BR102012027330A2 - Método por extrusão de microemulsão à quente para obtenção de nanoparticulas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados assim obtidos e usos - Google Patents

Abstract

MÉTODO POR EXTRUSÃO DE MICROEMULSÃO À QUENTE PARA OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS ASSIM OBTIDOS E USOS A presente invenção trata de um método por extrusão de microemulsão à quente para obtenção de nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipidicos nanoestruturados. Mais especificamente, nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) são obtidos pelo dito método e seus usos são objetos adicionais da presente invenção, O método da presente invenção tem aplicação na fabricação de todas as formulações destas partículas que se constituam de emulsões de óleo em água que contenham pelo menos um lipídio sólido. As nanopartículas e carreadores obtidos podem ser utilizadas como carreadores de material genético, desde SIRNA até DNA, assim como de fármacos e proteínas.

Description

MÉTODO POR EXTRUSÃO DE MICROEMULSÃO À QUENTE PARA OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS ASSIM OBTIDOS E USOS

Campo da invenção A presente invenção trata de um método por extrusão de microemulsão à quente para obtenção de nanopartícuias lipídicas e carreadores lipídicos nanoestruturados. Mais especificamente, nanopartícuias lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) são obtidos pelo dito método e seus usos são objetos adicionais da presente invenção. O método da presente invenção tem aplicação na fabricação de formulações de partículas que se constituam de emulsões de óleo em água que contenham pelo menos um lipídio sólido, podendo conter ou não óleos, com ou sem surfatante ou co-surfatantes. O método pode ser utilizado, inclusive, para produção de nanopartícuias lipídicas que tenham componentes instáveis ou lábeis em alta pressão ou não recomendáveis para uso em homogeneizador em alta pressão e/ou Ultra-Turrax.

As nanopartícuias lipídicas obtidas podem ser utilizadas como carreadores de material genético, desde siRNA até DNA, assim como de fármacos e proteínas.

Fundamentos da invenção Nanopartícuias Lipídicas Sólidas (NLS) foram descritas na década de 90 como uma alternativa aos lipossomas, por possuírem uma maior estabilidade física, de até 3 anos em estoque (Gasco, 2007), decorrente de seu núcleo -formado de lipídeos sólidos à temperatura ambiente e corporal. NLS são passíveis de esterilização por autoclave sem a perda da estrutura, além de evitar o uso de solventes orgânicos para solubilizar lipídios (Müller et al., 2000; Mehnert & Máder, 2001; Charcosset et al., 2005; Gasco, 2007).

Outras vantagens das NLS, comparativamente a outros sistemas, estão relacionadas com sua capacidade de proteger fármacos e ácidos nucleicos da degradação química; melhor biocompatibilidade e baixo custo de escalonamento (Müller et al., 2000; Silva et al., 2011; Souza et al., 2011). NLS têm atraído atenção para o carreamento de pequenas moléculas, proteínas recombinantes e também para gene delivery (carreamento de plasmídeos, RNA de interferência e micro RNA para terapia gênica) através do uso de lipídeos catiônicos em sua formulação. Nessas formulações, estabelecem-se interações eletrostáticas entre os grupos fosfato em ligações fosfodiéster dos ácidos nucleicos (carga negativa) e a cabeça polar (carga positiva) daqueles lipídeos, possibilitando, assim, o carreamento do material genético (Müller et al., 2000; Kumar et al., 2007).

Um fenômeno indesejável que se observa com as NLS é que, durante o estoque, pode ocorrer uma transição polimórfica (rearranjo no núcleo cristalino), tal que os lipídios adquirem um arranjo mais rígido, estável e ordenado o que pode levar à expulsão das moléculas incorporadas na matriz lipídica sólida (burst effect). Para evitar esta expulsão indesejada do material incorporado, foram desenvolvidos os Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (Gasco, 2007).

Os Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) são considerados como a segunda geração de nanopartículas lipídicas (um aprimoramento das NLS) em que a utilização de misturas de lipídios sólidos e líquidos (óleos) à temperatura ambiente e/ou corporal para compor o núcleo das partículas evita a reorganização cristalina observada nas NLS. Com isto, é possível aumentar o tempo de armazenamento e obter perfis de liberação sustentada mais próximos ao desejado, maior porcentagem de encapsulação de ativos, além de manterem-se as vantagens já presentes nas NLS (Mehnert & Màder, 2001; Müller et al., 2002; Gasco, 2007). NLS e CLN podem ser obtidos por diferentes métodos, dentre os quais, dois se tornaram os mais utilizados na literatura: a homogeneização à alta pressão e a microemulsão à quente, formada de óleo em água (Gasco, 2007; Silva et al., 2011).

Homogeneização à alta pressão Homogeneização à alta pressão foi o método inicial utilizado por Müller e col. (1995) para a produção de NLS, assim como, posteriormente, para preparar CLN. Este método tem demonstrado, até hoje, ser de alto desempenho para produção dessas nanopartículas, sendo o mais amplamente utilizado em literatura (Gasco, 2007). Esta técnica utiliza alta pressão (entre 100-2000 bar) através de um poro de tamanho conhecido para acelerar partículas, de forma que o cisalhamento leva a obtenção de partículas de escala nanométrica (Charcosset et al., 2005). No entanto, a alta pressão e velocidade envolvidas neste método podem impedir seu uso para carrear compostos quimicamente instáveis. Além disso, homogeneizadores pressurizados de escala laboratorial necessitam de pelo menos 50 ml_ de suspensão para o processo ocorrer, com perda de cerca de 20 mL durante o processo, o que resulta em custo excessivo de produção de nanopartículas lipídicas, especialmente para formulações que contenham moléculas de alto custo (fármacos, lipídios catiônicos, moléculas marcadas, entre outras). De fato, como descrito anteriormente, a produção de nanopartículas lipídicas (CLN e NLS) para terapia gênica requer a utilização de lipídios catiônicos; tais lipídios sintéticos elevam substancialmente o custo de produção das nanopartículas. A perda significativa de material e conseguinte aumento dos custos de produção durante o processo de homogeneização sob pressão para produção de nanopartículas lipídicas levou ao desenvolvimento de outro método: a microemulsão a quente (Rameez et al., 2009).

Microemulsão a quente Os menores custos de produção e a possibilidade da incorporação de compostos lábeis ou instáveis à alta pressão exercida pela homogeneização a alta pressão, tornaram a microemulsão a quente uma alternativa (Silva et al., 2011). O método é baseado em 2 passos: i) aquecimento e mistura do lipídio liquefeito em água, surfatante e co-surfatante, sob agitação vigorosa (Ultra-turrax); ii) agitação mecânica da suspensão em um banho frio, solidificando assim a fase lipídica, antes liquefeita, produzindo as partículas desejadas (Souza et al., 2011). Entretanto, este processo necessita de grandes quantidades de surfatante e de co-surfatante para produzir resultados semelhantes aos obtidos com a homogeneização à alta pressão.

Mesmo utilizando menores volumes que os necessários para homogeneização à alta pressão, a microemulsão a quente ainda requer volumes que podem ser considerados altos para a otimização de formulações contendo componentes de alto custo.

Diante do exposto, seria útil se a técnica dispusesse de um método de pré-formulação para preparo de nanopartículas lipídicas com utilização de microextrusão a quente, que fosse adequado para preparo de pequenos volumes e que se baseasse na utilização de uma mini-extrusora, para servir de alternativa aos processos atuais de nanopartículas lipídicas. Adicionalmente a presente invenção, apresenta menor custo, uma vez que a mini-extrusora é significativamente mais barata que um agitador tipo ultra-turrax e não apresenta limitações características daqueles outros métodos, como a agitação vigorosa criada pelo ultra-turrax, ou a pressão elevada necessária ao processo homogeneização à alta pressão.

Além disso, o método é simples, barato, rápido e auto-limpante, pois a amostra passa de um lado para o outro do sistema extrusor, o que diminui a chance de bloqueio da membrana. O método propõe uso em pequena escala não requerendo gás sob pressão, diminuindo os custos de produção. A emulsão é aquecida 5°C acima do ponto de fusão do lipídio sólido, permitindo a incorporação de fármacos e outras moléculas bioativas.

Outro aspecto importante a se considerar em sistemas carreadores é a necessidade de esterilização, sendo um passo importante para a estabilidade de nanopartículas como NLS e CLN, já que a esterilização por calor/pressão (através de autoclave) pode induzir modificações que comprometam sua estabilidade físico-química (Torchilin, 2006). Neste contexto, destacamos a técnica de esterilização por microfiltração, que consiste em filtrar partículas maiores que 0,3 pm através de membranas com poros definidos, de 0,22 pm (Tchobanoglous et al., 2005). Utilizando o princípio desta técnica, já que as nanopartículas lipídicas da presente invenção são produzidas pela extrusão através de filtros de poros inferiores a 0,22 pm, a suspensão obtida já se apresenta estéril, sem a necessidade de outros processos adicionais, diminuindo ainda mais os custos de produção, demonstrando outra vantagem do método da presente invenção.

Breve descrição da invenção A presente invenção trata de um método por extrusão de microemulsão à quente para obtenção de nanopartículas lipídicas e carreadores lipídicos nanoestruturados. Mais especificamente, nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) são obtidos pelo dito método e seus usos são objetos adicionais da presente invenção. O método por extrusão de microemulsão a quente para obtenção de nanopartículas lipídicas compreende as seguintes etapas: a) Aquecer o lipídio ou mistura de lipídios 5°C acima da temperatura de fusão do lipídio sólido presente; b) Manter o aquecimento e adicionar água (com ou sem surfactante) à fase lipídica obtida em (a) de forma que fique totalmente suspensa, formação de microemulsão, e em alguns casos utiliza-se agitação vigorosa para garantir que a solução esteja homogênea; c) Extrudar a microemulsão obtida em (b), com manutenção da temperatura, e d) Resfriar (opcional) a microemulsão, em banho a 0°C. O método da presente invenção tem aplicação na fabricação de todas as formulações destas partículas que se constituam de emulsões de óleo em água que contenham pelo menos um lipídio sólido. As nanopartículas e carreadores obtidos podem ser utilizados como carreadores de material genético, desde siRNA até DNA, assim como de fármacos e proteínas.

Breve descrição das figuras A Figura 1 apresenta um esquema do método de fabricação para obtenção de nanopartículas lipídicas, em suas etapas. A Figura 2 apresenta medidas de diâmetro médio, valores de índice de polidispersividade (PDI) e potencial zeta de NLS e CLN ao longo de 180. A Figura 3 apresenta imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de: A) Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN); B) Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS), ampliadas a 130.000x. A Figura 4 apresenta o perfil de liberação in vitro de mitoxantrona livre e carreada NLS e CLN durante 72 h. A Figura 5 apresenta a proteção contra enzimas degradadoras de DNA (DNase I) com os DNAp livre sem (-) e com (+) DNase I, seguido por NLS e CLN em gel de agarose 1,3%.

Descrição detalhada A presente invenção trata de um método por extrusão de microemulsão à quente para obtenção de nanopartículas lipídicas. Mais especificamente, nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) são obtidos pelo dito método e seus usos são objetos adicionais da presente invenção. O método por extrusão de microemulsão a quente para obtenção de nanopartículas lipídicas compreende as seguintes etapas: a) Aquecer o lipídio ou mistura de lipídios 5°C acima da temperatura de fusão do lipídio sólido presente; b) Manter o aquecimento e adicionar água (com ou sem surfactante) à fase lipídica obtida em (a) de forma que fique totalmente suspensa (formação de microemulsão); c) agitar vigorosamente para garantir a homogeneidade da suspensão (opcional); d) Extrudar a microemulsão obtida em (c), com manutenção da temperatura, e e) Resfriar a microemulsão em banho a 0°C (opcional).

Mais especificamente, o método por extrusão de microemulsão a quente para obtenção de nanopartículas lipídicas compreende as seguintes etapas: a) Aquecer o lipídio ou mistura de lipídios 5°C acima da temperatura de fusão do lipídio sólido presente; juntamente com o fármaco a ser incorporado (opcional); b) Manter o aquecimento e adicionar água (com ou sem surfatante) à fase lipídica obtida em (a) de forma que fique totalmente suspensa (formação de microemulsão); c) agitar vigorosamente para garantir a homogeneidade da suspensão (opcional); d) Extrudar a microemulsão obtida em (c), com manutenção da temperatura, em membranas de policarbonato, poliésteres e/ou inorgânicas com poros entre 0,1 a 1000 nm (preferencialmente 100-400 nm) por 10 a 30 passagens, preferencialmente 15, e d) Resfriar a microemulsão em banho a 0°C (opcional). O método da presente invenção consiste em misturar os componentes e aquecer o sistema 5°C acima da temperatura de transição de fases do lipídio sólido que formará o cerne da nanopartículas. Esta microemulsão é extrudada com uma mini-extrusora de duas seringas (Avanti Polar Lipids, EUA) utilizando membrana de policarbonato lsoporetm de poro definido (100 nm) (Millipore, Reino Unido).

Foi padronizado que, para uma completa homogeneização da amostra, são necessárias 15 passagens da amostra pela membrana de poro definido. Após as passagens, as amostras são resfriadas em gelo (0°C) e estocadas a 4-C. Ao final do método obteve-se 1 mL de formulação.

Analisamos a variação dos parâmetros físico-químicos das CLN e NLS modificando apenas a temperatura do sistema em +5, +10 e +15 graus acima do ponto de fusão do lipídio sólido (as temperaturas de fusão acrescidas de 5; 10 e 15eC são representados a partir deste momento por Tf+5°C; Tf+10°C e Tf+15°C. Para CLN (Tfmonoestearatodegiiceriia = 58°C) essas temperaturas correspondem a 63°C; 68°C e 73°C. Para as NLS (Tfácido esteánco = 70°C) essas temperaturas correspondem a 75°C; 80°C e 85°C. Cada suspensão resultante foi analisada em relação ao diâmetro médio, potencial Zeta e polidispersividade (PDI) em um Zetasizer Nanoseries (Malvern, Reino Unido).

Tabela 1 - Temperaturas utilizadas durante o desenvolvimento do método da presente invenção.

Na presente invenção consideram-se as seguintes definições: NLS para descrever as partículas contendo somente ácido esteárico no núcleo sólido e de CLN para partículas contendo a mistura de fosfatidilcolina de ovo (EPC) (Sigma-Aldrich, EUA) e o monoestearato de glicerila (Croda, Brasil) como lipídio para o núcleo, cujo ponto de fusão é Tc = 54°C ±5°C. A formulação de NLS obtida pelo método por extrusão de microemulsão à quente da presente invenção compreende os seguintes componentes: - Lipídio sólido a temperatura ambiente e corpórea; - Lipídio catiônico, e - Surfatante. A formulação de CLN obtida pelo método por extrusão de microemulsão a quente da presente invenção compreende os seguintes componentes: - Lipídio sólido a temperatura ambiente e corpórea; - Lipídio líquido a temperatura ambiente e corpórea; - Surfatante. O lipídio sólido selecionado para as NLS foi o ácido esteárico e para as CLN foi o monoestearato de glicerila, porém podem ser utilizados lipídios como triglicérides, (tri-estearina), glicerilas (trilaurato de glicerila, trimiristato de glicerila, tripalmitato de glicerila, triestearato de glicerila, monobehenato de glicerila, ácidos graxos (ácido esteárico, ácido palmítico, ácido behênico), esteróides (colesterol) e ceras (cetilpalmitato, séries Cutina CP e Precifac), cera de abelha (série Apifil), cera de carnaúba, entre outros, preferencialmente ácido esteárico e monoestearato de glicerila. O lipídio catiônico pode ser selecionado do grupo: 1,2-dioleoil 3-trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de cetilpiridínio, cetrimide, cloreto de benzalcônio, Esterquat 1, dimetilaminoetano-carbamoil-colesterol (DC-Chol), estearilamina, brometo de dodeciltrimetil amônio, N-[l(2,3-dimiristiloxi)propilacetil (DOTAB), brometo de dodeciltrimetil amônio (DTAB), cloreto de N-[1,2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), brometo e cloreto de dioctadecildimetil amônio (DODAB e DODAC), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi propilamino (DODMA), Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB) e 6-lauroxihexil ornitinato (LHON), entre outros, preferencialmente 1,2-dioleoil 3-trimetilamônio propano (DOTAP). O surfatante pode ser selecionado do grupo do Poloxamer (série Pluronic), sorbitano (série Span), polisorbato (série Tween) e polioxietilenoglicol alquil éter (Série Brij), entre outros, preferencialmente Pluronic F68. O lipídio líquido à temperatura ambiente e corporal pode ser selecionado do grupo dos fosfolipídios como as fosfatidilcolinas (dentre as quais se destacam a fosfatidilcolina de ovo e de soja (EggPC e SoyPC), 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DDPC), 1 -palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) e as fosfatidiletanolaminas (como 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLPE), 1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), e 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE); ácidos graxos (como ácido oleico, linoleico, ricinoleico e grupos derivados de ácido cáprico/caprílico (séries Miglyol e Softsan, e ácido capróico), óleos (como o de oliva, coco, soja, rícino e amêndoa), entre outros, preferencialmente fosfatidilcolina de ovo (EPC).

Tabela 2 - Composição final das modalidades preferenciais das formulações de NLS e CLN. A modalidade preferencial da formulação de CLN compreende os seguintes componentes: monoestearato de glicerila (Croda, Brasil), fosfatidilcolina de ovo (Sigma-Aldrich, EUA) e Pluronic F68 (também denominado Poloxamer 188) (Sigma-Aldrich, EUA), nas concentrações dispostas na Tabela 2. A suspensão de CLN foi submetida ao método da presente invenção e extrudada em membranas de policarbonato lsoporetm (Millipore, Reino Unido), com poros de tamanho de 100 nm.

Estabilidade Físico-Química As suspensões de CLN e NLS foram produzidas e, logo após, estocadas em tubos tipo eppendorf a 4°C, em água Milli-Qtm, em umidade relativa ambiente e sem proteção quanto a luminosidade, para avaliação da sua estabilidade físico-química ao longo do tempo (0; 7; 15; 30; 45; 60; 90; 120; 150 e 180 dias), através da medida de parâmetros físico-químicos como tamanho, potencial Zeta e polidispersividade (PDI) em um Zetasizer Nanoseries (Malvern, Reino Unido), como demonstrado pela Figura 2.

Determinação do número mínimo de passagens pela extrusora para homoqeinizacão das partículas A tabela 3 mostra a variação dos parâmetros diâmetro médio, potencial Zeta e polidispersividade das partículas CLN e NLS, produzidas a Tf+5QC, em relação ao número de passagens pela membrana de 100nm (0 a 30 passagens). Em relação ao diâmetro médio, observamos uma diminuição do tamanho médio com aumento do número de passagens, a partir da 10ã passagem é possível verificar que o tamanho das formulações não varia mais.

Apenas as formulações de NLS com 5 passagens foram estatisticamente diferentes, em relação ao diâmetro final das partículas obtidas após 30 passagens pela extrusora. Isso indica que para todas as preparações a extrusão diminuiu significativamente o diâmetro médio das partículas. O potencial Zeta das formulações de NLS não variou estatisticamente em função do número de passagens pela extrusora. Entretanto, 0 e 5 passagens para os CLNs apresentaram uma variação para este parâmetro quando comparados com 30 passagens para as mesmas formulações. Para os CLN, é possível que antes da extrusão o arranjo molecular favorecesse a exposição dos grupamentos fosfato da EPC na superfície das partículas de CLN, já que esses grupos constituem as únicas cargas aniônicas existentes nestas partículas, explicando assim os valores negativos de potencial Zeta observados a 0, 5 e 10 passagens pela membrana. Além disso, é possível notar a clara diferença entre NLS (com potencial zeta altamente positivo, > +50 mV, devido a presença do lipídio catiônico DOTAP), enquanto as CLN apresentam um potencial zeta próximo a neutralidade, após a extrusão.

Foi avaliado ainda, o índice de polidispersividade (PDI), que mede a variação do tamanho da população, um dos pontos cruciais para o sucesso das terapias (entrega de material genético e fármaco). Este índice determina a qualidade da suspensão, segundo a sua homogeneidade. O índice varia de 0, como suspensão totalmente homogênea, até 1, em suspensão totalmente heterogênea. Relatam-se valores de PDI abaixo 0,250 como ideais para administração intravenosa (Müller & Heinemann, 1992; Müller et al., 1995), sendo aceitáveis para suspensões coloidais valores de até 0,300 (Gasco, 2007).

Com 10 passagens em membrana de 0,1 pm a Tabela 3 mostra que, através da microextrusão (de 1 mL), é possível produzir nanopartículas lipídicas, NLS e CLN, com características físico-químicas desejáveis.

Na presente invenção valores de PDI abaixo de 0,25 foram alcançados após 10 passagens pelas membranas de extrusão, para todas as formulações.

Tomados em conjunto, os dados físico-químicos (diâmetro médio, potencial zeta, e PDI) demonstram que para uma produção homogênea de nanopartículas lipídicas são necessárias pelo menos 10 passagens pela membrana de extrusão. Para garantir a homogeneidade das formulações durante a produção de nanopartículas lipídicas através do método da presente invenção deve-se adotar 15 passagens pela membrana. A Tabela 4 mostra a influência da temperatura de produção das NLS e CLN sobre parâmetros físico-químicos das partículas como diâmetro médio, potencial Zeta e PDI. É descrito que o aumento da temperatura leva a um aumento no tamanho de lipossomas, devido a mudanças na viscosidade das bicamadas (Zook & Vreeland, 2010). Além disso, a fusão dos lipídios sólidos é um parâmetro importante na produção de nanopartículas lipídicas por outros métodos, justificando que analisássemos o efeito da variação da temperatura de produção, nas características físico-químicas das nanopartículas lipídicas obtidas. Como descrito anteriormente, as temperaturas testadas correspondem a 5, 10 e 15°C acima da temperatura de fusão (Tf) dos lipídios ácido esteárico nas NLS e monoestearato de glicerila nos CLN (Tabela 4).

Inicialmente o aquecimento do sistema houve uma diminuição do diâmetro médio partículas para as NLS produzidas a Tf+15°C. Isto pode ser explicado pelo possível rearranjo do ácido esteárico, para uma forma mais compactada com o aquecimento. Quanto ao diâmetro médio as nanopartículas lipídicas (CLN e NLS) não sofreram mudanças significativas, com exceção dos CLN produzido com Tf+15°C, o qual diminuiu seu diâmetro médio de forma significativa com o aumento da temperatura do sistema. Neste caso, o aumento temperatura do sistema para Tf+15°C pode ter auxiliado no cisalhamento dessas partículas, evidenciado pela maior facilidade de passagem desta formulação na Tf+15°C. A variação na temperatura de produção das nanopartículas lipídicas não levou a diferença estatística do potencial Zeta de qualquer das formulações testadas. Mesmo para a formulação de NLS preparada a Tf+5°C o potencial de cargas superficiais não foi significativamente diferente das formulações preparadas nas outras temperaturas, a saber, Tf+10°C e Tf+15°C. Há relatos em literatura mostrando que o aumento da temperatura do sistema induziu maior diâmetro e polidispersão de NLS (Charcosset, et al., 2005; 2006), demonstrando desestabilização coloidal das NLS. Nossos resultados com CLN e NLS preparadas até 15°C acima da temperatura de transição dos lipídios constituintes do cerne das partículas não indicam qualquer influência da temperatura sobre sua estabilidade, evidenciando que a diminuição na viscosidade lipídica devido ao aumento da temperatura não é um fator tão importante para as NLS nanopartículas lipídicas, já que em nenhum dos casos, o aumento para Tf+10°C e Tf+15°C levou a mudanças significativas nas características físico-químicas das nanopartículas lipídicas. Entretanto, como o aumento da temperatura (Tf+10°C e Tf+15°C) durante o preparo não refletiu em nenhuma vantagem nas propriedades das nanopartículas lipídicas adotamos a temperatura de 5°C acima da temperatura de fusão do lipídio sólido para a produção das nanopartículas lipídicas. Portanto, foram utilizados 63°C para a produção dos CLN e 75 °C para as NLS.

Tabela 5 - Características físico-químicas de CLN e NLS produzidas através do processo de extrusão de microemulsão com 15 passagens e Tf+5°C. Resultados apresentados em forma de média e desvio padrão de 3 experimentos independentes (n=3).

Como obtivemos, com os parâmetros de números de passagens e temperatura do sistema otimizados na extrusão de microemulsão, partículas modelo com tamanho similar às produzidas com homogeneização à alta pressão, propusemo-nos a verificar a estabilidade das partículas, estocadas à 4°C, ao longo do tempo.

Estabilidade físico-química das formulações produzidas Lipossomas são as nanopartículas lipídicas de uso consagrado para carreamento de fármacos e material genético. No entanto, lipossomas são comumente descritos como partículas com baixa estabilidade de prateleira, com tendência à fusão e formação de agregados que podem levar à degradação do material neles encapsulado durante o estoque (Couvreur et al., 1995; Mehnert & Máder, 2001; Martins et al., 2007). Diferentemente, NLS e CLN são descritas como mais estáveis, podendo manter suas características físico-químicas por mais de 2 anos (Anna, 2007). Os resultados da Figura 2 mostram que NLS e CLN produzidas permaneceram estáveis por período de armazenamento de 180 dias, a 4°C.

Tanto os CLN quanto as NLS apresentaram potencial Zeta estável ao longo do armazenamento. Cabe ressaltar que os CLN se apresentaram estáveis por 6 meses, apesar de seu potencial Zeta ser neutro. Esse resultado demonstra a boa estabilidade física dos CLN, advinda, provavelmente, de sua ultraestrutura monolítica e da presença do polímero Pluronic F68 em sua composição. Surfatantes, como o Pluronic F68, localizam-se na superfície das NLS e CLN e aumentam a estabilidade coloidal dessas partículas ao agirem como espaçadores entre as cabeças polares dos lipídios (Müller et al, 2000; Liu et al, 2009). No caso da CLN, a presença do surfatante pode ser um fator primordial para a estabilidade das partículas ao longo do tempo, já que os valores de potencial zeta próximos da neutralidade não favorecem repulsões eletrostáticas nas CLN para evitar a agregação entre as partículas. De fato, a repulsão eletrostática (potencial Zeta acima de |30| mV) é considerada, em literatura, como um dos principais fatores de estabilidade para essas partículas em suspensão (dei Pozo Rodriguez et al., 2007). Além disso, as NLS preparadas (com potencial Zeta altamente positivo) apresentaram atividade como agentes de transfecção por até 2 anos.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) Para análise morfológica de CLN e NLS produzidas, foram utilizados grids de cobre FCF200-cu (Koch Electron Microscopy, Brasil) para microscopia eletrônica, adicionando-se 1 gota da amostra; e após 10 s secou-se o excesso com papel filtro. Adicionou-se 1 gota do corante negativo (Uranila 2 %) por 8 s sobre a superfície do grid, secando-o novamente. Em seguida, uma gota de água Mili-Qtm foi adicionada à superfície por 5 s, para retirada do excesso de corante. Nanopartículas lipídicas foram visualizados por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), utilizando-se o equipamento LEO906E (Zeiss, Alemanha) à 60 kV e aumento de 130.000 vezes. A Figura 3(A) mostra que as NLS apresentaram ultraestrutura monolítica com formato esférico irregular e diâmetro médio em torno de 120 nm, o qual é bastante compatível com a medida de 135 nm, obtida por espalhamento de luz dinâmico. As CLN apresentaram ultraestrutura monolítica com diâmetro médio de 127,5 nm (resultado próximo aos 115,7 nm medidos por espalhamento de luz dinâmico), e formato esférico com mais reentrâncias que as NLS.

Recentemente, Feng e col. (2011) prepararam CLN, compostas de Compritol 888 ATO e EPC, e registraram por MET formatos esféricos para as partículas, com irregularidades semelhantes às observadas aqui, enquanto Pathak & Nagarsenker (2009) obtiveram imagens em que NLS de Compritol 888 ATO, Precirol ATO 5 e Tween 80 apresentaram formato esférico e irregularidades nas bordas. Bunjes e col. (2007) registraram imagens de NLS formadas de triestearina e lecitina de soja, com formato esférico e que apresentam camadas concêntricas até o centro, sendo este de alta densidade eletrônica (núcleo escuro). Tal organização lipídica foi denominado, pelos autores, de forma a, com distância entre as camadas de cerca de 5 nm. Para outras formulações, os autores ainda relataram NLS com formato circular e camadas orientadas em paralelo, que denominaram de modificação ? cristalina, apresentando listras com distâncias de 4,6 nm. A partir destes dados, os autores propuseram um modelo para o processo de solidificação que NLS formadas por triestearina e lecitina de soja. Segundo este modelo, as NLS ainda aquecidas se apresentam como partículas em emulsão. Com o resfriamento, sua parede externa começa se solidificar até que as partículas fiquem na forma a. Com o aumento da temperatura e ao longo do tempo, as NLS podem formar partículas com modificação ? cristalina, causando a expulsão dos fármacos da sua matriz sólida.

Em nossas partículas (Figura 3) pudemos verificar nas NLS e CLN um centro com alta densidade eletrônica (região escura no interior da partícula) de acordo com o descrito por Bunjes e col. (2007), bem como camadas concêntricas ao seu redor, sugerindo que as partículas produzidas estariam na forma ? cristalina.

Liofilizacão Alíquotas (75 pL de amostra diluídas em 1,425 mL de água Mili-Q) de CLN e NLS vazios produzidos foram liofilizadas em presença ou ausência de crio protetores (trealose ou sacarose) (Sigma-Aldrich, EUA) à concentração final de 4 % (peso:volume). As dispersões resultantes foram congeladas em nitrogênio líquido e liofilizadas em equipamento liofilizador Freezone 4.5 (Labconco, EUA) por 48 horas. As amostras liofilizadas foram reidratadas com água Milli-Q até o volume inicial (1,5 ml_) e suas propriedades físico-químicas resultantes (tamanho, potencial Zeta e PDI) foram analisadas em equipamento Zetasizer (Malvern, Reino Unido) e comparadas com a de alíquotas não liofilizadas.

Os fatores determinantes para que um crioprotetor seja eficiente incluem: uma alta temperatura de transição vítrea, baixa higroscopia, baixa taxa de cristalização e não possuir nenhum grupo redutor. A trealose e a sacarose são dissacarídeos que apresentam essas características e, por isso, são os mais utilizados em literatura (Allison et al., 2000; Hinrichs et al., 2001; Del Pozo-Rodriguez et al., 2009).

Testamos estes dois crioprotetores na liofilização de CLN e NLS, comparando características físico-químicas de partículas não liofilizadas e liofilizadas sem crioprotetor e os resultados obtidos estão expostos na Tabela 6.

Os dados da Tabela 6 mostram que todas as partículas liofilizadas sem crioprotetor apresentaram grande aumento do tamanho e polidispersão, demonstrando agregação das nanopartículas frente ao estresse físico do processo, o que inviabiliza o uso da liofilização como método de armazenamento das partículas nessas condições (sem crioprotetor). Dentre os crioprotetores utilizados, partículas com trealose apresentaram características mais próximas às partículas não liofilizadas, enquanto que o uso de sacarose produziu partículas com diâmetro médio e PDI ligeiramente superiores às correspondentes amostras não liofilizadas. Estes resultados estão de acordo com dados obtidos na literatura, em que suspensões de NLS e CLN liofilizadas com trealose apresentaram menor tendência de agregação que as liofilizadas na presença de sacarose e monossacarídeos como glicose (Allison et al., 2000; Molina et al., 2004; Del Pozo-Rodriguez et ai., 2009), não tendo efeitos na citotoxicidade, nem diminuição na taxa de transfecção dessas formulações. A literatura indica que os crioprotetores, em especial a trealose, tem um papel fundamental de estabilização, resultante da ligação dos grupos hidroxila (-OH) dos dissacarídeos com o grupamento fosfato dos fosfolipídios, por pontes de hidrogênio, evitando a fusão das partículas e danos nos fosfolipídios, causados pela desidratação. Carreamento de Fármacos (Drug Deliverv) Analisamos a incorporação e liberação do fármaco mitoxantrona e a interação e proteção de material genético, com as partículas lipídicas. A mitoxantrona é um quimioterápico capaz de se intercalar ao DNA, além de apresentar uma alta capacidade de inibir a topoisomerase II. Esses efeitos resultam em um comprometimento da síntese de RNA e consequente morte celular (Goodin et al., 2003; Li et al., 2005). A hidrofobicidade da mitoxantrona lhe permite atravessar barreiras biológicas (biomembranas) sem a necessidade de carreadores específicos e elicitar seu efeito citotóxico (Burns et al., 2002). Porém, células expostas ao tratamento com esse composto podem desenvolver resistência ao fármaco, principalmente células bastante indiferenciadas, como as de câncer de mama (Zhang et al., 2011). Com isto, doses cada vez maiores são necessárias para induzir o efeito terapêutico, pronunciando cada vez mais seus efeitos colaterais. Para evitar tais desvantagens, uma alternativa seria utilizar sistemas de carreamento de fármacos, pois esses podem aumentar a concentração intracelular do composto, revertendo, assim, a resistência ao tratamento (Alexis et al., 2008a).

Produzimos CLN e NLS contendo 5 mmol.L'1 de mitoxantrona. A caracterização físico-química dos carreadores com e sem mitoxantrona, tamanho e potencial Zeta é apresentada na Tabela 7 Os CLN apresentaram diâmetro ligeiramente maior que o das partículas não carregadas com o fármaco. Este fato pode se relacionar com a quantidade ou forma de encapsulação do fármaco na partícula. Os valores de PDI sofreram ligeiro aumento para as partículas de CLN, porém, em nenhum dos casos ultrapassou 0,300, indicando boa homogeneidade das formulações, conforme Gasco (2007).

Em relação ao potencial Zeta, não houve alteração significativa nos valores do potencial de superfície das partículas para as NLS. Como a mitoxantrona possui carga positiva em pH fisiológico (pKa da mitoxantrona entre 8,3-8,6 (Mahoney et al., 2003; Raghunand et al., 2003)), a não alteração do potêncial zeta pode demonstrar que o fármaco não está na superfície, mas sim no interior das nanopartículas lipídicas. No caso das NLS, houve diminuição significativa do potencial de superfície (positivo pela presença de DOTAP), indicando reorganização dos lipídios da superfície das NLS para incorporação da mitoxantrona, justificando a alteração nas cargas superficiais.

Avaliamos, também, a porcentagem de encapsulação de MTX pelas nanopartículas. Para tanto, adicionamos 150 pL das partículas produzidas na presença de mitoxantrona e as filtramos através de filtros de 10 kDa (Millex, Millipore) sob centrifugação a 3550 x g, por 5 min. Em seguida, o filtrado foi coletado e, ao filtro, foram adicionados 150 pL de solução de SDS (Sigma- Aldrich, EUA) a 20 %, para rompimento das partículas, que foram centrifugadas novamente à 3550 x g, por 5 min. O novo filtrado foi analisado em espectrofotômetro Carywin 50 (Varian, EUA), em 672 nm, e a absorbância medida permitiu a quantificação da mitoxantrona encapsulada nos carreadores, pelo uso da curva padrão de mitoxantrona.

Para a concentração final de 5 mmol.L'1 de mitoxantrona nos carreadores, a encapsulação da mitoxantrona obtida foi de 81% nos CLN (4,01 mmol.L'1 do fármaco carreado), e 64 % nas NLS (correspondente a 3,2 mmol.L' 1 do ativo realmente incorporado).

Para CLN compostas de triglicerídeos de cadeia média, há autores que mostram encapsulação de até 83,7 % de mitoxantrona (Li et al., 2010). Para NLS, Lu e col. (2006) registraram 87 % de encapsulação de mitoxantrona, enquanto que a nossa formulação apresentou encapsulação menor que a descrita, com 64 %. Este menor valor, em comparação com a CLN, pode estar relacionado com a repulsão eletrostática ocasionada entre DOTAP (lipídio catiônico) e a mitoxantrona que, em pH fisiológico, apresenta-se em sua forma catiônica (Mahoney et al., 2003; Raghunand et al., 2003).

Como os fármacos somente podem agir em seu sítio-alvo, é necessário que a mitoxantrona incorporada nas nanopartículas lipídicas seja liberada do carreador ao longo do tempo. Então, analisamos a liberação in vitro de mitoxantrona dessas partículas, ao longo de 72 horas, com a utilização de células de Franz adaptadas para o uso de membrana de diálise.

Liberação in vitro de mitoxantrona Para os estudos de liberação in vitro de mitoxantrona, sacos de diálise de 12-14 kDa (Spectrumlab, EUA) foram umedecidos em tampão fosfato salino (PBS) durante pernoite antes de serem abertos e cortados em 2 folhas. Uma folha da membrana de diálise foi adaptada em um sistema de células de Franz separando a câmara doadora da receptora. Foi aplicado na câmara doadora 200 pl_ das amostras diluídos em 0,8 ml_ de PBS, contendo 5 mmol.L'1 de Mitoxantrona (Sigma-Aldrich, EUA) livre ou nos carreadores (CLN e NLS), enquanto que 4 mL de PBS foram adicionados à câmara receptora da célula de Franz, de forma que não houvesse bolhas na interface do líquido com a membrana. 250 pl_ do volume contido na câmara receptora foram coletados em tempos determinados (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48 e 72 h) e analisados em espectrofotômetro Carywin 50 (Varian, EUA), em 672 nm. A absorbância medida permitiu a quantificação da mitoxantrona permeada, pelo uso da curva padrão de mitoxantrona. O volume retirado da câmara receptora para análise (250 ??_) foi imediatamente reposto com igual volume de PBS. A permeação total de mitoxantrona livre através da membrana ocorreu em cerca de 8 horas, como mostra a Figura 4. As NLS e CLN mostraram um perfil com 10,4 e 12,7 %, respectivamente, de liberação de mitoxantrona no tempo máximo transcorrido no ensaio (72 horas). Esses dados estão de acordo com a literatura, na qual Lu e col. (2005) relatam permeação de 7,8 h para o fármaco livre em PBS enquanto que para NLS (formadas de EPC, Tergitol® S-40 e Compritol® 888) com mitoxantrona, obtiveram 80 % da droga livre somente após 600 horas de permeação. Neste ensaio, não verificamos possíveis efeitos de expulsão do fármaco (Burst Effect), comumente relatados com NLS na literatura (Gasco, 2007), até 72 h de permeação.

Carreamento de genes (gene deliverv) Avaliamos a capacidade das partículas CLN e NLS (sem mitoxantrona) como carreadores de genes (gene delivery). O carreamento de materiais genéticos, e.g. DNA, RNA, siRNA, entre outros, através de sistemas virais ou não-virais é vital para a utilização dessas macromoléculas para fins terapêuticos. Os ácidos nucleicos, biopolímeros carregados negativamente (poliânions), além de serem incapazes de atravessar biomembranas devido sua carga aniônica e ausência de transportadores membranares, são alvos de diversas enzimas capazes de degradá-los, como as nucleases. Portanto, a interação do material genético com sistemas de carreamento capazes de promover sua internalização celular e protegê-los da degradação é a primeira etapa no desenvolvimento desses veículos.

Ensaios de Retardamento da Mobilidade Eletroforética (EMSA) Testamos a capacidade das nanopartículas lipídicas NLS e CLN de interagirem com DNAp utilizando o teste de retardamento na mobilidade eletroforética (EMSA). Esse teste consiste em separar o DNAp que não interagiu com as partículas, através de eletroforese, permeando o gel de agarose e se tornando disponível para visualização através do corante Brometo de Etídio, enquanto que o material que interagiu eletrostaticamente com os carreadores fica retido no poço inicial (retardamento da mobilidade eletroforética).

Para o Ensaio de Retardamento da Mobilidade Eletroforética (EMSA), 2 pg de plasmídeo pcDNA 3.1/V5-His-Topo (Invitrogen, EUA) contendo o gene para proteína PTEN (DNAp) foram diluídas em 10 pl de água Milli-Q™, enquanto que 3 ?! de nanopartículas (NLS e CLN) vazias foram diluídas em outros 7 ?? de água Milli-Q™. Após misturadas, as amostras foram incubadas por 20 min.; em seguida foram aplicadas em um gel de agarose a 1,3 % corado com brometo de etídio (0,5 pg/mL) e submetidas à eletroforese, sob tensão de 50 V, por 2 h. Foi utilizado como controle nesse ensaio, uma amostra contendo somente 2 pg DNAp livre. Uma solução de glicerol (Sigma-Aldrich, EUA) a 10 % foi usada nas corridas para evitar possíveis interferências do azul de bromofenol, presente no tampão de corrida convencional, na interação DNAp:nanopartícula. A análise foi realizada em câmara sob luz UV onde os resultados foram visualizados e fotografados. As bandas foram quantificadas utilizando-se o software ImageJ (Abramoff et al, 2004; Rasband, 2012; Scheider et al, 2012).

Os resultados obtidos mostraram que a formulação de CLN apresentou banda de DNAp livre, representando 88,8 % do total aplicado, respectivamente; indicando não ser capaz de interagir com o DNAp. Isso se deve ao fato CLN não conterem lipídio catiônico em sua constituição. Já a formulação de NLS foi capaz de reter 99,2 % do DNAp, respectivamente, indicando que, nas concentrações testadas, as NLS são capazes de interagir com praticamente todo material genético disponível.

Ensaio de Proteção contra DNase I A segunda etapa de desenvolvimento dessas partículas para carreamento de material genético consistiu em avaliar se os veículos seriam capazes de proteger o material genético carreado de suas enzimas degradadoras, como a DNase I (Del Pozo-Rodriguez et al., 2007).

Para o ensaio de proteção do material genético contra DNase I, 2 pg de plasmídeo pcDNA 3.1/V5-His-Topo (Invitrogen, EUA) contendo o gene para proteína PTEN (DNAp) foram diluídos em 10 pl de água Mllli-Q™, enquanto que 3 ?? de nanopartículas (CLN ou NLS) foram diluídos em outros 7 ?? de água Milli-Q™ Depois de misturadas, as amostras foram incubadas por 20 min.; em seguida foi aplicado 1 U de DNase I (Invitrogen, EUA) para cada 2,5 pg de DNAp e, em seguida as amostras foram incubadas, novamente, à 37BC por 30 min. Após esta etapa, foi adicionado 1 % de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Sigma-Aldrich, EUA), volume final, para dissociação do DNAp dos carreadores, e então as amostras foram aplicadas em um gel de agarose a 1,3 % corado com brometo de etídio (0,5 pg/mL) e submetidas à eletroforese, sob tensão de 50 V, por 2 h. Foram utilizados dois controles nesse ensaio, um deles contendo somente DNAp (2 pg) e outro contendo 2 pg DNAp e DNase I e outro contendo uma solução de glicerol (Sigma-Aldrich, EUA) a 10 %, usada durante as corridas para evitar possíveis interferências do azul de bromofenol, presente no tampão de corrida convencional, na interação DNAp:nanopartícula. A análise foi realizada em sob luz ultravioleta, onde os resultados foram visualizados e fotografados. As bandas foram quantificadas utilizando o software ImageJ (Abramoff et al, 2004; Rasband, 2012; Scheider et al, 2012). Dois controles, contendo DNA livre sem (-) e com (+) DNase I, demonstraram que a enzima estava funcional. Os resultados (Figura 5) mostraram que praticamente todo DNAp foi digerido pela enzima nos CLN, mas quase a totalidade desse é foi protegido da degradaçao nas NLS (99,1 % de DNAp recuperado após ação da enzima). Isso pode ser explicado pela não compactação do DNAp nas partículas CLN, por não haver interação eletrostática entre esses. Em contrapartida, NLS interagem com o DNAp, como mostrado anteriormente, e o compactam, de forma comprometer a degradação pela DNase I. Estes resultados estão de acordo com aqueles descritos por Pozo-Rodríguez e col. (2007) que, utilizando NLSs produzidas com o lipídio Precirol® ATO 5, DOTAP e Tween 80 demonstraram que o grau de compactação do DNAp determina o grau de proteção à ação de DNase I. Esses autores demonstraram que a condensação e proteção do material carreado da degradação citoplasmática é uma característica muito importante em um sistema de sistemas de transferência de genes (Pozo-Rodríguez et al., 2007).

Com ambos os sistemas de carreamento de genes e de fármacos caracterizados pudemos, então, analisar a eficiência dos carreadores para o transporte de fármacos e material genético, concomitantemente, através do teste de viabilidade celular.

Teste de Viabilidade Celular Após demonstrar que as nanopartículas lipídicas podem carrear fármacos e genes, procedemos com a avaliação da citotoxicidade dessas formulações em células de fibroblastos Balb/3T3 (não cancerígena) e células de câncer de mama (MCF-7) e próstata (PC3).

Para avaliação da citotoxicidade in vitro, utilizou-se o teste de MTT, cujo princípio consiste na captação deste corante e sua redução à formazan (um composto de cor púrpura) pelas desidrogenases mitocondriais, resultando em acúmulo desse composto em células viáveis. A lise das células possibilita a liberação do formazan que pode ser, então, quantificado em 570 nm (Denizot & Lang, 1986). Células Balb/3T3, PC3 e MCF-7 foram plaqueadas à concentração de 103 células por poço em placas de 96 poços. Após o pernoite para adesão, o meio foi trocado e adicionado de 20 pmol.L"1 de CLN ou 25 pmol.L"1 de NLS (concentrações finais), correspondentes a 10 pmol.L'1 de mitoxantrona encapsulada em cada (as concentrações encapsuladas foram determinadas anteriormente). Em seguida, 2,0 pg/mL de DNAp foram adicionados na suspensão das partículas de CLN e NLS. Após tratamento por 24 h, o meio foi removido e trocado por meio sem soro contendo o corante MTT (1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, EUA) e as células foram incubadas por mais 4 h. Em seguida, o meio foi retirado cuidadosamente e 0,2 mL de etanol (Synth, Brasil) foi adicionado por poço, para solubilização do formazan formado. As placas foram agitadas por 10 min. e a absorbância medida a 570 nm em espectrofotômetro ELX800 (Biotek, EUA).

Primeiramente, realizamos a curva dose-resposta para medir a dose de MTX capaz de reduzir a viabilidade celular a 50 % (IC50) das linhagens fibroblásticas Balb/3T3, de câncer de próstata PC3 e de câncer de mama MCF-7 (sensíveis ou resistentes à mitoxantrona).

Pudemos visualizar que, nas condições de ensaio, as 3 linhagens sensíveis à mitoxantrona (3T3, PC3 e MCF-7 não resistente) possuem IC50 próximo de 10 pmol.L"1, com exceção para MCF-7 resistente, cujo valor foi 5 vezes maior (IC50 de 50 pmol.L'1).

Como discutido anteriormente, encapsulamos mitoxantrona nas nanopartículas lipídicas para tentar reverter a resistência apresentada pelas células de câncer à este fármaco, quando carreado. Por outro lado testamos também os CLN e as NLS para inserir material genético (que se utiliza de um plasmídeo) no interior das células, uma vez que o plasmídeo é uma macromolécula carregada negativamente, o que a torna incapaz de atravessar passivamente biomembranas (Liu et al., 2007).

Com isso em mente, avaliamos a atividade citotóxica das formulações em linhagem de células de fibroblastos de rato (Balb/3T3), utilizando o teste de MTT. Os resultados obtidos permitem já numa primeira observação, concluir que os sistemas de carreamento não apresentam toxicidade intrínseca (viabilidade celular acima de 90 % para CLN e NLS).

Somente a mitoxantrona livre apresentou uma toxicidade significativa para as células Balb/3T3. Interessante destacar que a citotoxicidade intrínseca da mitoxantrona (p<0,05) foi mitigada em todas as formulações de NLS, contendo ou não plasmídeo. A exemplo das NLS, a grande eficiência de encapsulação de mitoxantrona nas CLN (81,4 %) também resultou em proteção da citoxicidade da mitoxantrona sobre a viabilidade celular, em relação ao fármaco livre.

Estes resultados mostram que a mitoxantrona, na concentração testada de 10 pmol.L'1, apresenta um efeito citotóxico aos fibroblastos, linhagem não-cancerígena, entretanto, quando encapsulada pela CLN ou NLS, este efeito é diminuído, não havendo citotoxicidade resultante da incorporação do fármaco nos carreadores. Também é possível observar que as formulações contendo o gene para a PTEN não apresentaram efeito citotóxico para as células não cancerígenas desta linhagem. O tratamento com mitoxantrona livre (10 pmol.L'1) diminuiu a viabilidade das células de câncer de próstata para 48,4 %, demonstrando a susceptibilidade desta linhagem ao fármaco. Não observamos toxicidade significativa para a formulação de MTX encapsulada em NLS. Já para a formulação de NLS, os níveis de toxicidade do gene PTEN foram significativos, e similares aos obtidos com a conjugação gene e fármaco.

Como último passo de nossa análise, avaliamos a citotoxicidade dos carreadores produzidos (SLN e CLN) em outra linhagem cancerígena, a de câncer de mama resistente à mitoxantrona (MCF-7).

Seleção de células MCF-7 resistentes à mitoxantrona Inicialmente, as células de MCF-7 foram expostas a 100 nmol.L1 de MTX (Sigma-Aldrich, EUA), para seleção de células resistentes ao fármaco. A cada troca de meio (aproximadamente 3 vezes por semana), 10 nmol.L'1 de MTX era adicionado ao meio, para manutenção do genótipo, submetendo-as sob ação do fármaco por, pelo menos, 1 mês antes do experimento, tempo necessário para evitar contaminação com células não resistentes (Volk et al., 2000). Para os experimentos, as células foram mantidas em meio sem fármaco por 1 semana, evitando quaisquer efeitos advindos do meio seletivo e não propriamente da MTX incorporada nas partículas (Taylor et ai., 1991; Volk et al., 2000; Zhang et al., 2004).

Para o tratamento das células de câncer de mama (MCF-7), observamos que a linhagem se mostrou resistente ao fármaco mitoxantrona livre ou nas NLS. O tratamento com o gene codificante de PTEN induziu toxicidade nas formulações em NLS, demonstrando que houve carreamento genético por esta partícula. Além disso, registrou-se um efeito sinérgico na formulação de carreamento conjunto do fármaco MTX e do gene codificante de PTEN pelas NLS, levando uma menor viabilidade celular (p<0,05). A liberação de MTX não pôde ser visualizada no carreamento somente de MTX pelas NLS provavelmente devido à resistência ao fármaco da MCF-7, algo que só pode ser demonstrado com a expressão de PTEN (conjugação NLS). Zhang e col. (2004) obtiveram resultados semelhantes com a conjugação de mitoxantrona e flavonóides, revertendo, assim, a resistência ao fármaco em células MCF-7.

Esta sinergia pode ter sido causada pela expressão da PTEN em conjunto com liberação da MTX das NLS para as células de MCF-7. Esta liberação de MTX não ocorreu nas células PC3, o que pode demonstrar a importância do mecanismo de internalização e o subsequente processamento intracelular de nanopartículas, demonstrando que esse fenômeno é célula-dependente, já que demonstramos não haver um efeito de expulsão repentina (burst effect) do fármaco em até 72 horas. Possivelmente, a internalização das partículas e consequente processamento intracelular sejam distintos nos tipos de células cancerígenas estudadas. É possível que nas células MCF-7, a MTX seja liberada das NLS, pois, os experimentos in vitro demonstraram que após 24 horas houve uma liberação de apenas 5,8 % da MTX encapsulada nas NLS. Enquanto que, nas células PC3 é possível que as nanopartículas sejam degradadas, ou ainda, não há liberação da MTX.

As CLN não apresentaram efeitos citotóxicos nas concentrações testadas, nem pelo MTX, nem pelo gene da PTEN, sobre as células MCF-7. Isso demonstra que a linhagem celular é resistente a esta concentração de fármaco ou que a MTX não foi liberada das CLN, não ocasionando efeito tóxico. Em relação ao carreamento genético e a possibilidade de efeito sinérgico entre MTX e gene da PTEN, não houve efeito citotóxico nessas células. Estes dados mostram que o carreamento genético se faz necessário, já que as CLN não possuem ligação especifica com o material genético e não foram efetivas, enquanto o carreamento genético obtido nas NLS foi fator determinante para a o sucesso obtido, na diminuição da viabilidade celular nesta esta linhagem resistente à MTX.

Em suma, pudemos ver que a sinergia entre dois ativos (MTX e gene da PTEN) é benéfica neste caso, onde possivelmente o gene para a proteína PTEN fragilize as células resistentes, possibilitando a atuação do fármaco mais eficientemente, matando as células cancerígenas (MCF-7), diferentemente dos resultados observados com células não cancerígenas (Balb/3T3).

Em todas as linhagens analisadas, o DNA codificante para PTEN não induziu níveis significativos de perda de viabilidade celular, reiterando a interpretação de não haver internalização significativa do material genético livre, o que está de acordo com relatos da literatura, em que nem com altas doses de DNA codificante para eGFP e LacZ foi possível diminuir significativamente a viabilidade celular em células de HEK293 (Liu et al., 2007). Análise Estatística Os resultados apresentados foram analisados pelo software Graphpad Prism (GraphPad Softwares, EUA) com significância de 95% de confiança (p<0,05) O teste de otimização do numero de passagens e temperatura do sistema foram reportados com média de 3 experimentos (n=3), com respectivos desvio-padrões e comparadas através da análise de variância (ANOVA) com os dados de 30 passagens pela membrana, para otimização do número de passagens, enquanto que os dados de temperatura foram comparados com a temperatura inicial (Tf+5°C).

Para estabilidade das nanopartículas, os dados são reportados com média de 3 experimentos (n=3), com respectivos desvio-padrões e comparadas através da análise de variância (ANOVA) com respectivos os dados iniciais (0 dias) para cada partícula.

Os testes de Liofilização e encapsulação de mitoxantrona são reportados com média de 3 experimentos (n=3), com respectivos desvio-padrões e comparadas através da análise de variância (ANOVA) com dados para partículas não liofilizadas e partículas vazias, respectivamente.

Os testes de liberação in vitro, EMSA e Proteção contra DNase I são mostrados como média de 2 experimentos independente (n=2).

Os resultados dos testes de citotoxicidade foram reportados como médias de 3 experimentos diferentes (n=3) com respectivos desvios-padrão e foram analisados através da análise de variância (ANOVA) com pós análise através do Teste de Tukey.

Podemos concluir que método reivindicado na presente pode produzir nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN), demonstrando toda sua versatilidade e otimizamos para o preparo dessas nanopartículas lipídicas com 15 passagens pela membrana e temperatura do sistema como a temperatura de fusão do lipídio sólido acrescido de 5°C (Tf+5SC). O método é vantajoso para o estado da técnica, pois trouxe homogeneização à alta pressão e microemulsão à quente, principalmente para formulações preparadas em pequenos volumes, escala laboratorial ou que contêm compostos caros ou difíceis de obter, como fármacos, lipídios catiônicos, moléculas usadas para endereçamento (targeting) da formulação, marcadores de fluorescência, entre outros. Além disso, a extrusão em pequenos volumes é uma técnica rápida, barata, reprodutiva e que não utiliza solventes orgânicos.

As CLN e NLS se apresentaram estáveis ao longo de 180 dias sob refrigeração (4°C). As micrografias demonstraram ultraestrutura monolítica nas nanopartículas lipídicas (CLN e NLS), enquanto que a calorimetria mostra transições endotérmicas residuais de seus lipídios sólidos, o que pode diferenciar tais partículas de outros carreadores lipídicos como os lipossomas de composição semelhante, que apresentaram grande fração aquosa na microscopia eletrônica de transmissão e nenhuma transição.

Para o carreamento de fármacos, ambas nanopartículas (CLN e NLS) foram capazes de incorporar eficientemente (81 e 64 %, respectivamente) o quimioterápico mitoxantrona. A cinética de liberação do fármaco foi diferente também, sendo que com o fármaco livre permeação de toda mitoxantrona ocorreu em 8 horas enquanto que apenas 12 % da MTX foram permeadas após 72 horas de ensaio, nas formulações de CLN e NLS.

Para o carreamento de genes, apenas as partículas catiônicas (NLS) foram capazes de interagir com material genético (DNAp) de forma eficiente e o proteger contra a enzima degradadora de DNA (DNase I), enquanto que partículas neutras (CLN) não apresentaram tal capacidade.

As NLS contendo o gene codificante para PTEN induziram citotoxicidade em câncer de próstata (PC3) e de mama (MCF-7). O carreamento concomitante do fármaco mitoxantrona e do gene codificante para PTEN nas NLS induziu uma diminuição da viabilidade celular em linhagem de câncer de mama (MCF-7 resistente), demonstrando um efeito sinergético na ação desses agentes anticancerígenos in vitro. Assim, a terapia combinada, com genes e fármacos carreados em sistemas de liberação sustentada, pode ser uma interessante alternativa para o tratamento mais eficiente contra o câncer. Bibliografia ABRAMOFF, M.D., MAGALHAES, P.J., RAM, S.J. "Image Processing with ImageJ". Biophotonics International, volume 11, issue 7, pp. 36-42, 2004. ALEXIS, F.; PRIDGEN, E.; MOLNAR, L.K.; FAROKHZAD, O.C., Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Mol. Pharm., v. 5, n. 4, p. 505-515, 2008. ALLISON, S. D.; MOLINA, M. D. C.; ANCHORDOQUY, T. 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Claims (19)

1. Método para obtenção de nanopartículas lipídicas e carreadores lipídicos nanoestruturados caracterizado por ser realizado por extrusão de microemulsão a quente e compreender as seguintes etapas: a) Aquecer o lipídio ou mistura de lipídios 5°C acima da temperatura de fusão do lipídio sólido presente; b) Manter o aquecimento e adicionar água (com ou sem surfactante) à fase lipídica obtida em (a) de forma que fique totalmente suspensa (formação de microemulsão); c) agitação vigorosa para garantir a homogeneidade da suspensão; d) Extrudar a microemulsão obtida em (c), com manutenção da temperatura, e e) Resfriar a microemulsão em banho a 0°C.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa (a) poder ser adicionado pelo menos um fármaco ou ativo de interesse.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa (d) ser realizada em membranas de policarbonato, poliésteres e/ou inorgânicas com poros variáveis entre 0,1 e 1000 nm, preferencialmente entre 100 e 400 nm, por 10 a 30 passagens, preferencialmente 15.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das etapas (c) e (d) serem opcionais.

5. Nanopartículas lipídicas caracterizadas por serem obtidas de acordo com as etapas descritas nas reivindicações de 1 a 4.

6. Nanopartículas lipídicas sólidas obtidas de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizadas por compreenderem os seguintes componentes: - Lipídio sólido a temperatura ambiente e corpórea; - Lipídio catiônico, e - Surfatante.

7. Nanopartículas lipídicas, de acordo com a reivindicação 6 caracterizadas pelo lipídio sólido poder ser selecionado do grupo: triglicérides (grupo Myritol), (tri-stearin), glicerilas (trilaurato de glicerila, trimiristato de glicerila, monoestearato de glicerila, tripalmitato de glicerila, triestearato de glicerila, behenato de glicerila, grupos Dynasan, Witepsol, Compritol, Cetiol e Precirol), ácidos graxos (ácido esteárico, ácido palmítico, ácido behênico), esteróides (colesterol) e ceras (cetilpalmitato (séries Cutina CP e Precifac), cera de abelha (série Apifil) e cera de carnaúba), entre outros, preferencialmente ácido esteárico.

8. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 6 caracterizadas pelo lipídio catiônico poder ser selecionado do grupo: 1,2-dioleoil 3-trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de cetilpiridínio, cetrimide, cloreto de benzalcônio, Esterquat 1, dimetilaminoetano-carbamoil-colesterol (DC-Chol), estearilamina, brometo de dodeciltrimetil amonio, N-[1(2,3-dimiristiloxi)propilacetil (DOTAB), brometo de dodeciltrimetil amônio (DTAB), cloreto de N-[1,2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), brometo e cloreto de dioctadecildimetil amônio (DODAB e DODAC), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi propilamino (DODMA), brometo de cetil-trimetilamônio (CTAB) e 6-lauroxihexil ornitinato (LHON), entre outros, preferencialmente 1,2-dioleoil 3-trimetilamônio propano (DOTAP).

9. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 6 caracterizadas pelo surfatante poder ser selecionado do grupo do poloxamer (série Pluronic), sorbitano (série Span), polisorbato (série Tween) e polioxietilenoglicol alquil éter (Série Brij), entre outros, preferencialmente Pluronic F68.

10. Nanopartículas lipídicas sólidas obtidas de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizadas por compreenderem os seguintes componentes: - 5 a 9 mmol.L'1 de lipídio sólido a temperatura ambiente e corpórea, preferencialmente 7 mmol.L'1 de ácido esteárico; - 2 a 3 mmol.L'1 de lipídio catiônico, preferencialmente 2,5 mmol.L' 1 de DOTAP, e - 0,5 e 1,5 mmol.L'1 de surfatante, preferencialmente 1,0 mmol.L'1 de pluronic F68.

11. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas por possuírem diâmetro médio de 135,9 ±10,3nm, potencial Zeta 40,65 ±5,49mV e índice de polidispersão 0,164 ±0,007.

12. Carreadores lipídicos nanoestruturados caracterizados por serem obtidos de acordo com as etapas descritas nas reivindicações de 1 a 4

13. Carreadores lipídicos nanoestruturados, obtidos de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizados por compreenderem os seguintes componentes: - Lipídio sólido a temperatura ambiente e corpórea; - Lipídio líquido a temperatura ambiente e corpórea; - Surfatante.

14. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 13 caracterizados pelo lipídio líquido pode ser selecionado do grupo dos fosfolipídios como as fosfatidilcolinas (dentre as quais se destacam a fosfatidilcolina de ovo e de soja (EggPC e SoyPC), 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DDPC), 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) e as fosfatidiletanolaminas (como 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLPE), 1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), e 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE); ácidos graxos (como ácido oleico, linoleico, ricinoleico e grupos derivados de ácido cáprico/caprílico (séries Miglyol e Softsan) e ácido capróico), óleos (como o de oliva, coco, soja, rícino e amêndoa), entre outros, preferencialmente fosfatidilcolina de ovo (EPC).

15. Carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizados por compreenderem os seguintes componentes: - 3 a 7 mmol.L'1 de lipídio sólido a temperatura ambiente e corpórea, preferencialmente 5 mmol.L'1 de monoestearato de glicerila; - 3 a 10 mmol.L'1 de lipídio líquido a temperatura ambiente e corpórea, preferencialmente 5 mmol.L'1 de EPC, e - 0,5 e 1,5 mmol.L'1 de surfatante, preferencialmente 1,0 mmol.L·1 de pluronic F68.

16. Carreadores, de acordo com a reivindicação 15, caracterizados por possuírem diâmetro médio de 115,7 ±8,1nm, potencial Zeta 1,30 ±1,42mV e índice de polidispersão 0,131 ±0,010.

17. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 4, caracterizado por ter aplicação na fabricação de formulações de partículas que se constituam de emulsões de óleo em água que contenham pelo menos um lipídio sólido, podendo conter ou não óleos, com ou sem surfatante ou co-surfatantes, para produção de nanopartículas lipídicas que tenham componentes instáveis ou lábeis em alta pressão ou não recomendáveis para uso em homogeneizador em alta pressão e/ou Ultra-Turrax.

18. Uso das nanopartículas lipídicas sólidas descritas nas reivindicações de 5 a 11, caracterizadas por serem utilizadas como carreadores de material genético, desde siRNA até DNA, assim como de fármacos e proteínas.

19. Uso dos carreadores lipídicos nanoestruturados descritos nas reivindicações de 12 a 16 caracterizadas por serem utilizadas como carreadores de material genético, desde siRNA até DNA, assim como de fármacos e proteínas.