BR102013000416A2 - Processo de utilização de células-tronco pós-natais adultas autólogas, heterólogas ou alogénicas pré ou pós-criopreservadas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em nichos celulares lesados visando o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida em animais acometidos por cinomose - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PÓS-NATAIS ADULTAS AUTÓLOGAS, HETERÓLOGAS OU ALOGÊNICAS PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS OU SEU RESPECTIVO CONCENTRADO, DEIFERENCIADO OU NÃO, EM NICHOS CELULARES LESADOS VISANDO O TRATAMENTO E/OU MELHORIA DA QUALIDADE DE VIDA EM ANIMAIS ACOMETIDOS POR CINOMOSE. A presente invenção refere-se a um processo de utilização de células-tronco pós-natais adultas pré ou pós-criopreservadas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, visando à cura e/ou melhoria da qualidade de vida de animais acometidos por cinomose.

Description

"PROCESSO DE UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PÓS-NATAIS ADULTAS AUTÓLOGAS, HETERÓLOGAS OU ALOGÉNICAS PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS OU SEU RESPECTIVO CONCENTRADO, DIFERENCIADO OU NÃO, EM 5 NICHOS CELULARES LESADOS VISANDO O TRATAMENTO E/OU MELHORIA DA QUALIDADE DE VIDA EM ANIMAIS ACOMETIDOS POR CINOMOSE”.

Apresentação da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de utilização de células-tronco pós-natais adultas pré ou pós-criopreservadas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, visando a cura 15 e/ou melhoria da qualidade de vida de animais acometidos por cinomose.

Antecedentes da Invenção

As células-tronco constituem uma população de células 20 com características singulares extremamente atrativas para a medicina regenerativa. Podem ser definidas como células primordiais indiferenciadas com capacidade de auto-renovação, podendo se diferenciar em diversos tipos celulares. Quando introduzidas no organismo adquirem a funcionalidade de qualquer tecido, 25 demonstrando assim, possuir um alto potencial de regeneração tecidual (Caplan, 2000, 2003). A formação de órgãos e tecidos ocorre de forma natural durante o desenvolvimento pré-natal do organismo sendo mantida durante toda a vida do indivíduo por meio de processos de reparação celular, os quais tem seu início em casos de trauma ou doença. Porém, 5 a capacidade das células de regenerar órgãos e tecidos em indivíduos adultos é limitada. 0 desenvolvimento, crescimento e reparação de órgãos estão baseados na diferenciação celular, a qual inclui a capacidade de proliferação e diferenciação para diferentes tipos de linhagens celulares. As células que promovem a manutenção contínua e 10 o reparo de órgãos e tecidos após o nascimento se encontram em um estágio não diferenciado. Estas demonstram possuir um enorme potencial terapêutico sendo atualmente denominadas de células de reserva ou células-tronco pós-natais adultas (Caplan, 1991).

As células-tronco pós-natais adultas são células 15 encontradas nos diversos órgãos e tecidos de organismos adultos estando situadas em um ambiente denominado de “nicho de célulastronco” o qual as mantêm, não diferenciadas, em regime de espera (Stand By). Durante a vida do indivíduo, as células-tronco garantem a renovação constante das células saudáveis como, por exemplo, a 20 descamação da pele ou produção de sangue. Quando ocorre uma doença, trauma ou injúria, os “nichos das células-tronco” são ativados pelo organismo para regenerar o tecido lesado ou atuar no organismo inteiro, como no caso das doenças degenerativas, leucemias, etc.

As células-tronco têm demonstrado possuir diferentes graus de capacidade de regeneração tecidual: as mais amplas, denominadas multipotentes, têm a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares como: ossos, cartilagens, músculos, tecidos adiposos (Caplan, 1991). Já as de capacidade mais restrita, denominadas células-tronco progenitoras tecido-específicas ou unipotentes, são capazes de se diferenciar somente para o mesmo tipo de tecido. Um bom exemplo é a 5 medula óssea, que é capaz de produzir vários tipos de células maduras hematopoiéticas (linfócitos TeB). Toda essa plasticidade das célulastronco garante o processo de auto-renovação do organismo durante a vida e a sua recuperação em caso de doenças, lesões, traumas ou injúrias adquiridas (Young e cols, 2004; Schena e cols, 2006).

Quando um trauma, injúria ou doença é muito abrangente,

o organismo não consegue produzir um número suficiente de célulastronco, intrínsecas ao nicho tecidual lesado, para a sua regeneração. Desta forma, existe a possibilidade de serem utilizadas as célulastronco extrínsecas ao nicho, que podem ser obtidas do mesmo paciente, 15 neste caso obtidas de outro nicho, ou de um doador como, por exemplo, na transfusão sanguínea.

Quando ocorre uma lesão no organismo, esta leva a uma alteração na homeostase, resultando em uma alteração no ambiente celular ao redor do local danificado. O tecido lesionado emite sinais 20 para as células-tronco presentes no nicho tecidual (células-tronco intrínsecas) as quais secretam fatores tróficos estimulando a produção de células-tronco presentes nos demais tecidos do organismo. Estas proliferam e migram para o local injuriado, onde se diferenciam no tipo celular danificado resultando na regeneração do tecido.

As células-tronco extrínsecas podem ser utilizadas em três

diferentes tipos de transplantes. No transplante autólogo, também conhecido como transplante autogênico, as células-tronco transplantadas são do próprio indivíduo, ou seja, apresentam a mesma composição genética. Já no transplante alogênico as células-tronco transplantadas são derivadas de um doador diferente do receptor, 5 porém que tenha uma composição genética similar a do paciente, ou seja, um parente próximo como irmão ou irmã. No transplante heterólogo as células-tronco transplantadas são de um doador diferente do receptor, ou seja, possuem uma composição genética diferente a do paciente. Embora as células-tronco extrínsecas não se localizem na 10 região lesionada, elas atuam por meio dos mesmos mecanismos de ação das células-tronco intrínsecas. No entanto as células-tronco extrínsecas possuem uma ação adicional, que é o efeito antiinflamatório, imunomodulador e imunossupressor, potencializando, desta forma, a sua ação na regeneração tecidual.

As células-tronco tomaram-se foco de atenção terapêutica

em razão de seu potencial imunomodulatório, embora os mecanismos de imunossupressão sobre a resposta inflamatória e sobre os mecanismos de rejeição ao transplante não estejam totalmente elucidados (Patel et al., 2008).

Mediante um contato direto das células-tronco com um

tecido ou interação parácrima com o interferon-gama (INF-γ) produzido pelas células imunes do organismo, as células-tronco desencadeiam a liberação de diversos fatores solúveis que atuam sobre as células do sistema imunológico (linfócitos e células dendríticas). Dentre esses 25 fatores, estão as prostaglandinas (PGE2), as interleucinas (IL-4, IL-6, IL10), o fator de crescimento transformador beta (TGF-β), o fator de crescimento hepatoide (HGF) e a enzima indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) (Nauta 85 Fibbe, 2007). A liberação de TGF-β e HGF suprime a proliferação dos linfócitos TeB, enquanto que a liberação de PGE2 inibe a produção dos linfócitos T citotóxicos e demais citocinas pró5 inflamatórias enquanto a enzima IDO induz a apoptose dos linfócitos T. De forma análoga aos mecanismos anteriormente descritos, a IDO, PGE2 e TGF-β induzem à perda do potencial citotóxico das células natural killer (NK) (Nauta & Fibbe, 2007).

As células-tronco interferem na diferenciação, maturação e 10 ativação das células APC por meio da produção de IL-6 e de fator de crescimento estimulador de macrófago (M-CSF). Além disso, a liberação de PGE2 pelas células-tronco inibe a produção e secreção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e de INF-γ além de estimular a produção de citocina antiinflamatória IL-10 (Aggarwal & Pittenger, 2005; Nauta & 15 Fibbe, 2007).

O contato célula-célula faz com que ocorra a produção de diferentes tipos de fatores de crescimento solúveis, incluindo fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos (M-CSF e GM-CSF) e diversas 20 interleucinas (IL-1, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 15) que influenciam fibroblastos e células granulocíticas envolvidas no processo de inflamação (Caplan, 2009).

As células-tronco possuem a capacidade de se acumular ao redor de processos inflamatórios e tumorais quando administradas in vivo. Por esse motivo, podem ser utilizadas em situações clínicas como, por exemplo, terapia regenerativa, tratamento da doença do enxerto contra hospedeiro (Graft X Host disease) e terapia gênica para o câncer. Além disso, as células-tronco possuem a capacidade de imunomodular tipos celulares do sistema imune inato e do sistema imune adaptativo.

A lesão tecidual ocasionada por traumas ou agentes químicos e/ou infecciosos pode resultar em perda anatômica, funcional e da integridade dos tecidos. Imediatamente após a lesão uma seqüência complexa de eventos é desencadeada na tentativa de restaurar a integridade da área lesada. Um coágulo se forma logo nos primeiros minutos sendo que as plaquetas tornam-se ativadas liberando fatores de crescimento. Em seqüência, desenvolve-se um processo inflamatório envolvendo as células do sistema imune (poucas horas após a lesão), primeiramente neutrófílos, macrófagos e células dendríticas (resposta imune inata) e, posteriormente, linfócitos (resposta imune adquirida). Os macrófagos, além de iniciarem a resposta inflamatória, fagocitam os debris celulares. Substâncias antigênicas interagem com as células da resposta adaptativa, produzindo moléculas estimuladoras e mediadores inflamatórios que ativam mecanismos e células participantes do processo de reparação (Tsirogianni et al., 2006). As células-tronco expressam uma grande variedade de receptores para quimiocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, as células-tronco podem ser estimuladas pelas células residentes (nichos) a se diferenciar ou secretar fatores solúveis que estimularão outros nichos celulares. Portanto, acredita-se que as células-tronco adultas sejam recrutadas para o local de lesão através da liberação de sinais quimiotáticos e/ou aumento da expressão de moléculas de adesão especificas. Apresentação dos Problemas Existentes

As células-tronco são encontradas em todos os órgãos do organismo, sendo responsáveis pela sua manutenção durante toda a vida. Essa manutenção ocorre graças à sua plasticidade, capacidade de 5 auto-renovação e atividade de um grande número de moléculas bioativas, que atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual (Wan et al., 2008; Caplan, 2009).

Devido a sua capacidade de se diferenciar em diversos tipos 10 celulares, quando reintroduzidas no organismo e adquirir a funcionalidade de qualquer tecido, estas células apresentam um forte potencial nos processos de regeneração tecidual (Caplan, 2000, 2003). Desta forma, as células-tronco têm despertado um grande interesse na medicina regenerativa.

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Cinomose

A cinomose é uma doença infecto-contagiosa, causada por um vírus semelhante ao da peste bovina (Swango LJ., 1997) e ao do sarampo (Zee YC. 2003), o Morbilivirus da Família Paramyxoviridae A cinomose pode ter variações clínicas, ou seja, fase aguda,

subaguda ou crônica, com manifestações neurológicas, oftálmicas, cutâneas, gastroentéricas e respiratórias (Sherding RG, 2008).

Na maioria das vezes o vírus da cinomose atinge o encéfalo, podendo resultar em lesões degenerativas e/ou inflamatórias do Sistema Nervoso Central (SNC) (Moro L. e col, 2004). Os sinais clínicos de afecção do SNC pelo vírus da cinomose são considerados permanentes e incluem tremores, paraplegia, deambulação em círculos, convulsões parciais e generalizadas, hiperestesia e mioclonias (Sherding RG, 2008).

O prognóstico de animais infectados com o vírus da 5 cinomose depende das manifestações apresentadas, sendo nos casos agudos reservados aos sinais neurológicos (Swango LJ., 1997). Atualmente, não existe tratamento para este tipo de seqüela, o que tende a levar, nos casos mais graves, a eutanásia do animal (Sherding RG, 2008).

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Tecnologia em destaque Há empresas no mercado que utilizam o aspirado de medula óssea ou de gordura do mesmo animal (aspirado autólogo). Tal tratamento utiliza a fração mononuclear do expirado de medula ou de gordura que, em muitos casos, é controverso e apresenta resultados pouco reprodutivos. Esse procedimento é de baixa adesão tecnológica, pois se trata de uma mistura das células-tronco com os demais tipos celulares dos tecidos, como hemácias e células endoteliais. Desta forma este tipo de tratamento não pode ser chamado de terapia com célulastronco, mas sim de terapia celular. Isso apresenta uma grande diferença no resultado, uma vez que se sabe que o efeito trófico e capacidade regenerativa são características das células-tronco.

O procedimento de isolamento do aspirado da medula ou gordura que vem sendo utilizado no mercado, expõe o animal, já debilitado, a um procedimento cirúrgico para a obtenção do tecido de onde serão isoladas as células-tronco. Uma vez que o animal já está debilitado e estressado devido a trauma ou injúria, a qualidade das células-tronco isoladas ou do aspirado pode estar comprometida.

Apresentação da Solução em Liwhas Gerais

Durante os últimos anos pesquisadores tiveram suas

atenções voltadas para um novo e promissor campo da ciência. 0 estudo das células-tronco. Devido a suas principais características de auto-renovação e capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, abriram-se inúmeras perspectivas tanto no campo científico como no comercial.

Nos anos mais recentes surgiu um novo campo da ciência aplicada o qual se denominou engenharia de tecidos, também conhecido como medicina regenerativa. Este visa à cura de tecidos lesionados pela introdução local de células-tronco. Tal fato abril uma 15 grande perspectiva no campo veterinário, pois irá possibilitar a cura de lesões até então crônicas ou sem perspectiva como, por exemplo, lesões nervosas, artrites, lesões nos tendões e ruptura de ligamento suspensórios.

Em razão do grande crescimento da clinica médicaveterinária a terapia celular pode ser inserida como uma nova terapia para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida para diversas doenças que atingem os pequenos e/ou grandes animais.

Devido à dificuldade de se curar algumas injurias ou doenças de alta incidência com as tecnologias atuais, os profissionais da área de veterinária vem se mostrando interessados no desenvolvimento, conhecimento e aplicação de novas metodologias. 0 tratamento com células-tronco vem surgindo como uma nova e bastante promissora tecnologia visando a melhoria da qualidade de vida dos animais. Segundo os veterinários e fisioterapeutas da área, a terapia celular com células-tronco tende a ser a solução mais adequada e promissora para diferentes tipos de lesões e doenças que acometem os animais, sejam eles de pequeno ou grande porte.

O processo desenvolvido no invento pelo Depositante permite a realização de um procedimento de inserção de populações homogenias de células-tronco adultas (autólogas, alogênicas ou heterólogas) ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, antes ou após serem submetidas ao processo de criopreservação. A população homogenia de células-tronco possui a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares com ou sem a presença de indutores. Tal resultado possibilita a utilização das células-tronco em tratamentos autólogos, alogênicos e heterõlogos com ou sem a presença de agentes indutores e/ou biomateriais.

Tendo em vista o estágio atual do tratamento de animais acometidos por cinomose, fez-se necessário o desenvolvimento de um processo que resulte na melhoria da qualidade de vida destes animais. A presente invenção se caracteriza pelo o processo de utilização das células-tronco autólogas, heterólogas ou alogênicas, antes ou após serem submetidas ao processo de criopreservação ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em animais acometidos por cinomose. Tal processo visa à utilização do potencial terapêutico das células-tronco com o objetivo de curar e/ou melhorar a qualidade de vida dos animais. Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a similaridade morfológica das célulastronco antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação (aumento de IOx).

A figura 2 mostra a diferenciação osteogênica das células

tronco antes (A) e após (B) serem submetidas ao processo de criopreservação (aumento de 2 Ox). Marcação com Von Kossa demonstrando a calcificação da matéria extracelular após 21 dias de diferenciação.

A figura 3 mostra a diferenciação adipogênica das células

tronco antes (A) e após (B) serem submetidas ao processo de criopreservação. A marcação com Oil Red O demonstra o acúmulo de gotas lipídicas (seta) nas culturas que foram expostas ao processo de diferenciação (aumento de 40x em contraste de fase).

A figura 4 mostra a diferenciação condrogênica das células

tronco induzida com TGF-βΙ. Marcação positiva para azul de toluidina foi observada na cultura em pellet antes (A) e após (B) as células-tronco terem sido submetidas ao processo de criopreservação (aumento de 40 x).

A figura 5 mostra o processo de acesso à medula óssea,

visando à introdução das células-tronco pós-natais adultas pré ou póscriopreservadas ou seu respectivo concentrado diferenciado ou não, pela via medular utilizando agulha jamshidi ou agulha illinois, objetivando o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico.

A figura 6 mostra o processo de introdução das células

tronco pós-natais adultas pré ou pós-criopreservadas ou seu respectivo concentrado diferenciado ou não, pela via medular, objetivando o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção tem como meta o processo de utilização de células-tronco pós-natais adultas pré ou póscriopreservadas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou 10 alogênico, utilizando as vias, endovenosa, intraperitonial ou intramedular visando a cura e/ou melhoria da qualidade de vida de animais acometidos por cinomose.

As células-tronco pós-natais adultas, demonstraram manter suas características de proliferação e diferenciação mesmo após 15 serem submetidas ao processo de criopreservação, possibilitando a utilização de células-tronco pré ou pós-criopreservadas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em animais acometidos pela cinomose (Figura 1).

Tal invenção também objetiva viabilizar o tratamento de animais acometidos pela cinomose por meio da utilização de célulastronco autólogas, heterólogas ou alogênicas a partir de um banco de células-tronco.

Nossa empresa possui um banco de células-tronco de pequenos e grandes animais as quais são utilizadas nos procedimentos terapêuticos. Nosso banco de células-tronco utiliza basicamente três tipos de células: autólogas (células isoladas e armazenadas do mesmo indivíduo), alogênicas (células isoladas e armazenadas de animais geneticamente similares) ou heterólogas (células obtidas e armazenadas de outro indivíduo jovem e saudável da mesma espécie).

Trata-se a presente invenção da utilização das célulastronco pós-natais adultas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em tratamentos de animais acometidos pela cinomose.

A presente invenção destina-se também a utilização das células-tronco heterólogas, alogênicas ou autólogas, submetidas ou não ao processo de criopreservação, seus concentrados, diferenciados ou 10 não, modificados ou não de forma a poderem ser utilizados na engenharia tecidual, terapia gênica ou celular assim como em estudos in-vitro envolvendo drogas ou produtos farmacêuticos e/ou biotecnológicos visando a cura e/oua melhoria da qualidade de vida de animais acometidos pela cinomose.

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Descrição Detalhada da Invenção

Nos últimos anos, uma nova área da medicina, denominada medicina regenerativa, vem sendo desenvolvida, abrindo perspectivas 20 inovadoras para o tratamento de doenças consideradas até então incuráveis. 0 uso de células-tronco para o reparo de órgãos e tecidos lesados abre as portas para uma nova era da medicina batizada de medicina regenerativa. Desta forma, as células-tronco demonstram ter um potencial revolucionário, graças às suas características biológicas. 25 Uma das primeiras terapias com células-tronco utilizadas nos últimos 50 anos foi o transplante heterólogo de medula óssea (aspirado de medula).

Sabe-se que as células-tronco são encontradas em todos os órgãos do organismo, sendo responsáveis pela sua manutenção durante toda a vida do indivíduo. Essa manutenção ocorre graças à sua plasticidade, capacidade de auto-renovação e atividade de um grande número de moléculas bioativas as quais atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual.

A presente invenção tem como meta o estabelecimento de processos de utilização de células-tronco adultas pré ou póscriopreservadas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em animais acometidos por cinomose.

De acordo com a presente invenção as células-tronco adultas pré ou pós-criopreservadas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, são particularmente utilizadas em animais acometidos por cinomose, por meio das vias endovenosa, intraperitonial ou intramedular.

A presente invenção objetiva também o estabelecimento de um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, e/ou melhoria da qualidade de vida de animais acometidos pela cinomose e possíveis doenças secundárias a cinomose.

Sendo uma população de células-tronco homogênia, as células se diferenciam de forma uniforme para os diferentes tipos celulares o que possibilita uma efetiva e ampla substituição das populações de células deficientes e/ou danificadas presentes no tecido lesado.

Armazenamento das Células-Tronco Na presente invenção, o meio de criopreservação pode

conter soros sintéticos ou não, fetal bovino ou humano ou de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, em uma concentração de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 20%. A concentração de meio, preferencialmente DMEM/F12 ou 10 DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, pode variar de 80% a 60% e a do criopreservador dimetilsulfõxido (DMSO) de 5% a 20%, podendo este ser substituído por glicerol. Em ambos os casos as concentrações 15 preferenciais são de 70% e 10% respectivamente. Posteriormente, a temperatura é gradualmente reduzida, aproximadamente I0C por minuto até a temperatura de - 80°C, sendo transferida após no máximo um ano, preferencialmente aproximadamente 24 horas, para um botijão de nitrogênio líquido. Posteriormente as células-tronco são testadas 20 quanto a sua morfologia (Figura 1) e diferenciação in vitro (Figuras 2, 3 e 4).

Processo de Expansão das Células-Tronco As células-tronco isoladas a partir de nichos dos tecidos/órgãos de pequenos e grandes animais são capazes de se autorenovar, proliferar continuamente e se diferenciarem em tipo celulares derivados de diferentes folhetos embrionários como, por exemplo, mesoderma (gordura, osso e cartilagem) e ectoderma (neurônios).

As células-tronco expandidas em cultura são dissociadas por meio do seguinte processo. 0 meio de cultivo é inicialmente descartado sendo as células-tronco, lavadas duas vezes com solução tampão PBS ou D-PBS (as soluções tampões utilizadas para lavagem das células podem ser phosphate-buffered sáline (PBS - 0,01M, ph= 7,4) e/ou phosphate-buffered saline A (PBS-A - 0,01M, ph= 7,4)) ou mistura dos mesmos, dissociadas na presença de uma solução de tripsina/EDTA, pelo mentos 0,05% (Life Technologies), ou Triple Express (Life Technologies), e transferidas, após adicionar “meio apropriado”, da garrafa para um tubo falcon, centrifugadas à aproximadamente 500g por 5 minutos, onde o sobrenadante é desprezado sendo o pellet posteriormente ressuspendido preferencialmente em 2ml de “meio apropriado” sendo metade, no caso lml, transferido para uma nova garrafa de cultura de 25 cm2 sendo o outro lml para outra garrafa de 25 cm2, a cada uma das garrafas acrescenta-se 4ml do meio de cultura, “meio apropriado”, podendo também se transferir 2ml para uma garrafa de 75 cm2 acrescentando-se IOml do “meio apropriado”

De acordo com a presente invenção, o “meio apropriado” da presente etapa refere-se a meios de cultura de células-tronco capazes de promover o isolamento de populações homogenias e puras de células-tronco como, por exemplo, o meio DMEM-HIGH (Dulbecco's 25 modified Eaglees's médium high glucose, Life Technologies) ou DMEM/Fl2 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12, Life Technologies) ou ALFA-MEM (Minimum Essential Médium, Life Technologies) ou DMEM-LOW (Dulbecco's modified Eaglees's médium Iow glucose, Life Technologies) ou RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos.

O meio em questão deve ser suplementado, de acordo com o processo, como variações de 10% a 30% de soro sendo preferencialmente Utilizada à concentração de 15%. A presente invenção utiliza particularmente o soro de origem bovina (FSB, HyClone, 10 Washington) não descartando porém a possível utilização de soros sintéticos ou não, humanos e de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, que possam ser empregados na presente inovação. A utilização de outros reagentes sintéticos ou não, que propiciem uma maior eficiência no processo de isolamento das células-tronco, inclusive 15 associação dos mesmos, devem ser considerados na presente invenção, pois estão relacionados nas variações e aprimoramentos do processo como relatado anteriormente.

0 meio para cultivo de células-tronco pode ser suplementado como antibiótico, em particular penicilina e/ou estreptomicina, e/ou aminoãcidos como, por exemplo, glutamina e outros aminoãcidos não-essenciais ou o conjunto dos mesmos.

Na presente inovação o processo de criopreservação das células-tronco ocorre quando as células são ressuspensas em meio apropriado. Na presente invenção, o meio de criopreservação pode conter preferencialmente soro fetal bovino podendo ser utilizado soros sintéticos ou não, humano ou de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, em uma concentração de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente ã concentração de 20%. A concentração de DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou DMEM-LOW ou ALFA-MEM ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, pode variar de 80% a 60% e a do criopreservador dimetilsulfóxido (DMSO) de 5% a 20%, podendo este ser substituído por glicerol. Em ambos os casos a concentração preferencial é de 70% e 10% respectivamente.

Após as células-tronco serem ressuspensas em meio de criopreservação apropriado, as mesmas são armazenadas em criotubos em concentrações que podem variar de 5 x IO5 a 3 x IO6 células-tronco por ml. A temperatura é gradualmente reduzida, aproximadamente I0C por minuto até a temperatura de - 80°C, sendo transferida após no máximo um ano, preferencialmente 24 horas, para um botijão de nitrogênio líquido.

Para descongelar as células, os criotubos são colocados em banho-maria e mantidos por 1 à 5 minutos, preferencialmente 2 minutos, podendo ser também descongelados a temperatura ambiente, sendo posteriormente adicionado meio contendo, preferencialmente, 20% de soro fetal bovino, podendo ser utilizado soros sintéticos ou não, humano ou de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, e 80% de DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, e este introduzido em garrafa de cultivo, preferencialmente T25. No dia seguinte o meio é substituído pelo “meio apropriado”. Diferenciação Osteogênica As células-tronco isoladas a partir de nichos presentes em tecidos/órgãos foram capazes de se diferenciar para osteoblastos uma vez que também apresentaram sinais de mineralização (Figura 2).

As células-tronco isoladas foram cultivadas em meio

(DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina) durante o período de 24 horas na concentração inicial de IxlO5 células. Após as 10 24 horas o meio foi trocado para o de diferenciação osteogênica (DMEMHIGH ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 1% de IO 5M de dexamethasone + 1% 5 mM de acido ascórbico + 10% de soro fetal bovino + 1% Streptomicina/Penicilina). A trocar o meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. 15 No dia 10 foi adicionado 1% de 200 mM de β-glicerolfosfato ao meio de cultura e nas trocas subsequentes. As células foram mantidas em cultura até o 21° dia de diferenciação. A caracterização das células foi feita por meio da coloração de Von Kossa (Figura 2). O cultivo controle foi mantido em meio durante todo experimento (DMEM-HIGH ou 20 DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina).

Na técnica de Von Kossa as células foram lavadas com solução tampão fosfato salina PBSA Ix por 2 minutos e fixadas com 5 mL de solução de paraformaldeído a 4% em PBSA5 por 1 hora. A seguir as células foram expostas à luz UV em presença de uma solução de nitrato de prata 1% por 45 minutos. As células forma lavadas Ix com água destilada aplicando posteriormente solução de Tiossulfato de sódio 3% por 5 minutos sendo novamente lavadas com água destilada. Aplicou-se o corante de Von Gieson (1% de fucsina, 49% de ácido pícrico 5 saturado e 50% de água destilada) por 5 minutos utilizando álcool 70% para remoção do corante sendo as imagens capturadas sob o microscópio Nikon Eclipse Ti-S, Japan. Os dados demonstraram que as células-tronco pós-natais adulas são capazes de gerar osso “in uitro”.

Diferenciação Adipogènica

As células-tronco isoladas a partir de nichos presentes em tecidos/ órgãos foram capazes, através do protocolo descrito a seguir, de se diferenciarem em adipócitos (Figura 3).

Para induzir a diferenciação adipogènica cultivamos IxlO5 células-tronco em meio de cultivo (DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina) durante 24 horas. Em seguida o meio basal foi trocado para o meio de diferenciação (DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 0,25M Isobutilmetilxantina +10 μΜ Insulina + 10% de Soro Fetal Bovino + 1% Streptomicina/Penicilina). A troca do meio foi realizada a cada 3 ou 4 dias. As células foram mantidas em cultura até o 21° dia. Após este período, as células foram fixadas por 60 minutos a temperatura ambiente com paraformaldéido 4% e lavadas 3 vezes com etanol 70%. Para serem coradas, as células foram encubadas a temperatura ambiente por 5 minutos com Oil Red O sendo posteriormente lavadas 3 vezes com água destilada. Os dados demonstraram que as células-tronco pós-natais adulas são capazes de gerar gordura “in vitro”.

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Diferenciação Condrogênica As células-tronco isoladas a partir de nichos presentes em tecidos/órgãos foram capazes, por meio do protocolo descrito a seguir, de se diferenciarem em tecido cartilaginoso (Figura 4).

Para diferenciação condrogênica, as células-tronco foram

transferidas na concentração 1 x IO6 células-tronco para tubos falcon de 15 ml, centrifugadas a 500g por 5 minutos e cultivadas em na presença de meio DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, com 1% 15 soro fetal bovino, 6.25 mM insulina, 10 ng/ml TGF-βΙ e 1% penicilina. A troca do meio indutor foi realizada diariamente durante 21 dias. Após este período ocorreu à formação de um pellet esférico o qual foi fixado e incluso em parafina para serem posteriormente cortadas e posteriormente analisadas a nível histológico. Obtiveram-se cortes 20 histológicos de 3μπι, das amostras fixadas, que foram corados com azul de toluidina demonstrando coloração positiva. Introdução de Células-Tronco ou Seu Respectivo Concentrado, Pré ou Pó s - Crio pre servado s, Diferenciados ou Não, em Animais Acometidos por

Cinomose

As células-tronco pós-natais adultas ou seus respectivos 5 concentrados, pré ou pós-criopreservados, diferenciados ou não, podem ser expostas a alterações celulares e/ou genéticas, e/ou utilizadas na terapia genética ou celular, engenharia tecidual bem como modelo in vitro para estudos da indústria farmacêutica e/ou biotecnológica.

O processo desenvolvido na presente invenção compreende 10 a aplicação das células-tronco e/ou concentrados, pré ou póscriopreservados, no estado diferenciado ou não, in vitro ou in vivo, em conjunto com diferentes tipos de arabouços, fatores que possam auxiliar no processo de regeneração tecidual e/ou como veículo para carreamento e introdução de estruturas moleculares modificadas e/ou 15 não, visando à terapia gênica e/ou celular.

Processo de Preparo para a Introdução das Células-Tronco ou seu Respectivo Concentrado, Pré ou Pós-Criopreservados. Diferenciados ou Não, em Animais Acometidos por Cinomose Os tubos criogênicos contendo as células-tronco ou seu

respectivo concentrado, diferenciado ou não, encontram-se inicialmente armazenados em gelo seco ou nitrogênio líquido. As células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, presentes em tubos criogênicos encontram-se em concentrações que variam de 1 milhão a 3 25 milhões de células-tronco, preferencialmente 2 milhões. As célulastronco presentes nos criotubos são expostas a temperaturas entre 20 0C a 45°C, preferencialmente 37°C, durante um período que pode variar de

1 minuto à 5 minutos, preferencialmente 2 minutos, para que sejam descongeladas. Retira-se o conteúdo líquido do tubo criogênico utilizando, por exemplo, uma pipeta Pasteur ou objeto similar que exerça a mesma função, transferindo-o para um tubo cônico, por exemplo, falcon, contendo a solução de descongelamento constituída por “meio apropriado de descongelamento”. De acordo com a presente invenção, o “meio apropriado” da presente etapa refere-se a meios de cultura capazes de promover a inativação do DMSO ou glicerol, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos. A solução é lentamente homogeneizada, por exemplo, com o auxilio da pipeta Pasteur e centrifugadas à aproximadamente 500g por 5 minutos. O conteúdo líquido (sobrenadante) com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo, é desprezado sendo o pellet posteriormente ressuspendido em “meio apropriado” da solução de lavagem. A primeira solução de lavagem da presente invenção é constituída de “meio apropriado” acrescido de possíveis variações e aprimoramentos. A solução é lentamente homogeneizada com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo, e centrifugada à aproximadamente 500g por 5 minutos. O conteúdo líquido (sobrenadante) com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo, é desprezado sendo o pellet posteriormente ressuspendido em “meio apropriado” da solução de lavagem dois. A solução de lavagem dois é constituída por PBS ou DPBS ou solução fisiológica ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos. A solução é lentamente homogeneizada com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo, e centrifugada à aproximadamente 500g por 5 minutos, desprezado o conteúdo líquido (sobrenadante) com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo, sendo o pellet posteriormente ressuspendido em “meio apropriado” da solução de lavagem três. A solução de lavagem três é 5 constituída por PBS ou DPBS ou solução fisiológica ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos. A solução é lentamente homogeneizada com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo, e centrifugada à aproximadamente 500g por 5 minutos, desprezado o 10 conteúdo líquido (sobrenadante) com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo. O pellet é posteriormente ressuspenso em “meio apropriado” da solução de aplicação. A solução de aplicação é constituída por “meio apropriado” ou PBS ou DPBS ou solução fisiológica ou concentrado sintético ou não, de origem animal ou humana ou mistura de dois ou 15 mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos. A solução de aplicação é lentamente homogeneizada com auxilio da pipeta Pasteur, por exemplo, e transferida para seringa. A seringa é mantida a temperatura ambiente ou em ambiente refrigerado até o momento da aplicação.

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Vias de Inoculacão das Células-Tronco em Animais Acometidos por

Cinomose

0 processo desenvolvido na invenção presente estabelece as condições preferências para que o animal acometido por cinomse seja submetido a inoculação das células-tronco ou seu respectivo concentrado, pré ou pós-criopreservado, diferenciado ou não. Os animais devem ser submetidos preferencialmente a uma análise clínica de forma a descartar tumores e/ou infecções. Os animais devem ser preferencialmente analisados a nível laboratorial por meio de testes bioquímicos e/ ou imunológicos assim como ser submetido a análise de ultrason e/ou raio-x.

Via de Inoculacão de Células-Tronco Via Endovenosa

Inicialmente ê feito o procedimento de acesso a veia do animal de preferência a veia femoral. Após ser feito o acesso, a suspensão celular, ressuspensa na solução de aplicação, é introduzida lentamente, preferencialmente com auxilio de uma seringa e cateter sendo introduzido pelo menos 1 milhão de células-tronco pós-natais adultas ou seu respectivo concentrado, pré ou pós-criopreservado, diferenciado ou não. O volume de solução utilizado para a administração da suspensão celular na veia femoral é preferencialmente de 3 ml.

Inoculacão de Células-Tronco Via Peritonial Após ser feito o acesso na região peritoneal, a suspensão celular, ressuspensa na solução de aplicação, é aplicada lentamente, preferencialmente com auxilio de uma seringa e cateter, sendo introduzido pelo menos 1 milhão de células-tronco pós-natais adultas ou seu respectivo concentrado, pré ou pós-criopreservado, diferenciado ou não. O volume de solução utilizado para a administração da suspensão celular na região peritoneal é preferencialmente de 3 ml. Inoculacão de Células-Tronco Via Intra-meduiar A indução anestésica é obtida preferencialmente através da medicação pré-anestésica Tramadol 4 mg/kg IM, seguida de indução ao efeito de Propofol 8 mg/kg IV e de manutenção com Isoflurano ao efeito.

A aplicação é preferencialmente feita através da injeção da suspensão celular na região do externo sendo possível a aplicação em outras regiões que permitam o acesso a medula (Figura 5 e 6). Após o acesso ser efetuado a suspensão celular, ressuspensa na solução de aplicação, é introduzida lentamente, preferencialmente com auxilio de uma 10 seringa e cateter, sendo introduzido pelo menos 1 milhão de célulastronco pós-natais adultas ou seu respectivo concentrado, pré ou póscriopreservado, diferenciado ou não. O volume de solução utilizado para a administração no espaço espinhal Utilizado é preferencialmente de 0,3 ml/kg, valor sugerido por Otero (2005). No pós-operatório imediato é 15 administrado preferencialmente Cefalexina 30 mg/ kg IV e Meloxicam

0,2 mg/kg IV em dose única. O paciente é então encaminhado para a recuperação anestésica. Preferencialmente, a Cefalexina é mantida na mesma dose por via oral a cada 12 horas, durante 7 dias.

0 número de transplantes de células-tronco pós-natais

adultas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, pré ou póscriopreservado realizados em animais acometidos por cinomose é preferencialmente de três transplantes, com intervalo de 30 dias entre cada transplante.

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Claims (67)

1. A presente invenção permitiu que o inventor desenvolve-se métodos para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida de animais acometidos pela cinomose. Tais métodos compreendem aspectos relativos a aplicação em pacientes, quantidades terapeuticamente eficazes das células-tronco e/ou concentrado celular diferenciados ou não, pré ou pró-criopreservadas assim como as inúmeras possibilidades de tratamento para cinomose. O Processo em questão tem como meta a utilização do potencial das células-tronco objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, como uma forma de melhorar a qualidade de vida dos animais que sofrem de cinomose. Para tal, são introduzidas, por diferentes processos de aplicação, células-tronco pósnatais adultas autólogas, heterólogas ou alogênicas ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, criopreservadas ou não, objetivando um processo para o tratamento e/ ou melhoria da qualidade de vida de animais acometidos por cinomose. Atualmente sabe-se que o tratamento utilizando um concentrado heterólogo ou alogênico de células-tronco pós-natais adultas apresenta um grande potencial, uma vez que eliminam a necessidade de submeter um paciente já debilitado a um procedimento de retirada de tecido de onde serão isoladas as células-tronco. A existência de células-tronco do animal doente, previamente armazenadas quando este ainda se apresentava saudável, possibilita o tratamento autólogo. Uma vez que o animal já está debilitado e estressado devido a trauma ou injúria, a qualidade das células-tronco isoladas pode estar comprometida. O Processo desenvolvido no invento pelo Depositante permite a utilização das células-tronco em tratamentos autólogos, alogênicos e heterólogos com ou sem a presença de agentes indutores, de animais acometidos por cinomose. O presente pedido refere-se ao Processo que permitiu ao inventor desenvolver métodos para o tratamento de animais acometidos por cinomose. O Processo desenvolvido pelo Depositante compreende aspectos relativos as vias de aplicação, quantidades terapeuticamente eficazes das células-tronco ou concentrados celulares, diferenciados ou não, pré ou pós-criopreservados assim como as inúmeras possibilidades de tratamento voltados para cinomose por meio de aplicações terapêuticas autóloga, heterólogaou alogênica.1. PROCESSO PARA A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO EM ANIMAIS ACOMETIDOS POR CINOMOSE caracterizado por: (a) introdução endovenosa; (b) introdução peritoneal; (c) introdução intramedular;

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por serem células-tronco pós-natais adultas a serem obtidas a partir de nichos de células-tronco presentes nos tecidos/ órgãos dos animais.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado por serem de animais.

4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 3, caracterizado por serem de animais recém nascidos, jovens, adultos ou velhos.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 4, caracterizado pelo fato de serem células-tronco obtidas a partir de tecidos ou órgãos normais.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser utilizado pelo menos 0.05% de tripisina ou Tryple-Express no processo de expansão das células-tronco à serem utilizadas.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio DMEM-HIGH, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio DMEM-LOW, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio DMEM/F12, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio ALFA-MEM, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio RPMI, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 7 a 11, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado ã mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

13. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 7 à 12, caracterizado pelo fato do meio ser suplementado por no mínimo 10% de soro.

14. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 7 ã 12, caracterizado pelo fato do meio ser suplementado com cerca de 15% de soro.

15. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 13 e 14, caracterizado pelo fato do dito soro se de origem sintética ou não, humana ou animal ou mistura de dois ou mais dos mesmos.

16. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 13 à 14, caracterizado pelo fato do dito soro se de origem bovina.

17. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 7 à 11, caracterizado pelo fato do meio não ser suplementado com soro.

18. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 7 à 11, caracterizado pelo fato do dito meio conter adicionalmente antibióticos e/ou aminoãcidos.

19. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 7 à 11, caracterizado pelo fato do dito meio não conter adicionalmente antibióticos e/ou aminoãcidos.

20. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 1 à 19, caracterizado pelo fato da expansão da cultura de células-tronco ser contínua compreendendo repiques

21. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 1 à 19, caracterizado pelo fato da cultura de células-tronco em expansão ser mantida semiconfluente.

22. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 1 à 19, caracterizado pelo fato da cultura de células-tronco ser dissociada na etapa de repique através de meios mecânicos e/ou enzimáticos.

23. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato das células serem congeladas em seu estágio in diferenciado.

24. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato das células serem congeladas após serem diferenciadas ou pré-diferenciadas.

25. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato do concentrado celular indiferenciado ser congelado.

26. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato do concentrado celular diferenciado ou prédiferenciado ser congelado.

27. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 23 a 26, caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração de soro de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente ã concentração de 20%.

28. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 23 e 26, caracterizado pelo fato do dito soro se de origem sintética ou não, humana ou animal ou mistura de dois ou mais dos mesmos.

29. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 23 e 26, caracterizado pelo fato do meio não ser suplementado com soro.

30. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 23 e 26, caracterizado pelo fato do dito meio conter adicionalmente antibióticos e/ou aminoãcidos.

31. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 23 e 26, caracterizado pelo fato do dito meio não conter adicionalmente antibióticos e/ou aminoãcidos.

32. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 23 a 26, caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração de DMEM/Fl2 ou ALFA-MEM ou DMEM-HIGH ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois mais dos respectivos, de 80% a 60% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 70%.

33. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 23 a 26, caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração do criopreservador dimetilsulfóxido (DMSO) ou glicerol de 5% a 20% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 10%.

34. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelas células-tronco ou seu respectivo concentrado celular, diferenciado ou não, serem armazenadas em criotubos em concentrações celulares que podem variar de 5 x IO5 a 3 x IO6 células por ml sendo Utilizado preferencialmente à concentração de 2 x IO6 células por ml.

35. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelos criotubos contendo concentrações celulares que podem variar de 5 x IO5 a 3 x IO6 células por ml de células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, a serem transportados em gelos seco ou nitrogênio líquido.

36. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo transporte células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em seringas contendo “meio apropriado” ou PBS ou DPBS ou solução fisiológica ou concentrado, sintético ou não, de origem animal ou humana ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos, a temperatura ambiente ou em ambiente refrigerado.

37. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelos criotubos contendo concentrações que podem variar de 5 x IO5 a 3 x IO6 células por ml de células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, sendo utilizado preferencialmente à concentração de 2 x IO6 células por ml, a serem expostos a temperaturas entre 10 0C a 45°C, preferencialmente 37°C, durante um período que pode variar de 1 minuto à 5 minutos, preferencialmente 2 minutos, para que sejam descongeladas.

38. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela utilização de um “meio apropriado” para promover a inativação do DMSO ou glicerol. O “meio apropriado” é composto por DMEM-HIGH (Dulbecco's modified Eaglees's médium high glucose, Life Technologies) ou DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12, Life Technologies) ou ALFA-MEM (Minimum Essential Medium, Life Technologies) ou DMEM-LOW (Dulbecco's modified Eaglees's médium Iow glucose, Life Technologies) ou RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) ou a mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos.

39. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela pelo “meio apropriado” ser ou não suplementado como variações de 5% a 30% de soro sendo preferencialmente utilizada ã concentração de 15%. A presente invenção utiliza particularmente o soro de origem bovina (FSB, HyClone, Washington) não descartando porém a possível utilização de soros sintéticos ou não, humanos e de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, que possam ser empregados na presente inovação.

40. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo “meio apropriado” ser ou não suplementado com antibiótico, em particular penicilina e/ou estreptomicina, e/ou aminoãcidos como, por exemplo, glutamina e outros aminoãcidos nãoessenciais ou o conjunto dos mesmos

41. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado por lavagens sucessivas das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, com “meio apropriado” ou PBS ou DPBS ou solução fisiológica ou concentrado, sintético ou não, de origem animal ou humana ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos.

42. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, de homogeneização de células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, caracterizado por ressuspender as células-tronco ou concentrado celular em “meio apropriado” ou PBS ou DPBS ou solução fisiológica ou concentrado, sintético ou não, de origem animal ou humana ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos.

43. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 15, 28, 36,39, 41 e 42, caracterizado pela utilização de reagentes sintéticos ou não, que propiciem uma maior eficiência no processo, inclusive associação dos mesmos, e variações e aprimoramentos relacionados aos mesmos.

44. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, de centrifugação das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, por aproximadamente 500g por aproximadamente minutos antes de serem homogeneizadas.

45. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, de análise clínicas dos Einimais que serão submetidos a introdução das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não pelas vias peritoneal e/ou endovenosae/ou intra-medular.

46. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5 e 45, de análise clínica ser laboratorial.

47. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 46, de análise clínica ser laboratorial ser bioquímica e/ou imunológica.

48. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5 e 44 a 47, dos animais preferencialmente não serem acometidos por tumores e/ou infecções.

49. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5 e 44 a48, dos animais preferencialmente serem submetido a análise de ultrason e/ou raio-x.

50. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, de introdução das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, para a região lesionada pela via peritonial.

51. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, de introdução das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, para a região lesionada pela via endovenosa.

52. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, de introdução das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, para a região lesionada pela via intra-medular.

53. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, de introdução das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, para a região lesionada pela via peritoneal e/ou endovenosa e/ou intra-medular.

54. CÉLULAS-TRONCO PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de nichos presentes em tecidos e/ou órgãos de animais.

55. CONCENTRADO CELULAR PRÉ OU PÓSCRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir de nichos de células-tronco presentes em tecidos e/ou órgãos de animais.

56. CONCENTRADO CELULAR PRÉ OU PÓSCRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender células-tronco.

57. CONCENTRADO CELULAR PRÉ-DIFERENCIADO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender células pré-diferenciadas.

58. CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender células diferenciadas.

59. USO DE CÉLULAS-TRONCO AUTÓLOGAS, ALOGÊNICAS OU HETERÓLOGAS, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para a terapia de animais acometidos pela cinomose.

60. USO DE CÉLULAS-TRONCO AUTÓLOGAS, ALOGÊNICAS OU HETERÓLOGAS, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para 0 tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida, de animais acometidos pela cinomose.

61. USO DE CONCENTRADO CELULAR AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÓLOGO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO COMPREENDENDO CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para a terapia de animais acometidos pela cinomose.

62. USO DE CONCENTRADO CELULAR AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÓLOGO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO COMPREENDENDO CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida, de animais acometidos pela cinomose.

63. USO DE CONCENTRADO CELULAR PRÉDIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÓLOGO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para a terapia de animais acometidos pela cinomose.

64. USO DE CONCENTRADO CELULAR PRÉDIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÓLOGO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida, de animais acometidos pela cinomose.

65. USO DE CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÓLOGO, PRÉ OU PÓSCRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para a terapia de animais acometidos pela cinomose.

66. USO DE CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÓLOGO, PRÉ OU PÓSCRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida, de animais acometidos pela cinomose.

67. MÉTODO PARA O TRATAMENTO E/OU MELHORIA DA QUALIDADE DE VIDA DE ANIMAIS, de acordo com as reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de ser para tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida de animais acometidos pela cinomose.