BR102012005230A2 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOETHANOL FROM THE BATHROOM PSEUDOCAULE WITH ENZYMATIC HYDROLYSIS AND USE - Google Patents

PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOETHANOL FROM THE BATHROOM PSEUDOCAULE WITH ENZYMATIC HYDROLYSIS AND USE Download PDF

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Abstract

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIOETANOL A PARTIR DO PSEUDOCAULE DE BANANEIRA COM HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E USO DO MESMO. A presente invenção se refere a um processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira com hidrólise enzimática onde se emprega o pré-tratamento com hidróxido de sódio puro ou em combinação com o hipoclorito de sódio, o ácido acético e ou vinagre em combinação com o peróxido de hidrogênio, ácido sulfúrico e a combinação de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico e a combinação de explosão a vapor e hidróxido de sódio e posterior hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada com as enzimas celulases NS 22074 e NS 50012 realizada em banho de ultra-som ou banho do tipo shaker, em que o melhor resultado obtido é a hidrólise enzimática em shaker durante 48 horas da biomassa com hidróxido de sódio (3%) (0,2g) com a mistura das enzimas NS 22074 (0,015ml) e NS 50012 (0,015 ml), pois para produzir 1Kg de açúcares fermentáveis são necessários somente 1,2 Kg de biomassa pré-tratada e apenas 180 ml da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, mostrando ser um processo economicamente viável para a produção de etanol.PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOETHANOL FROM BANANEIRA PSEUDOCAULE WITH ENZYMATIC HYDROLYSIS AND USE OF THE SAME. The present invention relates to a process for the production of bioethanol from enzymatic hydrolysis banana pseudostem where pretreatment with pure sodium hydroxide or in combination with sodium hypochlorite, acetic acid and / or vinegar is employed. combination with hydrogen peroxide, sulfuric acid and the combination of sodium hydroxide and sulfuric acid and the combination of steam blast and sodium hydroxide and subsequent enzymatic hydrolysis of the pretreated cellulose enzymes NS 22074 and NS 50012 carried out in ultrasound bath or shaker bath, in which the best result obtained is the 48 hour shaker enzymatic hydrolysis of the sodium hydroxide biomass (3%) (0.2g) with the NS 22074 (0.015) enzyme mixture. ml) and NS 50012 (0.015 ml), because to produce 1 kg of fermentable sugars requires only 1.2 kg of pretreated biomass and only 180 ml of the mixture of enzymes NS 22074 and NS 50012, proving to be an economically viable process for ethanol production.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIOETANOL A PARTIR DO PSEUDOCAULE DE BANANEIRA COM HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E USO DO MESMO".Patent Descriptive Report for: "BIOETHANOL PRODUCTION PROCESS FROM BATHROOM PSEUDOCAULE WITH ENZYMATIC HYDROLYSIS AND SAME USE".

Campo da InvençãoField of the Invention

A presente invenção se refere a um processo para a produção de bioetanol a partir de açúcares fermentáveis formados através da hidrólise enzimática da biomassa do pseudocaule de bananeira pré-tratada quimicamente. Mais especificamente, a presente invenção se refere à hidrólise enzimática do material lignocelulósico presente no pseudocaule de bananeira visando à produção de açúcares fermentáveis para posterior formação de bioetanol.The present invention relates to a process for the production of bioethanol from fermentable sugars formed by enzymatic hydrolysis of chemically pretreated banana pseudostem biomass. More specifically, the present invention relates to enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material present in banana pseudostem for the production of fermentable sugars for further bioethanol formation.

Antecedentes da InvençãoBackground of the Invention

As perspectivas de esgotamento das reservas de petróleo e os compromissos mais sólidos com a questão ambiental, desde a assinatura do Protocolo de Quioto, fizeram renascer a atenção nas fontes alternativas de energia. Existem diversas fontes alternativas de energia que, embora não possam substituir o petróleo em sua totalidade, pelo menos podem contribuir para diminuir o seu consumo. Entre elas, uma de particular interesse, em função da sua abundância e do seu caráter renovável, é a biomassa vegetal, principalmente aquela formada por resíduos florestais e agrícolas. No entanto, a matéria-prima para produção de bioetanol deve ser proveniente de partes não comestíveis dos alimentos, a fim de evitar a concorrência direta entre o bioetanol e a produção de alimentos (Sakai et al.r 2007). O 5 etanol pode ser produzido a partir de uma série de energias renováveis.Prospects for depletion of oil reserves and stronger commitments to the environment since the Kyoto Protocol signed attention on alternative energy sources. There are several alternative sources of energy that, while they cannot replace oil in its entirety, can at least contribute to lowering its consumption. Among them, one of particular interest, due to its abundance and renewable nature, is plant biomass, mainly that formed by forest and agricultural residues. However, the raw material for bioethanol production must come from inedible parts of food in order to avoid direct competition between bioethanol and food production (Sakai et al.r 2007). Ethanol can be produced from a range of renewable energies.

Resíduos lignocelulósicos da agroindústria contêm celulose, em combinação com a lignina. A celulose é o polímero predominante na biomassa lignocelulósica, com 10 hemicelulose e lignina encontrados em quantidades menores. O componente de celulose nestes materiais pode ser convertido em etanol em um processo de duas etapas, onde a celulose é primeiro convertido em açúcares (glicose) por hidrólise; os açúcares resultantes por sua vez podem ser 15 convertidos em etanol por fermentação. No entanto, devido à estreita associação da celulose e hemicelulose com a lignina na parede celular das plantas, é necessário fazer um pré-tratamento desses carboidratos disponíveis para facilitar a hidrólise enzimática e a fermentação, conforme 20 revelado por El-Zawawy, W.K. e colaboradores no trabalho intitulado "Acid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materiais into glucose for ethanol production" publicado na Carbohydrate Polymers em 2011, V. 84, pgs. 865-871. Endo e colaboradores descreveram no trabalho intitulado "Genome-wide screening of the genes required for tolerance to vanillin, which is a potential inhibitor of bioethanol fermentation in Saccharomyces cerevisiae", 5 publicado na Biotechnology for Biofuels em 2008, 1, 3, que por razões econômicas, pré-tratamentos termoquímicos vem sendo realizados, tais como hidrólise ácida diluida e a explosão a vapor, que solubiliza o componente hemicelulose e aumenta a acessibilidade de celulose.Lignocellulosic wastes from agribusiness contain cellulose in combination with lignin. Cellulose is the predominant polymer in lignocellulosic biomass, with 10 hemicellulose and lignin found in smaller quantities. The cellulose component in these materials can be converted to ethanol in a two-step process, where cellulose is first converted to sugars (glucose) by hydrolysis; The resulting sugars in turn can be converted to ethanol by fermentation. However, due to the close association of cellulose and hemicellulose with lignin in plant cell walls, a pretreatment of these available carbohydrates is required to facilitate enzymatic hydrolysis and fermentation, as revealed by El-Zawawy, W.K. and collaborators on the paper entitled "Acid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materials into glucose for ethanol production" published in Carbohydrate Polymers in 2011, V. 84, pgs. 865-871. Endo and colleagues described in a paper entitled "Genome-wide screening of the genes required for tolerance to vanillin, which is a potential inhibitor of bioethanol fermentation in Saccharomyces cerevisiae", 5 published in Biotechnology for Biofuels in 2008, 1, 3, which for reasons Economical, thermochemical pre-treatments have been performed, such as dilute acid hydrolysis and steam explosion, which solubilizes the hemicellulose component and increases the accessibility of cellulose.

Entretanto, nem todo o tipo de biomassaHowever, not all types of biomass

lignocelulósica pode ser pré-tratado da mesma forma. Enquanto a explosão a vapor tem sido experimentado e testado para agros resíduos, como palha de milho e palha de arroz, uma hidrólise ácida é necessária para produção de 15 açúcar a partir de madeira macia. Assim, é necessário realizar uma investigação para determinar a melhor estratégia do pré-tratamento que pode ser a mais econômica, e ao mesmo tempo, pode satisfazer todas as características de um bom pré-tratamento conforme descrito em diversos 20 trabalhos no estado da técnica.lignocellulosic can be pretreated in the same way. While steam blasting has been tried and tested for agros waste such as corn husk and rice straw, acid hydrolysis is required to produce sugar from softwood. Thus, an investigation is needed to determine the best pre-treatment strategy that may be the most economical, and at the same time, can satisfy all the characteristics of good pretreatment as described in several prior art studies.

Vários processos de pré-tratamento foram desenvolvidos para materiais lignocelulósicos no estado da técnica. Estes são realizados em parte pela solubilização das hemiceluloses e, em parte, pela degradação da lignina. Os pré-tratamentos são: moagem e trituração, pirólise, radiação de alta energia, alta pressão de vapor, alcalinos ou ácidos, tratamento de gás (dióxido de cloro, nitrogênio e ozônio), peróxido de hidrogênio, tratamento com solvente 5 orgânico, tratamento hidrotérmico, explosão a vapor, oxidação úmida e tratamento biológico.Several pretreatment processes have been developed for lignocellulosic materials in the state of the art. These are performed in part by solubilization of hemicelluloses and in part by lignin degradation. Pretreatments are: milling and grinding, pyrolysis, high energy radiation, high vapor pressure, alkali or acid, gas treatment (chlorine dioxide, nitrogen and ozone), hydrogen peroxide, organic solvent treatment, hydrothermal, steam explosion, wet oxidation and biological treatment.

Os residuos vegetais têm despertado grande interesse na produção de bioetanol. A rota mais estudada para a sua conversão em açúcares fermentáveis tem sido a hidrólise 10 ácida, tanto de forma isolada, conforme descreve Del Campo e colaboradores, no trabalho intitulado "Diluted acid hydrolysis pretreatment of agri-food wastes for biotethanol production", publicado na Industrial Crops and Products em 2006, V.24, pags. 214-221, tal como combinada com a 15 hidrólise enzimática, conforme o artigo de Cara e colaboradores, intitulado "Conversion of olive tree biomass into fermentable sugars by dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification'' publicado na Bioresource Technology em 2008, V. 99, pags.1869-1876.Vegetable waste has aroused great interest in bioethanol production. The most studied route for its conversion to fermentable sugars has been acid hydrolysis, both in isolation, as Del Campo and colleagues describe it in their paper entitled "Diluted acid hydrolysis pretreatment for agri-food wastes for biotethanol production", published in Industrial Crops and Products in 2006, V.24, pags. 214-221, as combined with enzymatic hydrolysis, according to the article by Cara et al. Entitled "Conversion of olive tree into fermentable sugars by dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification" published in Bioresource Technology in 2008, V. 99 , pages 1869-1876.

Entre os residuos gerados na agricultura encontra-se aAmong the residues generated in agriculture is the

biomassa da bananicultura. As condições de produção, industrialização e comercialização da banana resultam em grande quantidade de matéria vegetal, tanto em termos de resíduos acumulados quanto de frutos rejeitados. Souza e colaboradores descreveram no trabalho intitulado "Biodegradação de resíduos lignocelulósicos gerados na bananicultura e sua valorização para a produção de biogás" publicado na Revista Brasileira de Engenharia 5 Agricola e Ambiental em 2010, V. 4, pags. 438-443, que a produção de bioetanol a partir da biomassa da bananicultura torna-se um processo bastante atraente. Além de permitir a criação de uma fonte alternativa e renovável de energia e de contribuir com a redução de resíduos no meio ambiente, a 10 geração de energia pode agregar valor à matriz produtiva da fruta reduzindo assim o risco de perdas provocadas pelas oscilações do seu preço no mercado.banana biomass. Banana production, industrialization and marketing conditions result in a large amount of plant matter, both in terms of accumulated residues and rejected fruits. Souza and colleagues described in their work entitled "Biodegradation of lignocellulosic residues generated in banana farming and their valorization for biogas production" published in the Brazilian Journal of Agricultural and Environmental Engineering in 2010, V. 4, pags. 438-443, that bioethanol production from banana biomass becomes a very attractive process. In addition to allowing the creation of an alternative and renewable source of energy and contributing to the reduction of waste in the environment, energy generation can add value to the fruit production matrix, thus reducing the risk of losses caused by price fluctuations. in the market.

A bananeira é uma das principais frutíferas em exploração no Brasil; entretanto, a quantidade de bananas 15 produzidas anualmente no País só é superada pela de laranjas. A bananeira é cultivada, sem exceção, em todos os estados da Federação. Em 2005, o estado catarinense, segundo maior produtor nacional de bananas, produziu 668 mil toneladas da fruta, principalmente as das espécies Musa 20 sapientum e Musa cavendischii, popularmente conhecidas na região como banana branca e banana nanica, respectivamente (CEPA, 2006). Dados da EMBRAPA (2006) mostram que, de cada 100 kg de frutas colhidas em 2006, 46 kg não foram aproveitados. Além desse rejeito, a cultura da banana gera outros resíduos no campo provenientes da sua industrialização. De acordo com dados levantados em uma empresa de alimentos do município de Garuva, um dos maiores produtores de banana nanica na região nordeste do estado de 5 Santa Catarina, para cada tonelada de banana industrializada aproximadamente 3 toneladas de pseudocaule, 160 kg de engaços, 480 kg de folhas e 440 kg de cascas são gerados.The banana tree is one of the main fruit in exploitation in Brazil; However, the amount of bananas produced annually in the country is only surpassed by oranges. Banana is grown without exception in all states of the Federation. In 2005, the state of Santa Catarina, the second largest national producer of bananas, produced 668,000 tons of fruit, mainly those of the species Musa 20 sapientum and Musa cavendischii, popularly known in the region as white banana and banana nanica, respectively (CEPA, 2006). Data from EMBRAPA (2006) show that of every 100 kg of fruits harvested in 2006, 46 kg were not used. In addition, the banana crop generates other residues in the field from its industrialization. According to data from a food company in the municipality of Garuva, one of the largest producers of dwarf bananas in the northeastern region of 5 Santa Catarina, for each ton of industrialized bananas approximately 3 tons of pseudostem, 160 kg of stems, 480 kg of leaves and 440 kg of bark are generated.

Conforme Yoswathana e colaboradores escreveram em seu 10 trabalho intitulado "Bioethanol Production from Rice Straw", publicado na Energy Research Journal, 1; 26-31 em 2010, a palha do arroz tem sido tratada com diferentes produtos químicos (ácidos ou álcalis) e métodos físicos (água subcrítica, ultra-som) para converter o material 15 lignocelulósico em açúcar. 0 tratamento com ácido sulfúrico (1-9%) a 121°C durante 15 minutos é um método de pré- tratamento eficaz para conversão de lignocelulose para o açúcar, sendo que foi medido 21% de conversão em açúcares após o tratamento com o ácido. Um bom resultado foi obtido 20 ao utilizar a combinação do pré-tratamento químico e enzimático, sendo que aumentou o rendimento de açúcares, para 37 e 28% para as amostras pré- tratadas com ácido e alcalis, respectivamente. Melhor resultado foi obtido ao utilizar a combinação do pré-tratamento ácido com ultra-som antes do tratamento enzimático, sendo que a conversão em açúcar aumentou para 4 4%.As Yoswathana and colleagues wrote in their 10 paper entitled "Bioethanol Production from Rice Straw", published in the Energy Research Journal, 1; 26-31 In 2010, rice straw has been treated with different chemicals (acids or alkalis) and physical methods (subcritical water, ultrasound) to convert lignocellulosic material into sugar. Sulfuric acid treatment (1-9%) at 121 ° C for 15 minutes is an effective pretreatment method for converting lignocellulose to sugar, with 21% conversion to sugars measured after acid treatment. . A good result was obtained by using the combination of chemical and enzymatic pretreatment, which increased the sugar yield to 37 and 28% for the acid and alkali pretreated samples, respectively. The best result was obtained by using the combination of acid pretreatment with ultrasound before enzymatic treatment, and the conversion to sugar increased to 4 4%.

El-Zawawya e colaboradores escreveram em seu trabalho intitulado: nAcid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materiais into glucose for ethanol production", publicado na Carbohydrate Polymers, 84 865-871 em 2011, a hidrólise ácida e enzimática para a produção de glicose a partir de palha de arroz, resíduos de bananeira e sabugo de milho pré-tratados, como materiais lignocelulósicos. A hidrólise enzimática da celulose em glicose é realizada por enzima celulase. A hidrólise foi realizada em condições brandas (por exemplo, pH 4,5-5,0 e temperatura 40-50°C). Neste caso não teve grandes problemas de corrosão, apresentou baixo consumo de energia e baixa toxicidade dos hidrolisados como as principais vantagens deste processo em comparação com a hidrólise ácida realizada com ácido diluído em temperatura mais elevada. Ao realizar a hidrólise enzimática com o resíduo de bananeira, o melhor resultado obtido foi ao utilizar a biomassa pré- tratada com explosão a vapor, sendo que em 24 horas de reação foram formados 9 g/L de glicose.El-Zawawya and colleagues wrote in their paper entitled: nAcid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materials into glucose for ethanol production, "published in Carbohydrate Polymers, 84 865-871 in 2011, acid and enzymatic hydrolysis for the production of glucose a from rice straw, pre-treated banana and corn cob residues as lignocellulosic materials Enzymatic hydrolysis of glucose cellulose is performed by cellulase enzyme Hydrolysis was performed under mild conditions (eg pH 4.5- 5.0 and temperature 40-50 ° C.) In this case it did not have major corrosion problems, presented low energy consumption and low toxicity of hydrolysates as the main advantages of this process compared to the acid hydrolysis performed with dilute acid at higher temperature. When performing the enzymatic hydrolysis with the banana residue, the best result obtained was using the pre-treated biomass. with steam explosion, and within 24 hours of reaction 9 g / L of glucose was formed.

0 pedido de patente internacional WO 2008/095098, depositado em 31 de janeiro de 2008 em nome de Board of Supervisors of Louisiana State University & Agricultural & Mechanical College descreve um processo para obtenção de açúcares a partir de biomassa lignocelulósica, no qual se faz um pré-tratamento alcalino a quente do material com uma mistura de hidróxido de cálcio e água a temperatura de 800C 5 a 140°C durante cerca de 30 min a 3 horas. Após o tratamento, o bagaço é prensado; o líquido contém principalmente componentes solúveis de lignina, além de cal (que pode ser recuperada) e o material sólido fibroso é submetido à hidrólise por enzimas celulásicas. Segundo os 10 autores, este tratamento modifica a estrutura lignocelulósica de modo que possa ser rapidamente solubilizada pela celulase, mesmo usando altos teores de sólidos (10 a 30%), sem que a atividade enzimática seja afetada. Foram utilizadas enzimas comerciais, como por 15 exemplo, Spezyme CP (Genecor International Co) e Novo 188 (Novozymes).International patent application WO 2008/095098, filed January 31, 2008 on behalf of the Board of Supervisors of Louisiana State University & Agricultural & Mechanical College describes a process for obtaining sugars from lignocellulosic biomass in which a Hot alkaline pretreatment of the material with a mixture of calcium hydroxide and water at a temperature of 800 ° C 5 to 140 ° C for about 30 min to 3 hours. After treatment, the bagasse is pressed; The liquid contains mainly soluble lignin components as well as lime (which can be recovered) and the fibrous solid material is subjected to hydrolysis by cellulosic enzymes. According to the 10 authors, this treatment modifies the lignocellulosic structure so that it can be quickly solubilized by cellulase, even using high solids contents (10 to 30%), without affecting enzymatic activity. Commercial enzymes such as Spezyme CP (Genecor International Co) and Novo 188 (Novozymes) were used.

0 pedido de patente brasileiro PI 0700481-8, depositado em 02 de março de 2007 e intitulado "Pré- tratamento de bagaço de cana-de-açúcar para produção de 2 0 etanol" em nome de Fundação Universidade de Caxias do Sul descreve processos de pré-tratamento alcalinos para o bagaço de cana-de-açúcar e posterior hidrólise com a enzima de Penicillium echinulatum para a obtenção de açúcares fermentáveis. Esta invenção empregou quantidades de enzima de 10 a 15 FPU por grama de biomassa seca a temperatura de 40-60°C durante 24-48 horas. Os rendimentos em açúcares fermentáveis foram de 50-90%.Brazilian patent application PI 0700481-8, filed on March 2, 2007 entitled "Pre-treatment of sugarcane bagasse for the production of 20 ethanol" on behalf of the University of Caxias do Sul Foundation describes processes for alkaline pretreatment for sugarcane bagasse and subsequent hydrolysis with Penicillium echinulatum enzyme to obtain fermentable sugars. This invention employed enzyme amounts of 10 to 15 FPU per gram of dry biomass at a temperature of 40-60 ° C for 24-48 hours. Yields in fermentable sugars were 50-90%.

O pedido de patente internacional WO 2006/110901 5 depositado em 12 de abril de 2006 em nome de E. I. Du Pont de Nemours and Company e intitulado "Treatment of biomass to obtain fermentable sugars", relata o pré-tratamento da biomassa usando baixas concentrações de amônia aquosa a grandes concentrações de biomassa. A biomassa pré-tratada é 10 hidrolisada com enzimas.International Patent Application WO 2006/110901 5 filed April 12, 2006 on behalf of EI Du Pont de Nemours and Company and entitled "Treatment of biomass to obtain fermentable sugars", reports pre-treatment of biomass using low concentrations of aqueous ammonia at high biomass concentrations. The pretreated biomass is hydrolyzed with enzymes.

0 pedido de patente internacional WO 2006/026863, depositado em 0 9 de setembro de 2005 em nome de Iogen Energy Corporation e intitulado "Process for producing a pretreated feedstock" revela um método para tratar biomassa 15 lignocelulósica - grama, palhas de cereais e sabugo ou combinações destes materiais. Por este método, os resíduos são triturados e o pré-tratamento é realizado com a adição de ácido diluído aos resíduos. Esta mistura é mantida em temperatura de 160°C a 280°C.International Patent Application WO 2006/026863, filed September 0, 2005, on behalf of Iogen Energy Corporation and entitled "Process for producing a pretreated feedstock" discloses a method for treating lignocellulosic biomass - grass, cereal straw and cob or combinations of these materials. By this method, the waste is ground and pretreatment is carried out with the addition of dilute acid to the waste. This mixture is kept at a temperature of 160 ° C to 280 ° C.

0 pedido de patente internacional WO 2005/078140,International patent application WO 2005/078140,

depositado em 08 de fevereiro de 2005 em nome de JGC Corporation e intitulado "Process for producing monosaccharide from biomass and monosaccharide production apparatus" revela um processo que compreende uma primeira etapa, onde a biomassa é tratada com ácido sulfúrico na concentração de 65 a 85%, a temperaturas de 30 a 70°C e, na segunda etapa, ocorre a sacarificação do produto obtido na primeira etapa. Esta sacarificação é realizada com ácido 5 sulfúrico na concentração de 20 a 60% a temperaturas de 40 a 100°C.filed February 8, 2005 on behalf of JGC Corporation entitled "Process for producing monosaccharide from biomass and monosaccharide production apparatus" discloses a process comprising a first step, wherein the biomass is treated with sulfuric acid at a concentration of 65 to 85%. at temperatures from 30 to 70 ° C and, in the second stage, the product obtained in the first stage is saccharified. This saccharification is performed with sulfuric acid at a concentration of 20 to 60% at temperatures of 40 to 100 ° C.

Reyes e colaboradores descreveram no trabalho, intilulado "Hidrólise enzimática de casca de arroz utilizando-se celulases. Os efeitos de tratamentos químicos 10 e fotoquímicos", publicado na Quim. Nova em 1998, 21,2, a hidrólise enzimática da casca de arroz utilizando um preparado de celulase comercial. Os resultados mostraram que o pré-tratamento com clorito de sódio e luz inibe o processo de hidrólise enzimática, enquanto que com o 15 peróxido de hidrogênio e o ozônio favoreceu a produção enzimática de açúcares redutores, sendo de 5,9 e 54,9%, respectivamente.Reyes and colleagues described in their work, intilulated "Enzymatic hydrolysis of rice husk using cellulases. The effects of chemical and photochemical treatments", published in Quim. New in 1998, 21.2, enzymatic hydrolysis of rice husk using a commercial cellulase preparation. The results showed that pretreatment with sodium and light chlorite inhibits the enzymatic hydrolysis process, while with hydrogen peroxide and ozone it favored the enzymatic production of reducing sugars, being 5.9 and 54.9%. respectively.

O pedido de patente brasileiro PI 9200100-9 depositado em 15 de janeiro de 1992 em nome de U.S. Department of 20 Energy e intitulado "Processo para sacarificação e fermentação simultâneas" descreve um processo para produzir etanol a partir da biomassa em que o substrato inclui um hidrolisado de celulose, hemicelulose e amido, visando produzir açúcares fermentáveis de seis carbonos. Para a fermentação é utilizada uma cepa de levedura geneticamente modificada (Brettanomyces custersii CBS 5512) que produz a enzima B-glucosidade, o que torna esta levedura com habilidade de fermentar tanto glicose quanto celobiose.Brazilian patent application PI 9200100-9 filed January 15, 1992 in the name of the US Department of 20 Energy entitled "Process for Simultaneous Saccharification and Fermentation" describes a process for producing ethanol from biomass in which the substrate includes a hydrolyzate of cellulose, hemicellulose and starch to produce fermentable sugars of six carbons. Fermentation uses a genetically modified yeast strain (Brettanomyces custersii CBS 5512) that produces the enzyme B-glucosity, which makes this yeast capable of fermenting both glucose and cellobiose.

O pedido de patente brasileiro PI 0408165-0,Brazilian patent application PI 0408165-0,

depositado em 08 de março de 2004 em nome de Athenix Corporation e intitulado "Processos para melhorar a atividade das enzimas de degradação de lignocelulose" descreve um método para hidrolisar materiais 10 lignocelulósicos para a obtenção de açúcares, além disso, utiliza um pré-tratamento químico com condições de temperatura (10-90°C) e pressão (2 atm) . Nesta invenção o pré-tratamento é realizado com peróxido de hidrogênio, hipoclorito de cálcio da biomassa de palha de milho. Ao 15 utilizar a biomassa pré-tratada com peróxido de hidrogênio e com a celulase T.Iongibrachiatum (25mg) durante 24h a 65°C, o rendimento foi de 47%. No referido documento PI 0408165-0, ao utilizar a enzima Spezyme (0,3mL para 0,2g de biomassa) o rendimento obtido foi de 71,9% em 24 horas de 20 reação, e sem prévio pré-tratamento o rendimento foi de 32,8%. Além disso, os autores descrevem que a partir do material hidrolisado eles podem produzir de uma forma geral um combustível, um fármaco, um ácido orgânico, um ácido lático, uma enzima industrial e um aminoácido. Na presente invenção podem-se obter todos estes produtos, no entanto foi enfatizada a formação de combustível etanol. Além disso, na presente invenção foram realizados diferentes pré-tratamentos químicos.filed March 8, 2004 on behalf of Athenix Corporation entitled "Processes for Improving Lignocellulose Degradation Enzyme Activity" describes a method for hydrolyzing lignocellulosic materials to obtain sugars and utilizes a chemical pretreatment. with temperature (10-90 ° C) and pressure (2 atm) conditions. In this invention the pretreatment is performed with hydrogen peroxide, calcium hypochlorite from maize straw biomass. By using the hydrogen peroxide pretreated biomass and T.Iongibrachiatum cellulase (25mg) for 24h at 65 ° C, the yield was 47%. In PI 0408165-0, when using the enzyme Spezyme (0.3mL to 0.2g of biomass) the yield obtained was 71.9% in 24 hours of reaction, and without previous pretreatment the yield was 32.8%. Furthermore, the authors describe that from hydrolyzed material they can generally produce a fuel, a drug, an organic acid, a lactic acid, an industrial enzyme and an amino acid. In the present invention all these products can be obtained, however the formation of ethanol fuel has been emphasized. Furthermore, in the present invention different chemical pretreatments were performed.

No estado da técnica já é bem descrito diversos pré-In the state of the art, several pre-

tratamentos químicos ou físicos, mas cada material lignocelulósico se comporta de forma distinta com os pré- tratamentos devido ao seu teor de lignina, celulose e hemicelulose. Portanto, na presente invenção foram 10 realizados diferentes pré-tratamentos com uma única substância ou em combinações, por exemplo: hidróxido de sódio (5%) sob refluxo de 2 horas; ácido sulfúrico (5%) sob refluxo de 2 horas; combinação de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico; combinação do hidróxido de sódio com o 15 hipoclororito de sódio e peróxido de hidrogênio; combinação do hidróxido de sódio com vinagre ou ácido acético e peróxido de hidrogênio. Aqui se pode incluir o hidróxido de sódio 3% e a explosão a vapor pura ou em combinação com hidróxido de sódio.chemical or physical treatments, but each lignocellulosic material behaves differently with pretreatments due to its lignin, cellulose and hemicellulose content. Therefore, in the present invention different pretreatments were performed with a single substance or in combinations, for example: sodium hydroxide (5%) under reflux of 2 hours; sulfuric acid (5%) at reflux for 2 hours; combination of sodium hydroxide and sulfuric acid; combination of sodium hydroxide with sodium hypochlorite and hydrogen peroxide; combination of sodium hydroxide with vinegar or acetic acid and hydrogen peroxide. This may include 3% sodium hydroxide and pure steam explosion or in combination with sodium hydroxide.

É importante ressaltar que na presente invenção oIt is important to note that in the present invention the

rendimento em glicose com NaOH (3%) em 2 horas de refluxo e com 0,03mL das enzimas NS 22074 (complexo celulósico-β- glucosidase, xilanase) e NS 50012 ( complexo celulósico - arabinase, hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase) para cada 0,2 g de material pré-tratado foi de 85% em 48 horas de reação em shaker a 50°C. Ao realizar a hidrólise da amostra com explosão a vapor o rendimento foi de 51%, e quando foi realizado a combinação com hidróxido de sódio e 5 explosão a vapor o rendimento foi de 71,5%, enquanto que na invenção presente no documento PI 0408165-0 foram necessários 0,3 mL da enzima Spezyme para obter 71,9% de rendimento em glicose. Já é descrito também no estado da técnica que para hidrolisar o material lignocelulósico é 10 necessário utilizar celulase. Portanto nota-se que a presente invenção é diferente da descrito no pedido de patente brasileiro PI 0408165-0 que utiliza as seguintes enzimas Spezyme (0,3mL) e T. Longibhachiatum (25mg). Além de serem enzimas diferentes a quantidade usada no pedido de 15 patente brasileiro PI 0408165-0 foi superior a quantidade utilizada na presente invenção. Ademais, o pré-tratamento com hidróxido de sódio demonstrou ser melhor que o do hipoclorito de sódio, e no caso da presente invenção não foi necessário utilizar pressão e temperaturas elevadas ao 20 realizar a reação com hipoclorito de sódio, foram menores que na condição ótima obtida no pedido de patente brasileiro PI 0408165-0 e, finalmente, salienta-se que o substrato pseudocaule de bananeira da presente invenção é diferente dos materiais lignocelulósicos empregados no documento do pedido de patente brasileiro PI 0408165-0.glucose yield with 2% NaOH (2%) at reflux and 0.03mL of the enzymes NS 22074 (cellulosic complex β-glucosidase, xylanase) and NS 50012 (cellulosic complex - arabinase, hemicellulase, cellulase, pectinase and xylanase) for each 0.2 g of pretreated material was 85% within 48 hours of shaker reaction at 50 ° C. Hydrolysis of the steam blast sample yielded 51%, and when combined with sodium hydroxide and steam blast the yield was 71.5%, whereas in the invention present in PI 0408165 -0 0.3 mL of Spezyme enzyme was required to obtain 71.9% glucose yield. It is also described in the prior art that to hydrolyze the lignocellulosic material it is necessary to use cellulase. It is therefore noted that the present invention is different from that described in Brazilian patent application PI 0408165-0 which uses the following enzymes Spezyme (0.3mL) and T. Longibhachiatum (25mg). In addition to being different enzymes the amount used in Brazilian patent application PI 0408165-0 was greater than the amount used in the present invention. Moreover, pretreatment with sodium hydroxide proved to be better than that of sodium hypochlorite, and in the case of the present invention it was not necessary to use high pressure and temperatures when performing the reaction with sodium hypochlorite, were lower than in the optimum condition. obtained from Brazilian patent application PI 0408165-0 and, finally, it is noted that the banana pseudostem substrate of the present invention is different from the lignocellulosic materials employed in Brazilian patent application document PI 0408165-0.

O pedido de patente brasileiro PI 0802559-2, depositado em 07 de julho de 2008 em nome Universidade Estadual de Campinas - Unicamp e intitulado "Processo de pré-tratamento e hidrólise de biomassa vegetal lignocelulósica, e produto para a produção industrial de álcoois" descreve processos de pré-tratamento e hidrólise de biomassa vegetal. O produto obtido pelo referido processo é substancialmente útil como insumo na produção industrial de etanol e/ou outros álcoois. Em um aspecto preferencial, o processo da invenção proporciona um processo compreendendo as etapas de: a) Pré-tratamento da biomassa vegetal lignocelulósica com uma solução de peróxido de hidrogênio alcalino; e b) Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada utilizando misturas compreendendo celulases, glicosidases, hemicelulases, ou combinações das mesmas. Opcionalmente, o referido processo adicionalmente compreende uma etapa de fermentação dos carboidratos produzidos nas etapas anteriores, proporcionando a produção de etanol e/ou outros álcoois.Brazilian patent application PI 0802559-2, filed July 7, 2008 in the name of Universidade Estadual de Campinas - Unicamp and entitled "Pretreatment and hydrolysis process of lignocellulosic plant biomass, and product for the industrial production of alcohols" describes pre-treatment processes and hydrolysis of plant biomass. The product obtained by said process is substantially useful as an input in the industrial production of ethanol and / or other alcohols. In a preferred aspect, the process of the invention provides a process comprising the steps of: a) pre-treating the lignocellulosic plant biomass with an alkaline hydrogen peroxide solution; and b) Enzymatic hydrolysis of the pretreated biomass using mixtures comprising cellulases, glycosidases, hemicellulases, or combinations thereof. Optionally, said process further comprises a fermentation step of the carbohydrates produced in the previous steps, providing the production of ethanol and / or other alcohols.

A presente invenção usa somente o hidróxido de sódio (3%) em 2h de reação enquanto que o pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 utiliza 7,35% de peróxido de hidrogênio e mais a quantidade de base para atingir o pH 11,5, não foi citado no referido documento PI 0802559-2 a concentração necessária para realizar este processo. O rendimento em glicose obtido pela presente invenção foi de 85% em 48 horas de reação com apenas 0,03 mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 para cada 0,2 gramas de substrato. Enquanto o pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 obteve 84% de rendimento em glicose. Além disso, a presente invenção emprega um material lignocelulósico pseudocaule de bananeira, enquanto que o pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 emprega bagaço e/ou palha de cana. As enzimas utilizadas no pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 não foram definidas e muito menos quais foram utilizadas e sim que são uma celulase, β-glicosidase, hemicelulase ou combinação destas e a quantidade é muito maior em relação ao que foi utilizada na presente invenção.The present invention uses only sodium hydroxide (3%) in 2h reaction whereas Brazilian patent application PI 0802559-2 uses 7.35% hydrogen peroxide plus the base amount to reach pH 11.5. , the concentration required to carry out this process was not cited in said document PI 0802559-2. The glucose yield obtained by the present invention was 85% within 48 hours of reaction with only 0.03 ml of the NS 22074 and NS 50012 enzyme mix for each 0.2 grams of substrate. While Brazilian patent application PI 0802559-2 obtained 84% glucose yield. In addition, the present invention employs a banana pseudostem lignocellulosic material, while Brazilian patent application PI 0802559-2 employs sugarcane bagasse and / or straw. The enzymes used in Brazilian patent application PI 0802559-2 have not been defined, let alone which ones have been used, but which are a cellulase, β-glycosidase, hemicellulase or combination thereof and the amount is much higher than that used in the present. invention.

O pedido de patente brasileiro PI 0608369-2, depositado em 14 de março de 2006 em nome de Novozymes North America, INC e intitulado "Processo para a produção de um produto de fermentação a partir de material 20 lignocelulósico" fornece um processo de produção de um produto de fermentação que compreende as etapas de i) pré- tratar o material lignocelulósico para a liberação ou separação de celulose, hemicelulose e/ou lignina, ii) submeter o material pré-tratado a uma celulase, iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação, em que a xilose isomerase é adicionada na etapa ii) e/ou etapa iii) . A presente invenção utiliza hidróxido de sódio (3%) em 2h de reação posterior a reação de explosão a vapor, o 5 que auxilia na remoção de algum interferente que se forma durante a explosão a vapor, o qual não é desejável para a fermentação e posteriormente obtenção de etanol. Além disso, os pré-tratamentos revelados na presente invenção resultaram no aumento do rendimento de glicose de 51% para 10 71,5 % com apenas 0,03 mL de enzima, sendo que se utilizou as enzimas NS 22074 (complexo celulósico-p-glucosidase, xilanase) e NS 50012 (complexo celulósico- arabinase, β- glucanase, hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase). Enquanto, o pedido de patente brasileiro PI 0608369-2 15 utiliza as enzimas Novozym 188 e celullast 1.5L ou viscozyme e utiliza aproximadamente 0,5 mL de enzima. Ademais, o uso de ácido já está bem descrito que forma interferentes tais como o HMF que dificultará a etapa de fermentação caindo assim o rendimento.Brazilian patent application PI 0608369-2, filed March 14, 2006 on behalf of Novozymes North America, INC entitled "Process for the Production of a Fermentation Product from Lignocellulosic Material" provides a process for the production of a fermentation product comprising the steps of i) pretreating the lignocellulosic material for the release or separation of cellulose, hemicellulose and / or lignin, ii) subjecting the pretreated material to a cellulase, iii) fermenting in the presence of a fermentation organism, wherein xylose isomerase is added in step ii) and / or step iii). The present invention utilizes sodium hydroxide (3%) in 2h reaction after steam explosion reaction, which aids in the removal of any interferent that forms during steam explosion which is undesirable for fermentation and later obtaining ethanol. In addition, the pretreatments disclosed in the present invention resulted in an increase in glucose yield from 51% to 10 71.5% with only 0.03 ml of enzyme, using enzymes NS 22074 (cellulosic complex-p-1). glucosidase, xylanase) and NS 50012 (cellulosic arabinase complex, β-glucanase, hemicellulase, cellulase, pectinase and xylanase). Meanwhile, Brazilian patent application PI 0608369-2 15 uses the enzymes Novozym 188 and celullast 1.5L or viscozyme and uses approximately 0.5 ml enzyme. In addition, the use of acid is already well described which forms interferers such as HMF that will make the fermentation stage difficult, thus decreasing the yield.

Como já vem sendo descrito no estado da técnica, umAs already described in the prior art, a

grande grupo de pesquisadores vem estudando formas de produzir etanol a partir de materiais lignocelulósicos. Assim, para que este processo se torne possivel, é necessário que o pré-tratamento fisico ou quimico seja economicamente viável, bem como a enzima a ser utilizada como catalisador. Atualmente, vem sendo estudada diferentes enzimas (celulases, hemicelulases) e a busca de novos catalisadores que proporcionem a hidrólise do material lignocelulósico com maiores rendimentos e um custo menor.A large group of researchers has been studying ways to produce ethanol from lignocellulosic materials. Thus, for this process to become possible, it is necessary that the physical or chemical pretreatment be economically viable, as well as the enzyme to be used as a catalyst. Currently, different enzymes (cellulases, hemicellulases) are being studied and the search for new catalysts that provide hydrolysis of lignocellulosic material with higher yields and lower cost.

Como pode ser observado nenhum documento do estado da técnica descreve ou sugere um processo de hidrólise enzimática do pseudocaule de bananeira com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 e diferentes pré-tratamentos para a produção de bioetanol.As can be seen no prior art document describes or suggests an enzymatic hydrolysis process of banana pseudostem with the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 and different pretreatments for bioethanol production.

Sumário da InvençãoSummary of the Invention

Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos processos para a produção de bioetanol 15 utilizando pré-tratamento químico do pseudocaule de bananeira seguido da hidrólise enzimática com enzimas comerciais, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.To solve the aforementioned problems, the present invention will provide significant advantages over bioethanol production processes using chemical pretreatment of banana pseudostem followed by enzymatic hydrolysis with commercial enzymes, enabling an increase in their performance and having a relationship most favorable cost / benefit ratio.

0 processo da presente invenção baseia-se no pré- tratamento químico do pseudocaule de bananeira seguido da hidrólise enzimática utilizando enzimas comerciais, tais como a NS 22074 e NS 50012 para a obtenção de açúcares fermentáveis para posteriormente formação do bioetanol.The process of the present invention is based on the chemical pretreatment of banana pseudostem followed by enzymatic hydrolysis using commercial enzymes such as NS 22074 and NS 50012 to obtain fermentable sugars for further bioethanol formation.

No estado da técnica já é bem descrito diversos pré- tratamentos químicos ou físicos, mas cada material lignocelulósico se comporta de forma distinta com os pré- tratamentos, visto que a composição da biomassa varia de acordo com sua origem vegetal (teor de lignina, celulose e hemicelulose) e a forma que estes estão associados.Several chemical or physical pretreatments are well described in the prior art, but each lignocellulosic material behaves differently with the pretreatments, since the composition of biomass varies according to its plant origin (lignin content, cellulose and hemicellulose) and the way they are associated.

Apesar dos documentos citados no estado da técnica revelarem pré-tratamentos de biomassa lignocelulósico e a produção de etanol a partir de material lignocelulósico e/ou diferentes meios de cultura, o método ou processo 10 utilizado na presente invenção é inovador, pois nenhum dos processos citados no estado da técnica, descreve a tecnologia de pré-tratamento do pseudocaule de bananeira, empregando hidróxido de sódio (5%) sob refluxo de 2 horas ou hidróxido de sódio (3%) sob refluxo de 2 horas; ácido 15 sulfúrico (5%) sob refluxo de 2 horas; combinação de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico; combinação do hidróxido de sódio com o hipoclororito de sódio e peróxido de hidrogênio; combinação do hidróxido de sódio com vinagre ou ácido acético e peróxido de hidrogênio e explosão a 20 vapor durante 8 minutos a 2000C seguido de hidróxido de sódio 3% durante 2 horas de refluxo.Although prior art documents disclose pre-treatments of lignocellulosic biomass and ethanol production from lignocellulosic material and / or different culture media, the method or process used in the present invention is innovative, as none of the above processes in the prior art describes the banana pseudostem pre-treatment technology employing sodium hydroxide (5%) under 2 hour reflux or sodium hydroxide (3%) under 2 hour reflux; sulfuric acid (5%) under reflux for 2 hours; combination of sodium hydroxide and sulfuric acid; combination of sodium hydroxide with sodium hypochlorite and hydrogen peroxide; Combination of sodium hydroxide with vinegar or acetic acid and hydrogen peroxide and explosion at 20 ° C steam for 8 minutes at 2000 ° C followed by 3% sodium hydroxide for 2 hours at reflux.

0 processo da presente invenção é bastante versátil, pois proporciona a seleção do melhor pré-tratamento a ser aplicado para pseudocaule de bananeira. Além disso, os processos empregados na presente invenção mostraram através de análises de HPLC que o principal açúcar fermentável formado é a sacarose e que não há geração de compostos que são inibitórios nas etapas posteriores.The process of the present invention is quite versatile as it provides the selection of the best pretreatment to be applied to banana pseudostem. In addition, the processes employed in the present invention have shown by HPLC analysis that the major fermentable sugar formed is sucrose and that there are no compounds that are inhibitory in later steps.

Descrição Detalhada da InvençãoDetailed Description of the Invention

Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, é mostrada nas tabelas e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser 10 considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.Although the present invention may be susceptible to different embodiments, it is shown in the tables and the following detailed discussion, a preferred embodiment with the understanding that the present embodiment should be considered an exemplification of the principles of the invention and is not intended to limit the present invention to the present invention. which has been illustrated and described here.

A presente invenção descreve um método de melhorar a degradação do material lignocelulósico utilizando o pré- 15 tratamento químico, bem como aumentar o rendimento de açúcares fermentáveis na hidrólise enzimática com a mistura das celulases comerciais NS 22074 e NS 50012 para posterior produção de etanol.The present invention describes a method of improving degradation of lignocellulosic material using chemical pretreatment, as well as increasing the yield of fermentable sugars in enzymatic hydrolysis with the blending of commercial cellulases NS 22074 and NS 50012 for further ethanol production.

A presente invenção se refere à avaliação da percentagem de conversão em açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa necessária para produzir açúcares fermentáveis visando à produção de etanol.The present invention relates to the evaluation of the percentage conversion to fermentable sugars and the amount of biomass required to produce fermentable sugars for ethanol production.

Outro diferencial da presente ivenção é que emprega a principal enzima para uso na hidrólise de lignocelulósicos a NS 22074 (complexo celulósico-p-glucosidase, xilanase) e o efeito desta enzima é potencializado com a adição da enzima NS 50012 (complexo celulósico - arabinase, hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase).Another advantage of the present invention is that it employs the main enzyme for use in the hydrolysis of lignocelluloses to NS 22074 (cellulosic complex-p-glucosidase, xylanase) and the effect of this enzyme is enhanced by the addition of the enzyme NS 50012 (cellulosic complex - arabinase, hemicellulase, cellulase, pectinase and xylanase).

A presente invenção apresenta diversas vantagens emThe present invention has several advantages over

relação ao estado da técnica, tais como praticidade, elevada hidrólise enzimática do pseudocaule de bananeira, proporcionando bons rendimentos de açúcares redutores e assim, possibilitando bons rendimentos na produção de etanol.In relation to the state of the art, such as practicality, high enzymatic hydrolysis of banana pseudostem, providing good yields of reducing sugars and thus enabling good yields in ethanol production.

O processo revelado pela presente invenção utiliza um substrato altamente sustentável, por se tratar de um rejeito, o que viabiliza a produção de etanol a partir deste material lignocelulósico.The process disclosed by the present invention uses a highly sustainable substrate, as it is a tailings, which enables the production of ethanol from this lignocellulosic material.

A presente invenção revela diferentes pré-tratamentosThe present invention reveals different pre-treatments.

para avaliar qual o mais adequado para a biomassa de pseudocaule de bananeira, onde o tratamento com hidróxido de sódio (3%) em refluxo é melhor que aos descritos no estado da técnica, inclusive melhor que o hipoclorito de sódio.to evaluate which one is most suitable for banana pseudostem biomass, where the treatment with refluxing sodium hydroxide (3%) is better than those described in the state of the art, even better than sodium hypochlorite.

Outro aspecto da presente invenção é que a condição reacional descrita no processo da presente invenção não foi relatada no estado da técnica. Nenhum dos métodos de pré- tratamento, descrito no estado da técnica utilizam as mesmas combinações de reagentes e equipamentos, tais como o banho de ultrassom utilizado no processo da presente invenção. Visto que, no estado da técnica a biomassa estudada é o bagaço de cana ou palha de trigo, a presente 5 invenção tem relevância ao utilizar o pseudocaule de bananeira como uma biomassa lignocelulósica alternativa, abundantemente gerada no setor agrícola, para produção de bioetanol de segunda geração.Another aspect of the present invention is that the reaction condition described in the process of the present invention has not been reported in the prior art. None of the pretreatment methods described in the prior art use the same combinations of reagents and equipment as the ultrasonic bath used in the process of the present invention. Since, in the state of the art, the studied biomass is sugarcane bagasse or straw, the present invention has relevance when using banana pseudostem as an alternative lignocellulosic biomass, abundantly generated in the agricultural sector, for the production of second bioethanol. generation.

Além disso, a presente invenção obteve 85% de 10 rendimento em açúcares fermentáveis com uma quantidade mínima de enzima, muito inferior ao que vem sendo descrito no estado da técnica e, outro aspecto importante é que a biomassa da presente invenção está isenta de interferentes que afetam a fermentação, devido ao tratamento com 15 hidróxido de sódio que foi utilizado, além da ausência de xilose e a presença de sacarose como o principal açúcar redutor formado.In addition, the present invention has obtained 85% yield of fermentable sugars with a minimal amount of enzyme, much lower than that described in the prior art, and another important aspect is that the biomass of the present invention is free of interfering substances. affect fermentation due to the treatment with sodium hydroxide that was used, in addition to the absence of xylose and the presence of sucrose as the main reducing sugar formed.

As enzimas usadas no processo da presente invenção são diferentes das descritas no estado da técnica, apesar de serem celulase, hemicelulase β -glicosidase, a origem delas são distintasThe enzymes used in the process of the present invention are different from those described in the prior art, although they are cellulase, β-glycosidase hemicellulase, their origin are distinct.

Inicialmente, o pseudocaule de bananeira caturra {in natura) foi lavado com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente foi colocado em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. Após a secagem o pseudocaule de bananeira foi moido em moinho do tipo Willye, modelo MA680, com peneira de 30 mesh e armazenados em sacos plásticos para posteriormente realizar 5 os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática (este material lavado é chamado a partir desta etapa de biomassa), descrito no pedido de patente brasileiro PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade.Initially, the banana caturra (fresh) pseudostem was washed with running water about 3 times to remove the dirt and the resin, then placed in an oven at 60 ° C for drying. After drying the banana pseudostem was ground in a Willye model MA680 mill with a 30 mesh sieve and stored in plastic bags for subsequent chemical treatments and enzymatic hydrolysis (this washed material is called from this stage. biomass), described in Brazilian patent application PI 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety.

Posteriormente foram realizados diferentes tratamentosLater different treatments were performed

químicos, tais como: com o hidróxido de sódio puro ou em combinação com o hipoclorito de sódio e o peróxido de hidrogênio, com o hidróxido de sódio em combinação com o ácido acético ou o vinagre e peróxido de hidrogênio; e a combinação de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico.chemicals such as: pure sodium hydroxide or in combination with sodium hypochlorite and hydrogen peroxide, with sodium hydroxide in combination with acetic acid or vinegar and hydrogen peroxide; and the combination of sodium hydroxide and sulfuric acid.

Além desses pré-tratamentos foi realizada a explosão a vapor em combinação com o hidróxido de sódio; os resultados desta presente invenção foram comparados com os resultados obtidos com a combinação de hidróxido de sódio e ácido 20 peracético, pré-tratamento descrito no pedido de patente brasileiro PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade.In addition to these pre-treatments, a steam explosion was performed in combination with sodium hydroxide; The results of this invention were compared to the results obtained with the combination of sodium hydroxide and peracetic acid, pretreatment described in Brazilian patent application PI 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety.

0 pré-tratamento com hidróxido de sódio foi realizado adicionando IOg da biomassa de pseudocaule de bananeira em um balão de fundo redondo e 200 mL de uma solução de hidróxido de sódio (5% m/v) ou (3% m/v) , está mistura foi mantida em refluxo por 2 horas. Ao término deste período filtrou-se a solução e o sólido remanescente foi lavado com 5 água destilada. 0 sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60°C. Após a sua secagem o material foi moído, e realizado a hidrólise enzimática.Pretreatment with sodium hydroxide was performed by adding 10g of the banana pseudostem biomass in a round bottom flask and 200 ml of a (5% w / v) or (3% w / v) sodium hydroxide solution. This mixture was refluxed for 2 hours. At the end of this period the solution was filtered and the remaining solid was washed with distilled water. The collected solid was placed in the steam oven until its drying at a temperature of approximately 60 ° C. After drying the material was ground and enzymatic hydrolysis was performed.

0 tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura ácido acético e peróxido de hidrogênio foi realizado adicionando IOg da biomassa de pseudocaule de bananeira em um erlenmeyer e 100 mL de uma solução de hidróxido de sódio (0,1M), está mistura foi agitada em agitador magnético porTreatment with sodium hydroxide followed by the mixture of acetic acid and hydrogen peroxide was performed by adding 10g of the banana pseudostem biomass in an erlenmeyer and 100 ml of a sodium hydroxide solution (0.1M), this mixture was stirred on a shaker. magnetic by

1 hora a temperatura de 70°C ou em banho de ultra-som a temperatura fixa de 60°C.1 hour at a temperature of 70 ° C or in an ultrasonic bath at a fixed temperature of 60 ° C.

Após este período adicionou-se na mistura reacional uma solução de ácido acético e peróxido de hidrogênio (30%, sendo 40% de ácido acético (12mL) em peróxido de hidrogênio (18 mL) ) (IOOmL) o restante do volume foi completado com 20 água destilada. Está mistura reacional foi agitada por 6 horas a temperatura de 70°C ou em outro experimento no banho de ultra-som a temperatura fixa de 60°C. Ao término deste período filtrou-se a mistura reacional e regulou o pH para 4-5, lavando com água destilada, o material sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem. Posteriormente, o material seco foi macerado e armazenado em frascos para posterior hidrólise enzimática.After this period, a solution of acetic acid and hydrogen peroxide (30%, 40% of acetic acid (12mL) in hydrogen peroxide (18 mL)) (100mL) was added to the reaction mixture. 20 distilled water. This reaction mixture was stirred for 6 hours at 70 ° C or in another experiment in the fixed temperature ultrasound bath at 60 ° C. At the end of this period the reaction mixture was filtered and the pH adjusted to 4-5, washing with distilled water, the collected solid material was placed in the steam oven until drying. Subsequently, the dried material was macerated and stored in flasks for later enzymatic hydrolysis.

0 tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura vinagre e peróxido de hidrogênio foi realizado adicionando IOg da biomassa pseudocaule de bananeira em um erlenmeyer e 100 mL de uma solução de NaOH (0,1M), a mistura reacional foi agitada por lhora em agitador magnético a temperatura de 70°C. Após este periodo adicionou-se na mistura reacional uma solução de vinagre de maçã (marca Rosina) e peróxido de hidrogênio (30%, sendo 40% de vinagre (12mL) em peróxido de hidrogênio (18 mL) ) (IOOmL) o restante do volume foi completado com água destilada. Está mistura reacional foi agitada em agitador magnético por 7 horas a temperatura de 70°C. Ao término deste período filtrou-se a mistura reacional e, lavou com água destilada, até regular o pH entre 4-5. Após o sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60°C. Posteriormente, o material seco foi triturado e armazenado para posterior hidrólise enzimática.Treatment with sodium hydroxide followed by the vinegar and hydrogen peroxide mixture was performed by adding 10g of the banana pseudostem biomass in a conical flask and 100 ml of a 0.1M NaOH solution, the reaction mixture was stirred for one hour on a magnetic stirrer. at a temperature of 70 ° C. After this period, a solution of apple vinegar (Rosina brand) and hydrogen peroxide (30%, 40% vinegar (12mL) in hydrogen peroxide (18 mL)) (100mL) was added to the reaction mixture. The volume was completed with distilled water. This reaction mixture was stirred on a magnetic stirrer for 7 hours at 70 ° C. At the end of this period the reaction mixture was filtered and washed with distilled water until the pH was adjusted to 4-5. After the collected solid was placed in the steam oven until its drying at a temperature of approximately 60 ° C. Subsequently, the dried material was ground and stored for later enzymatic hydrolysis.

0 tratamento com o ácido sulfúrico foi realizado adicionando IOg de biomassa em um balão de fundo redondo e 200 mL de uma solução de ácido sulfúrico (5%) (v/v) , a mistura reacional foi mantida por 2 horas sob refluxo. Ao término deste período filtrou-se a mistura reacional e, lavou o sólido com água destilada, o material sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60°C. Posteriormente, o 5 material seco foi triturado e armazenado em frascos para posterior hidrólise enzimática.Sulfuric acid treatment was carried out by adding 10 g of biomass in a round bottom flask and 200 mL of a 5% (v / v) sulfuric acid solution, the reaction mixture was kept for 2 hours under reflux. At the end of this period the reaction mixture was filtered and the solid was washed with distilled water, the collected solid material was placed in a steam oven until drying at a temperature of approximately 60 ° C. Subsequently, the dried material was ground and stored in flasks for further enzymatic hydrolysis.

0 tratamento com explosão a vapor foi realizado a temperatura de 200°C por 8 minutos, posteriormente foi pesado IOg da biomassa pré-tratada por explosão a vapor em 10 um balão de fundo redondo e 200 mL de uma solução de hidróxido de sódio (3%)(v/v), a mistura reacional foi mantida por 2 horas sob refluxo. Ao término deste período filtrou-se a mistura reacional e, o sólido foi lavado com água destilada, o material sólido coletado foi colocado na 15 estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60°C. Posteriormente, o material seco foi triturado e armazenado em frascos para posterior hidrólise enzimática.Steam blast treatment was carried out at 200Â ° C for 8 minutes, then 10 g of steam blast pretreated biomass was weighed into a round bottom flask and 200 ml of sodium hydroxide solution (3 %) (v / v), the reaction mixture was kept for 2 hours under reflux. At the end of this period the reaction mixture was filtered and the solid was washed with distilled water, the collected solid material was placed in the steam oven until drying at a temperature of approximately 60 ° C. Subsequently, the dried material was ground and stored in flasks for further enzymatic hydrolysis.

Para realizar a hidrólise enzimática foi utilizado 20 0,lg de biomassa pré-tratada, 0,03 mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, 5 mL de tampão acetato de sódio pH = 4,8. A mistura foi deixada em banho de ultra-som em temperatura fixa de 60°C durante 4 horas. Os resultados de percentagem de açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa necessária para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis estão apresentados na Tabela 1.To perform the enzymatic hydrolysis, 20.1 g of pretreated biomass, 0.03 ml of the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012, 5 ml of sodium acetate buffer pH = 4.8 were used. The mixture was left in a fixed temperature ultrasound bath at 60 ° C for 4 hours. The results of percentage of fermentable sugars and the amount of biomass required to produce 1 kg of fermentable sugars are presented in Table 1.

A Tabela 1 mostra a percentagem de açúcares redutores liberada de suspensões de 0,lg de pseudocaule de bananeira 5 com diferentes pré-tratamentos químicos com a mistura das celulases NS 22074 (0f015mL) e NS 50012 (0,015mL) diretamente assistida no banho de ultra-som com a temperatura fixa de 60°C durante 4 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir IKg de açúcares 10 redutores.Table 1 shows the percentage of reducing sugars released from 0.1 pg suspension of banana pseudostem 5 with different chemical pretreatments with the mixture of NS 22074 (0f015mL) and NS 50012 (0.015mL) cellulose directly assisted in the ultra bath. only at a fixed temperature of 60 ° C for 4 hours and the amount of biomass required to produce 10 kg of reducing sugars.

Tabela 1 - Hidrólise enzimática assistida no banho deTable 1 - Assisted enzymatic hydrolysis in the bath of

ultra-som do pseudocaule de bananeira pré-tratado quimicamente com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012. Tratamento químico Rendimento (%) Biomassa necessária para produzir I Kg de açúcares redutores Sem tratamento 19 5.3 kg NaOH/ác.peracético 47 2.1 kg NaOH/ác.acético/H202 45 2.2 Kg NaOH/ác. 33 3.0 kg Acético/H202/üS Na0H/vinagre/H202 47 2.2 Kg NaOH/hipoclorito de 45 2.2 kg sódio/H202 NaOH 51 2.0 kg H2SO4 35 3.0 Kg Na0H/H2S04 47 2.1 Kg Condições reacionais: biomassa (3.3 gramas de biomassa por mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8), banho de ultra-som durante 4 horas de reação a temperatura de 5 60 0C. onde:Ultrasound of the banana pseudostem chemically pretreated with the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012. Chemical treatment Yield (%) Biomass required to produce I Kg of reducing sugars Untreated 19 5.3 kg NaOH / peracetic acid 47 2.1 kg NaOH / acetic acid / H2 O 45 2.2 Kg NaOH / acid. 33 3.0 kg Acetic / H202 / üS Na0H / vinegar / H202 47 2.2 kg NaOH / 45 hypochlorite 2.2 kg sodium / H202 NaOH 51 2.0 kg H2SO4 35 3.0 kg Na0H / H2S04 47 2.1 Kg Reaction conditions: biomass (3.3 grams of biomass per mL of NS 22074 and NS 50012 enzyme mixture, 1:50 biomass / volume of sodium acetate buffer pH = 4.8), ultrasound bath for 4 hours of reaction at 5 60 ° C. Where:

> NaOH/AC. perácetico: Pseudocaule de bananeira tratada com solução de NaOH (0,1M) por 1 hora a temperatura de 70°C seguida do tratamento com ácido peracético (30%)> NaOH / AC. peracetic: Banana pseudostem treated with NaOH solution (0.1M) for 1 hour at 70 ° C followed by treatment with peracetic acid (30%)

realizado a temperatura de 70°C durante 7 horas.performed at 70 ° C for 7 hours.

> NaOH/ác.acético/H202: Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 70°C, seguido do tratamento com a mistura ácido acético e peróxido de hidrogênio durante 6h a 70°C.> NaOH / acetic acid / H202: Banana pseudostem treated with sodium hydroxide for 1 hour at 70 ° C, followed by treatment with the mixture acetic acid and hydrogen peroxide for 6h at 70 ° C.

> NaOH/ác. acético/H202/US: Pseudocaule de bananeira> NaOH / Acid. acetic acid / H202 / US: Banana pseudostem

tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 60°C no banho de ultra-som, seguido do tratamento com a mistura ácido acético e peróxido de hidrogênio durante 6h a 60°C no banho de ultra-somtreated with sodium hydroxide for 1 hour at 60 ° C in the ultrasound bath, followed by treatment with the mixture acetic acid and hydrogen peroxide for 6h at 60 ° C in the ultrasound bath

> Na0H/vinagre/H202: Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 70°C, seguido do tratamento com a mistura vinagre e> Na0H / vinegar / H2O: Banana pseudostem treated with sodium hydroxide for 1 hour at a temperature of 70 ° C, followed by treatment with the vinegar mixture and

peróxido de hidrogênio durante 6h a 70°C.hydrogen peroxide for 6h at 70 ° C.

> NaOH/hipoclorito de sódio/H202: Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 70°C, seguido do tratamento com a mistura de hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio durante 6h a> NaOH / Sodium hypochlorite / H202: Banana pseudostem treated with sodium hydroxide for 1 hour at 70 ° C, followed by treatment with the mixture of sodium hypochlorite and hydrogen peroxide for 6h at

70 0C.70 ° C.

> NaOH: Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio (5%) durante 2 horas sob refluxo.> NaOH: Banana pseudostem treated with sodium hydroxide (5%) for 2 hours under reflux.

> H2SO4: Pseudocaule de bananeira tratada com ácido sulfúrico (5%) durante 2 horas sob refluxo.> H2SO4: Banana pseudostem treated with sulfuric acid (5%) for 2 hours under reflux.

> Na0H/H2S04: Pseudocaule de bananeira tratada com> Na0H / H2S04: Banana pseudostem treated with

hidróxido de sódio (5%) durante 2 horas sob refluxo seguido do tratamento com ácido sulfúrico (5%) durante 2 horas sob refluxo.sodium hydroxide (5%) for 2 hours under reflux followed by treatment with sulfuric acid (5%) for 2 hours under reflux.

A partir dos resultados obtidos na Tabela 1, a presenteFrom the results obtained in Table 1, the present

invenção mostra que ao utilizar o pré-tratamento com hidróxido de sódio (5%), a conversão em açúcares fermentáveis foi de 51%, este resultado foi melhor que ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético (sendo que este pré-tratamento foi desenvolvido no pedido de patente PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade), no entanto para comparar os pré-tratamentos, realizou a hidrólise enzimática nas mesmas condições reacionais, descrita nesta invenção.The invention shows that when using sodium hydroxide pretreatment (5%), the conversion to fermentable sugars was 51%, this result was better than using sodium hydroxide pretreated biomass followed by peracetic acid (being that this pretreatment was developed in patent application PI 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety), however to compare the pretreatments, performed the enzymatic hydrolysis under the same reaction conditions as described in this invention.

Neste caso ao utilizar o pré-tratamento com hidróxido de sódio as quantidades de enzima e de biomassa necessárias para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis foram menores em relação ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético.In this case, when using sodium hydroxide pretreatment, the amounts of enzyme and biomass needed to produce 1 kg of fermentable sugars were lower than when using sodium hydroxide pretreated biomass followed by peracetic acid.

Além disso, o custo do pré-tratamento químico com hidróxido de sódio é menor em comparação ao utilizar a mistura hidróxido de sódio e ácido peracético, mostrando que o pré-tratamento com hidróxido de sódio é melhor e economicamente mais viável e eficiente.In addition, the cost of chemical sodium hydroxide pretreatment is lower compared to using the sodium hydroxide and peracetic acid mixture, showing that sodium hydroxide pretreatment is better and more economically viable and efficient.

Deve se destacar na presente invenção que o pré- tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de vinagre e peróxido de hidrogênio e com a mistura hidróxido de sódio e ácido sulfúrico, a conversão em açúcares 20 fermentáveis foram de aproximadamente 47%, a mesma porcentagem obtida ao realizar a hidrólise enzimática com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético nas mesmas condições reacionais. No entanto estes pré-tratamentos apresentam a vantagem de ser economicamente mais viável que ao utilizar o ácido peracético.It should be noted in the present invention that pretreatment with sodium hydroxide followed by the mixture of vinegar and hydrogen peroxide and the mixture of sodium hydroxide and sulfuric acid, the conversion to fermentable sugars was approximately 47%, the same percentage. obtained by performing enzymatic hydrolysis with sodium hydroxide pretreated biomass followed by peracetic acid under the same reaction conditions. However, these pretreatments have the advantage of being more economically viable than using peracetic acid.

Os resultados mostrados até o presente momento indicam que a conversão em açúcares fermentáveis foi 60% maior em 5 comparação a amostra não pré-tratada ao utilizar a amostra pré-tratada com hidróxido de sódio, dessa forma, este processo torna-se viável para a produção de açúcares fermentáveis.The results shown to date indicate that the conversion to fermentable sugars was 60% higher compared to the untreated sample when using the sodium hydroxide pretreated sample, so this process becomes viable for production of fermentable sugars.

Como descrito na presente invenção, o melhor resultado obtido foi ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) e realizar a hidrólise enzimática assistida em banho de ultra-som.As described in the present invention, the best result obtained was using sodium hydroxide pretreated biomass (5%) and performing assisted enzymatic hydrolysis in an ultrasound bath.

Outro aspecto da presente invenção é realizar a hidrólise enzimática utilizando a biomassa pré-tratada com 15 hidróxido de sódio (5%) (0,lg) ou com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético com pré-tratamento descrito no pedido de patente brasileiro PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade, com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 (0, 03mL), 5 mL de tampão 20 acetato de sódio pH = 4.8, agitar esta mistura em agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50 °C, rpm de 150, durante 4 e 24 horas.Another aspect of the present invention is to perform enzymatic hydrolysis using pre-treated sodium hydroxide (5%) (0.1g) or sodium hydroxide biomass followed by pretreatment peracetic acid described in Brazilian patent application PI 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety, with the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 (0.03mL), 5 mL of sodium acetate buffer pH = 4.8, stir this mixture on a horizontal shaker shaker at 50 ° C, 150 rpm for 4 and 24 hours.

Nesta presente invenção também avaliou a hidrólise enzimática em banho do tipo shaker com a biomassa de pseudocaule de bananeira pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) e estes resultados foram comparados com os obtidos com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético. Estes resultados estão apresentados na Tabela 2.In the present invention also evaluated enzymatic hydrolysis in a shaker bath with sodium hydroxide pretreated banana pseudostem biomass (5%) and these results were compared with those obtained with sodium hydroxide pretreated biomass followed of peracetic acid. These results are presented in Table 2.

A Tabela 2 mostra a percentagem de açúcares redutores liberada de suspensões de 0,lg de pseudocaule de bananeira pré-tratado com hidróxido de sódio (5%) sob refluxo durante 2 horas ou a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio 10 seguido do pré-tratamento com ácido peracético com a mistura das celulases NS 22074 (0,015mL) e NS 50012 (0,015mL) no banho tipo shaker, a temperatura de 50°C e rpm de 150 por 4 e 24 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir IKg de açúcares redutores 15 Tabela 2 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada com o hidróxido de sódio (5%) ou com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 em shaker horizontal.Table 2 shows the percentage of reducing sugars released from 0.1 g suspension of sodium hydroxide pretreated banana pseudostem (5%) under reflux for 2 hours or the 10% sodium hydroxide pretreated biomass followed by -treatment with peracetic acid with the mixture of cellulases NS 22074 (0.015mL) and NS 50012 (0.015mL) in the shaker bath, at 50 ° C and rpm of 150 for 4 and 24 hours and the amount of biomass required to produce IKg of reducing sugars 15 Table 2 - Enzymatic hydrolysis of biomass pretreated with sodium hydroxide (5%) or sodium hydroxide followed by peracetic acid with the mixture of enzymes NS 22074 and NS 50012 in horizontal shaker.

NaOH NaOH/ác. Peracético Tempo Rendimento Biomassa Rendimento Biomassa (h) (%) necessária (%) necessária para para produzir produzir IKg IKg de de açúcares açúcares redutores redutores 4 72 1.5 kg 43 2.3 kg 24 96 1.1 kg 98 1.0 kg Condições reacionais: biomassa pré-tratada quimicamente 3.3g/mL de enzima), 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 5 0 ° C, 150 rpm.NaOH NaOH / Acid. Peracetic Time Yield Biomass Yield Biomass (h) (%) required (%) required to produce produce IKg IKg of sugar reducing sugars 4 72 1.5 kg 43 2.3 kg 24 96 1.1 kg 98 1.0 kg Reaction conditions: pre-treated biomass 3.3 g / mL enzyme), 1:50 biomass / volume of sodium acetate buffer pH = 4.8) shaker bath temperature 50 ° C, 150 rpm.

A partir dos resultados obtidos na Tabela 2, observa-From the results obtained in Table 2, we observed

se que ao realizar a hidrólise enzimática em shaker do tipo horizontal com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio a conversão em açúcares fermentáveis foi de 72% em apenas 4 horas, ou seja, apresentou um rendimento maior em 10 comparação ao utilizar a hidrólise assistida em banho de ultra-som (descrito na Tabela 1) . Além disso, esta percentagem é superior ao descrito na literatura com diferentes substratos lignocelulosicos e em tempo menor.The enzymatic hydrolysis in horizontal shaker with sodium hydroxide pretreated biomass resulted in a 72% conversion to fermentable sugars in just 4 hours, ie, a 10% higher yield compared to using hydrolysis. assisted in an ultrasound bath (described in Table 1). Moreover, this percentage is higher than that described in the literature with different lignocellulosic substrates and in shorter time.

A tabela 2 também mostra que o pré-tratamento com hidróxido de sódio é melhor que o tratamento com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético, pois a conversão em açúcares fermentáveis foi cerca de 40% maior ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio.Table 2 also shows that sodium hydroxide pretreatment is better than sodium hydroxide treatment followed by peracetic acid, since the conversion to fermentable sugars was about 40% higher when using the sodium hydroxide pretreated biomass. sodium.

Cabe salientar aqui, que ao utilizar a biomassa pré- tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético, os resultados de conversão foram melhores quando a reação foi realizada no banho de ultra-som em cerca de 10% em comparação ao ser realizada em shaker, o que comprova os resultados obtidos no pedido de patente PI 1102362-7 e incorporados aqui por referência em sua totalidade.It should be noted here that when using pre-treated sodium hydroxide biomass followed by peracetic acid, conversion results were better when the reaction was performed in the ultrasound bath by about 10% compared to that performed in shaker which confirms the results obtained in patent application PI 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety.

Portanto, a presente invenção mostra que dependendo do pré-tratamento químico, da enzima e das condições reacionais usadas a hidrólise enzimática pode ser mais eficiente com um método ou outro.Therefore, the present invention shows that depending on the chemical pretreatment, the enzyme and the reaction conditions used the enzymatic hydrolysis may be more efficient with one method or another.

O terceiro aspecto da presente invenção é realizar aThe third aspect of the present invention is to perform the

hidrólise enzimática utilizando a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) (0,2g) e comparar os resultados com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético (0,2g)(pré-tratamento descrito no pedido 15 de patente PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade), com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 (0,03mL), 10 mL de tampão acetato de sódio pH = 4.8, agitar esta mistura em agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50°C, rpm de 150, durante 4, 24 e 48 horas. 20 Os resultados da percentagem de açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa necessária para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis estão apresentados na Tabela 3enzymatic hydrolysis using sodium hydroxide pretreated biomass (5%) (0.2g) and compare the results with sodium hydroxide pretreated biomass followed by peracetic acid (0.2g) (pretreatment described in PI patent application 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety), with the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 (0.03mL), 10 mL sodium acetate buffer pH = 4.8, stir this mixture on a shaker horizontal shaker type at 50 ° C, 150 rpm for 4, 24 and 48 hours. The results of the percentage of fermentable sugars and the amount of biomass required to produce 1 kg of fermentable sugars are presented in Table 3.

Nesta presente invenção também deve ressaltar que ao dobrar a quantidade de biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio utilizando a mesma quantidade de enzima. Os resultados foram significativos, pois observou uma redução da enzima necessária para a produção de etanol, estes dados foram comparados com os resultados obtidos com a biomassa 5 pré-tratada com hidróxido de sódio seguido do peróxido de hidrogênio e estão apresentados na Tabela 3.In this present invention it should also be noted that by doubling the amount of biomass pretreated with sodium hydroxide using the same amount of enzyme. The results were significant because they observed a reduction in the enzyme required for ethanol production. These data were compared with the results obtained with biomass 5 pretreated with sodium hydroxide followed by hydrogen peroxide and are presented in Table 3.

A Tabela 3 mostra a percentagem de açúcares redutores liberada de suspensões de 0,2g de pseudocaule de bananeira pré-tratado com hidróxido de sódio (5%) sob refluxo durante 10 2 horas ou pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético com a mistura das celulases NS 22074 (0,015mL) e NS 50012 (0,015mL) no banho tipo shaker, a temperatura de 50°C e rpm de 150 por 4, 24 e 48 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir IKg de 15 açúcares redutores.Table 3 shows the percentage of reducing sugars released from 0.2g suspensions of sodium hydroxide pretreated banana pseudostem (5%) under reflux for 10 hours or pretreatment with sodium hydroxide followed by peracetic acid with the mixture of the NS 22074 (0.015mL) and NS 50012 (0.015mL) cellulases in the shaker bath, the temperature of 50 ° C and 150 rpm for 4, 24 and 48 hours and the amount of biomass required to produce 15 kg IKg. reducing sugars.

Tabela 3 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada quimicamente com o hidróxido de sódio (5%) ou com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 em shaker horizontal.Table 3 - Enzymatic hydrolysis of biomass pre-treated chemically with sodium hydroxide (5%) or sodium hydroxide followed by peracetic acid with the mixture of enzymes NS 22074 and NS 50012 in horizontal shaker.

NaOH NaOH/AC. Peracético Tempo Rendimento Biomassa Rendimento Biomassa (h) (%) necessária (%) necessária para produzir para I Kg de produzir 1 açúcares Kg de redutores açúcares redutores 4 23 4.3 kg 10 10 24 58 1.7 kg 43 2.3 48 70 1,4 kg 48 2.1 Condições reacionais: biomassa pré-tratada (6.7g/mL de enzima); 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 50°C, 150 rpm.NaOH NaOH / AC. Peracetic Time Yield Biomass Yield Biomass (h) (%) required (%) required to produce for I Kg of producing 1 Kg of reducing reducers 4 23 4.3 kg 10 10 24 58 1.7 kg 43 2.3 48 70 1.4 kg 48 2.1 Reaction conditions: pretreated biomass (6.7g / mL enzyme); 1:50 biomass / volume of sodium acetate buffer pH = 4.8) shaker bath 50 ° C, 150 rpm.

A partir dos resultados obtidos na Tabela 3, observa- 5 se que ao realizar a hidrólise enzimática com uma massa maior e a mesma quantidade de enzima, formou uma quantidade maior de açúcares fermentáveis, ou seja, o custo do processo tornou-se economicamente mais viável, pois é necessário uma quantidade inferior de enzima.From the results obtained in Table 3, it is observed that by performing enzymatic hydrolysis with a larger mass and the same amount of enzyme, it formed a larger amount of fermentable sugars, ie, the cost of the process became economically lower. feasible as a lower amount of enzyme is required.

Além disso, os resultados de conversão obtidos aoIn addition, the conversion results obtained under

utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio são melhores em comparação ao obtidos com a biomassa pré- tratada com hidróxido de sódio seguida do ácido peracético.using sodium hydroxide pretreated biomass is better compared to that obtained with sodium hydroxide pretreated biomass followed by peracetic acid.

O quarto aspecto da presente invenção é realizar a hidrólise enzimática utilizando a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (3%) (0,2g) e comparar os resultados com a biomassa pré-tratada com explosão a vapor seguida do pré- tratamento com hidróxido de sódio (3%) (0,2g) com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 (0, 03mL), 10 mL de tampão acetato de sódio pH = 4.8, agitar esta mistura em agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50°C, rpm de 5 150, durante 4, 24 e 48 horas. Os resultados da percentagem de açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa necessária para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis estão apresentados na Tabela 4.The fourth aspect of the present invention is to perform enzymatic hydrolysis using sodium hydroxide pretreated biomass (3%) (0.2g) and compare the results with steam blast pretreated biomass followed by pretreatment with sodium hydroxide (3%) (0.2g) with the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 (0.03mL), 10 ml sodium acetate buffer pH = 4.8, stir this mixture on a horizontal shaker shaker at room temperature. 50 ° C, rpm of 5 150 for 4, 24 and 48 hours. The results of the percentage of fermentable sugars and the amount of biomass required to produce 1 kg of fermentable sugars are presented in Table 4.

Para diminuir ainda mais o custo do processo, foi 10 realizado na presente invenção a hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (3%) em refluxo durante 2 horas e a biomassa pré-tratada com explosão a vapor seguida do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%) .To further reduce the cost of the process, enzymatic hydrolysis of the sodium hydroxide pretreated biomass (3%) at reflux for 2 hours and steam blast pretreated biomass followed by sodium hydroxide treatment (3%).

A Tabela 4 mostra a percentagem de açúcares redutoresTable 4 shows the percentage of reducing sugars.

liberados de suspensões de 0,2g de pseudocaule de bananeira pré-tratado com hidróxido de sódio (3%) sob refluxo durantereleased from 0.2g suspensions of pre-treated sodium hydroxide (3%) banana pseudostem under reflux for

2 horas ou pré-tratamento com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%) durante 2 horas 20 sob refluxo com a mistura das celulases NS 22074 (0,015mL) e NS 50012 (0,015mL) no banho tipo shaker, a temperatura de 50°C e rpm de 150 por 4, 24 e 48 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir IKg de açúcares redutores. Tabela 4 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada quimicamente com o hidróxido de sódio (3%) ou com explosão a vapor seguido do hidróxido de sódio (3%) com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 em shaker horizontal.2 hours or steam blast pretreatment followed by pretreatment with sodium hydroxide (3%) for 2 hours under reflux with the mixture of NS 22074 (0.015mL) and NS 50012 (0.015mL) cellulases in the bath type shaker, the temperature of 50 ° C and 150 rpm for 4, 24 and 48 hours and the amount of biomass required to produce IKg of reducing sugars. Table 4 - Enzymatic hydrolysis of biomass pretreated chemically with sodium hydroxide (3%) or with steam explosion followed by sodium hydroxide (3%) with the mixture of enzymes NS 22074 and NS 50012 in horizontal shaker.

NaOH Explosão a vapor /NaOH Tempo Rendimento Biomassa Rendimento Biomassa (h) (%) necessária (%) necessária para produzir para I Kg de produzir 1 açúcares Kg de redutores açúcares redutores 4 25 4.0 kg 21.5 4.7 kg 24 62.5 1.6 kg 37.5 2.7 kg 48 85 1,2 kg 71.5 1.4 kg Condições reacionais: biomassa pré-tratada (6.7g/mL de enzima); 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 50°C, 150 rpm.NaOH Steam Explosion / NaOH Time Yield Biomass Yield Biomass (h) (%) required (%) required to produce for I Kg of producing 1 Kg of reducing reducers 4 25 4.0 kg 21.5 4.7 kg 24 62.5 1.6 kg 37.5 2.7 kg 48 85 1.2 kg 71.5 1.4 kg Reaction conditions: pretreated biomass (6.7g / mL enzyme); 1:50 biomass / volume of sodium acetate buffer pH = 4.8) shaker bath 50 ° C, 150 rpm.

A partir dos resultados obtidos na Tabela 4, observa- se que ao realizar a hidrólise enzimática da biomassa pré- tratada com hidróxido de sódio (3%) ou com a biomassa pré- tratada por explosão a vapor seguida do tratamento com hidróxido de sódio (3%), foi formada uma quantidade maior de açúcares fermentáveis, ou seja, o custo do processo tornou-se economicamente mais viável, pois é necessária uma quantidade inferior de enzima.From the results obtained in Table 4, it can be seen that by performing enzymatic hydrolysis of sodium hydroxide pretreated biomass (3%) or steam blast pretreated biomass followed by sodium hydroxide treatment ( 3%), a higher amount of fermentable sugars was formed, ie the cost of the process became more economically viable as a lower amount of enzyme is required.

5 Portanto, o melhor resultado obtido é realizar a hidrólise enzimática em shaker durante 48 horas de reação da biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (3%), pois para produzir Ikg de açúcares fermentáveis são necessários somente l,2Kg de biomassa pré-tratada e apenas 180mL da mistura das 10 enzimas NS 22074 e NS 50012, mostrando ser economicamente viável. Além disso, outra vantagem de utilizar o pré- tratamento com hidróxido de sódio nestas condições reacionais, é que este tratamento não forma inibidores, mostrando desta forma mais uma grande vantagem.5 Therefore, the best result obtained is to perform enzymatic hydrolysis in shaker during 48 hours of reaction of sodium hydroxide pretreated biomass (3%), because to produce Ikg of fermentable sugars only 1.2 kg of pre-treated biomass is required. treated and only 180mL of the mixture of 10 enzymes NS 22074 and NS 50012, proving to be economically viable. Furthermore, another advantage of using sodium hydroxide pretreatment under these reaction conditions is that this treatment does not form inhibitors, thus showing a further major advantage.

Os resultados das análises de cromatografia HPLC das amostras de pseudocaule de bananeira tratadas com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo e tratadas com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio estão apresentados nas Tabelas 5 e 6, 20 respectivamente. A Tabela 5 mostra a ausência de glicose e xilose e a presença de sacarose como o principal açúcar redutor ao contrário do que se esperava. Além disso, a Tabela 5 mostra apenas quantidades muito pequenas de ácidos orgânicos, e a ausência do principal interferente do processo de fermentação, o hidroximetilfurfural.The results of HPLC chromatography analyzes of the 2-hour refluxed steam-blown sodium hydroxide (3%) banana pseudostem samples followed by pretreatment with sodium hydroxide are presented in Tables 5 and 6, 20 respectively. Table 5 shows the absence of glucose and xylose and the presence of sucrose as the main reducing sugar contrary to expectations. In addition, Table 5 shows only very small amounts of organic acids, and the absence of the main interfering fermentation process, hydroxymethylfurfural.

Tabela 5 - Análises de cromatografia HPLC das amostras de pseudocaule de bananeira tratadas com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo.Table 5 - HPLC chromatography analyzes of the sodium hydroxide-treated banana pseudostem (3%) samples at 2 hours of reflux.

Pseudocaule de bananeira pré-tratado com NaoH (3%) com 2 horas de refluxo PARÂMETRO UNIDADE RESULTADO Glicose g/100 mL ND Frutose g/100 mL ND Xilose g/100 mL ND Sacarose g/100 mL 1, 53 Galactose g/100 mL 0,14 Manose g/100 mL ND Ribose g/100 mL ND Manitol g/100 mL 0,38 Sorbitol g/100 mL 0, 04 Arabinose g/100 mL 0, 04 Maltose g/100 mL ND Maltotriose g/100 mL 0, 01 Ácido acético mg/L 124, 6 Ácido lático mg/L 5, 95 Ácido propiônico mg/L 16, 4 Ácido cítrico mg/L 4,79 HMF mg/L ND (hidroximetilfurfural) ND - Não dectadoNaoH pretreated banana pseudostem (3%) with 2 hours reflux PARAMETER UNIT RESULTS Glucose g / 100 mL ND Fructose g / 100 mL ND Xylose g / 100 mL ND Sucrose g / 100 mL 1,5 Galactose g / 100 mL 0.14 Mannose g / 100 mL ND Ribose g / 100 mL ND Mannitol g / 100 mL 0.38 Sorbitol g / 100 mL 0.04 Arabinose g / 100 mL 0.04 Maltose g / 100 mL ND Maltotriose g / 100 mL 0.01 Acetic acid mg / L 124.6 Lactic acid mg / L 5.95 Propionic acid mg / L 16.4 Citric acid mg / L 4.79 HMF mg / L ND (hydroxymethylfurfural) ND - Not detected

A Tabela 6 mostra que para as amostras tratada com explosão a vapor seguida do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo, o principal açúcar redutor é a 5 sacarose, o segundo é a glicose e que a xilose está ausente. Neste tratamento, é confirmada a presença de quantidade muito pequena de hidroximetilfurfural nas amostras.Table 6 shows that for steam blast treated samples followed by pre-treatment with 2 hours reflux sodium hydroxide (3%), the main reducing sugar is 5 sucrose, the second is glucose and that xylose is missing. In this treatment, the presence of very small amount of hydroxymethylfurfural in the samples is confirmed.

Tabela 6 - Análises de cromatografia HPLC das amostras de pseudocaule de bananeira tratadas com explosão a vapor seguida do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo.Table 6 - HPLC chromatography analyzes of steam blast-treated banana pseudostem samples followed by pre-treatment with sodium hydroxide (3%) with 2 hours of reflux.

Pseudocaule de bananeira pré-tratado com NaoH (3%) com 2 horas de refluxo PARAMETRO UNIDADE RESULTADO Glicose g/100 mL 0,81 Frutose g/100 mL ND Xilose g/100 mL ND Sacarose g/100 mL 1, 96 Galactose g/100 mL 0, 07 Manose g/100 mL ND Ribose g/100 mL ND Manitol g/100 mL 0,24 Sorbitol g/100 mL ND Arabinose g/100 mL 0,06 Maltose g/100 mL ND Maltotriose g/100 mL 0, 02 Ácido acético mg/L 151,4 Ácido lático mg/L 8, 05 Ácido propiônico mg/L ND Ácido cítrico mg/L ND HMF (hidroximetiIfurfurai) mg/L 53, 1NaoH pretreated banana pseudostem (3%) with 2 hours reflux PARAMETER UNIT RESULT Glucose g / 100 mL 0.81 Fructose g / 100 mL ND Xylose g / 100 mL ND Sucrose g / 100 mL 1, 96 Galactose g / 100 mL 0.07 Mannose g / 100 mL ND Ribose g / 100 mL ND Mannitol g / 100 mL 0.24 Sorbitol g / 100 mL ND Arabinose g / 100 mL 0.06 Maltose g / 100 mL ND Maltotriose g / 100 mL 0.02 Acetic acid mg / L 151.4 Lactic acid mg / L 8.05 Propionic acid mg / L ND Citric acid mg / L ND HMF (hydroxymethylfurfuryl) mg / L 53.1

ND - Não dectado ~~ ~ND - Not Detected ~~ ~

As condições reacionais do tratamento químico e posteri hidrólise enzimática descritas na Tabela 4 além de resultThe reaction conditions of the chemical treatment and enzyme enzymatic hydrolysis described in Table 4 in addition to

na melhor conversão de açúcares redutores, apresenta uma condição muito favorável para a fermentação destes açúcares para a produção de bioetanol. Isto se justifica frente ao desafio que se impõe à obtenção do etanol a partir da celulose, que é o da fermentação de pentoses. As hemiceluloses são ricas em pentoses como xiloses e arabinoses. 0 Saccharomyces cereviseae, microorganismo usualmente empregado na produção de álcool a partir da sacarose, é muito pouco eficiente na conversão de pentoses. A presença de pentoses de fato inibe a fermentação das hexoses. 0 rendimento do etanol celulósico será elevado se praticamente todos os tipos de açúcares na celulose e na hemicelulose forem convertidos para etanol. Um aspecto importante da presente invenção é que a hidrólise enzimática usando a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 de pseudocaule de bananeira tratadas com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo e tratadas com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio, resultou na formação de sacarose como o principal açúcar fermentável, o qual pode ser facilmente e eficientemente convertido em etanol pelo microorganismo SãcchãjromycGS cereviseae em condições industriais.In the best conversion of reducing sugars, it presents a very favorable condition for the fermentation of these sugars for bioethanol production. This is justified by the challenge of obtaining ethanol from cellulose, which is the fermentation of pentoses. Hemicelluloses are rich in pentoses such as xylose and arabinosis. Saccharomyces cereviseae, a microorganism usually employed in the production of alcohol from sucrose, is very inefficient in pentose conversion. The presence of pentoses actually inhibits the fermentation of hexoses. The yield of cellulosic ethanol will be increased if practically all types of sugars in cellulose and hemicellulose are converted to ethanol. An important aspect of the present invention is that enzymatic hydrolysis using the mixture of sodium hydroxide-treated banana pseudostem enzymes NS 22074 and NS 50012 (3%) with 2 hours reflux and treated with steam explosion followed by pretreatment with sodium hydroxide resulted in the formation of sucrose as the main fermentable sugar which can be easily and efficiently converted to ethanol by the microorganism SachchromycGS cereviseae under industrial conditions.

Nesta presente invenção destaca-se a influência da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 em comparação com a celulase pura NS 22074, o uso da enzima NS 50012 potenciali za a hidrólise enzimática e com isso reduz o custo enzimático, para mostrar este efeito realizou-se a hidrólise enzimática com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (5%)(0,lg) com a enzima NS 22074 (0,03 mL) e a mistura das enzimas NS 22074 (0, 015 mL) e 50012 (0,015 mL) , 5 mL de tampão acetato de sódio pH = 4.8, agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50°C, 150 rpm, durante 4 e 24 horas. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 7.In this present invention the influence of the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 in comparison with the pure cellulase NS 22074, the use of the enzyme NS 50012 enhances the enzymatic hydrolysis and with this reduces the enzymatic cost, to show this effect accomplished enzymatic hydrolysis with sodium hydroxide (5%) (0.1g) pretreated biomass with NS 22074 enzyme (0.03 mL) and NS 22074 (0.015 mL) and 50012 enzyme mixture (0.015 mL), 5 mL sodium acetate buffer pH = 4.8, horizontal shaker shaker at 50 ° C, 150 rpm for 4 and 24 hours. The results obtained are presented in Table 7.

Tabela 7 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada quimicamente com o hidróxido de sódio (5%) com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 ou com a enzima NS 22074 em shaker horizontal.Table 7 - Enzymatic hydrolysis of biomass pretreated chemically with sodium hydroxide (5%) with the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 or with the enzyme NS 22074 in horizontal shaker.

Enzima 22074 e 50012 22074 Tempo Rendimento Biomassa Rendimento Biomassa (h) (%) necessária (%) necessária para para produzir produzir IKg IKg de de açúcares açúcares redutores redutores 4 72 1.5 kg 31 2.3 kg 24 96 1.1 kg 57 1.7 kgEnzyme 22074 and 50012 22074 Time Biomass Yield Yield Biomass (h) (%) required (%) required to produce produce IKg IKg of sugar reducing sugars 4 72 1.5 kg 31 2.3 kg 24 96 1.1 kg 57 1.7 kg

Condições reacionais: biomassa pré-tratada quimicamente 3.3g/mL de enzima), 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 50°C, 150 rpm.Reaction conditions: chemically pretreated biomass 3.3g / mL enzyme), 1:50 biomass / volume sodium acetate buffer pH = 4.8) shaker bath temperature 50 ° C, 150 rpm.

A partir dos resultados obtidos na Tabela 7, observa- se que ao realizar a hidrólise enzimática com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 os resultados de conversão foram muito melhores em comparação ao utilizar a enzima NS 22074, ou seja, a conversão em açúcares fermentáveis foi aproximadamente 80% maior em comparação ao utilizar somente a enzima NS 22074 em apenas 4 horas de reação. Portanto está é mais uma vantagem desta patente o uso de mistura de enzimas, o que faz com que o custo enzimático se reduza significativamente e torna o processo economicamente viável. ReferênciasFrom the results obtained in Table 7, it is observed that when performing the enzymatic hydrolysis with the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 the conversion results were much better compared to using the enzyme NS 22074, ie the conversion to Fermentable sugars were approximately 80% higher compared to using only the enzyme NS 22074 in just 4 hours of reaction. Therefore, it is a further advantage of this patent to use enzyme blending, which causes the enzyme cost to be significantly reduced and makes the process economically viable. References

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Claims (32)

1. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira com hidrólise enzimática caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) lavar o pseudocaule de bananeira com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de ácido acético e peróxido de hidrogênio.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem with enzymatic hydrolysis characterized by the fact that it comprises the following steps: a) wash the banana pseudostem with running water about 3 times to remove the dirt and resin afterwards Place in oven at 60 ° C for drying. b) grind the banana pseudostem and store for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis. c) pretreatment with sodium hydroxide followed by the mixture of acetic acid and hydrogen peroxide. 2. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas: a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio, durante 1 hora a 70°C (1:10 m/v), em agitador magnético, b) adição da mistura de ácido acético e peróxido de hidrogênio (30%), e completar o volume com água destilada) (1:10 m/v) durante 6 horas a temperatura de 7 0°C em agitador magnético ou em ultra-som com temperatura fixa de 60℃. c) filtrar a amostra e lavar com água destilada até pH: 4-5, e d) colocar para secar e moer.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 1, characterized in that step (c) comprises the following steps: a) treating the banana pseudostem with sodium hydroxide; for 1 hour at 70 ° C (1:10 m / v) on a magnetic stirrer, b) adding the mixture of acetic acid and hydrogen peroxide (30%) and making up to the mark with distilled water) (1:10 m / v) for 6 hours at 70 ° C on a magnetic stirrer or fixed temperature ultrasound of 60 ℃. c) filter the sample and wash with distilled water to pH: 4-5, and d) place to dry and grind. 3. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a mistura de ácido acético e peróxido de hidrogênio compreende 40% de ácido acético e60% de peróxido de hidrogênio.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 2, characterized in that the mixture of acetic acid and hydrogen peroxide comprises 40% acetic acid and 60% hydrogen peroxide. 4. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) lavar o pseudocaule de bananeira com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de vinagre e peróxido de hidrogênio.4. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: a) wash the banana pseudostem with running water about 3 times to remove dirt and resin, then put in oven at 60 ° C for drying. b) grind the banana pseudostem and store for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis. c) pre-treat with sodium hydroxide followed by the mixture of vinegar and hydrogen peroxide. 5. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas: a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio, durante 1 hora a 70°C (1:10 m/v), em agitador magnético, b) adição da mistura de vinagre e peróxido de hidrogênio (30%), o restante completar com água destilada) (1:10 m/v) durante 6 horas a temperatura de 70°C; c) filtrar a amostra e lavar com água destilada até pH: 4-5, e d) colocar para secar e moer.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 4, characterized in that step (c) comprises the following steps: a) treating the banana pseudostem with sodium hydroxide; for 1 hour at 70 ° C (1:10 m / v), on a magnetic stirrer, b) addition of vinegar and hydrogen peroxide mixture (30%), the remainder complete with distilled water) (1:10 m / v ) for 6 hours at a temperature of 70 ° C; c) filter the sample and wash with distilled water to pH: 4-5, and d) place to dry and grind. 6. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a mistura de vinagre e peróxido de hidrogênio compreende 40% de vinagre e 60% de peróxido de hidrogênio.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 5, characterized in that the vinegar and hydrogen peroxide mixture comprises 40% vinegar and 60% hydrogen peroxide. 7. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio.7. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: a) wash with running water about 3 times to remove dirt and resin, then place in oven at 60 ° C ° C for drying. b) grind the banana pseudostem and store for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis. c) pre-treat with sodium hydroxide followed by the mixture of sodium hypochlorite and hydrogen peroxide. 8. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas: a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio, durante 1 hora a 70°C (1:10 m/v), em agitador magnético, b) adição da mistura de hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio (5:1) (1:10 v/v durante 6 horas a temperatura de 70°C; c) filtrar a amostra e lavar com água destilada até pH: 4-5, d) colocar para secar e moer.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 4, characterized in that step (c) comprises the following steps: a) treating the banana pseudostem with sodium hydroxide; for 1 hour at 70 ° C (1:10 m / v) on a magnetic stirrer, b) adding the mixture of sodium hypochlorite and hydrogen peroxide (5: 1) (1:10 v / v for 6 hours at room temperature). c) filter the sample and wash with distilled water to pH: 4-5, d) place to dry and grind. 9. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio.9. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: a) wash with running water about 3 times to remove dirt and resin, then place in oven at 60 ° C ° C for drying. b) grind the banana pseudostem and store for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis. c) pre-treat with sodium hydroxide. 10. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas: a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio (3%) ou (5%){1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo, b) filtrar a amostra e lavar com água destilada, c) colocar para secar e moer.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 9, characterized in that step (c) comprises the following steps: a) treating the banana pseudostem with sodium hydroxide ( 3%) or (5%) (1:20 m / v) for 2 hours under reflux, b) filter the sample and wash with distilled water, c) put to dry and grind. 11. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. c) fazer um pré-tratamento com ácido sulfúrico.11. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: a) wash with running water about 3 times to remove dirt and resin, then place in oven at 60 ° C. ° C for drying. b) grind the banana pseudostem and store for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis. c) pre-treatment with sulfuric acid. 12. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas: a) tratar o pseudocaule de bananeira com ácido sulfúrico (5%) (1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo, b) filtrar a amostra e lavar com água destilada, c) colocar para secar e moer.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 11, characterized in that step (c) comprises the following steps: a) treating the banana pseudostem with sulfuric acid (5). %) (1:20 m / v) for 2 hours under reflux, b) filter the sample and wash with distilled water, c) place to dry and grind. 13. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio combinado com ácido sulfúrico.13. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: a) wash with running water about 3 times to remove dirt and resin, then place in oven at 60 ° C. ° C for drying. b) grind the banana pseudostem and store for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis. c) pretreatment with sodium hydroxide combined with sulfuric acid. 14. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas: a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio (5%) (1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo, b) adicionar ácido sulfúrico (5%) (1:10 m/v) durante 2 horas sob refluxo, c) filtrar a amostra e lavar com água destilada, d) colocar para secar e moer.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 13, characterized in that step (c) comprises the following steps: a) treating the banana pseudostem with sodium hydroxide ( 5%) (1:20 m / v) for 2 hours under reflux, b) add sulfuric acid (5%) (1:10 m / v) for 2 hours under reflux, c) filter the sample and wash with distilled water , d) put to dry and grind. 15. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 600C para a secagem. b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. c) fazer um pré-tratamento com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio.15. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: a) wash with running water about 3 times to remove dirt and resin, then put in a greenhouse at 600C for drying. b) grind the banana pseudostem and store for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis. (c) pre-treat with steam explosion followed by pre-treatment with sodium hydroxide. 16. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas: a) tratar o pseudocaule de bananeira com explosão a vapor durante 8 minutos a 200°C seguido do pré-tratamento com hidróxido se sódio (3%) (1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo, b) filtrar a amostra e lavar com água destilada, c) colocar para secar e moer.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claim 15, characterized in that step (c) comprises the following steps: a) treating the steam-blown banana pseudostem during 8 minutes at 200 ° C followed by pretreatment with sodium hydroxide (3%) (1:20 m / v) for 2 hours under reflux, b) filter the sample and wash with distilled water, c) dry and grind. 17. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato da referida hidrólise enzimática ser realizada conforme as seguintes etapas: a) adição de 0,lg de biomassa pré-tratada, 0,03 mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, 5 mL de tampão acetato de sódio pH = 4,8; e b) a mistura foi deixada em banho de ultra-som em temperatura fixa de 60aC durante 4 horas.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claims 1 to 12, characterized in that said enzymatic hydrolysis is carried out according to the following steps: a) addition of 0.1 l of pre-treated biomass 0.03 mL of the mixture of NS 22074 and NS 50012 enzymes, 5 mL of sodium acetate buffer pH = 4.8; and b) the mixture was left in a fixed temperature ultrasound bath of 60 ° C for 4 hours. 18. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) Hidrolisar a biomassa pré-tratada conforme definida pelas reivindicações 1-12 (3.3g/mL de enzima) diretamente no banho de ultra-som com a mistura das enzimas celulases NS 22074 e NS 50012 durante 4 horas; b) Utilizar 1:50 de biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized in that it comprises the following steps: a) Hydrolyzing the pretreated biomass as defined by claims 1-12 (3.3g / mL enzyme) directly in the bath ultrasound with the mixture of cellulase enzymes NS 22074 and NS 50012 for 4 hours; (b) Use 1:50 biomass / volume of sodium acetate buffer pH = 4.8. 19. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) Hidrolisar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio e hidróxido de sódio seguido de ácido peracético em shaker tipo horizontal (3.3g/mL de enzimas) com a mistura das enzimas celulases NS 22074 e NS 50012 ou somente com a enzima NS 22074 durante 4 e 24 horas; b) Utilizar 1:50 de biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8; c) Utilizar temperatura de 50°C e rpm de 150.19. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: (a) hydrolyze the pretreated biomass with sodium hydroxide and sodium hydroxide followed by peracetic acid in horizontal type shaker (3.3). g / mL of enzymes) with the mixture of the cellulase enzymes NS 22074 and NS 50012 or only with the enzyme NS 22074 for 4 and 24 hours; b) Use 1:50 biomass / volume of sodium acetate buffer pH = 4.8; c) Use temperature of 50 ° C and rpm of 150. 20. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) Hidrolisar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio ou hidróxido de sódio seguido de ácido peracético em shaker tipo horizontal (6,7g/mL de enzimas) com a mistura das enzimas celulases NS 22074 e NS 50012 durante4, 24 e 48 horas. b) Utilizar 1:50 de biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8; e c) Utilizar temperatura de 50°C e rpm de 150.20. Process for the production of bioethanol from banana pseudostem characterized by the fact that it comprises the following steps: (a) hydrolyze the pretreated biomass with sodium hydroxide or sodium hydroxide followed by peracetic acid in horizontal type shaker (6). , 7g / ml of enzymes) with the mixture of cellulase enzymes NS 22074 and NS 50012 for 4, 24 and 48 hours. b) Use 1:50 biomass / volume of sodium acetate buffer pH = 4.8; and c) Use a temperature of 50 ° C and rpm of 150 ° C. 21. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a enzima celulase NS22074 é um complexo celulósico-p-glucosidase e xilanase.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to Claims 1 to 20, characterized in that the cellulase enzyme NS22074 is a cellulosic complex-p-glucosidase and xylanase. 22. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a enzima NS 50012 é um complexo celulósico - arabinase, hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claims 1 to 20, characterized in that the enzyme NS 50012 is a cellulosic complex - arabinase, hemicellulase, cellulase, pectinase and xylanase. 23. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a bananeira é preferencialmente do tipo que produz banana caturra.Process for the production of bioethanol from banana pseudostem according to claims 1 to 20, characterized in that the banana tree is preferably of the type producing banana caturra. 24. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise foi de 33 a 51%.Process for the production of bioethanol according to claims 1 to 12, characterized in that the conversion of reducing sugars by hydrolysis was 33 to 51%. 25. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise foi de 31 a 96%.Process for the production of bioethanol according to claim 19, characterized in that the conversion of reducing sugars by hydrolysis was 31 to 96%. 26. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise foi de 10 a 70%.Process for the production of bioethanol according to claim 20, characterized in that the conversion of reducing sugars by hydrolysis was from 10 to 70%. 27. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise com hidróxido de sódio (3%) foi de 25 a 85%.Process for the production of bioethanol according to claim 10, characterized in that the conversion of reducing sugars by hydrolysis with sodium hydroxide (3%) was 25 to 85%. 28. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com as reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise foi de21,5 até 71,5%.Process for the production of bioethanol according to claims 15 and 16, characterized in that the conversion of reducing sugars by hydrolysis was from 21.5 to 71.5%. 29. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado enzimático obtido para produzir etanol compreende uma mistura de açúcares fermentáveis tendo a sacarose como açúcar principal, a ausência de glicose e xilose e a ausência de hidroximetilfurfural.Process for the production of bioethanol according to claim 10, characterized in that the enzymatic hydrolyzate obtained to produce ethanol comprises a mixture of fermentable sugars having sucrose as the main sugar, the absence of glucose and xylose and the absence of hydroxymethylfurfural. 30. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com as reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado enzimático obtido para produzir etanol compreende uma mistura de açúcares fermentáveis tendo a sacarose como açúcar principal, a glicose como açúcar secundário, a ausência de xilose e a presença de hidroximetilfurfural em quantidade muito pequena.Process for the production of bioethanol according to claims 15 and 16, characterized in that the enzymatic hydrolyzate obtained to produce ethanol comprises a mixture of fermentable sugars having sucrose as main sugar, glucose as secondary sugar, absence of xylose and the presence of hydroxymethylfurfural in very small quantity. 31. Uso do processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 30 caracterizado pelo fato de obter açúcares redutores para produzir etanol.Use of the process as defined by claims 1 to 30 wherein reducing sugars are produced to produce ethanol. 32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o processo de produção de etanol é realizado por fermentação com leveduras de açúcares fermentáveis.Use according to claim 31, characterized in that the ethanol production process is carried out by fermentation with fermentable sugar yeasts.
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