BR102012015339A2 - Polímero de impressão molecular restrito à ligação com macromoléculas por meio de recobrimento com albumina ram-mip-bsa. - Google Patents

Abstract

POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA-RAM-MIP-BSA. A presente invenção refere-se a um polímero de impressão molecular restrito à ligação com macromoléculas por meio de recobrimento com albumina - RAM-MIP-BSA. Esta metodologia de síntese permite a obtenção de um material seletivo, pr-e-concentrador e com capacidade de eliminar macromoléculas durante procedimentos de extração em fluidos protéicos. Sua obtenção é simples e barata e seu desempenho, em termos a sorventes comerciais. Possui uma longa vida útil e uma atrativa possibilidade de comercialização.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO DA PATENTE DE INVENÇÃO “POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polímeros de impressão molecular restrito à ligação de macromoléculas por meio de revestimento externo com albumina sérica bovina - RAM-MIP-BSA. Os polímeros de impressão molecular restritos à ligação com macromoléculas - RAM-MIP são materiais sintéticos empregados para a extração seletiva e direta de analitos em amostras dotadas de alta concentração de proteínas. Esses materiais são obtidos normalmente com a síntese de um polímero de impressão molecular - MIP e posteriormente com o seu recobrimento com um monômero funcional de baixo peso molecular e de característica hidrofílica como, por exemplo, monometacrilato de glicidila, metacrilato de 2-hidroxi-etila, maleato de mono-2-(metacriloiloxi)etiia. Dessa forma, quando o monômero hidrofílico é ligado na superfície do polímero, há a formação de uma camada hidrofílica externa que tem objetivo impedir a ligação de macromoléculas. Até o momento, essa é a única maneira de obter-se um polímero previamente impresso restrito à ligação de macromoléculas. Contudo, algumas limitações têm sido observadas nesses materiais como, por exemplo, a baixa seletividade, a inexistência de qualquer relato sobre vida útil, a incapacidade de eliminar completamente as proteínas, dentre outras. Nesse sentido, o objetivo principal da presente invenção é descrever um novo polímero de impressão molecular restrito à ligação de macromoléculas por meio de revestimento externo com albumina sérica bovina - RAM-MIP-BSA. Inicialmente o MIP é sintetizado empregando-se uma dada molécula modelo e obtendo-se assim um material rígido e dotado de sítios específicos de reconhecimento complementares a essa molécula. Em seguida, albumina sérica bovina - BSA é ligada quimicamente na superfície externa desse polímero. Essa BSA se porta como uma barreira química, impedindo a utilizado em procedimentos de extração da molécula modelo em fluidos protéicos. Assim, obtém-se um material seletivo à molécula modelo devido à síntese por impressão molecular, e ao mesmo tempo incapaz de se ligar a macromoléculas da matriz protéica devido à barreira obtida pela (mobilização da BSA em sua superfície. O exemplo descrito na presente invenção consiste em um RAM-MIP-BSA seletivo à clorpromazina mais eficiente na eliminação de macromoléculas do que todos os outros RAM-MIP descritos na literatura [Parisi ?. I., Ciriílo G., Curcio M., Puoci F., lemma F., Spizzirri U. G. and Picei N., Eur. Pol. J., 45 (2009) 1634, Sanbe H., Haginaka J , Analyst, 128 (2003) 593], O polímero RAM-MIP-BSA pode ser amplamente utilizado em indústrias e laboratórios que trabalham com análises em fluidos biológicos, podendo ser acondicionados em qualquer sistema que utilize uma fase sólida para extração direta sem pré-tratamento.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Polímeros de Impressão Molecular - MIP

Os MIP são materiais rígidos e que apresentam sítios específicos moldados tridimensionalmente ao redor de uma molécula modelo. Após as etapas de síntese e lavagem, esses materiais estão aptos a religarem-se à molécula modelo presente em uma dada amostra, em detrimento dos concomitantes presentes nela [Chen L, Xu S. and Li J., Chem. Soe Rev., 40 (2011) 2922]. No entanto, quando a molécula modelo encontra-se em um meio com alta concentração de macromoléculas (e.g. sangue total, plasma, soro, etc), por mais seletivo que seja o material, é inevitável que ocorram ligações indesejadas de proteínas em sua superfície externa, causando perda de seletividade, diminuição de sua vida útil e risco de degradação de colunas analíticas quando a análise é conduzida por técnicas cromatográficas.

Materiais de Acesso Restrito - RAM Já os materiais de acesso restrito - RAM são serventes a base de silica e dotados de poros onde as diversas moléculas de baixo peso molecular são capazes de se ligar. Além disso, esses materiais têm sua superfície externa modificada com ligantes hidrofílicos a ponto de inviabilizar quimicamente a ligação de macromoléculas indesejadas presentes na matriz [Sadílek P., Satínsky D., Solich P,, Anal. Chem., 26 (2007) 375-384], Então, pode-se concluir que os RAM são materiais pouco seletivos às moléculas pequenas, sido empregados na extração direta de analitos orgânicos em fluidos protéicos como sangue, plasma, soro, etc.

Polímeros de impressão Molecular com Material de Acesso Restrito -RAM-MIP

Como demonstrado, o MIP é um material seletivo à molécula modelo, porém, apresenta uma capacidade indesejada de reter macromoléculas, inviabilizando sua aplicação direta na extração de analitos em fluidos protéicos. Já o RAM não retém as macromoléculas, porém é pobre em seletividade permitindo a ligação de diversas moléculas de baixo peso molecular. Com intuito de aliar as características vantajosas de ambos os materiais, alguns trabalhos têm investigado a possibilidade de elaborar um MIP seletivo a uma dada molécula e ao mesmo tempo incapaz de se ligar a macromoléculas por meio de revestimentos em sua superfície externa. Esse material tem sido rotineiramente denominado de polímeros de impressão molecular restritos à ligação com macromoléculas - RAM-MIP. O RAM-MIP apresenta sítios específicos de reconhecimento molecular, bem como grupos hidrofílicos externos que bloqueiam a ligação com proteínas. Embora sejam evidentes as vantagens dos RAM-MIP no preparo de amostras, esta tecnologia ainda é pouco empregada. Os exemplos de polímeros encontrados na literatura podem ser divididos basicamente em dois tipos: i) aqueles que utilizam diretamente monômeros hidrofílicos [Sanbe H., Haginaka J., Analyst, 128 (2003) 593.] e ii) aqueles que utilizam monômeros que se tornam hidrofílicos após um tratamento químico posterior à síntese [Parisí O. !., Ciriilo G., Curcio M., Puoci F., lemma F., Spizzirri U. G. and Picei N., Eur. Pol. J., 45 (2009) 1634].

Cabe ressaltar que os RAM-MIP propostos na literatura não são totalmente eficazes na eliminação de macromoléculas. Além disso, pôde-se constatar que esses materiais perdem gradativa de seletividade e sensibilidade quando submetidos a extrações consecutivas, o que notadamente reduz sua vida útil.

No âmbito patentãrio, vale ressaltar que não existem tecnologias protegidas iguais à tecnologia proposta na presente invenção, sendo que, somente duas patentes apresentam pequena similaridade: O documento de patente US-2011/0275540 de Ohlson; Sten retrata um Polímero de Impressão Molecular - MIP para oligo e poli-nucleotídeos com capacidade de extrair seletivamente os mesmos. Este MIP foi sintetizado utilizando como molécula molde uma cadeia de oligo ou poli-nucleotídeo formando uma cavidade que será responsável pela religação de novas cadeias. Já o documento de patente CN102059104-A de Zhang Bandeira; Pan Guo-Qing; Zhang Ying emprega HEMA (metacrilato de hídroxietila) como reagente capaz de garantir hidrofilicidade ao polímero. Contudo, ambos os materiais se diferem do RAM-MIP-BSA por não apresentarem capacidade de exclusão de macromoléculas por ancoramento de albumina na superfície do polímero.

OBJETO DA INVENÇÃO O objetivo da presente invenção consiste no desenvolvimento de um Polímero de Impressão Molecular Restrito a Macromoléculas recoberto de Albumina Bovina Séríca - RAM-MIP-BSA que são materiais com a capacidade de eliminar 100% das macromoléculas presentes em fluidos protéicos submetidos à extração. O princípio de eliminação das macromoléculas pode ser classificado como de natureza físico-química, uma vez que a imobílização da BSA na superfície do polímero (durante o preparo) bloqueia e impede a ligação de outras proteínas presentes na amostra no momento da extração, enquadrando-se assim num mecanismo de barreira química. Aiém disso, devido às suas altas massas moleculares, as proteínas da matriz são incapazes de ligarem ao sítio seletivo do polímero caracterizando assim uma barreira física. Cabe ressaltar que os RAM-MIP presentes na literatura [Parisi O. 1,, Cirillo G., Curcio M., Puocí F., lemma F., Spizzirri U. G. and Picei N., Eur. Pol. J., 45 (2009) 1634, Sanbe H., Haginaka J., Analyst, 128 (2003) 593] promovem o bloqueio unicamente por meio de uma barreira química pouco volumosa, onde há apenas um bloqueio dos grupamentos do polímero aptos a se iígarem com proteínas presentes na amostra. O RAM-MIP-BSA apresenta longo tempo de vida útil, comprovado pela manutenção do seu desempenho mesmo após 100 extrações consecutivas. Em termos de custo, para a produção de 1 g de RAM-MIP-BSA são gastos ca. R$ 25,00. Vale ressaltar que um cartucho de RAM comercial (Cartridge se 25-4 LiChrospher® RP-18 ADS 25pm) contendo 2 g de material custa R$ 2.000,00. Essa diferença de preço é certamente um grande atrativo comercial para empresas especializadas.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A Figura I mostra o esquema de síntese do Polímero de Impressão Molecular Restrito à Ligação com Macromoléculas por meio de Recobrimento com Albumina - RAM-MIP-BSA, onde: (1) refere-se ao monômero funcional responsável pela ligação entre o polímero e a molécula modelo; (2) refere-se à molécula modelo responsável peto formato seletivo da cavidade do polímero; (3) refere-se à compiexação; (4) refere-se ao agente de ligação cruzada responsável pelo entrecruza -mento dos monôneros funcionais; (5) refere-se à polimerização; (6) refere-se ao monômero hidrofífico;

(7) refere-se ao polímero de impressão molecular - MíP (8) refere-se à polimerização; (9) refere-se à limpeza/eluição; (10) refere-se ao polímero de impressão molecular - material de acesso restrito - RAM-MIP; (11) refere-se à albumina - BS A; (12) refere-se ao recobrimento com albumina - BSA; (13) refere-se ao polímero de impressão molecular restrito à ligação com macromoléculas por meio de recobrimento com albumina - RAM-MIP-BSA; (14) refere-se à BSA ancorada ao polímero; (15) refere-se a sítio de ligação seletivo à molécula modelo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A metodologia de recobrimento com BSA [Menezes M. L, Félix G., J. Liq. Chromatogr R. T., 21 (1998) 2863, de Lima V. V., Cassiano N. M., Cass Q. B.; Química Nova, 29 (2006) 72], utilizada na presente invenção pode ser aplicada a diferentes tipos de M1P sintetizados para diferentes moléculas modelo (2), por diferentes metodologias de síntese e usando diferentes reagentes de síntese.

Exemplos de reagentes capazes de serem empregados na síntese do Polímero de Impressão Molecular Restrito à Ligação com Macromoléculas por meio de Recobrimento com Albumina - RAM-MIP-BSA, objeto da presente invenção.

Empregam-se como reagentes na síntese do RAM-MIP-BSA, os monômeros funcionais (1): acrílicos e metacrílicos, álcoois, alílílicos, vinílicos, amínicos, anidridícos, bisfenóis, sulfonildifenóis, ácidos carboxílicos, epóxidos, isocianatos, silanóis e siloxanos, estirênicos, ésteres de vinila, éteres de vinila, halogenetos de vinila, ureias e uretanos;

Empregam-se como reagentes na síntese do RAM-MIP-BSA os agentes de ligação cruzada (4): p-divinilbenzeno, 1,3-diisopropenil benzeno, etileno glicol dimetacrilato e outros dimetacrilatos e di-acrilatos, ?,?-bisacriloil-L-fenilalaninol,1,4 fertílenodiacrilamida e ??,??’- feniiendiacrilamida;

Empregam-se como reagentes na síntese do RAM-MIP-BSA, os iniciadores radicalares: 2,2:-azo-bis-iso-butironitrila, azo-bis-dimetilvaleronitri!a, dimetilacetal de benzíla, peróxido de benzoíla, ácido 4,4-azo-bis (4-ciano pentaenóíco) e peróxido de hidrogênio;

Empregam-se como reagentes na síntese do RAM-MIP-BSA, os solventes: clorofórmio, acetonitrila, hexano, tolueno, metanol, etanol, diclorometano, acetona e líquidos tônicos. A síntese é executada solubiiizando-se, no solvente, os reagentes de síntese. Diferentes ordens de adição e proporções dos reagentes podem ser empregadas. A reação pode ser iniciada em temperaturas elevadas (de 40 a 100°C) ou sob radiação ultra-violeta. O oxigênio deve ser eliminado borbulhando-se qualquer outro gás inerte na mistura reacional, por sonícação, ou mesmo por qualquer outro processo de desgaseificação.

Após a síntese é importante promover o revestimento do polímero com reagentes de caráter hidrofílico dotados de grupamentos hidroxilas. O aumento da densidade de hidroxilas na superfície do polímero é importante porque estas podem ancorar a BSA na superfície do polímero [Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand M. J. and Waldron K. C., BioTechnrques 37 (2004) 790; Farris S., Song J., and Huang Q., J. Agric. Food Chem. 58 (2010) 998].

Para tal procedimento, adiciona-se um ou mais monômeros funcionais dotados de grupamentos hidroxilas terminais como, por exemplo, glicidil mono metacrilato, hidroxi etii metacrilato, glicidil metacrilato, maleato de mono-2-(metacriloiioxi)etil, glicidil dimetacrilato. A síntese é então processada e entre 15 e 150 minutos os monômeros adicionados para que se liguem à rede polimérica. O polímero é então lavado (9) com uma solução composta de um solvente orgânico e um ácido forte até que toda a molécula modelo e demais reagentes remanescentes da síntese tenham sido eliminados. O próximo passo é o recobrimento do polímero com BSA (11). Assim, uma determinada massa de polímero é acondicionada em um cartucho de extração em fase sólida (SPE). Uma solução de BSA em tampão fosfato 0,2M pH 6,0 é percolada pelo cartucho, seguido de uma solução aquosa de glutaraldeído. O material é deixado em repouso entre 1 e 7 horas e, em seguida, percolado por uma solução aquosa de borohidreto de sódio 1% e por água. O glutaraldeído é um agente reticuíante bifuncional e por isso deve promover a ligação covalente entre grupamentos amina da BSA e terminações hidroxila da superfície do polímero [Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand M. J. and Waldron K. C., BioTechniques 37 (2004) 790; Farris S., Song J., and Huang Q., J. Agric. Food Chem. 58 (2010) 998], bem como ligações entre dois grupamentos amina das proteínas, resultando assim no ancoramento da BSA na superfície do polímero [Menezes M. L, Félix G., J. Liq. Chromaíogr R. T, 21 (1998) 2863; de Lima V. V., Cassiano N. M., Cass Q. B., Química Nova, 29 (2006) 72], Finalmente, o excesso de atdeídos residuais e bases de Schiff são quimicamente reduzidos percolando-se uma solução de borohidreto de sódio.

Como exemplo descrevemos a síntese de um RAM-MIP-BSA seletivo à clorpromazina e avaliado como sorvente na extração direta de clorpromazina em plasma humano. Ácido metacrílico, etiíenoglicol dimetacriiato, 2,2’-azo-bis-iso-butironitrila e clorofórmio foram usados como monômero funcional, agente de ligação cruzada, iniciador radicalar e solvente de síntese, respectivamente.

As quantidades empregadas foram: a) 0,004 a 1 mmol de clorpromazina; b) 0,01 a 3 mmol de ácido metacrílico; c) 0,1 a 25 mg de 2,2’-azo-bis-iso-butironitrila; d) 0,03 a 7 mmol de (dimetacriiato de etiíenoglicol) etiíenoglicol dimetacriiato; e) 12 a 40 mL de clorofórmio.

Os reagentes foram misturados em um frasco de síntese e a solução foi borbulhada com nitrogênio entre 10 e 60 minutos para a eliminação de oxigênio. O frasco foi então lacrado e acondicionado em banho Maria entre 50 e 80° C, entre 50 e 90 minutos. Em seguida, adicionou-se clorofórmio, metacrilato de 2-hidróxi-etila e dimetacrilato de glicidila nas seguintes quantidades: a) 0,02 e 7,5 mmol de metacrilato de 2-hídroxi-elila; b) 0,1 e 1,5 mmol de dimetacrilato de glicidila; c) 10 a 40 ml_ de clorofórmio. A síntese foi então conduzida por 24 h com agitação constante. Em seguida o polímero obtido foi lavado percolando-se, sequencialmente, as seguintes soluções em uma massa de 500 mg de polímero em cartucho de SPE: a) 50 a 200 mL de metanoLacido acétíco 4:1- v/v; b) 30 a 60 mL de metanol; c) 20 a 250 mL de metanolitampão acetato de sódio 0,2 mol.L'1 pH 4,1 (8:2-v/v);

Nenhum pico de clorpromazina foi observado com a análise cromatografia do eluato da última solução de lavagem, comprovando assim que o polímero estava limpo. As condições cromatográficas foram: coluna C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 pm), detector UV/Vis operando a 280 nm, fase móvel composta por meíanolrtampão acetato de sódio 0,2 mol.L’1 pH 4,1 (8:2-v/v), com vazão de 1,0 mL.min'1.

Em seguida, o polímero foi recoberto com BSA, percolando-se, sequencialmente, entre 10 e 20 mL de solução BSA entre 0,1 e 10% em tampão fosfato 0,05 mol.L’1 - pH 6,0 e 5 mL de uma solução aquosa de glutaraldeído 25% (v/v) em 500 mg do material acondicionado em um cartucho de SPE. Após 5 h, 10 mL de uma solução aquosa de boroidreto de sódio 1% foram percolados pelo polímero. Finalmente ele foi lavado em abundancia com água para a retirada dos reagentes remanescentes do processo de recobrimento.

Uma coluna de 4,6 mm de diâmetro interno por 2 cm de comprimento foi preenchida com o polímero RAM-MIP-BSA e acoplado em sistema cromatográfico na posição da coluna analítica. Vinte e cinco microlitros de um padrão aquoso de BSA 22 mg.mL'1 foram injetados pela coluna e o pico resultante (detectado a 280 nm) foi comparado com o pico obtido com a injeção do mesmo padrão de BSA no sistema sem a coluna RAM-MIP-BSA. Constatou-se então que praticamente não houve retenção de BSA no polímero (recuperação de 99,7%), indicando que o recobrimento impediu, satisfatoriamente, a ligação de proteínas na superfície do polímero. Vale ressaltar que o MIP não recoberto com BSA apresentou uma recuperação de proteínas da ordem de 84%. O RAM-MIP-BSA foi também avaliado quanto à sua seletividade para clorpromazina (molécula modelo) em reiação à catecol e dopamina, que são moléculas de menor massa molecular, e de caráter ácido e básico, respectivamente. O experimento foi conduzido empregando-se um cartucho de SPE contendo 300 mg de RAM-MIP-BSA. Percolou-se iniciaimente 3 ml_ de acetonitrila seguido de 3 mL de água como etapas de condicionamento. Posteriormente, 1 mL de uma solução aquosa contendo 22 mg.mL'1 de BSA, 200 pg.L"1 de clorpromazina, 200 pg.L"1 de catecol e 200 pg.L"1 de dopamina foi percolado pelo cartucho. Finalmente ele foi lavado com 2 mL de água e eíuído com 1 mL de fase móvel (metanol:tampão acetato de sódio 0,2 moi.L'1 e pH 4,1, na proporção de 8:2-v/v). 0 eluato foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV a 280 nm e empregando-se uma solução de metano!:tampão acetato de sódio 0,2 moi.L'1 e pH 4,1, na proporção de 8:2-v/v, como fase móvel. O cromatograma obtido apresentou somente o pico de clorpromazina, comprovando a seletividade do RAM-MIP-BSA. Por fim, o mesmo cartucho foi empregado durante ca. 100 extrações consecutivas, não apresentando diferença significativa em sua eficiência de eliminação de macro moléculas, bem como na extração de clorpromazina. Esse fato torna a ecnologia atraente no sentido de que o custo por análise pode ser jrasticamente reduzido pela possibilidade de reutilização do cartucho diversas /ezes, além da possibilidade de automação da análise em sistemas üromatográficos que permitem a realização de SPE-HPLC online.

Claims (13)

1. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA, caracterizado pelo processo de síntese de polímero, produto e uso.

2. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar monômeros funcionais dos seguintes grupos: acrílicos e metacrílicos, álcoois, alilílicos, vinílicos, amínicos, anidridícos, bisfenóis, sulfonildifenóis, ácidos carboxílicos, epóxidos, isocianatos, silanóis e siloxanos, estirênicos, ésteres de vinila, éteres de vinila, halogenetos de vinüa, uréias, uretanos.

3. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar agentes de ligação cruzada dos seguintes grupos: p-divinilbenzeno, 1,3-diisopropenil benzeno, etileno glicol dimetacnlato e outros dimetacrilatos e di-acrilatos, N.O-bisacriloil-L-fenilalaninol^^fenilenodiacrilami-da, N,N'feneíendiacrimiüamida.

4. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar iniciadores radicalares dos seguintes grupos: 2,2’-azo-b is-i so-butironitrila, azo-bis-dimetilvaleronitrila, dimetilacetal de benzila, peróxido de benzoíla, ácido 4,4’-azo-bis (4-ciano pentaenóico), peróxido de hidrogênio.

5. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar um dos seguintes solventes: clorofórmio, acetonitriía, hexano, totueno, metanol, etanol, diclorometano, acetona, líquidos iônicos.

6. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar uma das seguintes proteínas: albumina, glicoproteínas, proteínas do leite.

7. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar molécula modelo na faixa de concentrações de 0,004 a 1 mmol.L"1.

8. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar monômeros funcionais na faixa de concentrações de 0,01 a 3 mmol.L'1

9. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar agente de ligação cruzada na faixa de 0,03 a 7 mmol.L'1

10. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMIN A - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar iniciador radicalar na faixa de concentrações de 0,1 a 25 mg.mmol.L'1,

11. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIMENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar monômeros hidrofílicos na faixa de concentrações de 0,002 a 7,5 mmol.L'1;

12. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIM ENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar BSA na faixa de concentrações de 0,1 a 10 % (m/v).

13. POLÍMERO DE IMPRESSÃO MOLECULAR RESTRITO À LIGAÇÃO COM MACROMOLÉCULAS POR MEIO DE RECOBRIM ENTO COM ALBUMINA - RAM-MIP-BSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizado em extração de fase sólida e recheio de pre- coluna cromatogrãfica.