iv) realização do RT-PCR quantitativo utilizando iniciadores específicos para antígenos epiteliais CK-19 e/ou CERB-B2.[0047] The method according to this particular modality consists of the following steps: (i) peripheral blood hemolysis, (ii) extraction of RNA in the mononuclear fraction of peripheral blood, (iii) reverse transcription, (iv) performing RT -Quantitative PCR using specific primers for epithelial antigens CK-19 and/or CERB-B2.

[0048] Em realização particular, a detecção simultânea de RNA mensageiro para CK-19 E CERB-B2 no sangue periférico de pacientes com carcinoma através da técnica de PCR quantitativo, antes do início da quimioterapia adjuvante, estabelece o prognóstico de um intervalo livre de recidiva significativamente menor para aqueles com a presença da dupla expressão destas moléculas em seu sangue periférico.[0048] In a particular embodiment, the simultaneous detection of messenger RNA for CK-19 AND CERB-B2 in the peripheral blood of patients with carcinoma by the quantitative PCR technique, before the initiation of adjuvant chemotherapy, establishes the prognosis of an interval free of significantly lower recurrence for those with the presence of the double expression of these molecules in their peripheral blood.

[0049] Esta modalidade particular da presente invenção avalia informações referentes ao potencial micrometastático do câncer, avaliado pela presença de células tumorais circulantes por detecção da expressão de marcadores epiteliais (CK-19 e erb-B2) na fração mononuclear do sangue periférico em pacientes com câncer inicial antes, após 3 e 6 meses do início do tratamento (antes, durante e após a quimioterapia adjuvante), bem como a quimiossensibilidade das células tumorais circulantes utilizando avaliação seriada de forma quantitativa da presença de células tumorais circulantes ao longo do tratamento quimioterápico adjuvante ou neoadjuvante.[0049] This particular embodiment of the present invention evaluates information regarding the micrometastatic potential of cancer, assessed by the presence of circulating tumor cells by detecting the expression of epithelial markers (CK-19 and erb-B2) in the mononuclear fraction of peripheral blood in patients with early cancer before, 3 and 6 months after the start of treatment (before, during and after adjuvant chemotherapy), as well as the chemosensitivity of circulating tumor cells using serial quantitative assessment of the presence of circulating tumor cells throughout adjuvant chemotherapy treatment or neoadjuvant.

[0050] Assim, a presente invenção contempla um método prognóstico para predizer a recorrência de câncer em um paciente que compreende submeter sangue periférico do paciente à técnica de detecção molecular quantitativa utilizando, para reações de amplificação, iniciadores específicos para antígenos epiteliais CK-19 e/ou CERB-B2. Os iniciadores são aqueles conhecidos da técnica e disponíveis comercialmente.[0050] Thus, the present invention contemplates a prognostic method to predict the recurrence of cancer in a patient that comprises subjecting the patient's peripheral blood to the technique of quantitative molecular detection using, for amplification reactions, specific primers for epithelial antigens CK-19 and /or CERB-B2. Primers are those known in the art and commercially available.

[0051] Em outra modalidade, a presente invenção contempla ainda os usos:- de um conjunto de genes em um método prognóstico para predizer a recorrência de câncer em um paciente, dito conjunto sendo um ou mais dentre (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTINA, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININA;- dos antígenos epiteliais CK-19 E/OU CERB-B2 um método prognóstico para predizer a recorrência de câncer a partir do sangue periférico um paciente;- dos iniciadores de acordo com a presente invenção em um método prognóstico para predizer a recorrência de câncer em um paciente;- dos amplicon de acordo com a presente invenção em um método prognóstico para predizer a recorrência de câncer em um paciente.[0051] In another embodiment, the present invention further contemplates the uses:- of a set of genes in a prognostic method to predict the recurrence of cancer in a patient, said set being one or more of (i) GAPDH + KI-67 , (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININ;- of the epithelial antigens CK-19 AND/OR CERB-B2 a prognostic method to predict the recurrence of cancer from peripheral blood a patient ;- the primers according to the present invention in a prognostic method for predicting recurrence of cancer in a patient;- the amplicons according to the present invention in a prognostic method for predicting the recurrence of cancer in a patient.

[0052] Em outra modalidade, a presente invenção contempla métodos para predizer o tempo de sobrevivência de um paciente com câncer de mama sem recidiva ou de obtenção de dados para direcionamento do tratamento de câncer de mama, ou um modelo prognóstico para predizer o tempo de sobrevivência de um paciente de câncer de mama sem recidiva, que compreendem ao menos:(a) submeter uma amostra tumoral do paciente à técnica de detecção molecular quantitativa caracterizado pelo fato de que utiliza, para reações de amplificação, um ou mais dentre os conjuntos de genes (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTINA, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININA;(b) submeter sangue periférico do paciente à técnica de detecção molecular quantitativa utilizando, para reações de amplificação, os genes CK-19 e/ou CERB-B2;(c) correlacionar os dados obtidos em (a) e (b) para obter uma escala de risco (baixo, médio ou alto).[0052] In another embodiment, the present invention contemplates methods for predicting the survival time of a patient with breast cancer without recurrence or obtaining data for targeting breast cancer treatment, or a prognostic model for predicting the time of survival. survival of a breast cancer patient without recurrence, which comprise at least: (a) subjecting a tumor sample from the patient to the quantitative molecular detection technique characterized by the fact that it uses, for amplification reactions, one or more of the sets of genes (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2, (xi) SURVININ; (b) subject peripheral blood of the patient to the quantitative molecular detection technique using, for amplification reactions , the CK-19 and/or CERB-B2 genes; (c) correlate the data obtained in (a) and (b) to obtain an esc risk ward (low, medium or high).

[0053] A pontuação do perfilamento tumoral é realizada através da obtenção de curva de expressão dos genes referenciados, que são normalizados com os genes reguladores, obtendo-se uma expressão normalizada. Aos valores de expressão obtidos, atribui-se um peso (nota), bem estabelecido na literatura - escala de risco (Paik et al., 2004, aqui incorporado como referência).[0053] The tumor profiling score is performed by obtaining the expression curve of the referenced genes, which are normalized with the regulatory genes, obtaining a normalized expression. The expression values obtained are assigned a weight (grade), well established in the literature - risk scale (Paik et al., 2004, incorporated herein by reference).

[0054] É possível, portanto, se servindo conjuntamente de marcadores gênicos como o perfilamento do tumor primário e de marcadores diretamente relacionados ao processo metastático (células tumorais circulantes), ter uma visão mais ampla do processo tumoral. Assim, um modelo prognóstico mais amplo pode ser obtido da avaliação simultânea: 1) do tumor primário em relação às suas variáveis patológicas e genômicas; 2) das células tumorais circulantes dele derivadas; 3) da quimiossensibilidade destas células frente à quimioterapia adjuvante ou neoadjuvante administrada.[0054] It is possible, therefore, using together genetic markers such as the profiling of the primary tumor and markers directly related to the metastatic process (circulating tumor cells), to have a broader view of the tumor process. Thus, a broader prognostic model can be obtained from the simultaneous assessment of: 1) the primary tumor in relation to its pathological and genomic variables; 2) from circulating tumor cells derived therefrom; 3) the chemosensitivity of these cells to the adjuvant or neoadjuvant chemotherapy administered.

[0055] Desse modo, ao aplicar uma análise multivariada subsequente com todos esses dados, a presente invenção determina o quanto os dados do perfilamento, a presença e a quimiossensibilidade de células tumorais circulantes contribuem para refinar o modelo prognóstico.[0055] Thus, by applying a subsequent multivariate analysis with all these data, the present invention determines how much the profiling data, presence and chemosensitivity of circulating tumor cells contribute to refine the prognostic model.

[0056] De maneira particular, o modelo prognóstico para predizer o tempo de sobrevivência de um paciente de câncer específico da presente invenção, avalia tanto a capacidade de um dado biomarcador rastrear um tumor (através do estudo da expressão dos 21 genes descrito acima), bem como testa seu potencial valor para o seguimento de pacientes já diagnosticados durante seu tratamento (através do estudo da presença de CTC) e auxilia na conduta do tratamento.[0056] In particular, the prognostic model for predicting the survival time of a specific cancer patient of the present invention, assesses both the ability of a given biomarker to track a tumor (by studying the expression of the 21 genes described above), as well as tests its potential value for the follow-up of patients already diagnosed during their treatment (through the study of the presence of CTC) and helps in the conduct of the treatment.

[0057] Assim, a plataforma de avaliação prognóstica de acordo com a presente invenção, particularmente para pacientes com câncer de mama, correlaciona:a) dados de novos marcadores moleculares obtidos do tumor primário (perfilamento gênico) na forma de uma pontuação (score) com critérios já definidos na literatura (Paik et al., 2004);b) informações referentes ao potencial micrometastático avaliado pela presença de células tumorais circulantes por detecção da expressão de marcadores epiteliais (CK-19 e c- erb-B2) na fração mononuclear do sangue periférico em mulheres com câncer de mama inicial antes, após 3 e 6 meses do início do tratamento (antes, durante e após a quimioterapia adjuvante);c) quimiossensibilidade das células tumorais circulantes utilizando avaliação seriada de forma quantitativa da presença de células tumorais circulantes ao longo do tratamento quimioterápico adjuvante ou neoadjuvante.d) variáveis clínico-patológicas tradicionais (tamanho do tumor, grau histológico, expressão de receptores para estrógeno, progesterona e c-erb-B2, nível de acometimento axilar).[0057] Thus, the prognostic assessment platform according to the present invention, particularly for breast cancer patients, correlates: a) new molecular marker data obtained from the primary tumor (gene profile) in the form of a score (score) with criteria already defined in the literature (Paik et al., 2004); b) information regarding the micrometastatic potential evaluated by the presence of circulating tumor cells by detecting the expression of epithelial markers (CK-19 and c-erb-B2) in the mononuclear fraction of peripheral blood in women with early breast cancer before, after 3 and 6 months of treatment initiation (before, during and after adjuvant chemotherapy); c) chemosensitivity of circulating tumor cells using serial quantitative assessment of the presence of tumor cells circulating during adjuvant or neoadjuvant chemotherapy.d) traditional clinicopathological variables (tumor size, histological grade, expr estrogen, progesterone and c-erb-B2 receptors, level of axillary involvement).

[0058] Embora outras plataformas eficientes estejam disponíveis, aquela de acordo com a presente invenção apresenta vantagens de tempo e custo. Por exemplo, os métodos de acordo com a presente invenção propiciam um custo de 4,6 vezes menor em 1/3 do tempo em relação aquele atualmente disponível no mercado (comparação em relação à plataforma Oncotype, considerando custo estimado em 2012 de cerca de US$ 4000 com obtenção de resultados em 10 dias úteis).[0058] Although other efficient platforms are available, the one according to the present invention has time and cost advantages. For example, the methods according to the present invention provide a cost of 4.6 times lower in 1/3 of the time compared to that currently available on the market (comparison with the Oncotype platform, considering an estimated cost in 2012 of about US $4000 with results in 10 business days).

[0059] A presente invenção contempla ainda um kit laboratorial que compreende pelo menos um iniciador conforme previamente definido e manual de instruções para uso.[0059] The present invention also contemplates a laboratory kit that comprises at least one primer as previously defined and instruction manual for use.

[0060] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitadores. Referência é feita a câncer de mama por facilidade de apresentação, sem impor qualquer limitação além daquelas contidas nas reivindicações anexas.Exemplo 1Tabela 1Conjunto de genes utilizados na presente invenção

Exemplo 2Extração de RNA de material parafinado[0060] The present invention is further illustrated by the following non-limiting examples. Reference is made to breast cancer for ease of presentation, without imposing any limitations other than those contained in the appended claims.Example 1Table 1Set of genes used in the present invention

Example 2 RNA extraction from paraffin material

[0061] Para a extração de RNA de material emblocado, são utilizadas duas secções de 10 μm por bloco, obtidas com o auxílio de um micrótomo. É utilizado RNeasy FFPE kit (Qiagen, cat. no. 74404, Hilden, DE), conforme as instruções do fabricante.[0061] For the extraction of RNA from block material, two sections of 10 μm per block are used, obtained with the aid of a microtome. RNeasy FFPE kit (Qiagen, cat. no. 74404, Hilden, DE) is used as per the manufacturer's instructions.

[0062] O material extraído é quantificado utilizando-se o espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) e analisado quanto a sua integridade utilizando-se o Agilent RNA 6000 series Nano Kit e o Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA).Exemplo 3Transcrição reversa[0062] The extracted material is quantified using the ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) and analyzed for integrity using the Agilent RNA 6000 series Nano Kit and the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc. , Santa Clara, USA).Example 3Reverse transcription

[0063] As amostras de cDNA utilizadas no ensaio de PCR em tempo real serão sintetizadas a partir de 1 μg de RNA total obtido dos tecidos sob estudo, utilizando o kit SuperScriptTM III First - Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen Brasil Ltda., cat.no.18080-051), conforme as instruções do fabricante. Para as reações de amplificação, as amostras de cDNA sintetizadas serão inicialmente diluídas 10 vezes.Exemplo 4PCR em tempo realPerfilamento genético - Reação de amplificação[0063] The cDNA samples used in the real-time PCR assay will be synthesized from 1 μg of total RNA obtained from the tissues under study, using the SuperScriptTM III First kit - Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen Brasil Ltda. , cat.no.18080-051), according to the manufacturer's instructions. For the amplification reactions, the synthesized cDNA samples will be initially diluted 10 times.Example 4PCR in real timeGenetic profiling - Amplification reaction

[0064] Para a reação de amplificação, é utilizado o sistema multiplex Plexor (kit Plexor qPCR System, Promega cat. No. A4011). As reações de PCR em tempo real são realizadas em um termociclador ABI Prism 7300 (Applied Biosystems).[0064] For the amplification reaction, the Plexor multiplex system (Plexor qPCR System kit, Promega cat. No. A4011) is used. Real-time PCR reactions are performed on an ABI Prism 7300 thermal cycler (Applied Biosystems).

[0065] São avaliados 21 genes, sendo 15 genesalvo para o câncer de mama e seis genes constitutivos. Estes genes foram agrupados em duplas, de acordo com o equipamento a ser utilizado para as reações de amplificação e compatibilidade de suas marcações.Exemplo 5Desenho dos primers e amplicons[0065] 21 genes are evaluated, 15 target genes for breast cancer and six constitutive genes. These genes were grouped in pairs, according to the equipment to be used for the amplification reactions and the compatibility of their markings.Example 5Design of primers and amplicons

[0066] Para desenhar primers e amplicons específicos para cada gene alvo deste estudo, foi utilizado o software Plexor ® Primer Design (que pode ser acessado em http://www.promega.com/applications/PCR/qPCR/primer_design. htm).Exemplo 6Análise dos resultados[0066] To design specific primers and amplicons for each target gene of this study, the Plexor ® Primer Design software was used (which can be accessed at http://www.promega.com/applications/PCR/qPCR/primer_design. htm) .Example 6Analysis of results

[0067] A análise da reação de amplificação em tempo real foi realizada com o auxílio do Plexor Data Analysis Software, disponível no site da Promega. Este software permite a interpretação do resultado gerado em reação multiplex (http://www.promega.com/plexorresources/). Exemplo 7 CK-19 e erb-B2[0067] The analysis of the amplification reaction in real time was performed with the aid of the Plexor Data Analysis Software, available on the Promega website. This software allows the interpretation of the result generated in the multiplex reaction (http://www.promega.com/plexorresources/). Example 7 CK-19 and erb-B2

[0068] As reações de PCR em tempo real para avaliação da quimiossensibilidade são realizadas em um termociclador ABI Prism 7300 (Applied Biosystems), utilizando-se primers RT2 qPCR (Super Array Bioscience Corporationr).[0068] Real-time PCR reactions to evaluate chemosensitivity are performed in an ABI Prism 7300 thermocycler (Applied Biosystems), using RT2 qPCR primers (Super Array Bioscience Corporation).

[0069] O seguinte protocolo é usado para estudo dos marcadores propostos: para 25 μl de volume final de reação, serão adicionados 12,5 μl de tampão 2x RT2 Real Time SYBR Green PCR Master Mix, 1,0 μl de DNAc, 1,0 μl de RT2 PCR Primer Assay. O volume é completado utilizando água deionizada. Os tubos são colocados em termociclador no seguinte programa: 950 C, 10 minutos; 40 ciclos de (950 °C, 15 segundos; 600 °C, 60 segundos). Exemplo 8 Métodos estatísticos[0069] The following protocol is used to study the proposed markers: for 25 μl of final reaction volume, 12.5 μl of buffer 2x RT2 Real Time SYBR Green PCR Master Mix, 1.0 μl of cDNA, 1, 0 µl RT2 PCR Primer Assay. The volume is completed using deionized water. The tubes are placed in a thermal cycler in the following program: 950 C, 10 minutes; 40 cycles of (950°C, 15 seconds; 600°C, 60 seconds). Example 8 Statistical Methods

[0070] O escore é analisado de formaquantitativa ou categórica (risco baixo, médio ou alto). A sobrevida global ou sobrevida livre de recidiva foram estudadas por curvas de Kaplan-Meier e modelos de riscos proporcionais de Cox. O programa estatístico foi o R, versão 8.0.[0070] The score is analyzed quantitatively or categorically (low, medium or high risk). Overall survival or recurrence-free survival were studied using Kaplan-Meier curves and Cox proportional hazards models. The statistical program was R, version 8.0.

[0071] Além disso, foram utilizados os testes qui-quadrado e exato de Fisher para relacionar variáveis discretas entre si e o de análise de variância (ANOVA) para avaliar correlações entre variáveis contínuas e discretas entre si. Também foram realizadas análises multivariadas. Os cálculos estatísticos foram realizados com o programa NCCS.Exemplo 9Obtenção de dados de expressão gênica da plataforma de 21 genes e avaliação dos marcadores de quimiossensibilidade e progressão tumoral CK-1919 e HER2[0071] In addition, the chi-square and Fisher's exact tests were used to relate discrete variables to each other and the analysis of variance (ANOVA) to evaluate correlations between continuous and discrete variables with each other. Multivariate analyzes were also performed. Statistical calculations were performed using the NCCS program.Example 9Obtaining gene expression data from the 21-gene platform and evaluating the chemosensitivity and tumor progression markers CK-1919 and HER2

[0072] Foram analisadas amostras biológicas de 167 pacientes, sendo 39 pacientes com carcinoma mamário estadios I, II e III com indicação de quimioterapia adjuvante advindas do Hospital Estadual Mário Covas (Brasil) e 126 pacientes semelhantes incluídas pelo Hospital de Câncer de Barretos (Fundação Pio XII - Brasil). Amostras do tumor e 20mL de sangue periférico foram obtidas na entrada do estudo, após assinatura do termo de consentimento informado.Tabela 2Características clínicas das 167 pacientes analisadas

Tabela 3Características patológicas das amostras tumorais das 167 pacientes analisadas.

Exemplo 10Avaliação da expressão de CK-19 e HER2 no sangue periférico[0072] Biological samples from 167 patients were analyzed, 39 patients with breast carcinoma stages I, II and III with indication for adjuvant chemotherapy from the Mário Covas State Hospital (Brazil) and 126 similar patients included by the Barretos Cancer Hospital (Fundação Pius XII - Brazil). Tumor samples and 20mL of peripheral blood were obtained at study entry, after signing the informed consent form.Table 2Clinical characteristics of the 167 patients analyzed

Table 3Pathological characteristics of tumor samples from the 167 patients analyzed.

Example 10Assessment of CK-19 and HER2 expression in peripheral blood

[0073] As 167 pacientes avaliadas quanto ao perfilamento genético de amostras tumorais também foram avaliadas quanto à expressão dos marcadores de quimiossensibilidade e progressão tumoral CK-19 e HER2 no sangue periférico. A avaliação foi realizada em amostras obtidas ao diagnóstico e após três e seis meses. As pacientes foram diagnosticadas e tratadas no período de fevereiro de 2008 a fevereiro 2012.[0073] The 167 patients evaluated for genetic profiling of tumor samples were also evaluated for the expression of chemosensitivity and tumor progression markers CK-19 and HER2 in peripheral blood. The evaluation was performed on samples obtained at diagnosis and after three and six months. Patients were diagnosed and treated from February 2008 to February 2012.

[0074] Inicialmente, decodificaram-se os valores da expressão de CK-19 e Her2 da fração mononuclear do sangue periférico em positivos e negativos através do estudo da expressão encontrada em 23 controles normais (Tabela 4). Escolheu-se o valor do limite superior do intervalo de confiança de 95% ao redor da Média para ambos CK-19 e Her2. Valores superiores ou iguais ao limite superior do intervalo de confiança ao redor da média do CK- 19 (1.47) e do Her2 (1.10) foram considerados positivos, e os inferiores a estes limites, negativos.Tabela 4Evolução da expressão de CK-19 e de Her2 ao longo do tempo. CK-19 e Her2 (primeira amostra); CK-19 e Her2 (segunda amostra: após 3 meses) e CK-19 e Her2 (terceira amostra: após 6 meses).

[0074] Initially, the values of CK-19 and Her2 expression of the peripheral blood mononuclear fraction were decoded into positive and negative by studying the expression found in 23 normal controls (Table 4). The value of the upper limit of the 95% confidence interval around the Mean was chosen for both CK-19 and Her2. Values greater than or equal to the upper limit of the confidence interval around the mean of CK-19 (1.47) and Her2 (1.10) were considered positive, and those below these limits were considered negative.Table 4 Evolution of CK-19 and of Her2 over time. CK-19 and Her2 (first sample); CK-19 and Her2 (second sample: after 3 months) and CK-19 and Her2 (third sample: after 6 months).

[0075] Enquanto a taxa de positividade da expressão de CK-19 praticamente não se alterou (p = 0.4253) ao longo do tempo, houve significativa diminuição da expressão de Her2 ao longo do tempo (p = 0.0088). É observada correlação significativa entre expressão de CK-19 e Her2 entre si e ao diagnóstico (p = 0.000415).[0075] While the positivity rate of CK-19 expression practically did not change (p = 0.4253) over time, there was a significant decrease in Her2 expression over time (p = 0.0088). A significant correlation is observed between CK-19 and Her2 expression with each other and at diagnosis (p = 0.000415).

[0076] Quando se analisa apenas pacientes que tiveram a primeira amostra de Her2 positiva, observa-se que pacientes que negativaram o Her2 na segunda coleta tenderam a ter ILD superior (p = 0.06579).Exemplo 11Pontuação do perfilamento tumoral[0076] When analyzing only patients who had the first Her2 positive sample, it is observed that patients who were Her2 negative in the second collection tended to have higher ILD (p = 0.06579).Example 11 Tumor profiling score

[0077] Os 21 genes de interesse foram agrupados para amplificação em multiplex no sistema Plexor® de detecção. A normalização dos resultados de expressão dos genes alvo foi realizada utilizando a média da expressão dos cinco genes constitutivos.[0077] The 21 genes of interest were pooled for multiplex amplification in the Plexor® detection system. Normalization of target gene expression results was performed using the average of the expression of the five constitutive genes.

[0078] O estudo da expressão destes genes gerou uma pontuação (escore) que variou de 0 a 100.Tabela 5Estatística descritiva da pontuação na padronização do Perfilamento tumoral.

[0078] The study of the expression of these genes generated a score (score) that ranged from 0 to 100.Table 5 Descriptive statistics of the score in the standardization of Tumor Profiling.

[0079] Analisando a pontuação do perfilamentotumoral como variável continua, observa-se correlação significativa com Intervalo Livre de Doença (p = 0.006538). Observa-se também que pacientes com o quartil superior desta pontuação tiveram sobrevida livre de progressão significativamente menor do que aqueles com valores menores (log Rank p = 0,000471).[0079] Analyzing the tumor profiling score as a continuous variable, a significant correlation with Disease Free Interval (p = 0.006538) is observed. It is also observed that patients with the upper quartile of this score had significantly lower progression-free survival than those with lower values (log Rank p = 0.000471).

[0080] Em pacientes com estadio 2 percebe-se que sua sobrevida livre de recidiva é impactada de forma significativa pela pontuação do perfilamento do quartil superior em comparação com pacientes com estadio 2 e pontuações menores.[0080] In stage 2 patients it is perceived that their relapse-free survival is significantly impacted by the upper quartile profiling score compared to stage 2 patients and lower scores.

[0081] Observa-se também correlação significativa entre ILD e a pontuação do perfilamento tumoral (p = 0.006538) e que a pontuação do perfilamento tumoral se relaciona de forma estatisticamentesignificativa com o intervalo livre de recidiva no modelo como variável independente. Tabela 6 Análise multivariada com o modelo de riscos proporcionais de Cox para Intervalo Livre de Doença (ILD) como variável dependente

Exemplo 12Correlações com resposta a quimioterapia[0081] There is also a significant correlation between ILD and the tumor profiling score (p = 0.006538) and that the tumor profiling score is statistically significantly related to the recurrence-free interval in the model as an independent variable. Table 6 Multivariate analysis with the Cox proportional hazards model for Disease-Free Interval (DLI) as the dependent variable

Example 12Correlations with response to chemotherapy

[0082] Considerando-se apenas 21 casos em que se procedeu à neoadjuvância, classifica-se resposta como a soma de resposta clínica parcial e resposta clínica completa (critérios Recist) e como não resposta as demais ocorrências.Tabela 7Análise Logística de Resposta a Quimioterapia como variável dependente e demais características clínicas e variáveis.

[0082] Considering only 21 cases in which neoadjuvant therapy was performed, response is classified as the sum of partial clinical response and complete clinical response (Recist criteria) and other occurrences as non-response.Table 7 Logistical Analysis of Response to Chemotherapy as a dependent variable and other clinical characteristics and variables.

[0083] Observa-se que há correlação estatisticamente significativa entre resposta à quimioterapia e CK-19, Her2 no momento da inclusão e com pontuação do perfilamento tumoral.[0083] It is observed that there is a statistically significant correlation between response to chemotherapy and CK-19, Her2 at the time of inclusion and with tumor profiling score.

Claims

1. PROGNOSTIC METHOD TO PREDICT THE RECURRENCE OF CANCER IN A PATIENT, which comprises subjecting a patient's tumor sample to the quantitative molecular detection technique characterized by the fact that it consists of using, for amplification reactions, all sets of genes (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, ( viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2 and (xi) SURVININ.

2. METHOD, according to claim 1, characterized by the fact that the tumor sample is fresh, paraffinized or frozen.

3. METHOD, according to claim 1, characterized in that the tumor sample is cut to have a thickness of 8 to 12 μm.

4. METHOD, according to claim 3, characterized in that the tumor sample is cut to have a thickness of about 10 μm.

5. METHOD, according to claim 1, characterized in that the number of cuts used is from 5 to 15.

6. METHOD, according to claim 5, characterized in that the number of cuts used is about 10.

7. PROGNOSTIC METHOD TO PREDICT THE RECURRENCE OF CANCER IN A PATIENT characterized in that it comprises subjecting the patient's peripheral blood to the quantitative molecular detection technique using, for amplification reactions, primers for epithelial antigens CK-19 and/or CERB-B2 .

8. METHOD, according to one of claims 1 or 7, characterized in that the quantitative molecular detection technique is real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

9. METHOD, according to claim 7, characterized in that it comprises associating the results obtained with the results of the method defined in claim 1 to obtain a risk scale.

10. METHOD, according to claim 1, characterized in that it comprises associating the results obtained with the results of the method defined in claim 7 to obtain a risk scale.

11. METHOD, according to one of claims 1 to 10, characterized by the fact that the cancer is breast or prostate cancer.

12. USE OF GENE SETS characterized by the fact that it is a prognostic method to predict the recurrence of cancer in a patient, which consists of using, for amplification reactions, all sets of genes (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0 , (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2 and (xi) SURVININ.

13. USE OF EPITHELIAL ANTIGENS CK-19 AND/OR CEB-B2 characterized by the fact that it is in a prognostic method to predict the recurrence of cancer from the peripheral blood of a patient.

14. USE OF A PRIMER characterized in that it is defined by one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 38 in a prognostic method for predicting recurrence of cancer in a patient.

15. USE, according to claim 14, characterized in that the sense primers include a 5-methyl-isocytosine (iso-dC) residue at the 5' end.

16. USE, according to claim 15, characterized in that the sense primers include one or more fluorophore labels at the 5' end, which are emitted at a wavelength ranging between 100 and 800 nm.

17. USE OF AN AMPLICON characterized in that it is defined by one of SEQ ID NO: 39 to SEQ ID NO: 57 in a prognostic method for predicting recurrence of cancer in a patient.

18. METHOD TO PREDICT THE SURVIVAL TIME OF A PATIENT WITH BREAST CANCER WITHOUT RECURRENCE characterized by the fact that it comprises: (a) subjecting a patient's tumor sample to the quantitative molecular detection technique that consists of using, for amplification reactions, all gene sets (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1 , (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2 and (xi) SURVININ; (b) subject peripheral blood of the patient to the quantitative molecular detection technique using, for amplification reactions, the CK-19 and/or CERB-B2 genes; (c) correlate the data obtained in (a) and (b) to obtain a risk scale.

19. PROGNOSTIC MODEL TO PREDICT THE SURVIVAL TIME OF A BREAST CANCER PATIENT WITHOUT RECURRENCE characterized by the fact that it comprises at least: (a) subjecting a tumor sample from the patient to the quantitative molecular detection technique that consists of using, for of amplification, all gene sets (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2 and (xi) SURVININ; (b) subjecting the patient's peripheral blood to the molecular detection technique quantitative using, for amplification reactions, the CK-19 and/or CERB-B2 genes; (c) correlate the data obtained in (a) and (b) to obtain a risk scale.

20. METHOD OF OBTAINING DATA FOR TARGETING THE TREATMENT OF BREAST CANCER characterized by the fact that it comprises at least: (a) subjecting a patient's tumor sample to the quantitative molecular detection technique that consists of using, for amplification reactions, all the gene sets (i) GAPDH + KI-67, (ii) SCUBE2 + BETA-ACTIN, (iii) TRFC + CCNB1, (iv) GUSB + MMP11, (v) ER + PGR, (vi) BAG1 + GSTM1, (vii) BCL2 + STK15, (viii) MYBL2 + RPLP0, (ix) CD68 + CTSL2, (x) GRB7 + HER2 and (xi) SURVININ; (b) subject peripheral blood of the patient to the quantitative molecular detection technique using, for amplification reactions, the CK-19 and/or CERB-B2 genes; (c) correlate the data obtained in (a) and (b) to obtain a risk scale.