BR102012031096A2 - Método e uso para verificação de erros de montagem em genomas - Google Patents

Abstract

MÉTODO E USO PARA VERIFICAÇÃO DE ERROS DE MONTAGEM EM GENOMAS A presente invenção trata-se de um método para verificação de erros de montagem em genomas de organismos sequenciados ou produzidos de maneira sintética que utiliza relações de frequência entre fragmentos de sequências de nucleotídeos de um genoma. O método possui aplicações na verificação de erros em um genoma montado a partir de fragmentos oriundos dos diferentes tipos de tecnologias de sequenciamento e auxiliar na construção de genomas sintéticos, como por exemplo. Pode ser empregado para compressão de material genético, pois as relações de frequência determinadas pelo método permitem reduzir a complexidade de sequências de nucleotídeos, de forma a representar seu conteúdo de maneira comprimida, reduzindo assim o espaço necessário para seu armazenamento.

Description

MÉTODO E USO PARA VERIFICAÇÃO DE ERROS DE MONTAGEM EM

GENOMAS

Campo da invenção

A presente invenção trata-se de um método para verificação de erros de montagem em genomas de organismos sequenciados ou produzidos de maneira sintética que utiliza relações de frequência entre fragmentos de seqüências de nucleotídeos de um genoma.

O método possui aplicações na verificação de erros em um genoma montado a partir de fragmentos oriundos dos diferentes tipos de tecnologias de 10 sequenciamento (lllumina, 454, Solid, PacBio, entre outros) e pode auxiliar na construção de genomas sintéticos, como por exemplo como por exemplo em organismos geneticamente híbridos ou transgênico. Além disso, o método proposto também pode ser empregado para compressão de material genético, pois as relações de frequência determinadas pelo método permitem reduzir a 15 complexidade de seqüências de nucleotídeos, de forma a representar seu conteúdo de maneira comprimida, reduzindo assim o espaço necessário para seu armazenamento.

Fundamentos da Invenção

Nos últimos anos, o barateamento e o aperfeiçoamento das tecnologias de sequenciamento em larga escala de material genético tornou possível conhecer o DNA e o RNA de todos os seres vivos. Entretanto, todas as tecnologias de sequenciamento existentes, desde as mais antigas até as mais recentes, usam técnicas de fragmentação da molécula original. Tais fragmentos são então analisados por ferramentas computacionais que, utilizando métodos baseados em sobreposição de fragmentos, tentam reconstruir a molécula original. A alta frequência de seqüências repetitivas, erros oriundos dos equipamentos de sequenciamento bem como falhas e falta 5 de precisão dos processos de laboratório para purificação das amostras que serão sequenciadas também podem introduzir erros que se refletem na montagem final dos fragmentos sequenciados. Em função dos problemas mencionados, existem algumas ferramentas computacionais que permitem filtrar os fragmentos sequenciados que apresentam baixa qualidade ou que são 10 oriundos de artefatos introduzidos antes ou durante o processo de sequenciamento. Apesar de sua utilidade, tais ferramentas limitam-se a apenas remover os fragmentos, ou partes dele, que poderão gerar inconsistências na montagem do genoma. Após a etapa final de montagem do genoma, os únicos métodos existentes que permitem verificar sua qualidade com maior rigor são 15 aqueles baseados em similaridade, em que é necessário o uso de um genoma de referência de algum organismo da mesma espécie, ou que seja geneticamente próximo daquele que foi sequenciado (Meader et al., 2010). O problema disso é que muitas espécies ainda não possuem organismos sequenciados e até mesmo aqueles que já foram sequenciados podem 20 apresentar erros de montagem, transferindo seus erros para outros organismos que fizerem uso de sua montagem danificada. Já outros baseiam-se no uso de informações da qualidade dos fragmentos sequenciados para tentar melhorar a qualidade de uma montagem (Haiminen etal., 2011). As limitações tecnológicas existentes para extração de seqüências completas de nucleotídeos (moléculas de DNA ou RNA) requer que as mesmas sejam fragmentadas em pedaços curtos (reads), impondo o uso de ferramentas computacionais para sua reconstrução. Tais ferramentas baseiam-se em 5 métodos que utilizam os reads e buscam por regiões de sobreposição em suas extremidades, de forma a expandí-los e, ao final, reconstruir a molécula original. Apesar da comprovada qualidade de tais metodologias de montagem em gerar seqüências equivalentes a genomas inteiros, ainda não há formas eficientes de tratar diversos tipos de situações, sejam de contexto biológico ou 10 computacional. Problemas como heterozigozidade, quantidade de ploidias e qualidade biológica da amostra que pode estar em fase de degradação podem introduzem erros e problemas no processo de montagem, sendo o principal deles a alta frequência de seqüências repetitivas em um genoma. No contexto tecnológico e computacional há dois grandes problemas: o primeiro é a 15 incapacidade atual dos equipamentos de sequenciamento em extrair material genético que corresponda a seqüências inteiras de nucleotídeos, o que torna necessário introduzir uma etapa de fragmentação em diferentes regiões da molécula. O segundo é a incapacidade das ferramentas computacionais de tratar de forma precisa a alta frequência de seqüências repetitivas presentes 20 nos genomas, os quais costumam ser muito maiores do que o tamanho médio dos reads gerados pelo processo de sequenciamento. Além disso, as etapas de montagem computacional de genomas também requerem uma correta e minuciosa configuração dos softwares que serão utilizados, pois os parâmetros variam de acordo com o tipo de organismo, equipamento de sequenciamento utilizado e recursos computacionais disponíveis. Outros fatores, como preparo e/ou contaminação do material genético e falta de um controle rígido no processo de purificação das amostras que serão sequenciadas, também 5 influenciam na montagem final de um genoma. Apesar da maioria das ferramentas computacionais tentarem tratá-los, elas utilizam uma abordagem conservadora, reduzindo assim a quantidade de erros na montagem e, também, o nível de reconstrução da molécula original.

Os problemas de montagem motivaram o desenvolvimento de metodologias que procuram minimizar ou até mesmo corrigir possíveis erros de montagem nos genomas. Estratégias experimentais são muito mais custosas e complexas, e por isso há preferência por metodologias estritamente computacionais. Algumas se baseiam no uso de informações de genomas de organismos próximos como referência na identificação de problemas de montagem. Outras metodologias utilizam informações de regiões conservadas entre grupos de organismos para localizar eventuais erros em regiões específicas do genoma montado. Há ainda outras metodologias que utilizam informações da frequência de nucleotídeos do genoma, sendo a mais conhecida delas o método baseado nas "Regras de Chargaff". Nele, é contabilizada a frequência dos nucleotídeos A (adenina), C (citosina), G (guanina) e T (timina), e são verificadas se as duas relações de frequência a seguir são válidas: A-=T e C~=G. Pelo fato de não haver, ainda, um método eficiente e que seja capaz de substituir todos os demais, a melhor estratégia tem sido combinar diferentes abordagens para conferir maior garantia na qualidade de um genoma, seja ele montado ou produzido de forma sintética.

Apesar da necessidade de métodos que permitam verificar a qualidade

de montagens de genomas, ainda não há métodos similares ao proposto por esta patente. Nele, é apresentado um método que, pela primeira vez, é capaz de utilizar informações de relações de frequência entre fragmentos de nucleotídeos de um genoma para que seja possível verificar a qualidade da montagem de um genoma.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção trata-se de um método para verificação de erros de montagem em genomas de organismos sequenciados ou produzidos de maneira sintética que utiliza relações de frequência entre fragmentos de seqüências de nucleotídeos de um genoma.

A partir das relações de frequência descritas pelo método, é possível utilizá-las para verificar se há erros de montagem em um genoma que foi reconstruído a partir de fragmentos de seqüências de nucleotídeos, ou que foi construído de forma sintética. Sua utilização traz vantagens relacionadas a 20 possibilidade de obtenção de seqüências que sejam mais próximas da seqüência original quando extraída de um organismo qualquer da natureza. Para o caso de moléculas sintéticas, como genomas sintéticos, o método pode ser empregado para verificar se a contrução da mesma foi realizada de forma a se aproximar mais de um genoma natural, sugerindo assim reorganizá-la para que seja biologicamente mais eficiente. Outra vantagem deste método é o fato de permitir que seqüências de nucleotídeos possam ser comprimidas, tornando sua transferência mais rápida e reduzindo o espaço necessário para seu armazenamento.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 apresenta uma aplicação do método, da presente invenção, baseado em relações de frequência das palavras F(wk) e F(R(Wk)) para identificar erros de montagem em genomas, para tamanhos de palavra 10 variando entre 2 e 8. Trinta e dois genomas foram considerados e, conforme considerado pelo método, o desvio inesperado de pelo menos 0.01 na soma da frequência das palavras no genoma da bactéria Xylella fastidiosa 9a5c demonstra a existência de erros de montagem.

A Figura 2 apresenta uma aplicação do método; da presente invenção. considerando as relações de frequência para fragmentos de tamanho variando entre 1 e 8. Nota-se claramente que, independentemente do valor de k, as relações de frequência tornam-se inválidas para o genoma da bactéria Xylella fastidiosa 9a5c, montada por Simpson et al. (2000).

A Figura 3 apresenta uma comparação das montagens do genoma das espécies de X. fastidiosa ssp. com o uso do software Gmap do NCBI.

A Figura 4 apresenta um alinhamento múltiplo das montagens do genoma das espécies de X. fastidiosa ssp. Blocos do genoma da X. fastidiosa 9a5c (Xf_9a5c_DNA.fas) que se encontram na parte inferior representam regiões que sofreram inversões ou translocações com relação aos demais genomas que são praticamente iguais estruturalmente.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção trata-se de um método para verificação de erros de montagem em genomas de organismos sequenciados ou produzidos de maneira sintética que utiliza relações de frequência entre fragmentos de seqüências de nucleotídeos de um genoma.

O invento descreve um conjunto de regras de paridade de frequência de oligonucleotideos que são observadas em vários genomas e podem ser aplicadas para: verificar a ocorrência de erros de montagem em genomas reconstruídos a partir de fragmentos de seqüências; avaliar a qualidade de

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genomas sintéticos da mesma forma que é feita em um genoma montado; comprimir seqüências de nucleotídeos para reduzir o espaço físico ocupado por elas em um sistema computacional. As seções seguintes contextualizam e descrevem brevemente detalhes do método proposto na presente invenção.

É apresentado um novo método que é estritamente computational e pode ser aplicado para verificar a existência de erros de montagem em um genoma, o qual foi testado em diversos organismos. Outras aplicações são citadas em outras seções, Este método representa uma extensão das regras propostas por Chargaff.

O método considera a existência de duas relações de frequência (Equações 1 e 2) de palavras que são invariantes entre si. Tais relações levam em consideração uma seqüência w de tamanho k, e os seguintes operadores sobre wk: R(wk) - seqüência reversa de wk; C(wk) - seqüência complementar de wk em que complementar de A é T, e de C é G; e R(C(wk)) - seqüência reversa e complementar de wk.

jF(wk) + J F (RQwk)) = 0,5 (1)

5/CC ÍH fc» + J F = 0,5 (2)

O método para verificação de erros de montagem em genomas

compreende as seguintes etapas:

i) fragmentar o genoma em palavras de tamanho k; onde K representa o tamanho de uma subpalavra do genoma, podendo variar entre 3 e 8;

ii) calcular, para cada palavra wk, a frequência das palavras FiwA -IO F(RlwfJ)j F(CiwkJ) e FiC(R(Wk)J);

iii) calcular, a partir das frequências das palavras, o somatório das frequências de palavras para cada tipo de operador, de forma a obter

((W*)) YiF(RiWk)) JiF(CiwkJ) Jf (C(R(wk))}

e ;

iv) aplicar as relações de frequência das Equações 1 e 2;

v) detecção de erro de montagem se a variaçãojor superior a 0.01.

Exemplos

Considerando um caso fictício em que k=3 (fragmentos de seqüências de tamanho 3 obtidas de um genoma montado ou sintético), serão 64 palavras ao todo, e com apenas 20 delas, aplicando os operadores descritos, é possível representar o conjunto inteiro de palavras possíveis em um MathTabIe1 como pode ser visto na Tabela 1. As 20 palavras fazem parte do que é definido de Generating Set (GS)1 e cada uma delas juntamente com as palavras derivadas com o uso dos operadores C, R e C(R) formam uma Classe de Equivalência (CE).

Por exemplo, dado uma palavra w3=ATC (classe de equivalência 6 da tabela 1), cujo tamanho k=3, aplicando-se os operadores descritos tem-se que R(ATC3)=CTA, C(ATC3)=TAG e R(C(ATC3))=GAT. Analisando-se a frequência destas palavras no genoma de 32 organismos, considerando animais, plantas, 10 micro-organismos e organismos modelos em geral, tem-se a confirmação das frequências descritas pelas equações 1 e 2. Mesmo que a seleção do GS seja feita de forma aleatória, as relações de frequência continuam válidas para as 20 CE, para k variando entre 3 e 10.

Esta forma de representar um conjunto de palavras do genoma com apenas o GS torna também viável o uso das relações de frequência para compressão de seqüências de nucleotídeos.

Tabela 1 - MathTabIe com palavras de tamanho k=3. São 20 Classes de Equivalência geradas a partir da aplicação dos operadores C, R e C(R) sobre o Generating Set. MathTable GS W CM R(w) R(C{w» 1 AAA TTT 2 AAT TTA TAA ATT 3 TTG AAC GTT CAA 4 CTT GAA TTC AAG ATA TAT - 6 ATC TAG CTA GAT 7 ATG TAC GTA CAT 8 ACA TGT - 9 TGA ACT AGT TCA CCA GGT ACC TGG 11 GCA CGT ACG TGC 12 TCT AGA - 13 GCT CGA TCG AGC 14 AGG TCC GGA CCT CAC GTG - 16 CAG GTC GAC CTG 17 CTC GAG _ 18 CCC GGG - 19 GCC CGG CCG GGC GCG CGC - O método descrito já foi aplicado para analisar o genoma de 32 organismos, considerando animais, plantas, micro-organismos e organismos modelos que possuem um genoma com alta qualidade em sua montagem 5 (Arabidopsis thaliana, Drosophila meianogaster, Oryza sativa, Danio rerio, Escherichia coli, Homo sapiens, entre outros). Para todos os organismos analisados, com exceção de dois casos, obteve-se a confirmação das relações frequências descritas pelo método, para palavras cujo tamanho k variou entre 3 e 8 (Figura 1). A Tabela 2 traz de forma ilustrativa o MathTabIe calculado para 10 o genoma (versão hg19) do organismo Homo sapiens. Na parte inferior da tabela é apresentado o valor numérico proporcional obtido com o cálculo da frequência das palavras que são consideradas pelas relações de frequência descritas pelas Equações 1 e 2 desta patente. Para todos os outros organismos com genomas cuja montagem apresenta alta qualidade, as frequências finais para os 3 operadores (C(w), R(w) e C(R(w))), considerados sobre uma palavra w de tamanho k, também são bastante aproximados, nunca variando mais do que 0.01, seja para mais ou para menos.

Tabela 2 - MathTabIe com os Generating Sets (GS) para o organismo primata Homo sapiens, quando k=3.

MathTable do primata Homo sapiens

GS W C{W) Ríw) RfC(W)) 1 AAA 109749140 TTT 110166459 2 AAC 41627244 TTG 54311635 CAA 54094783 GTT 41794674 3 AAG 57034179 TTC 56449412 GAA 56378039 CTT 57146588 4 AAT 71276139 TTA 59555531 TAA 59464724 ATT 71375304 5 ACA 57802370 TGT 57813554 6 ACC 33255490 TGG 52825740 CCA 52721754 GGT 33294580 7 ACG 7181698 TGC 41224955 GCA 41189144 CGT 7199396 8 ACT 45999155 TGA 58051516 TGA 56034342 AGT 46059366 9 AGA 63234914 TCT 63331299 10 AGC 39995034 TCG 6321268 CGA 6309329 GCT 40009048 11 AGG 50786559 TCC 44155607 GGA 44181008 CCT 50842082 12 ATA 58958922 TAT 59017407 13 ATC 38179270 TAG 36920158 CTA 3Θ870884 GAT 38221759 14 ATG 52548021 TAC 32449297 GTA 32468243 CAT 52546267 15 CAC 42952367 GTG 43059447 15 CAG 37953591 GTC 27046527 GAC 27009201 CTG 57996064 17 CCC 37601949 GGG 37636541 18 CCG 7900528 GGC 34037239 GCC 34053268 CGG 7900539 19 CGC 8807741 GCG ©813510 20 CTC 48167470 GAG 48167946 Frequência 328812381 327355048 560772719 504386307 Proporção 0.3246 0.3241 0.1750 0.1763 A Figura 1 representa a aplicação do método baseado em relações de frequência das palavras F(wk) e F(R(wk)) para identificar erros de montagem

em genomas, para tamanhos de palavra variando entre 2 e 8. Trinta e dois genomas foram considerados e, conforme considerado pelo método, o desvio inesperado de pelo menos 0.01 na soma da frequência das palavras no genoma da bactéria Xylella fastidiosa (9a5c) demonstra a existência de erros de montagem. As exceções ocorreram com o genoma do vírus de RNA HIV e a bactéria Xylella fastidiosa 9a5c. Nelas, as relações de frequência do método apresentaram variação maior do que 0.01, e com grande desvio se comparado aos demais organismos (Figura 1). Para o caso do vírus, foi o único organismo 5 que consideramos em nossa análise cujo genoma é formado por RNA, ao contrário dos demais que possuem DNA como molécula que forma o genoma. Consequentemente, o MathTabIe apresentou grande variação com relação ao que seria esperado para um genoma com boa qualidade de montagem. Podese observar claramente que o MathTabIe calculado para a bactéria X. fastidiosa 10 (Tabela 3) não segue as relações de frequência propostas por este trabalho.

Para facilitação a visualização dos erros de montagem, utiizados outros métodos de comparação de seqüências. Em um deles, foi realizado um alinhamento par-a-par dos genomas da Xylella (Figura 3) para observar diversas inversões no genoma da Xylella fastidiosa 9a5c com relação às 15 demais. A posição das inversões pode ser claramente observando quando é feito um alinhamento múltiplo dos genomas da bactéria, conforme Figura 4, em que diversos blocos desordenados com relação as outras subespécies da bactéria representam as regiões com erro.

Tabela 3 - MathTabIe com os Generating Sets (GS) para o organismo primata Homo sapiens, quando k=3. MathTable da bactéria Xytefla fastidiosa fsp. 9A5c

GS W cm Riw) R(C(w)) 1 AAA 38964 TTT 49374 2 AAC 35965 TTG 65079 CAA 49575 GTT 49539 3 AAG 36339 TTC 39850 GAA 38416 CTT 38041 4 AAT 39909 TTA 28057 TAA 24222 ATT 43405 S ACA 35417 TGT 47893 6 ACC 38513 TGG 62998 CCA 50381 GGT 51864 7 ACG 40005 TGC ©5349 GCA 57815 CGT 45418 8 ACT 27941 ΤΘΑ 53687 TCA 46238 AGT 32755 9 AGA 29254 TCT 30401 HS AGC 43807 TCG 40207 CGA 39461 GCT 47727 11 AGG 38156 TCC 34S58 GGA 38452 CCT 30773 12 ATA 26182 TAT 289Θ3 13 ATC 47917 TAG 20939 CTA 19375 GAT 54887 14 ATG 51519 TAC 28043 GTA 30573 CAT 45264 IS CAC 44301 GTG 61279 16 CAG 50711 GTC 38339 GAC 33567 CTG 51828 17 CCC 29523 GGG 38355 18 CCG 43980 GGC 55670 GCC 51783 CGG 46834 19 CGC 55253 VJW 82774 20 CTC 27598 GAG 33983 Frequência 779254 881836 479838 538315 Proporção 0.2908 0.3:292 0.1791 0.2009 O sequenciamento e posterior montagem de genomas a partir do uso de tecnologias de sequenciamento tem se tornado cada vez mais freqüente. Tais tecnologias baseiam-se na fragmentação das moléculas que, com o uso de 5 ferramentas computacionais baseadas em sobreposição de seqüências, são recontruídas. Entretanto, diversos fatores que vão desde a alta frequência de seqüências repetitivas nos genomas e também a geração de artefatos (contaminação ou má qualidade dos dados) torna o processo de montagem bastante complexo. Apesar da importância de utilização de métodos para 10 permitir verificar a qualidade final de um genoma, seja ele montado ou até mesmo aqueles construídos de forma sintética, não há ainda métodos que sejam baseados em relações de frequência de fragmentos de um genoma. O presente trabalho descreve um novo método que pode ser utilizado para a etapa de validação de um genoma. No método, um genoma é fragmentado em seqüências de tamanho fixo. Para cada fragmento, é verificada sua frequência e a frequência dos fragmentos equivalents ao seu rever, complementar e reverso complementar. Utilizando um conjunto de relações de frequências, nós 5 demonstramos que é possível validar um genoma, seja ele montado ou sintético, além de descrevermos brevemente como o método apresentado pode também ser utilizado como uma alternativa para compressão de seqüências de nucleotídeos.

Referências

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S Meader S, Hillier LW, Locke D, Ponting CP, Lunter G. Genome assembly quality: assessment and improvement using the neutral indel model. Genome Res. 2010 May;20(5):675-84.

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S Yamagishi MEB1 Hirai RH: Chargaffs “Grammar of Biology”: New Fraetal-Iike Rules. arXiv; 2011.

Claims (2)

1. Método para verificação de erros de montagem em genomas caracterizado por compreender as seguintes etapas: i) fragmentar o genoma em palavras de tamanho k; onde K representa o tamanho de uma subpalavra do genoma, podendo variar entre 3 e 8; ii) calcular, para cada palavra wk, a frequência das palavras F(H(Wfc))i FiCiwk)) e F(c(Síwfe))}; iii) calcular, a partir das frequências das palavras, o somatório das frequências de palavras para cada tipo de operador, de forma a obter JV(Cwii)) YiFtRiwk)) YiF(Ciwp)) (c(fí(Wfc))) , , e , iv) aplicar as relações de frequência das Equações 1 e 2, e v) detecção de erro de montagem se a variação for superior a 0.01.

2. Uso rio método descrito na reivindicação 1 caracterizado por ser aplicável na verificação de erros de montagem de genoma.