BR102012008876A2 - Processos de obtenção de complexo metálico de minerais com proteína peptídeo ou aminoácidos livres - Google Patents

Abstract

PROCESSOS DE OBTENÇÃO DE COMPLEXO METÁLICO DE MINEIRAIS COM PROTEÍNA, PEPTÍDEO OU AMINOÁCIDOS LIVRES. A presente invenção refere-se a processos de preparação com monitoramento da reação de complexação de metal com um ligante na obtenção de complexo ou quelato metal/ligante em meio aquoso. Sendo o ligante, proteína, pepotídeo ou aminoácido livres e os metais, o ferro, manganês, zinco, não excluindo outros metais. Os processos desenvolvidos possibilitam a preparação e monitoramento da ligação do metal ao ligante em um processo único e contínuo.

Description

PROCESSOS DE OBTENÇÃO DE COMPLEXO METÁLICO DE MINEIRAIS COM PROTEÍNA, PEPTÍDEO OU AMINOÁCIDOS LIVRES CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se insere no campo das Químicas Inorgânica e Analítica, mais especificamente aplicadas ao campo da Nutrição, uma vez que a invenção se refere a um processo de obtenção de complexo metálico de minerais com proteína, peptídeo ou aminoácidos livres.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA Esta invenção é aplicada ao campo da saúde humana e

animal (profilático ou tratamento), pois desnutrição é um problema de saúde em diversos países, sendo um expressivo fator de mortalidade. Apesar da predominância em países pobres, ela está presente também em países em 15 desenvolvimento e industrializados, manifestado de diferentes formas e intensidade.

A desnutrição, em humanos afeta a sobrevivência, o desenvolvimento, aprendizado, crescimento e produtividade no trabalho, com impacto negativo no desenvolvimento 20 social, econômico e na sobrevivência de mulheres e crianças especialmente durante a gravidez e nos primeiros dois anos de vida, respectivamente. Um terço dos óbitos de crianças, em todo o mundo foi devido à desnutrição. Em animais, a desnutrição afeta principalmente a sobrevida e 25 desenvolvimento, com reflexo negativo na atividade econômica.

A deficiência de minerais/metais tem forte contribuição na desnutrição por participar da manutenção e restauração do equilíbrio bioquímico e fisiológico dos seres vivos, participando de forma decisiva no metabolismo de proteínas, carboidratos e lipídios, consolidação óssea, atividade neural e muscular, entre outros.

A importância biológica dos minerais/metais está relacionada às características químicas e estado de 5 oxidação, capacidade de doar e receber elétrons, participando de reações de oxidação e redução, conhecidas como reações de Fenton. Essas reações são essenciais para as funções bioquímicas e processos metabólicos celulares.

Os níveis celulares dos minerais/metais devem ser 10 mantidos constantes, pois o excesso é altamente tóxico. Dentre os principais pode-se citar: Ferro, Manganês, Selênio, Cobalto, Cobre, Cromo e Zinco, sendo a deficiência de ferro a predominante em todo o mundo, porém não excluindo a deficiência de outros minerais/metais.

Os minerais/metais quando administrados na forma

inorgânica, apresentam vários inconvenientes, entre outros a reduzida biodisponibilidade. Altas doses não contribuem com o aumento da biodisponibilidade devido ao controle biológico da absorção. No entanto, nestas situações este 20 controle pode ser burlado, aumentando a probabilidade de ocorrência de efeitos adversos. Devido a este inconveniente tem se enfatizado o uso de metais complexados/quelados, especialmente com proteínas, peptídeos ou aminoácidos, baseados no fato de que aqueles naturalmente complexados 25 com proteínas (ferritina) e hemoglobina apresentam maior biodisponibilidade e menores efeitos colaterais, quando comparado aos inorgânicos.

Os benefícios do uso profilático ou terapêutico dos metais na forma complexada/quelada são amplamente documentados na literatura pertinente. Tais complexos normalmente possuem características específicas que os diferenciam dos minerais/metais inorgânicos, ou seja, o metal permanece ligado nas condições do trato gastrintestinal evitando sua complexação com componentes da 5 dieta que o torna indisponível.

Além disso, os metais complexados/quelados previnem a deficiência mesmo em situações de hipocloridria fisiológica ou induzida por medicamentos e são mais susceptíveis ao controle fisiológico, evitando assim a sobrecarga.

A ligação do metal ao ligante é função da

característica elétron doadora dos grupos funcionais presentes no ligante e da simetria de coordenação do metal, sendo que a força de ligação depende das características do ligante e do metal.

A formação do complexo/quelato é baseada no princípio

de ácido e base de Lewis. A base (ligante) age como doador de par de elétrons, enquanto que o ácido (metal) age como o aceptor de par de elétrons por apresentar um orbital vago no qual o par de elétrons pode ser acomodado, podendo 20 interagir com vários ligantes simultaneamente, visto que são polivalentes.

No entanto, a estabilidade de ligação é função da afinidade, base dura tem maior afinidade por ácido duro (bases e ácidos menores e pouco polarizáveis) e base mole 25 com ácido mole (maiores e mais polarizáveis). Quanto maior a similaridade do caráter do ácido e da base, mais estável será a ligação entre eles. Um exemplo da mudança da reatividade do ligante quando o metal muda o estado de oxidação pode ser verificado no estudo de derivados de 30 cianopiridínios coordenados ao Ru(II). Proteinas, hidrolisados e aminoácidos livres, são consideradas bases duras, quando os ligantes são grupo carboxilato, nitrogênio alifático da glutamina e aminoácidos fosforilados. Os considerados moles são os 5 resíduos sulfurados de enxofre (cisteína). Bases intermediárias, aquelas que contêm nitrogênio aromático (triptofano). Para os metais, podem ser citados entre outros: Mn2+, Fe3+, Al3+ são ácidos duros, Cu+, Ag+ e Au+, moles e Zn2+, Cu2+e Fe2+ intermediários.

Além da influência direta dos grupos ligantes e do

metal, os grupos vizinhos podem ser determinantes tanto na afinidade quanto na força de ligação, tornando imperativo que sistema de monitoramento e determinação do ponto de equivalência sejam partes integrantes do processo de obtenção do complexo/quelato.

Docvimentos do Estado da Técnica

Um dos desafios para a preparação de complexos/quelatos de proteínas, peptídeos ou aminoácidos com metais é a dificuldade em se determinar a estequiometria da reação, pois o excesso de metal e ligante no produto final não é benéfico.

Uma das primeiras citações deste tipo de complexo/quelato refere-se ao succinilcaseinato de ferro, cujo primeiro passo do processo foi a reação de amidação da 25 caseína, pela inserção de radicais succinil aos E amino grupos dos resíduos de lisina (succinil caseína), visando aumentar os sítios de ligação para o ferro. 0 segundo passo foi a reação da caseína succinilada com o ferro, obtendo assim o succinil caseinato de ferro. 0 pH do meio reacional 30 foi reduzido havendo assim a precipitação do complexo/quelato, este foi lavado com solução diluída de ácido mineral visando eliminar o ferro livre (não complexado/quelado). Após este procedimento o

complexo/quelato foi seco e o percentual de ferro 5 quantificado por espectroscopia de absorção atômica, este percentual foi considerado como o de ferro ligado. 0 procedimento e resultados similares foram obtidos por Franzone e seus colaboradores (1990) utilizando gutaril lisozima ferro. Outro artigo relacionado (CHAUD et al., 10 2002) descreve o processo de obtenção de ferro-peptídeo a partir de hidrolisado de caseína (DE FREITAS et al., 1993), cujo processo foi monitorado pela reação colorimétrica do Fe+3 presente na solução com tiocianato de potássio (KSCN).

0 processo desenvolvido por Cremonesi e seus 15 colaboradores (1984) foi patenteado pela Italfarmaco (European Patent Application n° 0.319.64). Esse documento, intitulado "Soluble polypeptide derivatives having iron contente for material therapy, processes for preparation thereof and pharmaceutical compositions therefron", 20 descreve a inserção de radicais acil a caseína, formando n- acil-caseína, como estratégia para aumentar os sítios carboxilatos e posterior reação de complexação/quelação desta com o ferro. Não relata processo de purificação nem o quanto de metal efetivamente foi complexado.

Outras patentes relacionadas (US 4.208.405) "Trace

element composition for iron deficiency anemia", descreve uma composição mineral específica contendo minerais na forma complexada/quelada, e (US 4.746.730) "Bio-available iron-protein derivatives and process for their preparation" se referem a processos de obtenção de complexo/quelatos, mais especificamente ao processo de complexação de proteínas ou peptídeo com o metal ferro e a biodisponibilidade do complexo/quelato,porém não aborda o monitoramento da reação e se os metais estão efetivamente complexados/quelados.

Outras patentes relacionadas foram depositadas pela Albion International, Inc. as quais são mais específicas para métodos de determinação da quantidade de metal complexado/quelado no produto final. Na primeira depositada 10 sob o n° US 7.144.737 "Process for determination the percent of chelation in a dry mixture", foi utilizada a espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Furier (FT-IR ou ICP-MS), para tanto são utilizados vários procedimentos e cálculos.

A segunda depositada sob o n° US 0.248.583

"Quantitative and qualitative chelation measuring methods and materiais" refere-se a processo que apresenta vários passos: reação da amostra com luminóforo, obtenção do espectro eletromagnético do composto formado, correlação entre os espectros do composto formado e dos reagentes.

A terceira intitulada "Method. for quantitatively determining unbound metal in formulation containing chelates" (US 7.946.155), refere-se à quantificação de metal não ligado em amostras líquidas, e é baseada na 25 separação do metal não ligado em coluna cromatográfica utilizando resina de troca catiônica. O metal não ligado é separado e quantificado por métodos convencionais tais como espectroscopia de absorção atômica ICP-EAS, ICP-OES ou ICP- MS. Estas patentes abordam técnicas de controle de 30 qualidade do produto, complexo/quelato pós-preparação. O documento US 4.599.152, "PURE AMINO ACID CHELATES", propõe a preparação de quelatos puros, ou seja, sem a presença de ânions inorgânicos tais como sulfatos e cloretos provenientes dos sais metálicos utilizados para a 5 preparação dos quelatos. Tais ânions, dependendo da utilização do quelato, podem ser prejudiciais, por exemplo: suplementação para plantas e reposição de metais para o solo que apresentam excesso dos ânions de sulfato e cloreto). Devido à dificuldade da eliminação desses ânions 10 após a formação do complexo/quelato, esta patente relata um processo que possibilita a obtenção dos quelatos sem a presença desses ânions. 0 processo consiste na produção de cátions metálicos por meio de uma reação eletrolitica. Essa reação ocorre em uma célula eletrolitica que consiste em 15 dois compartimentos (compartimento do ânodo e do cátodo) separados por uma membrana permeável somente aos cátions (ex: metais). Ou seja, esta patente relata processo de preparação do complexo/quelato isento de ânions utilizando técnicas eletroliticas, e ao final da reação é determinado 20 quando cessa a eliminação de hidrogênio. Já na presente invenção, a reação de complexação/quelação ocorre em reatores convencionais, porém com monitoramento continuo da quantidade de metal livre no meio racional, através da intensidade da corrente e/ou do potencial de pico do metal 25 em questão. Possibilitando obter complexos/quelatos em quantidades estequiométrica, ou seja, sem excesso de reagentes.

Vantagens da Invenção em relação ao estado da técnica

Nos processos aqui descritos, a complexação/quelação entre o metal e o ligante é monitorada possibilitando a obtenção de produto cujas quantidades sejam estequiométricas (sem excesso de reagentes).

Nos documentos previamente mencionados no estado da técnica, é realizada a reação de complexação e, a 5 quantidade de metal ligado é determinada após a obtenção do complexo/quelato, portanto o produto final pode ou não conter excesso de um dos reagentes. É conveniente lembrar que o excesso tanto do ligante quanto do metal reduz a eficácia biológica do complexo/quelato.

Na maioria das situações é determinado o teor do metal

no produto final (complexo/quelato), pelos métodos convencionais, não discriminando se este está ligado ou livre. Caso estivesse livre conduziria aos inconvenientes já citados. Nos processos ora pleiteados isto é evitado 15 pois a reação é monitorada por processo eletroquímico, possibilitando sua interrupção quando a estequiometria metal/ligante é atingida. Este processo difere da síntese eletroquímica relatada em alguns artigos científicos, onde a reação metal/ligante ocorre na superfície do eletrodo 20 formando um filme, nesses casos, o complexo/quelato é recuperado pela remoção do filme por raspagem do eletrodo, diferente do que ocorre na presente invenção.

Nos processos ora pleiteados isto é evitado, pois, a reação é interrompida quando esta atinge a estequiometria 25 metal/ligante. Métodos eletroquímicos são utilizados como ferramenta em estudos básicos de caracterização da capacidade redox de compostos de coordenação com estrutura química simples. Não foram encontrados antecedentes do uso de monitoramento eletroquímico na obtenção de 30 complexo/quelato de proteína ou seus derivados (hidrolisados enzimático parcial de proteína, onde grande número de entidade química é obtido, cada um com sua característica redox) com metais.

Dessa forma, os processos aqui descritos representam 5 avanço tecnológico, pois possibilitam a obtenção de complexo/quelato de metal com proteína, hidrolisado parcial de proteína e aminoácidos livres em quantidade estequiométricas, evitando assim a presença de reagentes na forma não complexada/quelada, podendo ser aplicados na área 10 alimentícia ou medicinal.

Os processos não utilizam pós-reação, técnicas complementares de separação ou outras, para separar o metal livre do complexo/quelato ou para determinar o teor de metal ligado. Ainda, por utilizar basicamente um reator e 15 os detectores eletroquímicos (eletrodos e potenciômetro) e os processos ocorrerem continuamente, os processos são simples, de fácil execução e possibilitam a redução de custo operacional.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a processos de

preparação com monitoramento da reação de complexação de metal com um ligante na obtenção de complexo ou quelato metal/ligante em meio aquoso e solucionam o problema da determinação da estequiometria ideal. Sendo o ligante, 25 proteína, peptídeo ou aminoácidos livres e os metais, o ferro, manganês, zinco, entre outros.

Nos processos de obtenção do produto, complexo/quelato, o ponto crítico é a determinação da estequiometria ligante/metal, ou seja, obter produto sem excesso de metal ou ligante livre. Para tanto foi utilizado um potenciostato acoplado a uma célula eletroquimica que está em contato direto com o meio reacional, para o monitoramento amperométrico ou potenciométrico.

De acordo com as características do processo redox do 5 metal/ligante e do complexo/quelato formado é escolhido o tipo de célula eletroquimica. Quando o potencial redox do complexo/quelato é muito próximo do potencial redox do metal livre ou do ligante, do aminoácido, da mistura de peptídeos ou proteína), o monitoramento amperométrico 10 (célula amperométrica) fica inviabilizado (por conta do baixo poder de discriminação). Neste caso, o mais apropriado é o método potenciométrico (célula potenciométrica), pois não há aplicação de potencial no eletrodo.

No caso de medição potenciométrica, a célula

eletroquimica é constituída por dois eletrodos, sendo um indicador e um de referência, selecionando-os de acordo com as características do processo redox do metal.

No caso de medição amperométrica, a célula eletroquimica é constituída por três eletrodos sendo um de trabalho, um auxiliar e um de referência selecionando-os de acordo com as características do processo redox do metal. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é uma representação gráfica de um voltamograma obtido para a determinação do ponto de equivalência do ferro com hidrolisado de proteína de soja.

A figura 2 é uma representação gráfica de um voltamograma obtido para a determinação do ponto de equivalência do zinco com hidrolisado de proteína de soja. A figura 3 é uma representação gráfica de uma titulação potenciométrica para determinação do ponto de equivalência do cobre em relação ao hidrolisado de proteína de soja.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os processos da presente invenção consistem na

obtenção de complexos/quelatos metálicos de minerais com proteína, peptídeo, ou aminoácidos livres a partir da reação entre um metal e um ligante.

0 metal oriundo de um sal mineral, poder ser: ferro, 10 zinco, manganês, cobre, cobalto, molibdênio, não excluindo outras possibilidades, sendo estes na forma de sal mineral de cloretos, sulfatos, carbonatos, fosfatos e, preferencialmente na forma de cloretos, não excluindo outros além dos citados.

0 ligante pode ser proteína intacta, peptídeos ou

aminoácidos livres.

.Os processos desenvolvidos possibilitam a preparação e monitoramento da ligação do metal ao ligante em um processo único e contínuo.

São duas modalidades de processo, a primeira

modalidade de processo utiliza a medição amperométrica para a realização do monitoramento da finalização da reação. Esta modalidade é mais apropriada quando o potencial redox do complexo/quelato difere significativamente do potencial 25 redox dos reagentes (metal/ligante), por exemplo, no monitoramento da reação entre o metal (ferro) com ligante (peptídeos oriundos de hidrolisados enzimáticos parciais de proteína), pois a diferença de potencial redox entre reagente e produto é grande, possibilitando a discriminação 30 entre o potencial das espécies envolvidas. A segunda modalidade de processo utiliza o método potenciométrico, utilizado preferencialmente em casos onde o monitoramento da reação não pode ser realizado pela corrente, devido às reações redox serem praticamente 5 concomitantes, por exemplo, no monitoramento da reação entre o metal (cobre) com ligante (peptídeos oriundos de hidrolisados enzimáticos parciais de proteína), pois o potencial redox dos reagentes (metal/ligante) é muito próximo do potencial do produto (complexo/quelato) 10 impossibilitando a discriminação entre o potencial das espécies. Neste caso a discriminação entre reagentes e produto formado é viabilizada pelo método potenciométrico.

A técnica da voltametria cíclica foi utilizada no processo para viabilizar o monitoramento e a determinação 15 do ponto de equivalência ligante/metal (final do processo). A informação sobre o analito (metal eletroativo) é fornecida devido a reações de oxi-redução do mesmo, ocasionadas pela aplicação de potencial variável em função do tempo. Essa varredura fornece dois picos que determinam 20 os parâmetros de potencial e corrente de pico catódico e anódico, quando o processo é reversível.

0 potencial de pico (Ep) varia de acordo com o metal em solução, uma vez que esse valor é característico para cada metal, enquanto que a corrente de pico (Ip) é 25 proporcional à concentração da espécie eletroativa. Assim aplicando o potencial do processo redox do metal (obtido por medidas voltamétricas) em solução pode-se monitorar a presença do mesmo, livre em solução pelo valor da corrente.

Em um perfil característico de voltamograma durante o processo de oxidação ou redução do analito, o potencial de pico (Ep) é característico para cada metal, enquanto que a corrente de pico (Ip) é proporcional à concentração do analito eletroativo. Os parâmetros determinados pela voltametria cíclica são utilizados para o monitoramento em 5 tempo real da corrente no potencial aplicado no processo redox do metal em questão (método potenciostático). Assim, na medição amperométrica, são utilizados eletrodo de trabalho, eletrodo auxiliar e eletrodo de referência com os potenciais específicos de cada metal.

No caso da medição potenciométrica, utilizada quando o

monitoramento da reação não pode ser realizado pela corrente, devido às reações redox concomitantes, são utilizados os eletrodos indicador e de referência (compatível com o metal a ser analisado), onde é monitorada 15 a variação do potencial que ocorre em função da variação da concentração do metal em solução.

Este método é semelhante às medidas de pH, cujo eletrodo indicador faz a leitura do potencial de circuito aberto, ou seja, não há aplicação de potencial. Por exemplo, para uma reação geral:

Ivl11+ + lie' M,,

(Φ

0 potencial E medido no eletrodo indicador (metal M) em relação a um eletrodo de referência é dado pela equação de Nernst:

0,0591 1

E = E° n l°g [Mn+] ~~ Eref

Portanto o potencial varia com a concentração do metal em solução. Quando todo o metal estiver complexado/quelado ocorre uma mudança abrupta de potencial, indicando o final da reação.

Primeira Modalidade de Processo de Obtenção de Complexo Metálicos de Minerais com Proteína, Peptídeo ou Aminoácidos Livres (Monitoramento Amperométrico)

Este processo possibilita a obtenção de complexo/quelato em condições estequiométrica e, em um processo único e continuo, já que o potencial ou a corrente são proporcionais à concentração do reagente ou produto

monitorado.

A primeira modalidade do processo de obtenção de complexo metálico de minerais com proteína, peptídeo ou aminoácidos livres ocorre de acordo com as seguintes etapas:

a) Preparação das dispersões aquosas do ligante e do

metal;

b) Agitação constante do meio reacional;

c) Estabilização da temperatura;

d) Medição da corrente;

e) Adição da dispersão do ligante;

f) Manutenção da agitação e temperatura;

g) Medição da corrente;

h) Retirada do conteúdo do reator; e

i) Secagem.

Etapa a - Preparação das dispersões aquosas do ligante e do metal

Na etapa "a", são preparadas as dispersões aquosas do ligante (proteína intacta, peptídeo ou aminoácidos livres) em concentração que pode variar de 5 a 25% (m/v) , levando

em consideração a viscosidade da dispersão, e do sal do metal em concentração que pode variar de 10 a 30% (m/v) levando em consideração a solubilidade do sal e o volume final da mistura reacional.

De forma resumida, para o ligante a concentração final 5 será definida em função da viscosidade, que deve estar entre 50 e 350cP pois, viscosidade maior prejudica a hidrodinâmica do meio reacional e para o metal a concentração final depende do coeficiente de solubilidade do sal do metal, pois acima deste ocorre precipitação.

A dispersão do ligante deve ser neutra ou levemente

alcalina com pH de 7 a 8,5, ajustado com solução de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico 1M.

A dispersão a ser preparada no próprio reator é a do sal do metal (que pode ser ferro, zinco, manganês, cobre, 15 cobalto, molibdênio, não excluindo outras possibilidades, sendo estes na forma de sal mineral de cloretos, sulfatos, carbonatos, fosfatos, etc.). O volume desta dispersão não deve exceder a 30% do volume nominal do reator para a posterior adição da dispersão do ligante (proteína, 20 peptídeo ou aminoácido) . Reservar de 5 a 10% do volume nominal do reator para, se necessário, ajustar a estequiometria no final da reação.

Etapa Opcional a.l - Adição da dispersão do sal do metal no reator

Quando não preparada no próprio reator, a dispersão do

sal do metal é colocada no mesmo, reservando de 5 a 10% do volume nominal do reator para, se necessário, ajustar a estequiometria ao final da reação.

Etapa b - Agitação constante do Meio Reacional

30

0 meio de reação é uma solução do metal na faixa de 10 a 30% (m/v) . Nessa etapa, o meio reacional é mantido sob agitação constante, opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco, com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, por um período de 10 a 30 minutos, mantendo a 5 temperatura a 25 ± 2°C.

Etapa c- Estabilização da temperatura

Nesta etapa, o meio reacional deverá ser mantido sob agitação constante durante o tempo necessário para a estabilização da temperatura, que varia entre 10 a 30 minutos, em função do volume de dispersão no reator.

Etapa d - Medição da corrente;

Após equilibrada a temperatura, é realizada a medição da corrente pela célula de monitoramento eletroquímico contendo eletrodo de trabalho inerte, cujo material pode 15 ser carbono vítreo, grafite, platina e outros, polarizado num potencial pré determinado que ocorrerá a reação redox do metal. A corrente gerada desta reação é específica (em um potencial com valor pré-determinado anteriormente), sendo o valor da corrente registrada pelo galvanômetro do 20 aparelho.

Esta medida representa o pico máximo de oxi-redução do metal e é realizada utilizando um eletrodo de trabalho, um eletrodo auxiliar e um eletrodo de referência, que ficam em contato direto com a mistura reacional.

O eletrodo de trabalho é constituído de material

eletroquimicamente inerte onde será polarizado em relação ao potencial do eletrodo de referência. A reação de oxidação ou redução gera uma corrente que passa através do eletrodo de trabalho sendo assim registrado. O eletrodo de referência contém componentes de semirreações que resultarão em um eletrodo com potencial constante. Por exemplo, o eletrodo de Ag/AgCl/KClsat é resultante da mistura dos componentes das semirreações abaixo:

AgCl(s) + e- , ■ -- Ag(a) + Cl' E0 = 0,197V Cl^saturadol

5

O eletrodo auxiliar é o eletrodo por onde irá passar a corrente oposta à corrente do processo que ocorre no eletrodo de trabalho sem interferir na resposta do mesmo. Para isso o eletrodo deve ser de área bem maior que o 10 eletrodo de trabalho. 0 material do eletrodo auxiliar pode ser o mesmo do eletrodo de trabalho, como por exemplo carbono vitreo, grafite, platina, etc. Como a corrente é diretamente proporcional a área do eletrodo, a técnica detecta com precisão a substância eletroativa em solução na 15 faixa de micromol/L a milimol/L.

Etapa e - Adição da dispersão do ligante

Determinado o potencial redox do metal em solução e aplicando este valor na célula eletroquimica, é adicionada vagarosamente a dispersão do ligante no reator, mantendo 20 constante a hidrodinâmica do meio reacional por meio de agitação e mantendo a temperatura constante. A adição do ligante é finalizada quando se observa o desaparecimento/estabilização total do sinal da corrente observada antes da adição do ligante.

Portanto, no reator, ocorre a reação entre o metal e o

ligante, cuja homogeneização das dispersões pode ser realizada em um duto de entrada ou pelo fluxo das soluções reagentes ou opcionalmente por um agitador mecânico.

Etapa f - Manutenção da agitação e temperatura

30

Após este procedimento, a mistura reacional é mantida por mais 30 a 60 minutos sob agitação constante, opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco, com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, mantendo a temperatura a 25 ± 2°C.

Etapa q - Medição da corrente

Na primeira modalidade do processo de obtenção de complexo metálico de minerais com proteína, peptídeo ou aminoácidos livres é realizado o monitoramento amperométrico.

Decorrido o tempo determinado na etapa "f", é

verificada novamente a corrente na célula de monitoramento eletroquímico. A manutenção da corrente indica o final da reação (todo o metal presente na dispersão foi complexado/quelado com o ligante).

A proporção estequiométrica (final da reação) é

monitorada pela célula de monitoramento eletroquímico (constituída pelos eletrodos de trabalho, auxiliar e referência) que está em contato direto com a mistura reacional, sendo a corrente correspondente ao processo 20 redox do metal registrada (ou lida) pelo potenciômetro. No modo amperométrico, a proporção estequiométrica (final da reação) é atingida quando a corrente que flui no eletrodo de trabalho, correspondente ao processo redox do metal, apresentar valor mínimo se o potencial aplicado for 25 referente ao metal livre em solução e valor máximo se o potencial aplicado for referente ao metal

complexado/quelado ao ligante.

Etapa opcional g.l - Adição de mais dispersão de ligante

Caso haja elevação da corrente, quando o potencial aplicado for referente ao metal livre em solução, ou ocorra redução da corrente, quando o potencial aplicado for referente ao metal complexado/quelado, esta indica a presença de metal livre na dispersão e, portanto é necessária a adição de mais dispersão ligante, até que a 5 corrente permaneça constante. Nestas condições a complexação/quelação ocorre de acordo com a estequiometria da reação.

Etapa h - Retirada do conteúdo do reator

Quando a reação se encontra finalizada, o conteúdo do reator é retirado por bombeamento direto para o sistema de secagem.

Etapa i - Secagem

O conteúdo retirado do reator é submetido à secagem por processo convencional, preferencialmente por spray drying, operando com vazão de alimentação da amostra entre

3,0 a 5,0 L/h, temperatura do ar de entrada entre 140 a 180°C e de saída 75 a 80°C. A vazão pode ser aumentada em função do tamanho do spray drying. Outro processo convencional que pode ser utilizado é a secagem em estufa 20 com circulação de ar, a temperatura entre 60 e 70° por período de 24 a 48h, este tempo pode ser alterado em função do teor de sólidos na dispersão.

Segunda Modalidade de Processo de Obtenção de Complexo metálico de Minerais com Proteína, Peptídeo ou Aminoácidos Livres (Monitoramento Potenciométrico).

Este processo possibilita a obtenção de complexo/quelato em condições estequiométrica em um processo único e contínuo, pois o logaritmo da concentração do analito é proporcional ao potencial de circuito aberto. Este processo é utilizado quando o monitoramento da reação não pode ser realizado pela corrente (processo amperométrico), devido às reações redox concomitantes. São utilizados os eletrodos indicadores e de referência (compatível com o metal a ser analisado), onde é monitorada a variação do potencial que ocorre em função da variação da concentração do metal em solução.

A segunda modalidade do processo de obtenção de complexo metálico de minerais com proteína, peptídeo ou aminoácidos livres ocorre de acordo com as seguintes etapas:

a) Preparação das dispersões aquosas do ligante e do metal;

b) Agitação constante do meio reacional;

c) Estabilização da temperatura;

d) Medição de potencial;

e) Adição da dispersão do metal;

f) Manutenção da agitação e temperatura;

g) Medição do potencial;

h) Retirada do conteúdo do reator; e

i) Secagem.

Etapa a - Preparação das dispersões aquosas do ligante e do metal

Na etapa "a", são preparadas as dispersões aquosas do ligante (proteína intacta, peptídeo ou aminoácidos livres) em concentração que pode variar de 5 a 25% (m/v) , levando em consideração a viscosidade da dispersão, e do sal do metal em concentração que pode variar de 10 a 30% (m/v) levando em consideração a solubilidade do sal e o volume final da mistura reacional.

De forma resumida, para o ligante a concentração final será definida em função da viscosidade, que deve estar entre 50 e 350cP pois, viscosidade maior prejudica a hidrodinâmica do meio reacional, para o metal a concentração final depende do coeficiente de solubilidade 5 do sal do metal, pois acima deste ocorre precipitação do metal.

O pH da dispersão do ligante deve ser de neutro a levemente alcalino com pH de 7,0 a 8,5, ajustado com solução de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico a 1M.

A dispersão a ser preparada no próprio reator é a do

ligante (proteína intacta, peptídeo ou aminoácidos livres). O volume desta dispersão não deve exceder a 7 0% do volume nominal do reator para a posterior adição da dispersão do sal do metal. Reservar de 5 a 10% do volume nominal do 15 reator, para posterior ajuste da estequiometria ao final da reação.

Esta condição é particularmente importante quando o ligante é uma mistura de peptídeos oriundo de hidrolisado parcial de proteína ligante, pois hoje este é bastante 20 utilizado no preparo de complexo/quelato para a suplementação de ração animal. Neste caso o hidrolisado de proteína (origem animal, vegetal ou de unicelular) pode ser preparado no próprio reator onde será realizada a reação de complexação/quelação possibilitando a otimização do 25 processo como um todo.

Opcional a.l - Adição da dispersão do ligante no reator

Quando não preparada no próprio reator, a dispersão do ligante é colocada no mesmo, cujo volume não deve exceder a 70% do volume nominal do reator, para posterior adição da dispersão do sal do metal. Reservar de 5 a 10% do volume nominal do reator, para posterior ajuste da estequiometria ao final da reação.

Etapa b - Agitação constante do Meio Reacional

0 meio de reação é uma dispersão do ligante na faixa de concentração que pode variar de 5 a 25% (m/v) . Nessa etapa o meio reacional é mantido sob agitação constante, por um período de 10 a 30 minutos, opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco, com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, mantendo a temperatura a 25 ± 20C.

Etapa c- Estabilização da temperatura

Nesta etapa, o meio reacional será mantido sob agitação constante até estabilização da temperatura a 25 ± 2°C, no tempo de 15 a 30 minutos, dependendo do volume de dispersão no reator.

Etapa d - Medição de potencial;

Após equilibrada a temperatura, é realizada a medição do potencial pela célula de monitoramento eletroquímico constituída por um eletrodo de referência

(Ag/AgCl (s)/KCl (sat)) e um eletrodo indicador. O uso do eletrodo de referência (Ag/AgCl (s)/KCl (sat)) , não exclui a possibilidade de uso de outro material que atenda às especificações de um eletrodo de referência. Para o eletrodo indicador, o material deve ser escolhido de acordo com o metal que será adicionado. Por exemplo, quando se adiciona Cu2+ utiliza-se um eletrodo de cobre metálico, assim o potencial Cu(s)/Cu2+ varia com a concentração de Cu2+, sendo registrado pelo potenciômetro.

Etapa e - Adição da dispersão do metal

Determinado o ponto de partida (medida do potencial na solução do ligante - potencial sem o metal livre em solução), inicia-se vagarosamente, a adição da solução de metal no reator. Esta adição será interrompida no momento em que houver a mudança abrupta do potencial, que está sendo continuamente medido.

.Portanto, no reator ocorre a reação entre o metal e o ligante, cuja homogeneização das dispersões pode ser realizada em um duto de entrada ou pelo fluxo das soluções reagentes ou opcionalmente por um agitador mecânico.

Etapa f - Manutenção da agitação e temperatura

Após este procedimento, a mistura reacional é mantida por mais 30 a 60 minutos sob agitação constante, opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco, com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, mantendo a temperatura a 25 ± 2°C.

Etapa g - Medição do potencial

Na segunda modalidade do processo de obtenção de complexo metálico de minerais com proteina, peptídeo ou aminoácidos livres é realizado o monitoramento potenciométrico.

No modo de leitura de potencial de circuito aberto o eletrodo chamado de indicador é constituído por um material compatível ao metal usado na reação. A variação de potencial observada a partir do momento em que há metal 25 livre em solução é maior e indica o final da reação. O potencial é lido no potenciômetro. Dessa forma, a manutenção do potencial indica que a reação atingiu o equilíbrio, ou seja, não há excesso de reagentes.

Etapa opcional g. 1 - Adição de mais dispersão de sal de

metal Caso não haja modificação do potencial, esta indica a presença de ligante livre na dispersão e, portanto é necessária a adição de mais dispersão de metal, até que haja uma variação brusca do potencial.

A manutenção do potencial indica que há ligante livre

em solução, ou seja, ainda é necessário adicionar mais solução do metal, quando todo o ligante disponível tiver reagido com o metal, uma pequena quantidade de metal em excesso levará a uma brusca mudança do potencial indicando 10 o final da reação. Caso esse potencial, após a mudança brusca, se mantiver constante é um indicativo que a reação atingiu a sua estequiometria, no caso desse potencial mudar (por exemplo, reduzir) é necessária a adição de mais metal para atingir a estequiometria da reação.

Etapa h - Retirada do conteúdo do reator

Quando a reação se encontra finalizada, ou seja, quando ocorre mudança brusca do potencial, o conteúdo do reator é retirado.

Etapa i - Secagem O conteúdo retirado do reator é submetido à secagem

por processo convencional, preferencialmente por spray drying, operando com vazão de alimentação da amostra entre de 3,0 a 5,0 L/h, e temperatura do ar de entrada entre 140 a 180°C e de saída 75 a 80°C. A vazão pode ser aumentada em 25 função do tamanho do spray drying. Outro processo convencional que pode ser utilizado é a secagem em estufa com circulação de ar, a temperatura entre 60 e 70° por período de 24 a 48h, este tempo pode ser alterado em função do teor de sólidos na dispersão.

Exemplo de Realização da Invenção Nos exemplos citados, nós utilizamos como ligante um hidrolisado enzimático parcial de proteína de soja, sendo a hidrólise conduzida com endopeptidase de origem microbiana, fabricada pela Novozyme e comercializada como nome de 5 Alcalase®. Tal hidrolisado é composto por peptídeos de diversos tamanhos, porém a maior contribuição é de peptídeos entre 2 e 9 resíduos de aminoácido.

Na preparação dos complexos/quelatos foram utilizados os sais metálicos solúveis como, por exemplo, cloreto de ferro (FeCl3), cloreto de zinco (ZnCl2) e cloreto de cobre (CuCl2) , como fonte dos metais ferro, zinco e cobre respectivamente.

O processo de preparação foi dividido em duas etapas: determinação do ponto de equivalência metal/peptídeo e preparação do complexo/quelato propriamente dito.

A determinação do ponto de equivalência dos metais com os peptídeos foi realizada, como exemplos, empregando-se duas metodologias distintas: voltametria cíclica (medida de corrente redox) para os metais ferro e zinco e a titulação 20 potenciométrica (medida do potencial de circuito aberto) para o cobre, sendo que dependendo da característica e do comportamento do metal em solução foi utilizada a metodologia considerada mais adequada.

A determinação do ponto de equivalência dos metais 25 ferro e zinco foi realizada com a técnica de voltametria cíclica, utilizando os eletrodos de prata (Ag/ AgCl (s) /KCl (sat)) como referência, platina como auxiliar e carbono vítreo como eletrodo de trabalho (área de superfície de aproximadamente 0,07 cm2).

0 eletrodo de carbono vítreo foi polido antes de cada leitura com uma suspensão de alumina (partículas de alumina com tamanho de 1 μπι) . Após o polimento, o eletrodo foi sonicado por 30 s em água deionizada para a eliminação de quaisquer partículas ou substâncias adsorvida durante o polimento.

Os voltamogramas cíclicos foram obtidos utilizando-se um potenciostato Bioanalytical System (BAS) modelo CV27.

0 experimento foi conduzido utilizando 3mL da solução aquosa do metal a 5 mM em KCl 0,1 M. A determinação do 10 ponto de equivalência metal/hidrolisado foi monitorada com adições consecutivas da dispersão aquosa do hidrolisado proteico a 10 % (m/v), pH 7,5, até o total desaparecimento ou estabilização da corrente de pico catódica do Fe3+ para Fe2+, como demonstrado na figura I, e Zn2+ para Zn+ , como 15 demonstrado na figura 2.

Sendo a figura 1 uma representação gráfica de um voltamograma obtido para a determinação do ponto de equivalência do ferro com hidrolisado de proteína de soja, onde se pode observar a diminuição do pico catódico em 0,3V com a adição de hidrolisado de soja, indicado pela flecha.

Sendo a figura 2 uma representação gráfica de um voltamograma obtido para a determinação do ponto de equivalência do zinco com hidrolisado de proteína de soja, onde se pode observar a diminuição do pico catódico em - 25 1,0V com a adição do hidrolisado de soja, indicado pela flecha.

Para o cobre, a determinação do ponto de equivalência foi realizada através da titulação potenciométrica em medidor de pH com eletrodo de vidro, na qual foram titulados volumes crescentes de solução de CuCl2 25 mM em uma dispersão de hidrolisado a 2,5% (p/v) até a estabilização dos valores de potencial lidos. A determinação da relação ideal de cobre/hidrolisado foi dada pela derivada da curva obtida no gráfico de potencial 5 versus volume de solução de cobre titulada, conforme pode ser visto na figura 3.

Ao longo da execução dos experimentos, ficou evidente a relação entre a quantidade de ligante adicionado à redução da corrente de pico para cada metal (indicado pelas 10 setas nas figuras 1 e 2) . Essa redução ocorreu de maneira gradativa, no entanto, cada metal apresentou uma resposta à adição do hidrolisado (dependente da afinidade entre ambas as partes), ou seja, a variação da intensidade do pico foi diferente para cada metal para um mesmo volume de adição de 15 hidrolisado de proteína de soja.

As figuras 1 e 2 representam exemplos de voltamogramas obtidos durante o processo de obtenção de complexo/quelato de hidrolisados enzimático parcial de isolado de proteína de soja com os metais Fe3+/Fe2+ e Zn2+/Zn+, mostrando a 20 redução gradativa da corrente relativa ao processo redox do metal (indicado pelas setas nas figuras 1 e 2), até o final da reação onde não há variação da corrente de pico. Nas mesmas condições o comportamento se mostrou reprodutível.

Quando o metal se liga à proteína ou derivado (peptídeos e aminoácidos livres) o potencial redox muda e consequentemente a corrente de pico correspondente ao metal livre diminui até o momento onde não é mais possível notar a presença de picos anódicos ou catódicos.

Deve-se enfatizar que após se atingir o ponto de equilíbrio, uma medida era realizada logo a seguir da adição do hidrolisado e outra medida 30 minutos após esta última para a confirmação do final da reação.

Para o cobre, a determinação do ponto de equivalência metal/hidrolisado foi realizada utilizando-se o método de titulação potenciométrica que consiste na medida de potencial de circuito aberto, visto que a voltametria cíclica não mostrou ser o método mais adequado para esse metal. A liberação de H+ no meio durante a formação do complexo permite o monitoramento da alteração do potencial e a determinação do ponto de equivalência cobre/hidrolisado (PANIAGO e CARVALHO, 1988) . O ponto de equivalência foi determinado com um gráfico obtido a partir da primeira derivada em função da curva de titulação (figura 3), o ponto de equivalência corresponde ao valor máximo da derivada.

Com os resultados obtidos pelo gráfico apresentado na figura 3 foi possível obter o ponto de equivalência entre o cobre e o hidrolisado. E o resultado prévio mostrou que o cobre apresentou uma maior afinidade pelo hidrolisado quando comparado ao zinco, porém inferior ao ferro.

Para a confirmação dos resultados obtidos foram realizadas mais duas caracterizações: a determinação da quantidade de cada metal ligado ao hidrolisado pelo método de absorção atômica e a confirmação da interação do metal 25 com o hidrolisado pela obtenção de espectros de absorção na região do ultravioleta-visível.

Assim os resultados mostraram que se pode monitorar a estequiometria do complexo/quelato de duas formas:

1) monitorando a variação de corrente no potencial redox do metal livre ou complexo em solução (método amperométrico);

2) monitorando o potencial de circuito aberto referente à presença ou ausência do metal livre em solução (monitoramento potenciométrico).

Embora a versão preferida da invenção tenha sido

ilustrada e descrita, deve ser compreendido que a invenção não é limitada. Diversas modificações, mudanças, variações, substituições e equivalentes poderão ocorrer, sem desviar do escopo da presente invenção.

Claims (46)

1.Processo de obtenção de complexo metálico de minerais com proteína, peptídeo ou aminoácidos livres caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) Preparação das dispersões aquosas do ligante e do metal; b) Agitação constante do meio reacional; c) Estabilização da temperatura; d) Medição da corrente; e) Adição da dispersão do ligante; f) Manutenção da agitação e temperatura; g) Medição da corrente; h) Retirada do conteúdo do reator; e i) Secagem.

2.Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do ligante ser proteína intacta, peptídeos ou aminoácidos livres.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da dispersão aquosa de metal ser preparada a partir de um sal mineral do tipo cloreto, sulfato , carbonato ou fosfato dos seguintes metais: ferro, zinco, manganês, cobre, cobalto ou molibdênio.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a etapa "a.l" de adição da dispersão do sal do metal no reator, que ocorre após a etapa "a".

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a etapa "g.l" de adição de dispersão de ligante, que ocorre após a etapa "g".

6.Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de na etapa "a" serem preparadas as dispersões aquosas da (proteína intacta, peptídeo ou aminoácidos livres), em concentração que pode variar de 5 a 25% (m/v) e pH de 7 a 8,5; e do sal do metal em concentração que pode variar de 10 a 30% (m/v).

7.Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato da dispersão do sal do metal ser opcionalmente preparada no próprio reator com volume desta de até 30% do volume nominal do reator e sendo reservado de 5 a 10% do volume de dispersão do sal de metal.

8. Processo, de acordo com as reivindicações 4 e 7, caracterizado pelo fato de na etapa opcional "a.l", a dispersão do sal do metal ser colocada no reator, caso não tenha sido preparada no mesmo, com volume de até 30% do volume nominal do reator, reservando de 5 a 10% do volume da dispersão do sal de metal.

9. Processo, de acordo com a reivindicação . 1, caracterizado pelo fato de na etapa "b", a solução do metal na faixa de 10 a 30% (m/v) ser mantido sob agitação constante com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, por um período de 10 a 30 minutos, mantendo a temperatura a 25 ± 20C.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato da agitação ser realizada opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa "c", o meio reacional permanecer sob agitação constante durante o tempo necessário para a estabilização da temperatura que varia de 10 a 30 minutos.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa "d" ser realizada a medição da corrente pela célula de monitoramento eletroquímico que contém um eletrodo de trabalho, um eletrodo auxiliar e um eletrodo de referência, que ficam em contato direto com a mistura reacional, sendo o valor da corrente registrada pelo galvanômetro do aparelho.

13.Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato do eletrodo de trabalho inerte ser de carbono vítreo, grafite, platina e ser polarizado em relação ao eletrodo de referência num potencial pré- determinado no qual ocorrerá a reação redox do metal.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato do eletrodo de referência conter componentes de semirreações que resultarão em um eletrodo com potencial constante.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato do eletrodo auxiliar ser de carbono vítreo, grafite, platina e detectar com precisão a substância eletroativa em solução na faixa de micromol/L a milimol/L.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa "e" ser adicionada vagarosamente a dispersão do ligante no reator, mantendo constante a hidrodinâmica do meio reacional por meio de agitação e manutenção da temperatura, até se observar o desaparecimento/estabilização total do sinal da corrente observada antes da adição do ligante.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ocorrer no reator a reação entre o metal e o ligante, cuja homogeneização das dispersões pode ser realizada em um duto de entrada ou pelo fluxo das soluções reagentes ou opcionalmente por um agitador mecânico.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa "f" a mistura reacional ser mantida por mais 30 a 60 minutos sob agitação constante com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, mantendo a temperatura a 25 ± 2°C.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato da agitação ser realizada opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa "g" ser realizado o monitoramento amperométrico através da célula de monitoramento eletroquímico em contato com o meio reacional eletrodos de trabalho, auxiliar e referência - sendo a corrente correspondente ao processo redox do metal registrada ou lida pelo potenciômetro.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato da proporção estequiométrica ser atingida quando a corrente que flui no eletrodo de trabalho apresentar valor mínimo para o potencial aplicado referente ao metal livre em solução ou valor máximo para o potencial aplicado referente ao metal complexado/quelado ao ligante.

22. Processo, de acordo com as reivindicações 5 e 21, caracterizado pelo fato da etapa opcional "g.l" ser realizada quando existir elevação da corrente, sendo adicionada mais dispersão ligante até que a corrente permaneça constante em seu valor mínimo para o potencial aplicado referente ao metal livre ou em seu valor máximo para o potencial aplicado referente ao do complexo/quelato.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa "h", o conteúdo do reator ser retirado quando detectada o final da reação.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa "i", o conteúdo retirado do reator ser submetido à secagem por spray drying, operando com vazão de alimentação da amostra entre 3,0 a 5,0 L/h, temperatura do ar de entrada entre 140 a 180°C e de saída 75 a 80°C; ou por secagem em estufa com circulação de ar, com temperatura entre 60 e 70° por período de 24 a 48 horas.

25. Processo de obtenção de complexo metálico de minerais com proteína, peptídeo ou aminoácidos livres caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) Preparação das dispersões aquosas do ligante e do metal; b) Agitação constante do meio reacional; c) Estabilização da temperatura; d) Medição de potencial; e) Adição da dispersão do metal; f) Manutenção da agitação e temperatura; g) Medição do potencial; h) Retirada do conteúdo do reator; e i) Secagem.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato do ligante ser proteína intacta, peptídeos ou aminoácidos livres.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato da dispersão aquosa de metal ser preparada a partir de um sal mineral do tipo cloreto, sulfato, carbonato ou fosfato dos seguintes metais: ferro, zinco, manganês, cobre, cobalto ou molibdênio.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a etapa "a.l" de adição da dispersão do ligante no reator, que ocorre após de etapa "a".

29. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a etapa "g.l" de adição de dispersão de sal de metal, que ocorre após a etapa "g".

30. Processo, de acordo com a reivindicação 25 e 26, caracterizado pelo fato de na etapa "a" serem preparadas as dispersões aquosas da proteína intacta, peptídeo ou aminoácidos livres em concentração que pode variar de 5 a 25% (m/v) e pH de 7 a 8,5; e do sal do metal em concentração que pode variar de 10 a 30% (m/v).

31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato da dispersão do ligante ser opcionalmente preparada no próprio reator com volume de até 70% do volume nominal do reator, sendo reservada de 5 a 10% do volume da dispersão de ligante.

32. Processo, de acordo com as reivindicações 25 e 31, caracterizado pelo fato de na etapa adicional "a.l" a dispersão do ligante ser colocada no reator, caso não tenha sido preparada no mesmo, com volume até 7 0% do volume nominal do reator, sendo reservado de 5 a 10% do volume da dispersão de ligante.

33.Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "b", a dispersão do ligante na faixa de concentração que pode variar de 5 a 25% (m/v) ser mantido sob agitação constante, por um período de10 a 30 minutos, com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, mantendo a temperatura a 25 í 2°C.

34. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato da agitação ser realizada opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco.

35. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "c", o meio reacional permanecer sob agitação constante durante o tempo necessário para a estabilização da temperatura a 25 ± 2°C que varia de 15 a 30 minutos.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "d" ser realizada a medição do potencial pela célula de monitoramento eletroquímico que contém um eletrodo de referência e um eletrodo indicador, sendo o valor do potencial registrado pelo potenciômetro.

37. Processo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato do material do eletrodo indicador ser escolhido de acordo com o metal que será adicionado e do eletrodo de referência ser preferencialmente de Ag/ AgCl (s) /KCl (sat) ·

38. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "e" ser adicionado vagarosamente a solução de metal no reator até que ocorra a mudança abrupta do potencial.

39. Processo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de ocorrer no reator a reação entre o metal e o ligante, cuja homogeneização das dispersões pode ser realizada em um duto de entrada ou pelo fluxo das soluções reagentes ou opcionalmente por um agitador mecânico.

40. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "f" a mistura reacional ser mantida por mais 30 a 60 minutos sob agitação constante, com velocidade de rotação entre 50 a 250 rpm, mantendo a temperatura a 25 + 2°C.

41. Processo, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato da agitação ser realizada opcionalmente com agitador mecânico, com hélice tipo de barco.

42. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "g" ser realizado o monitoramento potenciométrico no modo de leitura de potencial de circuito aberto através da célula de monitoramento eletroquímico, contendo eletrodo indicador e eletrodo referência, em contato com o meio reacional, sendo o potencial lido no potenciômetro.

43. Processo, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato da manutenção do potencial indicar que a reação atingiu o equilíbrio.

44. Processo, de acordo com as reivindicações 29 e 43, caracterizado pelo fato de na etapa opcional "g.l", caso não haja modificação abrupta do potencial, ser adicionada mais dispersão de metal até que haja uma variação brusca do potencial.

45. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "h", o conteúdo do reator ser retirado por bombeamento direto para o sistema de secagem no final da reação.

46. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de na etapa "i", o conteúdo retirado do reator ser submetido à secagem por spray drying, operando com vazão de alimentação da amostra entre 3,0 a 5,0 L/h, temperatura do ar de entrada entre 140 a 180℃ e de saída 75 a 80°C; ou por secagem em estufa com circulação de ar, com temperatura entre 60 e 70° por período de 24 a 48 horas.