BR102013026558B1

BR102013026558B1 - Use of metal complexes with indole or oxindolic ligands and their imine derivatives as antiparasitic agents

Info

Publication number: BR102013026558B1
Application number: BR102013026558-6A
Authority: BR
Inventors: Ana Maria Da Costa Ferreira; Gustavo Levendoski Sabino; Queite Antônia De Paula; Ricardo Alexandre Alves De Couto; Bruno Soares Dario; Leda Quercia Vieira; Grazielle Alves Ribeiro
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg; Universidade De São Paulo - Usp
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2022-01-25
Also published as: BR102013026558A2

Abstract

COMPLEXOS METÁLICOS COM LIGANTES INDÓLICOS OU OXINDÓLICOS E SEUS DERIVADOS IMÍNICOS E SEU USO COMO AGENTES ANTIPARASITÁRIOS. A presente invenção se refere a complexos metálicos com ligantes indólicos ou oxindólicos e seus derivados imínicos, bem como seu uso como principio ativo no preparo de uma composição farmacêutica para uso humano e/ou veterinário para tratamento de parasitoses, mais especificamente, Leishmania e Trypanossoma cruzi, agentes causadores da leishmaniose e da doença de Chagas.METALLIC COMPLEXS WITH INDOLE OR OXINDOLIC LIGENDERS AND THEIR IMINE DERIVATIVES AND THEIR USE AS ANTIPARSITARY AGENTS. The present invention refers to metal complexes with indole or oxindolic ligands and their imine derivatives, as well as their use as an active ingredient in the preparation of a pharmaceutical composition for human and/or veterinary use for the treatment of parasitic diseases, more specifically, Leishmania and Trypanosoma cruzi. , causative agents of leishmaniasis and Chagas disease.

Description

Field of invention:

[1] A presente invenção se refere a complexos metálicos com ligantes indólicos ou oxindólicos e seus derivados imínicos, bem como seu uso como princípio ativo no preparo de uma composição farmacêutica para uso humano e/ou veterinário para tratamento de parasitoses, mais especificamente, Leishmania e Trypanossoma cruzi, agentes causadores da leishmaniose e da doença de Chagas.[1] The present invention refers to metal complexes with indole or oxindolic ligands and their imine derivatives, as well as their use as an active ingredient in the preparation of a pharmaceutical composition for human and/or veterinary use for the treatment of parasitic diseases, more specifically, Leishmania and Trypanosoma cruzi, causative agents of leishmaniasis and Chagas disease.

Basics of the technique:

[2] A doença de Chagas é uma antropozoonose causada pelo protozoário Trypanosoma (Schyzotrypanum) cruzi. Por ser uma doença negligenciada, constitui um problema sério de saúde pública em muitos países.[2] Chagas disease is an anthropozoonosis caused by the protozoan Trypanosoma (Schyzotrypanum) cruzi. As a neglected disease, it constitutes a serious public health problem in many countries.

[3] Se o tratamento for iniciado imediatamente após a infecção, a doença de Chagas é uma doença curável. No entanto, cerca de 30% dos pacientes cronicamente infectados desenvolvem alterações cardíacas e destes, cerca de 10% podem desenvolver alterações digestivas e/ou neurológicas. A doença é provocada em humanos por infecção da derme ou da mucosa conjuntiva por parasitas flagelados na forma tripomastigota, transmitidos por insetos triatomíneos, sugadores de sangue.[3] If treatment is started immediately after infection, Chagas disease is a curable disease. However, about 30% of chronically infected patients develop cardiac alterations and of these, about 10% can develop digestive and/or neurological alterations. The disease is caused in humans by infection of the dermis or conjunctival mucosa by parasites flagellated in the trypomastigote form, transmitted by blood-sucking triatomine insects.

[4] Alternativamente, pode ser transmitida por transfusão de sangue contaminado, transmissão congênita, acidente em laboratório, transplante de órgãos ou via oral.[4] Alternatively, it can be transmitted by contaminated blood transfusion, congenital transmission, laboratory accident, organ transplantation, or oral route.

[5] Se não devidamente tratada, a doença de Chagas evolui da fase aguda para uma fase crônica, causando cardiopatias graves, usualmente letais. Os tripomastigotas invadem as células do hospedeiro, onde se transformam em amastigotas (forma intracelular) e se reproduzem assexuadamente, infectando outros órgãos e tecidos. No vetor, o parasita está presente como epimastigotas.[5] If not properly treated, Chagas disease progresses from the acute phase to a chronic phase, causing severe, usually lethal, heart disease. Trypomastigotes invade host cells, where they transform into amastigotes (intracellular form) and reproduce asexually, infecting other organs and tissues. In the vector, the parasite is present as epimastigotes.

[6] A Leishmania, por sua vez, é também transmitida por picada de inseto e causada por mais de 20 espécies de protozoários (dentre eles L. major, L. amazonensis, L. donovani e L. chagasi, outros), que causam desde infecções cutâneas até a forma visceral, usualmente letal.[6] Leishmania, in turn, is also transmitted by insect bites and caused by more than 20 species of protozoa (among them L. major, L. amazonensis, L. donovani and L. chagasi, others), which cause from skin infections to the usually lethal visceral form.

[7] Dentre os alvos biológicos promissores para o desenvolvimento de drogas mais eficientes, são citadas as enzimas topoisomerases e a síntese da tripanotiona, a partir de glutationa e espermidina nos tripanossomatídeos.[7] Among the promising biological targets for the development of more efficient drugs are topoisomerase enzymes and the synthesis of trypanothione from glutathione and spermidine in trypanosomatids.

[8] A quimioterapia específica para doença de Chagas foi estabelecida há pelo menos 3 décadas atrás. Os medicamentos em uso, benzonidazol ou nifurtimox, são eficazes apenas na fase aguda da doença.[8] Specific chemotherapy for Chagas disease was established at least 3 decades ago. The drugs in use, benznidazole or nifurtimox, are effective only in the acute phase of the disease.

[9] Assim, é imprescindível o desenvolvimento de novos fármacos, baseados em estudos mais recentes sobre a doença, que tenham ação não apenas na fase aguda, mas também na fase crônica.[9] Thus, it is essential to develop new drugs, based on more recent studies on the disease, which act not only in the acute phase, but also in the chronic phase.

[10] Avanços no conhecimento da proteômica, bioquímica e biologia, levaram à elucidação de etapas biossintéticas e de enzimas cruciais para a sobrevivência e desenvolvimento dos parasitas.[10] Advances in the knowledge of proteomics, biochemistry and biology have led to the elucidation of biosynthetic steps and enzymes crucial for the survival and development of parasites.

[11] Com isso, os alvos biológicos para novos medicamentos em estudo incluíram também inibidores da biossíntese de poliaminas e do metabolismo do esterol, além de enzimas específicas do parasita (topoisomerases, transialidases, prolina racemase, cruzaína, tripanotiona redutase, cisteína proteinase, hipoxantina-guanina fosforribosil-transferase, di-hidrofolato redutase e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, por exemplo). Tripanossomatídeos apresentam um metabolismo peculiar de tióis baseado na tripanotiona, que providencia elétrons para a síntese de precursores do DNA.[11] Thus, the biological targets for new drugs under study also included inhibitors of polyamine biosynthesis and sterol metabolism, in addition to parasite-specific enzymes (topoisomerases, transialidases, proline racemase, cruzain, trypanothione reductase, cysteine proteinase, hypoxanthine -guanine phosphoribosyl transferase, dihydrofolate reductase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, for example). Trypanosomatids have a peculiar metabolism of thiols based on trypanothione, which provides electrons for the synthesis of DNA precursors.

[12] As topoisomerases são enzimas largamente distribuídas em organismos vivos (incluindo humanos e parasitas) que catalisam modificações na topologia do DNA durante os processos de replicação, transcrição, recombinação, reparo, formação de cromatina e segregação microssomal.[12] Topoisomerases are enzymes widely distributed in living organisms (including humans and parasites) that catalyze changes in DNA topology during replication, transcription, recombination, repair, chromatin formation and microsomal segregation.

[13] As topoisomerases promovem a quebra e religação das fitas do DNA.[13] Topisomerases promote DNA strand breakage and reassembly.

[14] Em humanos há dois tipos dessas enzimas, as topoisomerases I e II, sendo a do tipo I constituída de 765 aminoácidos e apresentando 4 domínios: o sítio N-terminal, o caroço, o linker e o e-terminal. Essas proteínas formam um complexo com o DNA e, em geral, seus inibidores se ligam ao DNA, à proteína ou ao complexo proteína-DNA.[14] In humans, there are two types of these enzymes, topoisomerases I and II, with type I consisting of 765 amino acids and presenting 4 domains: the N-terminal site, the core, the linker and the e-terminal. These proteins form a complex with DNA and, in general, their inhibitors bind to the DNA, protein, or protein-DNA complex.

[15] A habilidade inibitória dos complexos metálicos estudados sobre a topoisomerase IB humana já foi verificada. Seu mecanismo de ação parece se concentrar em inibir a etapa de quebra das fitas do DNA. Esses complexos parecem ligar- se à proteína topo, impedindo, assim, sua interação com o DNA.[15] The inhibitory ability of the studied metal complexes on human topoisomerase IB has already been verified. Its mechanism of action seems to focus on inhibiting the DNA strand break step. These complexes appear to bind to the topo protein, thus preventing its interaction with DNA.

[16] Ao incubar os complexos com a proteína, antes da adição do DNA, acelera e amplifica o processo, quando comparado a experimentos em que os complexos- são 30 adicionados ao aduto proteína-DNA já formado.[16] Incubating the complexes with the protein, prior to the addition of DNA, accelerates and amplifies the process, when compared to experiments in which the complexes are added to the already formed protein-DNA adduct.

[17] Poucas drogas baseadas em íons metálicos foram reportadas como possíveis agentes anti-tripanossomíase ou anti-leishmaniose. Compostos de ouro, paládio e platina com ligantes sulfurados já foram testados contra T. cruzi, atuando como agentes intercaladores no DNA ou inibindo enzimas específicas do parasita.[17] Few metal ion-based drugs have been reported as possible anti-trypanosomiasis or anti-leishmaniasis agents. Gold, palladium and platinum compounds with sulfur ligands have already been tested against T. cruzi, acting as DNA intercalating agents or inhibiting specific enzymes of the parasite.

[18] Compostos de vanádio (IV) também já foram estudados como possíveis agentes anti-tripanossoma. Dentre os compostos relatados com atividade contra Leishmania, têm-se compostos de antimônio (V) e compostos orgânicos não- metalados, como anfotericina, glucantina e pentostam. Para os complexos de antimônio, um alvo importante parece 'ser a tripanotiona redutase de L. infantum.[18] Vanadium (IV) compounds have also been studied as possible anti-trypanosome agents. Among the compounds reported with activity against Leishmania, there are antimony (V) compounds and non-metallated organic compounds, such as amphotericin, glucantin and pentostam. For antimony complexes, an important target appears to be trypanothione reductase from L. infantum.

[19] Complexos metálicos apresentando ligantes indólicos ou oxindólicos ainda não foram reportados como agentes antiparasitários.[19] Metal complexes with indole or oxindole ligands have not yet been reported as antiparasitic agents.

[20] Compostos indólicos não-metalados já foram reportados como ativos contra agentes patogênicos de doenças tropicais como a malária, a doença de Chagas, a leishmaniose e a 20 tripanossomíase africana humana.[20] Non-metallated indole compounds have been reported to be active against pathogens of tropical diseases such as malaria, Chagas disease, leishmaniasis and human African trypanosomiasis.

[21] Diversos complexos de cobre com outros ligantes já foram testados e relatados na literatura, tais como os complexos denominados casiopeínas, de fórmula geral [Cu(N\N)(O\O)]NO3 ou [Cu (N\N) (O\N)]NO3, com ligantes mistos 25 do tipo diiminas aromáticas, em que N\N é fenantrolina ou bipiridina e O\N é a-aminoacidatos ou peptídeos. Outro estudo focaliza complexos metálicos mononucleares com ligantes derivados de sulfonamidas, de fórmula geral [L2 (M) •2H20], onde M = Co, Cu, Zn, Ni ou Mn, os quais se 30 mostraram letais para tripomastigotos de T. cruzi e reduziram a proliferação de epimastigotos.[21] Several copper complexes with other ligands have already been tested and reported in the literature, such as the complexes called casiopeins, with the general formula [Cu(N\N)(O\O)]NO3 or [Cu (N\N) (O\N)]NO3, with mixed ligands of the aromatic diimine type, where N\N is phenanthroline or bipyridine and O\N is a-aminoacidates or peptides. Another study focuses on mononuclear metal complexes with ligands derived from sulfonamides, with the general formula [L2 (M) •2H20], where M = Co, Cu, Zn, Ni or Mn, which proved to be lethal to trypomastigotes of T. cruzi and reduced the proliferation of epimastigotes.

[22] No caso de Leishmania, um estudo com complexos de cobre e ligantes acetilacetonatos mostrou atividade destes compostos frente à forma promastigotas de L. amazonensis. Estes compostos também inibiram a atividade de tripanotiona redutase de T. cruzi.[22] In the case of Leishmania, a study with copper complexes and acetylacetonate ligands showed activity of these compounds against the promastigote form of L. amazonensis. These compounds also inhibited the trypanothione reductase activity of T. cruzi.

[23] Complexos de cobre com derivados tiosemicarbazonas também apresentaram atividade frente a L. amazonensis, mostrando inibição praticamente completa da proliferação da forma promastigota. Ainda, complexos de cobre e zinco com ligantes sulfonamidas derivados de 8-aminoquinolina foram testados quanto a sua atividade antiprotozoária.[23] Copper complexes with thiosemicarbazone derivatives also showed activity against L. amazonensis, showing practically complete inhibition of the proliferation of the promastigote form. Furthermore, copper and zinc complexes with sulfonamide ligands derived from 8-aminoquinoline were tested for their antiprotozoal activity.

[24] Testes in vitro contra formas promastigotas de L. braziliensis e L. chagasi e a forma epimastigota de T.cruzi mostraram valores de IC50 bastante baixos. Por outro lado, os ligantes não-metalados mostraram-se inativos. Complexos de cobre (II) e de ouro (I) com os ligantes clotrimazol e cetoconazol já haviam sido estudados há algum tempo, como potenciais agentes anti-tripanossoma frente a epimastigotos, apresentando um percentual de inibição da proliferação do parasita bem maior que a apresentada pelos ligantes.[24] In vitro tests against promastigote forms of L. braziliensis and L. chagasi and the epimastigote form of T. cruzi showed very low IC50 values. On the other hand, non-metallic ligands were inactive. Copper (II) and gold (I) complexes with clotrimazole and ketoconazole ligands had already been studied for some time as potential anti-trypanosome agents against epimastigotes, showing a much higher percentage of inhibition of parasite proliferation than that presented. by the binders.

[25] Complexos de cobre com triazol-pirimidinas também foram avaliados em suas atividades anti-parasitárias frente a T. cruzi e L. (Viannia) peruviana e, no caso de T. cruzi, a transformação de tripomastigotos foi fortemente inibida. Assim, em vista da necessidade mostrada no estado da técnica, a presente invenção propõe o uso de complexos metálicos com ligantes indólicos ou oxindólicos, bem como os seus derivados imínicos, como um princípio ativo no preparo de produtos farmacêuticos de uso humano e/ou veterinário para tratamento de parasitoses, mais especificamente, Leishmania e Trypanossoma cruzi, agentes causadores da leishmaniose e da doença de Chagas.[25] Copper complexes with triazole-pyrimidines were also evaluated for their anti-parasitic activities against T. cruzi and L. (Viannia) peruviana and, in the case of T. cruzi, the transformation of trypomastigotes was strongly inhibited. Thus, in view of the need shown in the state of the art, the present invention proposes the use of metal complexes with indole or oxindolic ligands, as well as their imine derivatives, as an active principle in the preparation of pharmaceutical products for human and/or veterinary use. for the treatment of parasitic diseases, more specifically, Leishmania and Trypanosoma cruzi, causative agents of leishmaniasis and Chagas disease.

State of the Technique:

[26] O documento de anterioridade US 2010/0055201 Al se refere a compostos orgânicos contendo dois grupos indolil e seus derivados para tratamento de doenças causada? Por protozoários em mamíferos e pássaros. Os compostos citados, além de apresentarem dois grupamentos indólicos, apresentam mecanismo de ação através de apoptose provocada por estresse do retículo endoplasmático (diferentemente dos compostos ora descritos na presente invenção, os quais induzem apoptose através de danos no DNA e nas mitocôndrias).[26] Does the prior art document US 2010/0055201 Al refer to organic compounds containing two indolyl groups and their derivatives for the treatment of diseases caused? By protozoa in mammals and birds. The aforementioned compounds, in addition to having two indole groups, present a mechanism of action through apoptosis caused by endoplasmic reticulum stress (unlike the compounds described in the present invention, which induce apoptosis through DNA and mitochondrial damage).

[27] No documento WO 02/24685 Al, compostos derivad9s de indóis com substituintes tanto nos anéis aromáticos quanto no N do anel de 5 membros são descritos. As sínteses partem de derivados do indol, porém não são mencionados complexos metálicos.[27] In WO 02/24685 A1, compounds derived from indoles with substituents on both the aromatic rings and the N of the 5-membered ring are described. The syntheses start from indole derivatives, but metal complexes are not mentioned.

[28] O pedido BR PI 0600985-9A descreve o uso de derivados imínicos de oxindóis e indóis, bem como seus correspondentes complexos metálicos, os quais atuam como agentes de desacoplamento, desacoplando a síntese do ATP da respiração mitocondrial, apresentando, assim, uma atividade antitumoral.[28] BR PI 0600985-9A describes the use of imine derivatives of oxindoles and indoles, as well as their corresponding metal complexes, which act as uncoupling agents, uncoupling ATP synthesis from mitochondrial respiration, thus presenting a antitumor activity.

Brief description of the invention:

[29] A presente invenção se refere a complexos metálicos com ligantes indólicos ou oxindólicos e seus derivados imínicos, bem como seu uso como princípio ativo no preparo de uma composição farmacêutica para uso humano e/ou veterinário para tratamento de parasitoses, mais especificamente, Leishmania e Trypanossoma cruzi, agentes causadores da leishmaniose e da doença de Chagas.[29] The present invention refers to metal complexes with indole or oxindolic ligands and their imine derivatives, as well as their use as an active ingredient in the preparation of a pharmaceutical composition for human and/or veterinary use for the treatment of parasitic diseases, more specifically, Leishmania and Trypanosoma cruzi, causative agents of leishmaniasis and Chagas disease.

Brief description of figures:

[30] As Figuras lA, lB, lC e lD representam o esquema dos complexos mais ativos frente a T. cruzi, respectivamente, [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)] (ClO4); [Zn(isaepy)Cl2].[30] Figures lA, lB, lC and lD represent the scheme of the most active complexes against T. cruzi, respectively, [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)] (ClO4); [Zn(isaepy)Cl2].

[31] As Figuras 2A e 28 são gráficos que representam a viabilidade de macrófagos frente a complexos de cobre ou zinco com ligantes oxindolimínicos após 24 e 48h, em que [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)] (ClO4); [Zn(isaepy)Cl2] estão representados, respectivamente, por A, B, C e D.[31] Figures 2A and 28 are graphs depicting macrophage viability against copper or zinc complexes with oxindoliminic ligands after 24 and 48h, where [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)] (ClO4); [Zn(isaepy)Cl2] are represented, respectively, by A, B, C and D.

[32] As Figuras 3A e 3B são gráficos que representam toxicidade de complexos de cobre ou zinco com ligantes oxindolimínicos frente a tripamastigotas após 24 e 48h, em que [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)] (ClO4); [Zn(isaepy)Cl2] estão representados, respectivamente, por A, B, C e D.[32] Figures 3A and 3B are graphs depicting toxicity of copper or zinc complexes with oxindoliminic ligands against trypamastigotes after 24 and 48h, where [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)] (ClO4); [Zn(isaepy)Cl2] are represented, respectively, by A, B, C and D.

[33] As Figuras 4A e 48 são gráficos que representam a análise da inibição da proliferação de amastigotas pela quantidade total de macrófagos, utilizando compostos de cobre (II) ou de zinco (II) em 48 horas, em que A e G são o controle; B e C são [Cu(isapn)]+2 em diferentes concentrações; D e E são [Cu(isaepy)2]+2 em diferentesconcentrações; F e N são benznidazol; H, I e J são [Zn(isapn)]+ em diferentes concentrações; K, L e M são [Zn(isaepy)Cl2] em diferentes concentrações.[33] Figures 4A and 48 are graphs depicting the analysis of the inhibition of amastigote proliferation by the total number of macrophages, using copper (II) or zinc (II) compounds in 48 hours, where A and G are the control; B and C are [Cu(isapn)]+2 at different concentrations; D and E are [Cu(isaepy)2]+2 in different concentrations; F and N are benznidazole; H, I and J are [Zn(isapn)]+ at different concentrations; K, L and M are [Zn(isaepy)Cl2] at different concentrations.

[34] As Figuras 5A e 5B são gráficos que representam a análise da quantidade de amastigotas, em presença dos complexos de cobre ou de zinco, pela quantidade total de macrófagos, sendo esta quantidade total expressa !pelos 5 macrófagos infectados/quantidade total de macrófagos (infectados e não infectados) em 24 e 48h, respectivamente, em que A é o controle; B e C são [Cu(isapn)]+2 em diferentes concentrações; D e E são [Cu(isaepy)2]+2 em diferentes concentrações;; F, G e H, são [Zn(isapn)]+ em diferentes concentrações; I, J e K são [Zn(isaepy)Cl2] em diferentes concentrações e L é benznidazol.[34] Figures 5A and 5B are graphs that represent the analysis of the amount of amastigotes, in the presence of copper or zinc complexes, by the total amount of macrophages, this total amount being expressed by the 5 infected macrophages/total amount of macrophages (infected and uninfected) at 24 and 48h, respectively, where A is the control; B and C are [Cu(isapn)]+2 at different concentrations; D and E are [Cu(isaepy)2]+2 at different concentrations;; F, G and H, are [Zn(isapn)]+ at different concentrations; I, J and K are [Zn(isaepy)Cl2] at different concentrations and L is benznidazole.

Detailed description of the invention:

[35] Esta invenção se refere a complexos metálicos com ligantes indólicos ou oxindólicos, em especial com íons de metais essenciais como cobre e zinco, bem como os seus derivados imínicos, para uso como princípio ativo no preparo de uma composição farmacêutica para tratamento de parasitoses, mais especificamente, Leishmania e Trypanossoma cruzi, agentes causadores da leishmaniose e da doença de Chagas.[35] This invention relates to metal complexes with indole or oxindolic ligands, in particular with ions of essential metals such as copper and zinc, as well as their imine derivatives, for use as an active ingredient in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of parasitic diseases. , more specifically, Leishmania and Trypanosoma cruzi, causative agents of leishmaniasis and Chagas disease.

[36] Os compostos ligantes são obtidos em solução, através de etapas de condensação entre precursores adequados, e depois são submetidos à etapa de metalação, tanto na forma isolada como in situ, sendo os complexos resultantes isolados na forma sólida. Os ligantes imínicos apresentam propriedades coordenantes e podem também ser isolados na forma livre, no estado sólido. As espécies complexas metal- ligante isoladas apresentam diferentes estruturas, dependendo se o ligante é bi-, tri- ou tetradentado, e da natureza do íon metálico central.[36] The binding compounds are obtained in solution, through condensation steps between suitable precursors, and then are subjected to the metallation step, both in isolated and in situ form, and the resulting complexes are isolated in solid form. Iminic ligands have coordinating properties and can also be isolated in the free form, in the solid state. The isolated metal-ligand complex species present different structures, depending on whether the ligand is bi-, tri- or tetradentate, and on the nature of the central metal ion.

[37] Em urna modalidade preferida da invenção, os compostos são selecionados dentre: [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)](ClO4); e [Zn(isaepy)Cl2].[37] In a preferred embodiment of the invention, the compounds are selected from: [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)](ClO4); and [Zn(isaepy)Cl2].

[38] Todas as espécies foram caracterizadas por técnicas espectroscópicas: UV/Vis, infravermelha, RMN (no caso de zinco) e EPR (no caso de cobre).[38] All species were characterized by spectroscopic techniques: UV/Vis, infrared, NMR (in the case of zinc) and EPR (in the case of copper).

[39] Técnicas termogravimétricas também foram utilizadas, além de análise elementar e medidas de condutividade.[39] Thermogravimetric techniques were also used, in addition to elemental analysis and conductivity measurements.

[40] Os compostos são utilizados comoo princípio ativo no preparo de urna composição farmacêutica para uso humano e/ou veterinário no tratamento de parasitoses.[40] The compounds are used as the active ingredient in the preparation of a pharmaceutical composition for human and/or veterinary use in the treatment of parasites.

[41] As composições farmacêuticas compreendem os compostos em quantidades padronizadas, em sua forma isolada ou em combinações, associados a excipientes farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a forma de apresentação desejada.[41] Pharmaceutical compositions comprise the compounds in standardized amounts, in their isolated form or in combinations, associated with pharmaceutically acceptable excipients according to the desired presentation form.

[42] As referidas composições farmacêuticas são úteis no tratamento de parasitoses, mais especificamente, Leishmania e Trypanossoma cruzi, agentes causadores da leishmaniose e da doença de Chagas.[42] Said pharmaceutical compositions are useful in the treatment of parasitic diseases, more specifically, Leishmania and Trypanosoma cruzi, causative agents of leishmaniasis and Chagas' disease.

[43] Os testes biológicos foram realizados frente a T. Cruzi, verificando-se curvas de sua toxicidade em culturas 25 de macrófagos e de parasitas nas formas tripornastigotas e amastigotas. Os ligantes livres (não-metalados) mostraram- se inativos ou pouco ativos.[43] Biological tests were performed against T. Cruzi, verifying curves of its toxicity in cultures 25 of macrophages and parasites in the trypornastigote and amastigote forms. Free (non-metallated) ligands were shown to be inactive or not very active.

[44] A aplicação farmacológica dos ligantes indólicos, oxindólicos e seus derivados imínicos e correspondentes 30 complexos metálicos, corno agentes antiparasitários foi determinada a partir de testes de avaliação in vitro frente às formas tripomastigotas e amastigotas do T. cruzi.[44] The pharmacological application of indole, oxindolic ligands and their imine derivatives and corresponding metal complexes as antiparasitic agents was determined from in vitro evaluation tests against trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi.

[45] Testes-controle com macrófagos sadios também foram realizados, indicando toxicidade muito inferior dos 5 compostos testados, em comparação com os resultados contra os parasitas nas duas formas testadas.[45] Control tests with healthy macrophages were also performed, indicating much lower toxicity of the 5 compounds tested, compared to the results against parasites in the two tested forms.

a) Maintenance of parasites and LLCMK2 cells:

[46] As formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y) foram obtidas por infecção de células LLCMK2, em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino a 37oC e 5% de CO2.[46] Trypanosoma cruzi trypomastigote forms (Y strain) were obtained by infection of LLCMK2 cells in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37oC and 5% CO2.

[47] As células foram obtidas por repiques sucessivos utilizando tripsina, em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino a 37oC e 5% de CO2.[47] Cells were obtained by successive subcultures using trypsin, in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37oC and 5% CO2.

[48] As formas tripomastigotas de T. cruzi foram obtidas do sobrenadante de culturas de células (células epiteliais de rim de macaco Rhesus) infectadas pelo parasito.[48] Trypomastigote forms of T. cruzi were obtained from the supernatant of cell cultures (Rhesus monkey kidney epithelial cells) infected by the parasite.

[49] As células foram cultivadas em frascos de cultura de tecido de 75 cm2 em meio DMEM suplementado com 2% de soro fetal bovino (SFB), 3,7 mg/L de bicarbonato de sódio e 2,0 mg/L de Hepes.[49] Cells were grown in 75 cm2 tissue culture flasks in DMEM medium supplemented with 2% fetal bovine serum (FBS), 3.7 mg/L sodium bicarbonate and 2.0 mg/L Hepes .

[50] Após adesão e formação de uma monocamada celular, as células foram infectadas com 5x106 tripomastigotas e mantidas a 37°C em estufa de CO2.[50] After adhesion and formation of a cell monolayer, cells were infected with 5x10 6 trypomastigotes and kept at 37°C in a CO2 oven.

[51] Após 48 horas, as células foram lavadas para a remoção dos parasitos extracelulares e o meio de cultura, trocado a cada dois dias. Após sete dias de infecção, formas tripomastigotas, liberadas das células infectadas, foram coletadas no sobrenadante, purificadas, quantificadas e utilizadas nos ensaios de infecção.[51] After 48 hours, the cells were washed to remove extracellular parasites and the culture medium was changed every two days. After seven days of infection, trypomastigote forms, released from the infected cells, were collected in the supernatant, purified, quantified and used in the infection assays.

b) Compounds used and sample preparation:

[52] Quatro compostos metálicos (Figuras lA, lB, lC e 1D) foram utilizados neste estudo: [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)](ClO4); e [Zn(isaepy)Cl2].[52] Four metallic compounds (Figures 1A, 1B, 1C and 1D) were used in this study: [Cu(isapn)](ClO4)2; [Cu(isaepy)2](ClO4)2; [Zn(isapn)](ClO4); and [Zn(isaepy)Cl2].

[53] Estes compostos foram planejados de modo a interagir eficientemente com biomoléculas importantes para a manutenção do ciclo celular (ácidos nucleicos, mitocôndria, proteínas responsáveis por processos de replicação e transcrição do DNA, dentre outros).[53] These compounds were designed to efficiently interact with important biomolecules for the maintenance of the cell cycle (nucleic acids, mitochondria, proteins responsible for DNA replication and transcription processes, among others).

[54] Os ligantes utilizados têm estruturas semelhantes a metabólitos encontrados em fluidos humanos, sendo, assim facilmente reconhecidos fisiologicamente. A coordenação de um íon metálico confere carga às moléculas ativas, facilitando sua permeação através de membranas celulares e interação com grupos iônicos em proteínas e ácidos nucleicos.[54] The ligands used have structures similar to metabolites found in human fluids, thus being easily recognized physiologically. Coordination of a metal ion gives charge to active molecules, facilitating their permeation through cell membranes and interaction with ionic groups in proteins and nucleic acids.

[55] As soluções estoque foram previamente preparadas, quando 5 mg de compostos foram dissolvidos em 1 mL de DMSO, individualmente, em tubos de polipropileno de fundo cônico com capacidade de 1,5 ml e dissolvidos em dimetilsulfóxido 100% (DMSO).[55] Stock solutions were previously prepared, when 5 mg of compounds were dissolved in 1 mL of DMSO, individually, in 1.5 mL conical-bottomed polypropylene tubes and dissolved in 100% dimethyl sulfoxide (DMSO).

[56] Posteriormente, adicionou-se "Meio de Eagle modificado por Dulbecco" (DMEM) para obter as concentrações previamente selecionadas dos compostos. O meio DMEM possui 34 diferentes componentes, dentre aminoácidos, açúcares, vitaminas e sais, fundamentais para atender as necessidades básicas da célula.[56] Subsequently, "Dulbecco's Modified Eagle Medium" (DMEM) was added to obtain previously selected concentrations of compounds. The DMEM medium has 34 different components, including amino acids, sugars, vitamins and salts, essential to meet the basic needs of the cell.

e) Viability test in peritoneal macrophages:

[57] Camundongos C57BL/6 foram estimulados com tioglicolato 3%, três dias antes da obtenção dos macrófagos peritoneais. Para verificar o efeito dos compostos sobre a viabilidade dos macrófagos, foi realizado um ensaio com MTT [brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazoli)-2,5-difenil-2H- tetrazólio].[57] C57BL/6 mice were stimulated with 3% thioglycolate three days before obtaining peritoneal macrophages. To verify the effect of the compounds on macrophage viability, an MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] assay was performed.

[58] O princípio deste método consiste na absorção do sal MTT pelas células, sendo reduzido na mitocôndria a um 10 produto chamado formazan. Este produto, acumulado dentro da célula, é extraído através da adição do solvente DMSO.[58] The principle of this method consists in the absorption of the MTT salt by the cells, being reduced in the mitochondria to a product called formazan. This product, accumulated inside the cell, is extracted by adding the DMSO solvent.

[59] A quantificação da redução de MTT estabelece um método colorimétrico capaz de avaliar a viabilidade celular, pois indica a atividade da enzima succinatodesidrogenase presente nas mitocôndrias celulares.[59] The quantification of MTT reduction establishes a colorimetric method capable of evaluating cell viability, as it indicates the activity of the succinate dehydrogenase enzyme present in cellular mitochondria.

[60] Os cristais de formazan dissolvidos com DMSO absorvem na região do visível, sendo assim quantificados: por espectrofotometria. Foram plaqueadas 2x105células em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços.[60] The formazan crystals dissolved with DMSO absorb in the visible region, being thus quantified: by spectrophotometry. 2x10 5 cells were plated in each well of a 96-well culture plate.

[61] Após aderência das células, 200μL de meio DMEM contendo diferentes concentrações dos compostos, foram adicionados incubando-se a placa de cultura por um período de 24 horas em estufa a 37°, com 5% CO2.[61] After the cells had adhered, 200μL of DMEM medium containing different concentrations of the compounds were added by incubating the culture plate for a period of 24 hours in an oven at 37°, with 5% CO2.

[62] Posteriormente 22 μL de MTT (5mg/mL) foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada por 4 horas. Após este período de incubação, foi retirado o sobrenadante de cada poço e foram adicionados 80 μL de DMSO e, 5 minutos depois, a absorbância da placa foi medida em espectrofotômetro, a 492 nm.[62] Subsequently 22 μL of MTT (5mg/mL) was added to each well and the plate was incubated for 4 hours. After this incubation period, the supernatant was removed from each well and 80 μL of DMSO were added and, 5 minutes later, the absorbance of the plate was measured in a spectrophotometer at 492 nm.

d)Effect of the compounds on the trypomastigote forms of T. cruzi:

[63] Formas tripomastigotas de T. cruzi foram incubadas a 37°C por 24 e 48 horas na presença de concentrações crescentes dos compostos de cobre e zinco.[63] Trypomastigote forms of T. cruzi were incubated at 37°C for 24 and 48 hours in the presence of increasing concentrations of copper and zinc compounds.

[64] Foram plaqueados 2x105 parasitos em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços, sendo colocados 100 μL de meio de cultura contendo parasitas na forma tripomastigota e 100 μL das soluções dos complexos em diversas concentrações.[64] 2x105 parasites were plated in each well of a 96-well culture plate, with 100 μL of culture medium containing parasites in the trypomastigote form and 100 μL of the complex solutions at different concentrations.

[65] Após um período de 24 e 48h, a viabilidade de tripomastigotas de T. cruzi foi avaliada verificando-se a mobilidade dos parasitas por microscopia ótica, através da contagem em câmara de Neubauer.[65] After a period of 24 and 48h, the viability of T. cruzi trypomastigotes was evaluated by verifying the mobility of the parasites by light microscopy, by counting in a Neubauer chamber.

e) Evaluation of the effect of the compounds on amastigote forms of T. cruzi:

[66] Para a realização deste teste, 5x105 macrófagos peritoneais foram plaqueados sobre lamínulas em placas de 24 poços e incubados a 37oC em estufa de CO2 5% por 2 horas. Posteriormente, tripomastigotas de T. cruzi foram adicionadas na proporção 5:1 (parasito/macrófago) e as culturas foram incubadas por mais 2 horas.[66] To perform this test, 5x105 peritoneal macrophages were plated on coverslips in 24-well plates and incubated at 37oC in a 5% CO2 oven for 2 hours. Subsequently, T. cruzi trypomastigotes were added in a 5:1 ratio (parasite/macrophage) and the cultures were incubated for another 2 hours.

[67] Após incubação, os poços foram lavados três vezes com meio RPMI a 37oC para remover os parasitas livres. Em seguida, 1 ml de diferentes concentrações dos compostos decobre (10 - 25 μmol/L) e zinco (60 - 155 μmol/L) foram adicionados e a placa incubada por 24 horas e 48 horas.[67] After incubation, the wells were washed three times with RPMI medium at 37oC to remove free parasites. Then, 1 ml of different concentrations of copper (10 - 25 μmol/L) and zinc (60 - 155 μmol/L) compounds were added and the plate incubated for 24 hours and 48 hours.

[68] O benzonidazol foi utilizado como referência^ nos testes, realizado em duplicata. Decorrido os períodos de 24 e 48 horas, as lamínulas foram fixadas, utilizando o kit de coloração panótico rápido, para posterior verificação da atividade inibitória dos compostos frente ao parasito.[68] Benznidazole was used as a reference in the tests, performed in duplicate. After the periods of 24 and 48 hours, the coverslips were fixed, using the rapid panoptic staining kit, for later verification of the inhibitory activity of the compounds against the parasite.

[69] Para determinação da atividade inibitória foram contados amastigotas, macrófagos infectados e macrófagos não infectados, totalizando 300 macrófagos por contagem.[69] To determine the inhibitory activity, amastigotes, infected macrophages and uninfected macrophages were counted, totaling 300 macrophages per count.

Results obtained:

[70] Os resultados obtidos podem ser observados nas Figuras e Tabelas ora apensas.[70] The results obtained can be seen in the Figures and Tables appended hereto.

[71] Os complexos mais ativos foram os de cobre e os de zinco com os ligantes isapn e isaepy. Os compostos de zinco foram os mais eficazes, considerando os índices de seletividade, isto é, a relação entre as concentrações letais LC50 para os macrófagos (conforme pode ser observado nas Figuras 2A e 2B) e as concentrações IC50 para parasitas na forma tripomastigotas (conforme pode ser observado nas Figuras 3A e 3B).[71] The most active complexes were those of copper and zinc with the ligands isapn and isaepy. The zinc compounds were the most effective, considering the selectivity indices, that is, the relationship between the lethal LC50 concentrations for macrophages (as can be seen in Figures 2A and 2B) and the IC50 concentrations for parasites in the trypomastigote form (as shown in Figures 2A and 2B). can be seen in Figures 3A and 3B).

[72] Os valores referentes as concentrações letais LC50 e as concentrações IC50, bem como os valores referentes ao índice de seletividade (IS = LC50/IC50) estão descritos nas Tabelas 1, 2 e 3 abaixo. Tabela 1 - Valores de LC50 para macrófagos em presença de complexos de cobre ou de zinco com ligantes oxindolimínicos.

*experimentos realizados em triplicatas Tabela 2 - Valores de IC50 para tripomastigotos em presença de complexos de cobre ou de zinco com ligantes oxindolimínicos.

*Experimentos realizados em triplicatas. Tabela 3 - índice de seletividade = LD50/IC50 (macrófagosvs. tripomastigotas).

[72] The values referring to lethal concentrations LC50 and concentrations IC50, as well as the values referring to the selectivity index (IS = LC50/IC50) are described in Tables 1, 2 and 3 below. Table 1 - LC50 values for macrophages in the presence of copper or zinc complexes with oxindoliminic ligands.

*experiments carried out in triplicates Table 2 - IC50 values for trypomastigotes in the presence of copper or zinc complexes with oxindolimine ligands.

*Experiments carried out in triplicate. Table 3 - selectivity index = LD50/IC50 (macrophages vs. trypomastigotes).

[73] Os complexos de zinco e de cobre com o ligante isapn, os índices de seletividade após 24h foram de 4, 8 e 5, 6 respectivamente.[73] For the zinc and copper complexes with the isapn ligand, the selectivity indices after 24h were 4, 8 and 5, 6 respectively.

[74] Para estes mesmos complexos, esses índices foram de 11, 6 e 12, 4 respectivamente, após 48h. Para os compostos análogos com o ligante isaepy, esse índice, após 48 h, foi de 5,4 para [Cu(isaepy)H2O]ClO4, e 3,2 para [Zn(isaepy)Cl2].[74] For these same complexes, these indices were 11, 6 and 12.4 respectively, after 48h. For the analogous compounds with the isaepy ligand, this index, after 48 h, was 5.4 for [Cu(isaepy)H2O]ClO4, and 3.2 for [Zn(isaepy)Cl2].

[75] Para o fármaco benzonidazol, esse índice é de 2,74 após 24h, conforme dados da literatura.[75] For the drug benznidazole, this index is 2.74 after 24h, according to literature data.

[76] Frente à forma amastigota dos parasitas, os valores de IC50 dos compostos mais ativos de cobre ficaram na faixa de 10-20 μM e, para os de zinco, na faixa de 60-70 μM, após 24 h de incubação das células infectadas com os respectivos complexos ativos (conforme Figuras 4A, 4B, 4C e 40).[76] In view of the amastigote form of the parasites, the IC50 values of the most active compounds of copper were in the range of 10-20 μM and, for those of zinc, in the range of 60-70 μM, after 24 h of incubation of the cells. infected with the respective active complexes (as shown in Figures 4A, 4B, 4C and 40).

[77] Os valores de IC50 relatados para benzonidazol são de 30,3 μM, após 24 h de incubação com a forma tripamastigota, e 4,10 μM após 7 dias de incubação com amastigotos.[77] Reported IC50 values for benznidazole are 30.3 μM after 24 h incubation with the trypamastigote form, and 4.10 μM after 7 days incubation with amastigotes.

[78] Sendo assim, os compostos mais ativos ora propostos mostraram-se bons inibidores de enzimas topoisomerases e, portanto, eficientes na inibição da proliferação das formas tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi.[78] Therefore, the most active compounds proposed here proved to be good inhibitors of topoisomerase enzymes and, therefore, efficient in inhibiting the proliferation of trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi.

[79] Os complexos [Cu(isapn)](ClO4)2 e [Zn(isapn)]ClO4 mostraram-se inibidores muito eficientes da topoisomerase humana IB, especialmente na atividade de relaxação do DNA, sendo os melhores na série de complexos oxindolimínicos testada.[79] The [Cu(isapn)](ClO4)2 and [Zn(isapn)]ClO4 complexes proved to be very efficient inhibitors of human topoisomerase IB, especially in the DNA relaxation activity, being the best in the series of oxindoliminic complexes. tested.

[80] Este efeito inibitório sobre enzimas topoisomerases poderia explicar a atividade antiparasitária desses complexos metálicos.[80] This inhibitory effect on topoisomerase enzymes could explain the antiparasitic activity of these metal complexes.

Claims

1. Use of metal complexes with indole or oxindolic ligands and their imine derivatives: [Cu(isapn)](ClO4)2, [Cu(isaepy)2](ClO4)2, [Zn(isapn)](ClO4) and [ Zn(isaepy)Cl2] , characterized by being in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of parasites for human or veterinary use.

2. Use, according to claim 1, characterized by the fact that the parasites are caused by the agents Leishmania and Trypanosoma cruzi.