BR102012032972B1 - cellulase and hemicellulases production process using partially hydrolyzed cellulose, use of partially hydrolyzed cellulose, and substrate comprising partially hydrolyzed cellulose - Google Patents
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Abstract
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES EMPREGANDO CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA, USO DE CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA, E, SUBSTRATO COMPREENDENDO CELULOSE PARCIALMENTE HIDROLISADA A presente invenção se refere a um processo de produção de celulases caracterizado por compreender pré-hidrólise de celulose e inoculação de celulose pré-hidrolisada, açucares liberados da pré hidrolise e cultura de crescimento de Penicillium echinulatum com Penicillium echinulatum.PROCESS OF PRODUCTION OF CELLULASES AND HEMICELLULASES USING PARTIALLY HYDROLYZED CELLULOSE, USE OF PARTIALLY HYDROLYZED CELLULOSE, AND, SUBSTRATE UNDERSTANDING PARTIALLY HYDROLYZED CELLULOSE The present invention refers to a cellulose production process characterized by understanding pre-hydrolysis of cellulose -hydrolyzed, sugars released from pre-hydrolysis and growth culture of Penicillium echinulatum with Penicillium echinulatum.
Description
A presente invenção se refere a um processo de produção de enzimas, especialmente celulases e/ou hemicelulases, utilizando como substrato celulose parcialmente hidrolisada como fonte indutora e de carbono. Em uma realização preferencial, os indutores liberados da hidrólise parcial da celulose são adicionados ao meio de cultivo para obter maiores produções de enzimas e em outra realização, a celulose parcialmente hidrolisada é acrescida ao meio de cultivo. A presente invenção se situa no campo da biologia, química e bioquímica.The present invention relates to a process for the production of enzymes, especially cellulases and / or hemicellulases, using partially hydrolyzed cellulose as an inducer and carbon source as substrate. In a preferred embodiment, the inducers released from the partial hydrolysis of the cellulose are added to the culture medium to obtain greater production of enzymes and in another embodiment, the partially hydrolyzed cellulose is added to the culture medium. The present invention is in the field of biology, chemistry and biochemistry.
As celulases são constituídas por um complexo enzimático constituído por 1) endo-β-1,4-glicanases que hidrolisam as ligações glicosídicas ao acaso na fibra de celulose; 2) exo- β-1,4-glicanases ou celobiohidrolases, que agem nas extremidades redutoras e não redutoras de polímeros gerados pela ação das endoglicanases liberando oligossacarídeos e celobiose; e 3) β-1,4-glicosidases que hidrolisam oligossacarídeos e celobiose a glicose.Cellulases are constituted by an enzymatic complex consisting of 1) endo-β-1,4-glycanases that hydrolyze the glycosidic bonds at random in the cellulose fiber; 2) exo- β-1,4-glycanases or cellobiohydrolases, which act on the reducing and non-reducing ends of polymers generated by the action of endoglycanases, releasing oligosaccharides and cellobiosis; and 3) β-1,4-glycosidases that hydrolyze oligosaccharides and glucose cellobiosis.
A hidrólise de celulose a glicose tem cada vez mais importância, pois este açúcar pode ser utilizado como matéria-prima em uma série de processos biotecnológicos e químicos. Nas últimas décadas, as tecnologias baseadas na atividade de celulases vêm despertando cada vez mais interesse. A investigação para encontrar substratos adequados para produção de biocombustíveis tais como etanol de segunda geração tem sido de particular interesse. Além disso, a celulose é encontrada em substratos de baixo custo, tais como bagaços, serragens, resíduos da agricultura e no lixo urbano. No entanto, para que a celulose seja hidrolisada faz-se necessário o uso de enzimas (celulases) ou ácidos. A opção enzimática é mais promissora devido ao fato desta gerar menores quantidades de produtos de degradação, além das enzimas não serem corrosivas.The hydrolysis of cellulose to glucose is increasingly important, as this sugar can be used as raw material in a series of biotechnological and chemical processes. In the last decades, technologies based on the activity of cellulases have aroused more and more interest. The research to find suitable substrates for the production of biofuels such as second generation ethanol has been of particular interest. In addition, cellulose is found in low-cost substrates, such as bagasse, sawdust, agricultural waste and urban waste. However, for cellulose to be hydrolyzed it is necessary to use enzymes (cellulases) or acids. The enzymatic option is more promising due to the fact that it generates smaller amounts of degradation products, in addition to the non-corrosive enzymes.
No processo de produção de celulases, a celulose é adicionada ao meio de cultivo para servir como fonte indutora. No entanto, devido ao grande tamanho das fibras de celulose, as quais são constituídas por 8.000 a 12.000 unidades glicopiranosídicas, estas moléculas não são capazes de entrar no interior da célula e acionar o mecanismo de regulação gênica que controla a produção das enzimas do complexo celulases. Assim, celulases constitutivas presentes na parede celular do conídio ou da parede celular, realizam uma hidrólise parcial da fibra de celulose, liberando assim dissacarídeos e monossacarídeos que são capazes de entrar na célula e acionar o mecanismo de produção de celulases. Intracelularmente, monossacarídeos, como a glicose também podem ser convertidos a dissacarídeos por ação de β-glicosidases.In the cellulose production process, cellulose is added to the culture medium to serve as an inducing source. However, due to the large size of the cellulose fibers, which are made up of 8,000 to 12,000 glycopyranoside units, these molecules are not able to enter the interior of the cell and activate the mechanism of gene regulation that controls the production of the enzymes of the cellulases complex. . Thus, constitutive cellulases present in the cell wall of the conidium or cell wall, perform a partial hydrolysis of the cellulose fiber, thus releasing disaccharides and monosaccharides that are able to enter the cell and activate the cellulases production mechanism. Intracellularly, monosaccharides, such as glucose, can also be converted to disaccharides by the action of β-glycosidases.
No entanto, estes dissacarídeos gerados por hidrólise do substrato ou transglicosilação são gerados em pequenas quantidades, o que resulta em produção de enzimas para a manutenção da célula, não incrementando a produção de celulases como se deseja para tornar o processo de produção de celulases rentável economicamente. Neste sentido, uma alternativa é a suplementação do meio de cultivo com estes dissacarídeos. Porém, o uso destes açúcares para produção comercial de celulases torna-se inviável devido aos seus elevados valores, 100 mg de soforose custam R$ 8.410,00 (oito mil quatrocentos e dez reais) enquanto a gentiobiose custa R$ 1.334,00 (um mil trezentos e trinta e quatro reais) por grama.However, these disaccharides generated by substrate hydrolysis or transglycosylation are generated in small quantities, which results in the production of enzymes for cell maintenance, not increasing the production of cellulases as desired to make the process of producing cellulases economically profitable. . In this sense, an alternative is to supplement the culture medium with these disaccharides. However, the use of these sugars for the commercial production of cellulases becomes impracticable due to their high values, 100 mg of sophophoresis costs R $ 8,410.00 (eight thousand four hundred and ten reais) while gentiobiose costs R $ 1,334.00 (one thousand three hundred and thirty-four reais) per gram.
Assim, como para a produção de enzimas celulases o substrato utilizado é uma forma microcristalina da celulose um produto comercial oriundo da indústria papeleira, o qual apresenta custo em torno de US$ 130/tonelada.Thus, as for the production of cellulase enzymes, the substrate used is a microcrystalline form of cellulose, a commercial product from the paper industry, which has a cost of around US $ 130 / ton.
A literatura patentária contempla diversos documentos relacionados à produção de celulases e em alguns casos menciona o emprego dos dissacarídeos gentiobiose, soforose e lactose, no entanto não há relato de emprego de celulose parcialmente hidrolisada como fonte de indutores, conforme apresentado na presente invenção.The patent literature includes several documents related to the production of cellulases and in some cases mentions the use of the disaccharides gentiobiose, sophorose and lactose, however there is no report of the use of partially hydrolyzed cellulose as a source of inducers, as presented in the present invention.
O documento US 2011/0262997, depositada pela Novozymes North America, Inc. relata um processo de produção de celulase em célula hospedeira e emprega material lignocelulósico pré-tratado para induzir a produção de celulase. A invenção também se relaciona com a utilização de pré-tratado com o material ligno-celulósico como indutor ou fonte de carbono nos processos de produção de celulase.US 2011/0262997, filed by Novozymes North America, Inc. reports a cellulase production process in a host cell and uses pre-treated lignocellulosic material to induce cellulase production. The invention also relates to the use of pre-treated with ligno-cellulosic material as an inducer or carbon source in cellulase production processes.
O documento intitulado “Expression systems for commercial production of cellulase and xylanase in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis", US 5,888,800 descreve o aumento da produção de uma celulase heteróloga conseguido através da transformação de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis com construções genéticas que contêm um promotor de protease e da sequência de sinal para expressar genes de celulase alcalofflicas.The document entitled “Expression systems for commercial production of cellulase and xylanase in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis", US 5,888,800 describes the increased production of a heterologous cellulase achieved through the transformation of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis with genetic constructs that contain a promoter of protease and signal sequence to express alkaline cellulase genes.
O pedido de patente US 2008/0241885 relata a produção de celulases empregando uma cultura microbiana que produz soforolipídio e a utilização do soforolipídio para a produção de celulases.US patent application 2008/0241885 reports the production of cellulases employing a microbial culture that produces soforolipid and the use of soforolipid for the production of cellulases.
O documento intitulado “Method for cellulase production”, US 8,093,019, depositado pela logen Energy Corporation descreve um processo de fermentação usando hemicelulose para produção de misturas de celulase com uma elevada proporção de celulases em relação a hemicelulases. As celulases produzidas pelo processo da invenção são ainda caracterizadas por uma produtividade específica elevada. As misturas resultantes de celulase compreendem pelo menos duas vezes mais do que a celulase, hemicelulase e são úteis para a hidrólise de substrato celulósico, em particular, do substrato pré-tratado lignocelulósico.The document entitled “Method for cellulase production”, US 8,093,019, deposited by logen Energy Corporation describes a fermentation process using hemicellulose to produce cellulase mixtures with a high proportion of cellulases in relation to hemicellulases. The cellulases produced by the process of the invention are further characterized by a high specific productivity. The resulting cellulase mixtures comprise at least twice as much as cellulase, hemicellulase and are useful for the hydrolysis of cellulosic substrate, in particular, of the pretreated lignocellulosic substrate.
A patente US 4,275,163 “Cellulase-producing microorganism” descreve um processo e um microrganismo para a síntese de celulases. O microrganismo empregado é uma estirpe mutante de um fungo ascomiceto capaz de sintetizar celulases. A síntese de celulases pelo mutante não é reprimida por glicerol, reprimido pela glicose e indutíveis na presença de níveis elevados por lactose. Além disso, a combinação de lactose com xilose elicia síntese de celulases pelo mutante.US patent 4,275,163 "Cellulase-producing microorganism" describes a process and a microorganism for the synthesis of cellulases. The microorganism employed is a mutant strain of an ascomycetus fungus capable of synthesizing cellulases. The synthesis of cellulases by the mutant is not repressed by glycerol, repressed by glucose and inducible in the presence of high levels of lactose. In addition, the combination of lactose and xylose elicits synthesis of cellulases by the mutant.
O documento US 2010/0009408 “Induction of Gene Expression Using a High Concentration Sugar Mixture”, descreve uma composição útil para induzir a expressão de genes cuja expressão está sob controle de uma sequência de promotor indutível e métodos para a preparação composições e utilização. Neste documento são empregados os açúcares celobiose, gentiobiose, soforose e glicose para induzir a produção de celulases.US 2010/0009408 "Induction of Gene Expression Using a High Concentration Sugar Mixture" describes a composition useful for inducing the expression of genes whose expression is under the control of an inducible promoter sequence and methods for preparing compositions and use. In this document, the sugars cellobiose, gentiobiosis, soforose and glucose are used to induce the production of cellulases.
No documento patentário “Compositions and Methods for Improved Protein Production” US 2010/0279346, são utilizados como indutores para produção de celulases os substratos celulose, lactose, soforose e glicose/soforose.In the patent document “Compositions and Methods for Improved Protein Production” US 2010/0279346, cellulose, lactose, sophorosis and glucose / sophorose are used as inducers for cellulases.
A patente depositada sob número US 8,044,192 intitulada “Promoters and uses thereof da Rohm Enzyme GmbH, emprega vetores contendo promotores que são ativados por soforose. Estes vetores são inseridos na célula hospedeira por transformação.The patent filed under US number 8,044,192 entitled “Promoters and uses thereof from Rohm Enzyme GmbH, employs vectors containing promoters that are activated by sophorosis. These vectors are inserted into the host cell by transformation.
A invenção relatada na patente “Method for production of secreted proteins in fungi”, US 2004/0115790, refere-se a um promotor em hospedeiro fúngico para a produção de proteínas. De acordo com a invenção, o promotor foi modificado na sua resposta aos mecanismos que medeiam transcricional da regulação negativa de proteínas secretadas sob stress. Esta invenção relaciona-se também a métodos para a produção de proteína otimizado de proteínas secretáveis em fungos.The invention reported in the patent "Method for production of secreted proteins in fungi", US 2004/0115790, relates to a promoter in a fungal host for the production of proteins. According to the invention, the promoter has been modified in its response to the mechanisms that mediate transcriptional negative regulation of proteins secreted under stress. This invention also relates to methods for the production of optimized protein from fungi secretible proteins.
A existência de diversas patentes sobre a produção de celulases e hemicelulases, sendo que algumas depositadas por empresas produtoras de enzimas, como Novozymes e logen Energy Corporation, demonstra que há grande interesse comercial por estas enzimas, principalmente devido ao potencial de uso de celulases para produção de biocombustíveis de segunda geração.The existence of several patents on the production of cellulases and hemicellulases, some of which are filed by enzyme-producing companies, such as Novozymes and logen Energy Corporation, demonstrates that there is great commercial interest in these enzymes, mainly due to the potential use of cellulases for production second-generation biofuels.
A presente invenção descreve uma hidrólise parcial de celulose, empregando baixas concentrações de celulases, para liberar componentes, preferencialmente açúcares, que atuarão como indutores no processo de produção de celulases, incrementando assim os títulos enzimáticos produzidos.The present invention describes a partial hydrolysis of cellulose, using low concentrations of cellulases, to release components, preferably sugars, that will act as inducers in the cellulases production process, thus increasing the enzymatic titers produced.
Neste sentido, a presente invenção vem proporcionar uma forma alternativa de indução adicional aos processos de produção de celulases, levando a produção de maiores títulos enzimáticos devido a presença de indutores liberados a partir da degradação da celulose que será empregada nos meios de produção.In this sense, the present invention provides an alternative form of additional induction to the production processes of cellulases, leading to the production of higher enzymatic titers due to the presence of inductors released from the degradation of the cellulose that will be used in the production means.
A presente invenção apresenta diversas vantagens em relação ao estado da técnica, tais como:
- * o processo utiliza indutores liberados de processos de hidrólise parcial de celulose para a elevada produção das enzimas celulases a baixo custo;
- * o processo permite a utilização da celulose parcialmente degradada para produção de celulases como fonte de carbono e indutora;
- * possibilita maiores produtividades, visto que o emprego de indutores antecipa a produção de celulases;
- * possibilita a obtenção de indutores de baixo custo em relação aos disponíveis no mercado, mais eficientes para a produção de celulases.
- * the process uses inductors released from partial cellulose hydrolysis processes for the high production of cellulase enzymes at low cost;
- * the process allows the use of partially degraded cellulose to produce cellulases as a carbon source and inducer;
- * enables greater productivity, since the use of inductors anticipates the production of cellulases;
- * makes it possible to obtain low cost inductors in relation to those available on the market, which are more efficient for the production of cellulases.
O processo de produção de enzimas da presente invenção é uma alternativa aos processos conhecidos, pois, torna a produção mais rentável, visto que emprega o substrato que já é tradicionalmente empregado como fonte de carbono, porém, com a hidrólise parcial da celulose, os títulos enzimáticos são incrementados e os maiores títulos enzimáticos são obtidos em tempos menores.The enzyme production process of the present invention is an alternative to the known processes, since it makes production more profitable, since it uses the substrate that is already traditionally used as a carbon source, however, with the partial hydrolysis of cellulose, the bonds enzymes are increased and the highest enzyme titers are obtained in less time.
Do que se depende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.From what depends on the researched literature, no documents were found anticipating or suggesting the teachings of the present invention, so that the solution proposed here has novelty and inventive activity in view of the state of the art.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processo de produção de celulases caracterizado por compreender
- - pré-hidrólise de celulose,
- - inoculação de celulose pré-hidrolisada, açucares liberados da pré hidrolise e cultura de crescimento de Penicillium echinulatum com Penicillium echinulatum.
- - cellulose prehydrolysis,
- - inoculation of pre-hydrolyzed cellulose, sugars released from pre-hydrolysis and growth culture of Penicillium echinulatum with Penicillium echinulatum.
Em uma realização preferencial o Penicillium echinulatum é de linhagem 9A02S1.In a preferred embodiment, Penicillium echinulatum is of 9A02S1 strain.
Em uma realização preferencial os açúcares liberados da pré hidrolise são oligo-, di- e monossacarídeos.In a preferred embodiment, the sugars released from the pre-hydrolysis are oligo-, di- and monosaccharides.
Em uma realização preferencial a cultura de crescimento de Penicillium echinulatum compreender cultivos em estado sólido ou cultivos submersos.In a preferred embodiment, the growth culture of Penicillium echinulatum will comprise solid-state or submerged cultures.
Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.These and other objects of the invention will be immediately valued by those skilled in the art and by companies with interests in the segment, and will be described in sufficient detail for their reproduction in the following description.
A Figura 1 apresenta as atividades de endoglicanases obtidas em cultivo de Penicillium echinulatum em meio contendo celulose parcialmente hidrolisada em diferentes tempos de hidrólise.
Na Figura 2 são apresentadas as atividades de endoglicanases obtidas em cultivos com Penicillium echinulatum, empregando celulose hidrolisada enzimaticamente durante diferentes tempos. A atividade apresentada no gráfico refere-se a atividade obtida em 48 horas de cultivo. Verifica-se que a produção de endoglicanases na amostra que foi hidrolisada por uma hora foi superior ao cultivo com celulose não hidrolisada.
A Figura 3 apresenta as medidas de pH obtidas durante o cultivo de Penicillium echinulatum contendo hidrolisados de celulose em frascos mantidos sob agitação recíproca. Verifica-se que os meios formulados com celulose parcialmente hidrolisada apresentaram redução no pH anterior ao meio formulado com celulose não tratada enzimaticamente.
Na Figura 4 são apresentados os perfis de bandas de atividade de endoglicanases em gel contendo carboximetilcelulose e em mistura reacional do caldo enzimático, produzido por Penicillium echinulatum 9A02S1 obtido do cultivo submerso controle, contendo 1% de celulose. A- Perfil da atividade de proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) extraídas e precipitadas a partir de 2 μΙ do caldo enzimático. M - massa molecular. Na lateral direita encontram-se as informações dos valores da massa molecular. A) celulose não tratada enzimaticamente, B) celulose parcialmente hidrolisada durante 30 minutos, C) celulose parcialmente hidrolisada durante 1 hora. Verifica-se maior quantidade de bandas nas amostras que foram produzidas na presença de celulose parcialmente hidrolisada.
A Figura 5 ilustra os dados obtidos na cromatografia de interação iônica para quantificação dos açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose. A figura A mostra o tempo inicial (tempo zero) e, na figura B, após 1 hora de hidrólise.Figure 1 shows the activities of endoglycanases obtained in the cultivation of Penicillium echinulatum in medium containing partially hydrolyzed cellulose at different times of hydrolysis.
Figure 2 shows the activities of endoglycanases obtained in cultures with Penicillium echinulatum, using enzymatically hydrolyzed cellulose during different times. The activity shown in the graph refers to the activity obtained in 48 hours of cultivation. It appears that the production of endoglycanases in the sample that was hydrolyzed for one hour was superior to the cultivation with non-hydrolyzed cellulose.
Figure 3 shows the pH measurements obtained during the cultivation of Penicillium echinulatum containing cellulose hydrolysates in flasks kept under reciprocal stirring. It is verified that the media formulated with partially hydrolyzed cellulose showed a reduction in the pH before the medium formulated with non-enzymatically treated cellulose.
Figure 4 shows the profiles of endoglycanase activity bands in gel containing carboxymethylcellulose and in a reaction mixture of the enzymatic broth, produced by Penicillium echinulatum 9A02S1 obtained from the submerged control culture, containing 1% cellulose. A- Profile of proteins activity separated by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) extracted and precipitated from 2 μΙ of the enzymatic broth. M - molecular mass. On the right side are the information on the molecular mass values. A) cellulose not treated enzymatically, B) cellulose partially hydrolyzed for 30 minutes, C) cellulose partially hydrolyzed for 1 hour. There is a greater amount of bands in the samples that were produced in the presence of partially hydrolyzed cellulose.
Figure 5 illustrates the data obtained from ion interaction chromatography to quantify the sugars released from partial cellulose hydrolysis. Figure A shows the initial time (time zero) and, in figure B, after 1 hour of hydrolysis.
Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.The examples shown here are intended only to exemplify one of the countless ways of carrying out the invention, however, without limiting its scope.
A presente invenção descreve o processo de produção de enzimas compreendendo o emprego de celulose parcialmente hidrolisada e açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose.The present invention describes the process of producing enzymes comprising the use of partially hydrolyzed cellulose and sugars released from the partial hydrolysis of cellulose.
Em uma realização preferencial, a celulose é parcialmente hidrolisada empregando enzimas hidrolíticas (celulases, xilanases, etc..).In a preferred embodiment, the cellulose is partially hydrolyzed using hydrolytic enzymes (cellulases, xylanases, etc.).
Em uma outra realização preferencial, são empregados os açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose.In another preferred embodiment, sugars released from partial cellulose hydrolysis are used.
Em outra realização preferencial, são empregados os açúcares liberados da hidrólise parcial da celulose juntamente com a celulose parcialmente hidrolisada.In another preferred embodiment, sugars released from partial cellulose hydrolysis are used together with partially hydrolyzed cellulose.
Em uma realização preferencial, o processo de produção compreende a produção das enzimas em cultivos em estado sólido.In a preferred embodiment, the production process comprises the production of enzymes in solid-state crops.
Em outra realização preferencial, o processo de produção compreende a produção em cultivos submersos.In another preferred embodiment, the production process comprises production in submerged crops.
A presente invenção também descreve o uso de celulose parcialmente hidrolisada e dos oligo- di- e monossacarídeos liberados da hidrólise da celulose para produção de enzimas, preferencialmente celulases.The present invention also describes the use of partially hydrolyzed cellulose and the oligo-di- and monosaccharides released from cellulose hydrolysis for the production of enzymes, preferably cellulases.
P. echinulatum denominada 9A02S1, é linhagem mutante de Penicilium echinulatum linhagem 9A02S1, depositada no Centro Depositário DSMZ, na Alemanha, com registro de deppósito número DSM18942. Número de acesso par ao depósito : DSM18942; data de depósito : 17/01/2007; Nome e endereço da instituição depositária: Centro Depositário DSMZ, Alemanha, DSMZ GmBH, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig. A linhagem pode ser facilmente crescida em meio Potato dextrose Agar na temperatura de 28 C.P. echinulatum called 9A02S1, is a mutant strain of Penicilium echinulatum strain 9A02S1, deposited at the DSMZ Depositary Center, in Germany, with deposit registration number DSM18942. Warehouse access number: DSM18942; deposit date: 01/17/2007; Name and address of the depositary institution: DSMZ Depositary Center, Germany, DSMZ GmBH, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig. The strain can be easily grown on Potato dextrose Agar medium at a temperature of 28 C.
A presente invenção também descreve um substrato compreendendo celulose parcialmente hidrolisada para produção de enzimas, preferencialmetne celulases.The present invention also describes a substrate comprising partially hydrolyzed cellulose for the production of enzymes, preferably cellulases.
Na presente invenção, foram desenvolvidos processos de produção de celulases empregando celulose parcialmente hidrolisada enzimaticamente ou empregando os oligo-, di- e monossacarídeos liberados da hidrólise da celulose para produção de enzimas. A produção de celulases empregando este substrato pode ser realizada tanto por fungos como por bactérias, em cultivos submersos e/ou em estado sólido. O processo é inovador e visa preencher diversas lacunas encontradas no estudo da técnica, apresentando diversas alternativas para a produção de maiores títulos enzimáticos em menores tempos, empregando substratos (substâncias indutoras) e técnicas de baixo custo, o que possibilita uma maior eficiência econômica no processo de produção de celulases, diferenciando esta tecnologia das demais existentes.In the present invention, cellulase production processes have been developed using enzymatically partially hydrolyzed cellulose or using the oligo-, di- and monosaccharides released from cellulose hydrolysis for enzyme production. The production of cellulases using this substrate can be carried out by both fungi and bacteria, in submerged cultures and / or in solid state. The process is innovative and aims to fill several gaps found in the study of the technique, presenting several alternatives for the production of higher enzyme titers in less time, using substrates (inducing substances) and low-cost techniques, which enables greater economic efficiency in the process production of cellulases, differentiating this technology from the other existing ones.
Nas Figuras 1 a 4 são apresentados alguns resultados que evidenciam a importância da utilização de celulose parcialmente hidrolisada e de oligossacarídeos liberados da celulose para a indução da produção de celulases.Figures 1 to 4 show some results that show the importance of using partially hydrolyzed cellulose and oligosaccharides released from cellulose to induce cellulose production.
O exemplo a seguir detalha melhor a metodologia utilizada pelo inventor: Exemplo 1: Produção de celulases empregando celulose parcialmente hidrolisadaThe following example details the methodology used by the inventor in greater detail: Example 1: Production of cellulases using partially hydrolyzed cellulose
Neste exemplo, a produção de enzimas foi realizada empregando um fungo mutante de P. echinulatum, fato este que constitui novidade, pois os mutantes de P. echinulatum ainda não foram utilizados para a produção de celulases em meio formulado com celulose parcialmente hidrolisada e/ou com os oligo-, di- e monossacarídeos liberados da hidrólise parcial da celulose para a produção de celulases.In this example, the production of enzymes was carried out using a mutant fungus of P. echinulatum, a fact that is new, since the mutants of P. echinulatum have not yet been used for the production of cellulases in a medium formulated with partially hydrolyzed cellulose. with the oligo-, di- and monosaccharides released from the partial hydrolysis of cellulose for the production of cellulases.
A hidrólise enzimática é realizada com um complexo enzimático contendo hidrolases (celulases, hemicelulases, etc.), empregando cargas enzimáticas na faixa de 0,1 a 50 FPU/g de substrato e por diferentes tempos.Enzymatic hydrolysis is carried out with an enzymatic complex containing hydrolases (cellulases, hemicellulases, etc.), employing enzymatic loads in the range of 0.1 to 50 FPU / g of substrate and for different times.
À celulase parcialmente hidrolisada são adicionados sais minerais, farelo de soja e trigo e água destilada. Esta mistura é autoclavada inoculada com microrganismos produtores de celulases que é incubada para o desenvolvimento do microrganismo e para produção. Para a coleta das enzimas, realiza-se uma filtragem e/ou centrifugação do cultivo para a remoção do micélio e o caldo enzimático é recolhido. Alternativamente, também é possível a utilização dos preparados enzimáticos sem a filtragem ou centrifugação.To the partially hydrolyzed cellulase are added mineral salts, soybean and wheat bran and distilled water. This mixture is autoclaved inoculated with cellulase producing microorganisms which is incubated for the development of the microorganism and for production. For the collection of enzymes, filtration and / or centrifugation of the culture is performed to remove the mycelium and the enzyme broth is collected. Alternatively, it is also possible to use enzymatic preparations without filtering or centrifuging.
Os versados na arte valorizarão o processo aqui proposto como uma excelente alternativa aos processos de produção de celulases já existentes e muito colaboram para a otimização dos processos de produção e aumento da produtividade. Estes fatores possibilitaram o desenvolvimento de processos de baixo custo com elevadas produtividades e rendimentos.Those skilled in the art will value the process proposed here as an excellent alternative to the existing cellulose production processes and greatly contribute to the optimization of production processes and increased productivity. These factors enabled the development of low-cost processes with high productivity and yields.
Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.Those skilled in the art will value the knowledge presented here and will be able to reproduce the invention in the modalities presented and in other variants, covered by the scope of the attached claims.
Claims (4)
- a) Pré-hidrólise enzimática de celulose ;
- b) Inoculação da celulose pré-hidrolisada, dos açucares liberados da pré hidrolise e de um meio de cultura de crescimento de Penicillium echinulatum com Penicillium echinulatum.
- a) Enzymatic pre-hydrolysis of cellulose;
- b) Inoculation of pre-hydrolyzed cellulose, sugars released from pre-hydrolysis and a growth medium of Penicillium echinulatum with Penicillium echinulatum.
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