BR102013009768A2

BR102013009768A2 - PROTOZOAN METABOLIC ACTIVITY DETECTION METHOD

Info

Publication number: BR102013009768A2
Application number: BRBR102013009768-3A
Authority: BR
Inventors: Jose Euclides Stipp Paterniani; Samuel Ricardo Dos Santos; Cristiano De Melo Gallep; Jessica Bezerra Da Silva; Regina Maura Bueno Franco; Nilson Branco
Original assignee: Unicamp
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2015-01-06
Also published as: BR102013009768B1; WO2014172764A1

Description

MÉTODO DE DETECÇÃO DA ATIVIDADE METABÓLICA DE PROTOZOÁRIOSPROTOZOAN METABOLIC ACTIVITY DETECTION METHOD

Campo da invenção O presente pedido de patente de invenção refere-se a um método de detecção da atividade metabólica de protozoários. O método permite a detecção da atividade metabólica, com potencial estimativa da infectividade, dispensando o uso de incubação em jmodelos animais, reduzindo assim os custos envolvidos e a infraestrutura__ laboratorial. Ele pode ser aplicado no campo de monitoramento ambiental através de dispositivos portáteis, apresentando um reduzido tempo de análise após o isolamento dos protozoários de interesse.Field of the invention The present patent application relates to a method of detecting the metabolic activity of protozoa. The method allows the detection of metabolic activity, with potential estimation of infectivity, eliminating the use of incubation in animal models, thus reducing the costs involved and laboratory infrastructure. It can be applied in the field of environmental monitoring through portable devices, presenting a short analysis time after isolation of the protozoans of interest.

Fundamentos da invenção Problemas de qualidade da água configuram-se como um grande desafio que a humanidade enfrenta no século XXI. Doenças de veiculação hídrica, a urgente necessidade de saneamento básico e a falta de água potável afetam atualmente mais de um terço da população mundial. O uso da água para diversas finalidades requer o atendimento de parâmetros microbiológicos visando à segurança dos seres vivos, que podem ser infectados por organismos patogênicos presentes nela. Dentre os diferentes gêneros de organismos patogênicos que podem ser encontrados na água, Cryptosporidium e Giardia têm ganhado atenção especial de pesquisadores e autoridades, por serem capazes de propagarem enfermidades podendo em alguns casos, levarem os indivíduos a óbito.Background of the invention Water quality problems are a major challenge facing mankind in the 21st century. Waterborne diseases, the urgent need for sanitation and the lack of clean water currently affect more than one third of the world's population. The use of water for various purposes requires compliance with microbiological parameters aimed at the safety of living beings, which can be infected by pathogenic organisms present in it. Among the different genera of pathogenic organisms that can be found in water, Cryptosporidium and Giardia have gained special attention from researchers and authorities, as they are capable of spreading diseases and may in some cases lead individuals to death.

Sendo assim, esses organismos permanecem como uma constante preocupação para os sistemas produtores de água e métodos de monitoramento rápidos e efetivos são ainda necessários para determinar a ocorrência e infectividade tanto na água bruta captada para consumo humano como para água tratada.As such, these organisms remain a constant concern for water-producing systems, and rapid and effective monitoring methods are still needed to determine the occurrence and infectivity of both raw water intake and treated water.

Quanto aos testes de infectividade, estes permitem avaliar a capacidade de infecção, e são de grande utilidade principalmente na análise da eficiência dos tratamentos para inativação/desinfecção nas mais diversas metodologias. Porém, o tempo para obtenção de resultados, a dificuldade laboratorial e os custos envolvidos dificultam o emprego desses métodos no cotidiano de uma estação de tratamento de água.As for the infectivity tests, these allow to evaluate the capacity of infection, and are of great use mainly in the analysis of the efficiency of treatments for inactivation / disinfection in the most diverse methodologies. However, the time to obtain results, the laboratory difficulty and the costs involved make it difficult to use these methods in the daily life of a water treatment plant.

Embora haja vários métodos aplicados à detecção de protozoários, eles não são capazes de informarem a atividade metabólica dos organismos isolados. Existe a dificuldade de se obter informações precisas indicando se tais organismos após serem detectados estão mortos.Although there are several methods applied to the detection of protozoa, they are not able to inform the metabolic activity of isolated organisms. It is difficult to obtain accurate information indicating whether such organisms upon detection are dead.

Os ensaios de infectividade efetuados em modelo animal utilizam a inoculação do parasito em estudo, que após completar o seu ciclo de vida são eliminados nas fezes do hospedeiro para posteriormente serem confirmados através das técnicas de detecção. O documento (Craik, Stephen A. et al., “Inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts using medium and low pressure ultraviolet radiation”, Water Research, v. 35, n. 6, p.1387-1398, 2001) relata testes de infectividade em camundongos para avaliar a eficiência de inativação do Cryptosporidium com o uso de luz UV. Os ensaios foram efetuados com camundongos neonatais (5 dias de idade), sendo os organismos inoculados intragastricamente. Após 7 dias as fezes foram analisadas e a infectividade do Cryptosporidium confirmada.The infectivity assays performed in animal model use the inoculation of the studied parasite, which after completing its life cycle are eliminated in the host feces to be later confirmed by detection techniques. The document (Craik, Stephen A. et al., "Inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts using medium and low pressure ultraviolet radiation", Water Research, v. 35, no. 6, p.1387-1398, 2001) reports infectivity testing. in mice to evaluate the inactivation efficiency of Cryptosporidium with the use of UV light. The assays were performed with neonatal mice (5 days old) and the organisms were inoculated intragastrically. After 7 days the stools were analyzed and the Cryptosporidium infectivity confirmed.

Com o objetivo de demonstrar a infectividade de Cryptosporidium em águas de reuso, o documento (Gennaccaro, Angela L. et al. “Infectious Cryptosporidium parvum Oocysts in Final Reclaimed Effluent. Applied And Environmental Microbiology”, v. 69, n. 8, p.4983-4984, 2003) utiliza meio celular HCT-8 para incubação do Cryptosporidium isolado e purificado em amostras de efluente bruto, efluente de tratamento secundário, pós-filtração e pós-desinfecção. Os testes foram conduzidos com média de 48 horas de duração e a confirmação da infectividade efetuada com o uso de microscopia de fluorescência.In order to demonstrate the infectivity of Cryptosporidium in reused waters, the document (Gennaccaro, Angela L. et al. "Infectious Cryptosporidium parvum Oocysts in Final Reclaimed Effluent. Applied And Environmental Microbiology", v. 69, n. 8, p .4983-4984, 2003) uses HCT-8 cell medium for incubation of isolated and purified Cryptosporidium in samples of crude effluent, secondary treatment effluent, post filtration and post disinfection. The tests were conducted with a mean duration of 48 hours and the confirmation of infectivity was performed using fluorescence microscopy.

Analisando os métodos que avaliam infectividade, tais como a infecção in vitro em modelo celular ou teste de infectividade em modelo animal, podemos dizer que eles são caros, demorados e requerem infraestrutura sofisticada. Esses testes são sujeitos à variabilidade já que pressupõem uma resposta diferenciada do animal ou da célula escolhida como modelo para o teste de infectividade in vitro. O documento (“A device for Gated Autosynchronous Luminescence Detection”, Connally, Russell, Analytical chemistry, Vol. 83, N°. 12, (2011), p.4782-4787) apresenta um método aplicado à microscopia de epifluorescência. A utilização de dispositivos construídos pelo autor permite a redução daquilo que ele chama de luminescência retardada proveniente de possíveis interferences na amostra que podem apresentar autofluorescência. O método é então utilizado para reduzir o ruído de fundo das amostras. De acordo com o autor, o procedimento melhora a sensitividade no procedimento microscópio e aumenta a capacidade captura da imagem com o uso de câmera CCD. O autor argumenta também que procedimentos que utilizam marcadores a base de europium e terbium são beneficiados pela técnica. O autor utilizou cistos de Giardia para demonstrar o emprego da técnica na detecção do organismo. Nada é comentado acerca da medida da atividade metabólica envolvendo Giardia. O método proposto neste pedido de patente refere-se à detecção da emissão ultra-fraca de luz envolvendo cistos de Giardia spp. previamente purificados e incubados em marcadores fluorescentes capazes de detectar a presença de atividade metabólica de células. Comparando-se ambos os métodos, não é possível vislumbrar semelhanças no que diz respeito a detecção de atividade metabólica, como proposto neste pedido de patente. O documento (“Spectral analysis of laser-induced ultraweak delayed luminescence in cultured normal and tumor human cells: temperature dependence”, Musumeci F, Applegate LA, Privitera G, Scordino A, Tudisco S, Niggli HJ., J Photochem Photobio B.; 79(2):93-9. 2005 Jan 22) descreve a aplicação da luminescência retardada na diferenciação entre células tumorais e sadias. A luminescência retardada é induzida através de um laser e sua medida é efetuada através de válvulas fotomultiplicadoras. Os resultados são analisados com base na cinética de decaimento da luminescência retardada, tendo sido empregado modelos matemáticos do tipo probabilístico. O método demonstra a aplicabilidade da luminescência retardada como tecnologia inovadora na distinção entre células tumorais e sadias, com futuras aplicabilidades em oncologia e não se aplica em protozoários, dado que tais organismos diferem daquelas células tumorais. Já o método aqui proposto vale-se do uso de reagentes químicos medidores de atividade metabólica combinado com o fenômeno de luminescência retardada permitindo diferenciar protozoários metaboficamente ativos daqueles sem atividade metabólica. O documento (“Influence of presence of antrazine in water on the in-vivo delayed luminescence of Acetubeíaria acetabulum", A. Scordino, A. Triglia, F. Musumeci, F. Grasso, Z. Rajfur, Journal of Photochemistry and Photobiology Volume 32, Issues 1-2, January 1996, Pages 11-17) apresenta a aplicação da luminescência retardada na detecção de alterações metabólicas, proveniente de estresse químico, nas células da alga Acetubeíaria acetabulum. Demonstra-se que quando induzidas via excitação com luz verde, células sadias apresentam decaimento luminescente diferente daquelas estressadas com antrazina. Novamente aqui o método proposto se difere deste na aplicabilidade. Aspectos ecotoxicologicos são analisados pela técnica proposta por Scordino et. al., ao passo que propomos diferenciação entre organismos metabolicamente ativos daqueles não ativos. Tal método não pode ser utilizado para análise metabólica de protozoários dado que vale-se da excitação em 565 nm durante 2s e diferencia células sadias daquelas com toxicidade aguda na presença de agrotóxicos.Looking at methods that assess infectivity, such as in vitro infection in a cellular model or infectivity test in an animal model, we can say that they are expensive, time consuming and require sophisticated infrastructure. These tests are subject to variability as they assume a differentiated animal or cell response chosen as a model for the in vitro infectivity test. The document ("A device for Gated Autosynchronous Luminescence Detection", Connally, Russell, Analytical chemistry, Vol. 83, No. 12, (2011), p.4782-4787) presents a method applied to epifluorescence microscopy. The use of devices constructed by the author allows the reduction of what he calls delayed luminescence from possible interferences in the sample that may present autofluorescence. The method is then used to reduce the background noise of the samples. According to the author, the procedure improves sensitivity in the microscope procedure and increases the image capture capacity with the use of CCD camera. The author also argues that procedures using markers based on europium and terbium benefit from the technique. The author used Giardia cysts to demonstrate the technique's use in organism detection. Nothing is commented about the measurement of metabolic activity involving Giardia. The method proposed in this patent application concerns the detection of ultra-weak light emission involving Giardia spp cysts. previously purified and incubated in fluorescent markers capable of detecting the presence of metabolic activity of cells. Comparing both methods, it is not possible to see similarities in the detection of metabolic activity as proposed in this patent application. The document (“Spectral analysis of laser-induced ultraweak delayed luminescence in cultured normal and human tumor cells: temperature dependence”, Musumeci F, Applegate LA, Privitera G, Scordino A, Niggli HJ., J Photochem Photobio B .; 79 (2): 93-9. 2005 Jan 22) describes the application of delayed luminescence in the differentiation between tumor and healthy cells. Delayed luminescence is induced by a laser and measured by photomultiplier valves. The results are analyzed based on the delayed luminescence decay kinetics, using probabilistic mathematical models. The method demonstrates the applicability of delayed luminescence as an innovative technology in the distinction between healthy and tumor cells, with future applicability in oncology and does not apply to protozoa, as such organisms differ from those tumor cells. The method proposed here uses the use of chemical reagents that measure metabolic activity combined with the phenomenon of delayed luminescence, allowing the differentiation of metabolically active protozoa from those without metabolic activity. The document (“Influence of presence of anthrax in water on the in vivo delayed luminescence of Acetubia acetabulum”, A. Scordino, A. Triglia, F. Musumeci, F. Grasso, Z. Rajfur, Journal of Photochemistry and Photobiology Volume 32 , Issues 1-2, January 1996, Pages 11-17) presents the application of delayed luminescence in the detection of metabolic alterations, caused by chemical stress, in Acetubeíaria acetabulum algae cells. Healthy cells present luminescent decay different from those stressed with anthazine Again the proposed method differs from this in applicability Ecotoxicological aspects are analyzed by the technique proposed by Scordino et al, whereas we propose differentiation between metabolically active and non-active organisms. This method cannot be used for protozoal metabolic analysis since it uses 565 nm excitation during 2s and differentiates healthy cells from those with acute toxicity in the presence of pesticides.

Na literatura, encontram-se métodos que utilizam citometria de fluxo e valem-se de equipamentos dotados de válvulas fotomultiplicadoras onde a excitação é feita por fonte luminosa de alta intensidade. O sinal é analisado e é captado por espalhamento onde é feita a contagem e a diferenciação de células e protozoários. Embora tais equipamentos utilizem válvulas fotomultiplicadoras os sinais analisados após a excitação com laser são da ordem de 103 a 106 fótons, estando, portanto associados a fenômenos meramente físicos, e aptos apenas a contar o número de indivíduos. O método aqui proposto detecta a interação entre os protozoários e os marcadores de atividades enzimáticas com válvulas fotomultiplicadoras sensíveis no visível e capazes de realizarem contagens da ordem de dezenas de fótons (luminescência ultra-fraca), ainda assim capaz de diferenciar amostras vivas daquelas mortas. Esse por sua vez difere dos métodos baseados em citometria que não avaliam o comportamento do organismo do ponto de vista de luminescência retardada.In the literature, there are methods that use flow cytometry and use equipment with photomultiplier valves where the excitation is made by high intensity light source. The signal is analyzed and is captured by scattering where the counting and differentiation of cells and protozoa is made. Although such equipment uses photomultiplier valves, the signals analyzed after laser excitation are of the order of 103 to 106 photons, and are therefore associated with purely physical phenomena, and only able to count the number of individuals. The method proposed here detects the interaction between protozoa and enzyme activity markers with visible sensitive photomultiplier valves capable of counting tens of photons (ultra-weak luminescence), yet capable of differentiating living samples from dead ones. This in turn differs from cytometric-based methods that do not evaluate the behavior of the organism from the point of view of delayed luminescence.

Diante do exposto seria útil que o estado da técnica dispusesse de um método de detecção da atividade metabólica em protozoários, que seja de baixò custo e que apresente resposta rápida.Given the above, it would be useful if the state of the art had a method of detecting metabolic activity in protozoa, which is low cost and that presents rapid response.

Breve descrição da invenção O presente pedido de patente de invenção refere-se a um método de detecção da atividade metabólica de protozoários via luminescência retardada com uso de marcadores fluorescentes. O método proposto neste pedido de patente utiliza uma fonte luminosa com emprego de marcadores celulares como indicadores de presença de atividade metabólica. Além disso, soluciona-se a estimativa da atividade metabólica do parasito através da análise da emissão ultra-fraca de luz.BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION This patent application relates to a method of detecting protozoal metabolic activity via delayed luminescence using fluorescent markers. The method proposed in this patent application uses a light source employing cellular markers as indicators of the presence of metabolic activity. In addition, the estimation of the parasite's metabolic activity is solved by analyzing the ultra-weak light emission.

Atualmente os métodos aceitos para inferir a infectividade de parasitos necessitam de incubação em modelos animais e requerem dias para obtenção de resultado. O método proposto apresenta solução alternativa para a estimativa da atividade metabólica sem a necessidade de incubação do parasito em modelo animal. O método aqui proposto aplica-se a protozoários e permite distinguir a atividade metabólica dos mesmos com a vantagem de uma análise rápida, possuindo ampla aplicação no campo do monitoramento ambiental. Breve descrição das figuras e anexos O invento passará a ser descrito a seguir com referência aos desenhos apensos, nos quais: A Figura 1 apresenta as etapas para o desenvolvimento do ensaio com o uso da luminescência retardada. Nela as etapas consistem na coleta da amostra, isolamento, eluição, purificação, incubação, fóton-contagem, análise de dados e confirmação dos protozoários de interesse. O anexo 1 apresenta os resultados da microscopia de epifluorescência com testes envolvendo organismos vivos de Giardia lamblia e estressados com temperatura (organismos mortos a 100°C), além de cistos estressados com lâmpada UV-254 nm pelo período de 1 hora. O anexo 2 mostra os gráficos do comportamento dos grupos testados com base na cinética de decaimento luminescente e parâmetros estatísticos de contagem. Os dados são analisados com base nos parâmetros estatísticos e cinética do decaimento luminescente, distinguindo protozoários metabolicamente ativos daquele sem atividade metabólica.Currently accepted methods for inferring parasitic infectivity require incubation in animal models and require days to obtain results. The proposed method presents an alternative solution for estimating metabolic activity without the need for incubation of the parasite in an animal model. The method proposed here applies to protozoa and allows to distinguish their metabolic activity with the advantage of a rapid analysis, having wide application in the field of environmental monitoring. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES AND ATTACHMENTS The invention will now be described with reference to the accompanying drawings, in which: Figure 1 shows the steps for the development of the assay using delayed luminescence. The stages consist of sample collection, isolation, elution, purification, incubation, photon counting, data analysis and confirmation of protozoans of interest. Annex 1 presents the results of epifluorescence microscopy with tests involving Giardia lamblia living and temperature-stressed organisms (organisms killed at 100 ° C), and UV-254 nm lamp-stressed cysts for 1 hour. Annex 2 shows the graphs of the behavior of the groups tested based on luminescent decay kinetics and statistical counting parameters. Data are analyzed based on the statistical and kinetic parameters of luminescent decay, distinguishing metabolically active protozoa from those without metabolic activity.

Descrição detalhada da invenção Refere-se o presente pedido de patente de invenção a um método de detecção da atividade metabólica em protozoários com o uso luminescência retardada e marcadores fluorescentes. O método é baseado no princípio da emissão ultra-fraca de luz por todos os seres vivos e, principalmente correlacionado com a atividade metabólica das células. Uma vez vivas, células interagem com substratos e emitem fótons de natureza ultra-fraca que podem ser detectados com dispositivos fotônicos dotados de válvulas fotomultiplicadoras sensíveis em diversas regiões do espectro eletromagnético. A emissão ultra-fraca de luz ou biofótons (101 a 103 fótons*cm'2 s' 1) é encontrada em compostos orgânicos em conjunto com a atividade dos sistemas biológicos. Ela se relaciona também com a luminescência retardada, que reflete o comportamento do sistema biológico em termos da re-emissão de luz ultra-fraca após a excitação por fonte luminosa. Esta emissão espontânea de fótons é influenciada pela temperatura e pelas funções biológicas como a permeabilidade seletiva da membrana celular e as reações bioquímicas, refletindo diretamente no comportamento biofotônico. O método proposto neste pedido de patente compreende as seguintes etapas (Figura 1): a) Preparar a amostra, b) Adicionar à amostra o reagente marcador, c) Homogeneizar a amostra, d) Incubar a amostra, e) Conduzir a amostra para a câmara de fóton-contagem e acionar o dispositivo de iluminação, f) Realizar uma fóton-contagem da amostra, g) Comparar os dados provenientes da fóton-contagem com as curvas de luminescência retardada provenientes do controle positivo (microrganismos vivos), h) Realizar um ajuste de Bolztman e curva integral dos gráficos da amostra e do controle positivo e obter os coeficientes, i) Comparar os coeficientes Ak obtidos pelo gráfico da amostra e do controle positivo, caso o coeficiente da amostra seja maior, a mesma contém protozoários vivos.Detailed Description of the Invention This patent application relates to a method of detecting metabolic activity in protozoa using delayed luminescence and fluorescent markers. The method is based on the principle of ultra-weak light emission by all living beings and mainly correlated with the metabolic activity of cells. Once alive, cells interact with substrates and emit ultra-weak photons that can be detected with photonic devices with sensitive photomultiplier valves in various regions of the electromagnetic spectrum. Ultra-weak light or biophoton emission (101 to 103 photons * cm'2 s' 1) is found in organic compounds in conjunction with the activity of biological systems. It also relates to delayed luminescence, which reflects the behavior of the biological system in terms of ultra-weak light re-emission following light source excitation. This spontaneous emission of photons is influenced by temperature and biological functions such as selective cell membrane permeability and biochemical reactions, directly reflecting the biophotonic behavior. The method proposed in this patent application comprises the following steps (Figure 1): a) Prepare the sample, b) Add the marker reagent to the sample, c) Homogenize the sample, d) Incubate the sample, and) Drive the sample to photon-counting chamber and actuation of the lighting device, (f) perform a photon-counting of the sample, (g) compare the data from the photon-counting with the delayed luminescence curves from the positive control (living organisms), (h) perform a Bolztman fit and integral curve of the sample and positive control graphs and obtain the coefficients, i) Compare the Ak coefficients obtained by the sample and positive control graphs, if the sample coefficient is higher, it contains live protozoa.

Na etapa (a) a amostra deve ser preparada empregando qualquer processo conhecido do estado da técnica. Mais especificamente o isolamento e purificação podem ser efetuados de acordo com metodologia descrita pela Environmental Protection Agency, Method 1623.1: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water, Washington DC, 2012. É recomendado que a amostra seja homogeneizada vigorosamente para que os organismos de interesse fiquem suspensos no meio aquoso.In step (a) the sample should be prepared employing any process known from the prior art. More specifically isolation and purification may be carried out according to methodology described by the Environmental Protection Agency, Method 1623.1: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration / IMS / FA. Office of Water, Washington DC, 2012. It is recommended that the sample be vigorously homogenized so that the organisms of interest are suspended in the aqueous medium.

Na etapa (b) alguns exemplos de reagentes que podem ser utilizados são Resazurin-C12, 6-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil ester (CFDA-SE) e SYTOX (SYTO-9). Tais reagentes podem ser comercialmente adquiridos em empresas especializadas. A concentração ótima para a total marcação do organismo dependerá do tipo de organismo em estudo. No geral, recomenda-se análise de varredura em concentrações variando em escala de até 10 vezes. Uma faixa de concentração do reagente marcador a ser utilizada é de 0,5 pMol.L'1 a 5,0 pMol.L"1. A concentração do reagente marcador celular pode variar também em função do tipo de marcador bem como o organismo de interesse. Recomenda-se que seja feita a prévia verificação da fluorescência do marcador utilizado verificando-se a melhor concentração a ser utilizada. A concentração ótima é aquela que apresente fluorescência satisfatória observada em organismo vivos. A incubação da amostra na etapa (d) deve ser feita em uma câmara escura de incubação bacteriológica ou em dispositivos de fóton-contagem dotados de controle de temperatura. A temperatura da câmara deve estar compreendida na faixa de 33°C a 38°C e 5% de atmosfera de CO2. O tempo dè incubação pode variar em função do organismo de interesse. Intervalos de 15-45 minutos permite a completa reação bioquímica para a marcação celular e fluorescência. O analista poderá aferir o melhor tempo de incubação em função da escolha da melhor concentração do reagente. O dispositivo de iluminação na câmara de fóton-contagem na etapa (e) deve ser acionado por um tempo compreendido na faixa de 1 a 30 segundos para a excitação da amostra. A análise dos dados de fóton-contagem na etapa (h) é realizada com base no Fitting não-linear proveniente do modelo matemáticos Boltzman Fitting Decay como na equação (1): onde ai refere-se ao valor inicial, a2 ao valor final, t o tempo (s) e dt é a constante temporal de decaimento. O coeficiente a ser analisado é Ak = ^ - a2. A diferenciação pode ser efetuada com base na integral da curva de decaimento da luminescência retardada conforme equação (2): onde i = 0 é o instante inicial do decaimento luminescente, n é o instante final da curva de decaimento e DL é a fóton-contagem da luminescência retardada no intervalo i = 0 até n.In step (b) some examples of reagents that may be used are Resazurin-C12,6-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE) and SYTOX (SYTO-9). Such reagents may be commercially purchased from specialized companies. The optimal concentration for total organism labeling will depend on the type of organism being studied. In general, scanning analysis at concentrations ranging up to 10 times is recommended. A concentration range of the marker reagent to be used is 0.5 pMol.L'1 to 5.0 pMol.L "1. The concentration of the cell marker reagent may also vary depending on the type of marker as well as the organism of It is recommended that the fluorescence of the marker used be previously checked by checking the best concentration to be used The optimal concentration is the one that shows satisfactory fluorescence observed in living organisms The sample incubation in step (d) should be be carried out in a bacteriological incubation darkroom or in temperature-controlled photon-counting devices.The temperature of the chamber shall be within the range of 33 ° C to 38 ° C and 5% CO2 atmosphere. incubation may vary depending on the organism of interest 15-45 minute intervals allow complete biochemical reaction for cell labeling and fluorescence The analyst may incubation according to the choice of the best reagent concentration. The illumination device in the photon counting chamber in step (e) shall be operated for a time in the range of 1 to 30 seconds for excitation of the sample. The analysis of the photon-count data in step (h) is performed based on the nonlinear Fitting from the Boltzman Fitting Decay mathematical model as in equation (1): where ai refers to the initial value, a2 to the final value, t time (s) and dt is the time decay constant. The coefficient to be analyzed is Ak = ^ - a2. Differentiation can be made based on the integral of the delayed luminescence decay curve according to equation (2): where i = 0 is the initial moment of the luminescent decay, n is the final moment of the decay curve and DL is the photon count of the delayed luminescence in the range i = 0 to n.

Exemplo de concretização A avaliação da atividade metabólica dos cistos foi efetuada com o uso do reagente Carboxifluorceina succinimidil diacetato ester (CFDA-SE) que permite analisar a presença de atividade metabólica de células viáveis. A estimativa da quantidade de organismos foi efetuada com base na reação de imunofluorescência utilizando anticorpos monoclonais e corante marcador disponíveis em kit comercial. O kit utilizado possuía reagente de detecção contendo Isotiocianato de Fluorceína (FITC) combinados com anticorpos anti-Cryptosporidium e anti-Giardia, permitindo a identificação e a contagem dos cistos em microscopia de fluorescência.Embodiment Example The evaluation of the cysts metabolic activity was performed using the Carboxifluorcein succinimidyl diacetate ester reagent (CFDA-SE) which allows the presence of viable cell metabolic activity to be analyzed. Estimation of the amount of organisms was performed based on the immunofluorescence reaction using monoclonal antibodies and marker dye available in a commercial kit. The kit used had detection reagent containing Fluorcein Isothiocyanate (FITC) combined with anti-Cryptosporidium and anti-Giardia antibodies, allowing the identification and counting of cysts under fluorescence microscopy.

Ensaios de varredura com CFDA-SE foram efetuados com o intuito de avaliar a melhor concentração do marcador fluorescente.CFDA-SE scanning assays were performed to evaluate the best concentration of the fluorescent marker.

As soluções foram preparadas transferindo 90 pl_ de DMSO à 547 pg de CFDA-SE e posterior adição de 910 pl_ de tampão fosfato salino (PBS), totalizando volume de 1mL de uma solução estoque de 1mM. Diluições a partir da solução estoque foram efetuadas nas concentrações de: 0.5, 1.0, 5.0, 25.0, 50.0 e 100 ??.The solutions were prepared by transferring 90 µl DMSO to 547 µg CFDA-SE and then adding 910 µl phosphate buffered saline (PBS), totaling 1mL volume of a 1mM stock solution. Dilutions from the stock solution were made at concentrations of: 0.5, 1.0, 5.0, 25.0, 50.0 and 100 ??.

Cistos de Giardia lamblia foram incubados em CFDA-SE nas concentrações de: 0.5, 1.0, 5.0, 25.0, 50.0 e 100 ??. Primeiramente, alíquotas contendo aproximadamente: 2.5x102, 2.5x103, 5x103, 2x104 e 2.5x104 cistos foram transferidas para microtubos e homogeneizadas por 2 minutos em vortex. Posteriormente, CFDA-SE foi adicionado a cada alíquota de organismos. A suspensão foi novamente homogeneizada e o volume total foi transferido para lâminas microscópicas. Em seguida, as lâminas foram conduzidas para câmara de incubação pelo período de 30 minutos a 37°C e 5% de C02.Giardia lamblia cysts were incubated in CFDA-SE at concentrations of: 0.5, 1.0, 5.0, 25.0, 50.0 and 100 ??. First, aliquots containing approximately: 2.5x102, 2.5x103, 5x103, 2x104 and 2.5x104 cysts were transferred to microtubes and vortexed for 2 minutes. Subsequently, CFDA-SE was added to each aliquot of organisms. The suspension was homogenized again and the total volume was transferred to microscopic slides. The slides were then led to the incubation chamber for 30 minutes at 37 ° C and 5% CO2.

Ao longo da incubação, efetuou-se a medida de fóton-contagem, tendo sido iniciada imediatamente após a transferência da lâmina contendo os cistos para a câmara, acionando a placa de contagem num intervalo de aquisição de 1s pelo período de 30 minutos.During the incubation, the photon counting was performed and was started immediately after the transfer of the cyst-containing slide to the chamber, triggering the counting plate within 1s acquisition interval for 30 minutes.

Após a incubação, efetuou-se a medida da luminescência retardada excitando os organismos em câmara escura dotada de válvula fotomultiplicadora. No dispositivo de fóton-contagem os organismos foram excitados com lâmpada halogênica e filtros passa-banda (50 nm de largura) com os seguintes comprimentos de onda e respectiva intensidade média em lux: 375 nm (2,3 lux), 460 nm (120 lux), 582 nm (3070 lux) e luz branca (sem filtro 5120 lux). Em outro dispositivo de fóton-contagem efetuou-se excitação a partir de LEDs (~20 nm de banda) com comprimentos de onda de 680 nm e 700 nm, além de luz branca. A excitação dos organismos foi efetuada pelo intervalo de 30 s e em seguida efetuou-se a leitura da fóton-contagem no intervalo de aquisição de 100 ps e tempo de contagem de 10 s. ^ - Os dados de fóton-contagem foram analisados em seu parâmetro temporal expressos em photon-counts per 100 ps (cp100ps). Às análises estatísticas foram efetuadas em seu parâmetro de frequência de contagem, média, mínimos, máximos e desvio padrão das amostragens. Transformadas de Fourier foram efetuadas para avaliar o sinal de decaimento da luminescência retardada, sendo esse parâmetro avaliado com base na frequência e amplitude.After incubation, the delayed luminescence was measured by exciting the organisms in a darkroom with a photomultiplier valve. In the photon-counting device the organisms were excited with halogen lamp and bandpass filters (50 nm wide) with the following wavelengths and their mean intensity in lux: 375 nm (2.3 lux), 460 nm (120 lux), 582 nm (3070 lux) and white light (without filter 5120 lux). In another photon-counting device, excitation was performed from LEDs (~ 20 nm band) with wavelengths of 680 nm and 700 nm, in addition to white light. The excitation of the organisms was performed for the 30 s interval and then the photon-counting was read at the 100 ps acquisition interval and 10 s counting time. ^ - Photon-count data were analyzed in their temporal parameter expressed in photon counts per 100 ps (cp100ps). Statistical analyzes were performed using their parameter of counting frequency, mean, minimum, maximum and standard deviation of the samples. Fourier transforms were performed to evaluate the delayed luminescence decay signal, and this parameter was evaluated based on frequency and amplitude.

Leitura da fluorescência Após os ensaios de incubação, as lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência com excitação em 490 nm e verificação da fluorescência decorrente da atividade metabólica dos cistos em microscópio de epifluorescência com filtros FITC.Fluorescence reading After incubation assays, slides were analyzed under fluorescence microscopy with 490 nm excitation and fluorescence checking for the metabolic activity of cysts under FITC filter epifluorescence microscope.

Para a confirmação da presença de cistos bem como a estimativa da quantidade quando do preparo das alíquotas, efetuou-se a leitura da fluorescência com o uso de kit comercial. Ao passo que os ensaios efetuados com CFDA-SE acompanhados por fóton-contagem foram analisados sob as mesmas condições.To confirm the presence of cysts and to estimate the amount when preparing aliquots, fluorescence was read using a commercial kit. Whereas the assays performed with CFDA-SE accompanied by photon counting were analyzed under the same conditions.

Análise Microscópica e captura de imaaens Após a análise do comportamento da fluorescência, os organismos foram analisados e imagens foram coletadas com uso de microscópio de epi-fluorescência com filtro FITC, DIC e objetivas de 40, 100 e 400x, lâmpada halogênica e software de captura comercial. As imagens foram coletadas nos campos FITC e DIC e posteriormente justapostas para análise dos padrões de fluorescência proveniente do reagente CFDA-SE.Microscopic Analysis and Image Capture After fluorescence behavior analysis, the organisms were analyzed and images were collected using FITC filter, DIC and 40, 100 and 400x objectives, halogen lamp and capture software. commercial. Images were collected in the FITC and DIC fields and subsequently juxtaposed for analysis of fluorescence patterns from the CFDA-SE reagent.

Resultados Testes efetuados com cepa sem estresse demonstram que o CFDA-SE nas concentrações acima de 0,5 pM apresentam fluorescência satisfatória e facilmente detectável com uso de microscopia de epi-fluorescência. No anexo 1 está descrito o comportamento da fluorescência de cistos de Giardia lamblia incubados em CFDA-SE. Observa-se que para concentrações de 0,5 ?? (quadros (11) (12) e (13)), apenas cistos vivos apresentam fluorescência. O aumento da concentração do reagente promove o aumento da intensidade da fluorescência. Cistos estressados com UV-254nm apresentaram fluorescência para concentrações de CFDA-SE acima de 2,5 pM. Contudo tal fluorescência possui intensidade menor que aquela apresentada por cistos vivos. Esse fato pode ser observado nos quadros (13), (16) e (19) na anexo 1.Results Stress-free tests show that CFDA-SE at concentrations above 0.5 pM exhibit satisfactory fluorescence and is easily detectable using epi-fluorescence microscopy. Annex 1 describes the fluorescence behavior of Giardia lamblia cysts incubated in CFDA-SE. It is observed that for concentrations of 0.5 ?? (Tables (11) (12) and (13)), only living cysts show fluorescence. Increasing reagent concentration promotes increased fluorescence intensity. UV-254nm stressed cysts showed fluorescence at CFDA-SE concentrations above 2.5 pM. However such fluorescence has lower intensity than that presented by living cysts. This fact can be observed in tables (13), (16) and (19) in annex 1.

Cistos mortos não apresentam fluorescência quando analisados em microscopia, demonstrando comportamento de ruído. A análise dos padrões de fóton-contagem provenientes da luminescência retardada, demonstram que grupos estressados com luz UV-254 nm, grupos contendo cistos mortos à 100°C e cistos vivos sem estresse, apresentam comportamentos biofotônicos diferentes entre si.Dead cysts do not fluoresce when analyzed under microscopy, demonstrating noise behavior. The analysis of photon-counting patterns from delayed luminescence shows that groups stressed with UV-254 nm light, groups containing cysts killed at 100 ° C and living cysts without stress, present different biophotonic behaviors.

Cistos vivos possuem decaimento da luminescência retardada com taxas de fóton-contagem superiores aos cistos sem atividade metabólica. As análises estatísticas demonstram que grupos vivos e sem estresse possuem frequências de contagem superiores quando comparados com grupos mortos e estressados.Living cysts have delayed luminescence decay with photon-counting rates higher than cysts without metabolic activity. Statistical analyzes show that living and stress-free groups have higher counting frequencies when compared to stressed and dead groups.

No anexo 2 encontra-se a descrição dos comportamentos de cistos de Giardia lamblia mortos a 100°C, estressados com luz UV-254nm, comparando-os com cistos vivos e sem estresse. As curvas de (20) a (23) demonstram o decaimento luminescente de cistos incubados em CFDA-SE 5,0pM, analisados com base nas médias dos 100 pontos locais. As curvas de (24) a (27) referem-se ao ajuste exponencial nos dados de fóton-contagem. Já as curvas de (28) a (31) referem-se às análises estatísticas com base na média das frequência de contagem, mínimos e máximos.Annex 2 describes the behavior of Giardia lamblia cysts killed at 100 ° C, stressed under UV-254nm light, and compared to live and stress-free cysts. The curves from (20) to (23) demonstrate the luminescent decay of cysts incubated in 5.0pM CFDA-SE, analyzed based on the averages of 100 local points. The curves from (24) to (27) refer to the exponential fit in the photon count data. Curves from (28) to (31) refer to statistical analyzes based on the average of the minimum and maximum counting frequencies.

Com base no anexo 2, demonstra-se que o método aplica-se na distinção entre organismos vivos e sem estresse e aqueles mortos ou estressados com luz UV. O decaimento luminescente parte de poucas dezenas de fótons medidos em intervalos de 100 ps. Posteriormente, o decaimento atinge o ruído de escuro a ordem de 1,0 cplOOps. Esse decaimento difere entre os grupos analisados em função do estado metabólico do organismo.Based on Annex 2, it is shown that the method applies in distinguishing between living and stress-free organisms and those killed or stressed with UV light. The luminescent decay starts from a few dozen photons measured at 100 ps intervals. Subsequently, the decay reaches the dark noise in the order of 1.0 cplOOps. This decay differs between the groups analyzed according to the metabolic state of the organism.

Os ensaios podem ser conduzidos com poucas horas de análise (1h no exemplo citado) com uso de reagentes e vidrarias facilmente obtidos no mercado.The assays can be conducted with few hours of analysis (1h in the above example) using commercially available reagents and glassware.

Claims

Method for detecting the metabolic activity of protozoans comprising the following steps: (a) prepare the sample, (b) add the marker reagent to the sample, (c) homogenize the sample, (d) incubate the sample, and) conduct the sample for the photon-counting chamber and actuate the lighting device, (f) perform a photon-counting sample, (g) compare the photon-counting data with the delayed luminescence curves from the positive control (living organisms), h) Perform a Bolztman adjustment and integral curve of the sample and positive control graphs and obtain the coefficients, i) Compare the Ak coefficients obtained by the sample and positive control graphs, if the sample coefficient is larger, it contains live protozoa. .

Method according to claim 1, characterized in that step (a) consists of isolating, purifying and centrifuging the sample.

Method according to claim 1, characterized in that the concentration of the labeling reagent is in the range of 0.5 ??? at 5.0 ????.

Method according to claim 1, characterized in that the concentration of the labeling reagent is preferably 5.0%.

Method according to claim 1, characterized in that step (d) is performed in a dark incubation chamber at a temperature in the range of 33 ° C to 38 ° C and 5% CO 2 for a period in the range of 15 ° C. at 45 minutes.

Method according to claim 1, characterized in that the incubation period in step (d) is preferably 30 minutes.

Method according to claim 1, characterized in that the activation time of the lighting device is in the range of 1 to 30 seconds.

Method for detecting the metabolic activity of protozoa comprising the following steps: (a) isolate, purify and centrifuge the sample; (b) add to the sample the solution containing the marker reagent at a concentration of 0,5 ???? at 5.0 ???? and homogenize the mixture, cj) Bring the solution into the dark incubation chamber at a temperature in the range of 33 ° C to 38 ° C and 5% CO 2 for a period of 15 to 45 minutes, d) Conduct the sample. to the photoncount chamber and operate the illumination device for a time in the range of 1 to 30 seconds for the excitation of the sample; e) perform a photoncount of the sample; f) compare the data from the photoncount. with the delayed luminescence curves from the positive control (living microorganisms), g) perform a Bolztman adjustment and integral curve of the sample and positive control graphs and obtain the coefficients, h) compare the coefficients Ak obtained from the sample graph and of positive control.

Method according to claim 8, characterized in that the concentration of the labeling reagent in step (b) is preferably 5.0 µm.

Method according to claim 8, characterized in that the incubation period in step (c) is preferably 30 minutes.