BR0202602B1

BR0202602B1 - Production of fructose and glucose-containing sugar syrup, whether or not enriched with fructooligosaccharides, from sucrose using purified enzyme immobilized on solid support

Info

Publication number: BR0202602B1
Application number: BR0202602A
Authority: BR
Inventors: Francisco Filho Maugeri; Andrelina Maria Pinheiro Santos
Original assignee: Unicamp
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2015-02-24
Also published as: BR0202602A

Description

"PRODUÇÃO DE XAROPE DE AÇÚCAR CONTENDO FRUTOSE EGLICOSE, ENRIQUECIDO OU NÃO COM FRUTOOLIGOSSACARÍDEOS, A PARTIR DE SACAROSE, USANDO A ENZIMA INULASE PURIFICADA E IMOBILIZADA EM SUPORTE SOLIDO" A presente invenção diz respeito a um processo de produção de xarope, ou açúcar líquido, contendo glicose, frutose, enriquecido ou não com frutooligossacarídeos, utilizando a enzima inulinase de Kluyveromyes sp. imobilizada. A produção de açúcar líquido tem grande importância para a industria de alimentos e bebidas, por ser ideal no uso de confecções de balas, bebidas carbonatadas, iogurtes, sorvetes, doces, geléias, biscoitos, produtos cámeos, conservas, etc. A presença de frutooligossacarídeos combinada com a frutose é interessante pois um produto assim formulado pode ser utilizado na indústria de alimentos e farmacêutica, na fabricação de produtos funcionais e diferenciados."Sugar syrup production containing eglucose fructose, whether or not enriched with fructooligosaccharides, using sucrose, using the purified and immobilized inulase enzyme in solid support". glucose, fructose, whether or not enriched with fructooligosaccharides, using the enzyme inulinase from Kluyveromyes sp. immobilized. The production of liquid sugar is of great importance to the food and beverage industry, as it is ideal in the use of candy confections, carbonated drinks, yogurts, ice cream, jams, jellies, cookies, canned goods, preserves, etc. The presence of fructooligosaccharides combined with fructose is interesting because such a product can be used in the food and pharmaceutical industry in the manufacture of functional and differentiated products.

Os frutooligossacarídeos são açúcares formados de 1 a 3 moléculas de frutose ligadas a uma molécula de sacarose na posição 13-(2-81). Apresentam propriedades fisicas e fisiológicas que o tomam um composto de grande potencial de aplicação em alimentos para nutrição humana e animal. São açúcares não digeridos pelo organismo humano, passando através do intestino delgado sem serem absorvidos e vão direto para o intestino grosso, onde são seletivamente utilizados pelas bifidobactérias na microfiora intestinal (U.S. Pat.:5.314.810) O grande interesse que existe nos frutooligossacarídeos como adoçantes alternativos, não é apenas pelas suas propriedades específicas de baixa cariogenicidade, baixa caloria e utilizável por diabéticos, mas também pelo fato de ser uma substância bifidogênica, a qual promove o crescimento da bifidobactéria. A bifidobactéria, microrganismo anaeróbico não formador de esporos gram-positivo, ocorre naturalmente no organismo humano, trazendo uma serie de benefícios para a saúde.Fructooligosaccharides are sugars formed from 1 to 3 fructose molecules attached to a sucrose molecule at position 13- (2-81). They have physical and physiological properties that make it a compound with great potential for application in food for human and animal nutrition. These are sugars not digested by the human body, passing through the small intestine without being absorbed and go straight to the large intestine, where they are selectively used by the bifidobacteria in the intestinal microfiora (US Pat.:5.314.810). The great interest that exists in fructooligosaccharides as Alternative sweeteners are not only because of their specific low cariogenicity, low calorie and usable properties for diabetics, but also because it is a bifidogenic substance, which promotes the growth of bifidobacteria. Bifidobacteria, an anaerobic non-gram-positive spore-forming organism, occurs naturally in the human organism, bringing a number of health benefits.

Os frutooligossacarídeos podem ser obtidos normalmente por fontes de origem vegetal ou pela ação da enzima P-frutosiltransferase sobre a sacarose. Este processo foi desenvolvido pela companhia japonesa Meiji Seika Kaisha Ltd.(U.S Pat. 4,681,771) com o nome de "neosugar" que corresponde a uma mistura de sacarose, glicose, frutose e frutooligossacarídeos. Os frutooligossacarídes são constituídos de kestose, nistose e frutosilnistose. Esta produção, desenvolvida pela companhia japonesa corresponde na reação da enzima fructosiltranferase obtida por fungo (Aspergillus niger), onde a enzima transfere resíduos frutosil da molécula da sacarose doadora para a molécula da sacarose receptora. A reação ocorre normalmente a uma temperatura de 50 a 60°C, com uma concentração de sacarose a 60%, pH a faixa de 5,5 a 6,0. A sacarose, o primeiro adoçante nutritivo obtido a partir da cana-de-açúcar ou de beterraba, é o mais importante dos açúcares, tanto pela quantidade encontrada na natureza, como pela sua importância na alimentação humana. A sacarose é um açúcar facilmente hirdrolisável química ou enzimáticamente, em glicose e frutose. A glicose também conhecida como açúcar do milho ou dextrose, é uma das principais fontes de energia dos organismos 40 vivos. Ocorre na forma livre em frutas e mel. A frutose é conhecida como açúcar de fruta, ou levulose. E a única cetose que ocorre em grande quantidade na natureza, principalmente em frutas e mel.Fructooligosaccharides can usually be obtained from sources of plant origin or by the action of the enzyme P-fructosyltransferase on sucrose. This process was developed by the Japanese company Meiji Seika Kaisha Ltd. (U.S. Pat. 4,681,771) under the name "neosugar" which corresponds to a mixture of sucrose, glucose, fructose and fructooligosaccharides. Fructooligosaccharides are made up of kestose, nystosis and fructosylnosis. This production, developed by the Japanese company corresponds to the reaction of the enzyme fructosyltransferase obtained by fungus (Aspergillus niger), where the enzyme transfers fructose residues from the donor sucrose molecule to the receptor sucrose molecule. The reaction usually occurs at a temperature of 50 to 60 ° C, with a concentration of 60% sucrose, pH in the range 5.5 to 6.0. Sucrose, the first nutritive sweetener obtained from sugar cane or beet, is the most important of sugars, both because of the amount found in nature and its importance in human nutrition. Sucrose is a chemically or enzymatically easily hydrolyzable sugar in glucose and fructose. Glucose, also known as corn sugar or dextrose, is a major source of energy for living organisms. It occurs in free form in fruits and honey. Fructose is known as fruit sugar, or levulose. It is the only ketosis that occurs in large quantities in nature, especially in fruits and honey.

Normalmente, o xarope de frutose é obtido à partir de fontes alternativas de amido, como por exemplo, arroz, trigo e batata, que são mais baratas que o milho, que é a matéria-prima mais utilizada. Entretanto, estes processos levam a produção de um xarope de baixo rendimento, além da necessidade do controle de pH, temperatura, e inibidores, se faz necessário ainda a adição de ativadores, o que provoca um aumento nos custo da produção.Fructose syrup is usually obtained from alternative starch sources such as rice, wheat and potatoes, which are cheaper than maize, which is the most widely used raw material. However, these processes lead to the production of a low yield syrup, besides the need to control pH, temperature and inhibitors, it is also necessary to add activators, which causes an increase in production costs.

Um processo alternativo para a obtenção de xarope é à partir da hidrólise da inulina pela ação da exo-inulinase. A inulina, polímero de frutose com uma unidade de glicose, encontrada em alcachofra de Jerusalém, chicória e dália, por possuir apenas uma molécula de glicose na cadeia, necessita apenas de uma etapa para a hidrólise total, obtendo ) um xarope com 95% de frutose. Ao contrário do processo convencional que necessita de três etapas enzimáticas (α-amilase, amiloglicosidase e glicose-isomerase) a partir do amido, com um rendimento final de 45%. ... O açúcar líquido invertido utiliza como matéria-prima o açúcar cristal, que é diluído, filtrado, refinado com resina de troca iônica, invertido e concentrado. O produto ormado por este processo é composto de sacarose, glicose e frutose, apresentando um composição final de aproximadamente 40% de sacarose, 30% de glicose e 30% de frutose Atualmente o açúcar líquido invertido é utilizado nas indústrias de alimentos e de refrigerantes. O inconveniente deste processo é que a hidrólise é química e o produto final é geralmente contaminado com compostos indesejáveis como o hidrometilfurfural, altamente toxico. . lnujinfs frutano frutanohidrolase, EC 3.2.1.7) são enzimas h droliticas classificadas como endo ou exo-inulinases, resultando, de sua ação sobre a inulina. oligomeros de frutose ou apenas frutose respectivamente. Esta enzima pode ser obtida de eve uras, fungos, bactérias e de plantas. O seu emprego em termos industriais é bastante promissor pois esta enzima apresenta dentre outras vantagens a boa estabilidade frente às variações de temperatura, pH e tempo de estocagem. Uma outra característica importante desta enzima a açao de transfrutosilação, produzindo frutooiigossacarídeos a partir da sacarose Uma característica importante do processo enzimático é que qualquer que seja as condições do processo, nunca e produzido substâncias indesejáveis, como no processo químico Dentre as leveduras produtoras de inulinases, as do gênero Klmeromvces ap—n melhor desempenho. O interesse do osodes.es mictotgJLs na “ eefc ?sas’S-enCOntra n0 fat0 delas Pertencerem 30 grupo GRAS (Generallv Reconized as Safe) e sao ace.tas pelo FDA (Food and Drug Adminstration) dos Estado Unidos para produtos farmacêuticos e alimentícios.An alternative process for obtaining syrup is from the inulin hydrolysis by the action of exo-insulinase. Inulin, a fructose polymer with a glucose unit found in Jerusalem artichoke, chicory and dahlia, having only one glucose molecule in the chain, only needs one step for total hydrolysis, yielding) a 95% syrup. fructose. Unlike the conventional process which requires three enzymatic steps (α-amylase, amyloglycosidase and glucose isomerase) from starch, with a final yield of 45%. ... Invert liquid sugar uses crystal sugar as its raw material, which is diluted, filtered, refined with ion exchange resin, inverted and concentrated. The product formed by this process is composed of sucrose, glucose and fructose, with a final composition of approximately 40% sucrose, 30% glucose and 30% fructose Currently invert liquid sugar is used in the food and soft drink industries. The drawback of this process is that hydrolysis is chemical and the end product is generally contaminated with undesirable compounds such as highly toxic hydromethylfurfural. . Frutano frutano frutanohydrolase, EC 3.2.1.7) are hydrolytic enzymes classified as endo or exo-inulinases, resulting from their action on inulin. fructose or just fructose oligomers respectively. This enzyme can be obtained from herbs, fungi, bacteria and plants. Its use in industrial terms is very promising because this enzyme presents among other advantages the good stability against the variations of temperature, pH and storage time. Another important feature of this enzyme is the action of transfructylation, producing fructo-oligosaccharides from sucrose. An important feature of the enzymatic process is that whatever the conditions of the process, undesirable substances are never produced, as in the chemical process. those of the Klmeromvces genre after better performance. Osodes.es mictotgJLs' interest in the “effc's” and “not” of them belongs to 30 Generallv Reconized as Safe (GRAS) groups and are accepted by the United States Food and Drug Administration (FDA) for pharmaceutical and food products.

DESCRIÇÃO DO INVENTO esnéciM a A'Pr°dUÇa° ía Inulinase: 0 m'crorganismo Kluyveromyces sp„ podendo ser as Solr°myCeS M sendo a mais utilizada a de 30 Λ T T ZAbulgarÍCUS ^ é inoculado em um meio de cultura constituído de 30g/L de sacarose, 10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 5g/L de Κ,ΗΡΟ da enzima A C°m ^ °sobrenadante obtido é utilizado para recuperação da enzima. A precipitação da enzima e realizada pela adição lenta do etanol a -15°C ao mantrdr, a temperatura * «,até a Ilação igiruma * w. ®nol. Em KgurtH centnfnga.se . I l.OOOg x 15 minutos a WC. O sobmnadante é destilado para recuperação do etanol e a raihaça decorrente é descarada e o precipitado lessuspendido em tampao fosfato de sódio 0,05MpH 5.0. F ressuspenaiao C-Purificação da Inulinase: A enzima recupereada em etanol é purificada nnr cromatografia lornn. O processo consiste em filtrar a solução enzimática ressuspendida em ampao fosfato de sodio 0,05M PH 5,0 em filtro 0,45pm. Antes de injetar a amosfra, a coluna η o resina trocadora de ânions é lavada com tampão fosfato de sódio 0 1M à dH 6 0 omml a J -/min-Após equilibrar a coluna com a so1^ Co fòsfl dfsôdt , p 6,0, solução enzimatica e injetada na coluna com um fluxo de 0 5 cmVmin A elu,ao da enzima é realizada com tampão fosfato de sódio 0,.M PH 6,0 segui^ όΓ'ιιίη gradiente salino linear de NaC! ascendente 0-90%. O processo é monitorado a 280nm. Durante a eluição da enzima são coletadas frações, onde determina-se a atividade enzimática. As frações que contiverem a enzima são reunidas numa só fração. D-lmobilização da Inulinase: a imobilização pode ser efetivada em diferentes meios, como por exemplo, carvão ativo juntamente com alginato de sódio como agente gelificame (Pat: 5.916.789), sílica e glutaraldeído, que produz um suporte modificado contendo ligações cruzadas (Pat.:5.998.183).Um dos melhores métodos para imobilização desta enzima é utilizando alginato de cálcio como descrito a seguir: inicialmente é pesado 3,5% de alginato de cálcio solubilizado em água destilada. A mistura é aquecida até atingir 80°C aproximadamente, para que ocorra a dissolução total do alginato. Finalizada a dissolução do alginato e resfriado a 40°C, adiciona-se 2% da solução enzimática. Para a formação das esferas, a solução é bombeada sobre uma solução de cloreto de cálcio 0,2M em tampão acetato 0,1M sob agitação. E- Produção de Xarope de Açúcar contendo glicose e frutose, enriquecido ou não com frutooligossacarídeos, a partir de sacarose: Uma coluna encamizada é empacotada com o biocatalizador, representado pelas esferas de alginato de cálcio com a enzima imobilizada, como descrito em D. A temperatura da coluna é controlada por água aquecida passando pela camisa da coluna. A temperatura do processo pode ser fixada entre 40 e 60°C sendo que a mais utilizada é 50°C. A coluna é alimentada com solução de sacarose de 40% a 70%, sendo que a mais utilizada é 60%. O pH da solução pode estar de 5,0 a 6,0, sendo que o mais utilizado é pH 5,0. A composição dos açúcares na saída pode variar segundo as condições do processo (concentração de alimentação, pH, temperatura, concentração do biocatalisador, atividade enzimática, tempo de residência na coluna). É possível, variando as condições do processo obter soluções na saída da coluna contendo somente glicose e frutose ou uma mistura de sacarose, frutose e glicose enriquecida com até 8% de frutooligossacarídeos. Este produto é apropriado para indústria de alimentos, para produtos funcionais, prebióticos e ricos em fibra alimentar solúvel.DESCRIPTION OF THE INVENTION Especially the Inulinase: The Kluyveromyces sp. Organism may be the Solr ° myCeS M being the most widely used 30 Λ TT ZAbulgarICUS is inoculated into a culture medium consisting of 30g / ml. L sucrose, 10 g / L yeast extract, 20 g / L peptone and 5 g / L of the enzyme AC ° m ° ° obtained supernatant is used for enzyme recovery. Precipitation of the enzyme is effected by slowly adding ethanol at -15 ° C to mantrdr, at room temperature until dilution. ®nol. In KgurtH centnfnga.se. 1100 x 15 minutes to toilet. The supernatant is distilled for ethanol recovery and the resulting streak is stripped and the precipitate less suspended in 0.05MpH 5.0 sodium phosphate buffer. Resuscitation C-Inulinase Purification: The enzyme recovered in ethanol is purified by chromatography. The process consists of filtering the resuspended enzyme solution in 0.05M sodium phosphate amp; pH 5.0 on 0.45pm filter. Prior to injecting the sample, the column and the anion exchange resin is washed with 0 1M sodium phosphate buffer at dH 6 0 omml at J - / min-After equilibrating the column with the column. Enzyme solution is injected into the column with a flow rate of 0 5 cmVmin. The enzyme is eluted with sodium phosphate buffer 0.1 M PH 6.0 followed by a linear salt gradient of NaC! ascending 0-90%. The process is monitored at 280nm. During the elution of the enzyme fractions are collected, where the enzymatic activity is determined. Fractions containing the enzyme are pooled into one fraction. Inulinase D-mobilization: Immobilization can be effected in different media, such as activated charcoal together with sodium alginate as a gelling agent (Pat: 5,916,789), silica and glutaraldehyde, which produces a modified support containing crosslinking ( Pat.:5.998.183).One of the best methods for immobilizing this enzyme is using calcium alginate as described below: initially 3.5% of calcium alginate solubilized in distilled water is weighed. The mixture is heated to approximately 80 ° C so that complete alginate dissolution occurs. After the alginate is dissolved and cooled to 40 ° C, 2% of the enzyme solution is added. For the formation of the beads, the solution is pumped into a solution of 0.2 M calcium chloride in 0.1 M acetate buffer under agitation. E- Production of glucose and fructose-containing sugar syrup, whether or not enriched with fructooligosaccharides, from sucrose: A channeled column is packaged with the biocatalyst, represented by the immobilized enzyme calcium alginate beads, as described in D.A. Column temperature is controlled by heated water passing through the column jacket. The process temperature can be set between 40 and 60 ° C, the most commonly used being 50 ° C. The column is fed with 40% to 70% sucrose solution, the most used being 60%. The pH of the solution can be from 5.0 to 6.0, the most used being pH 5.0. The composition of the sugars at the outlet may vary depending on the process conditions (feed concentration, pH, temperature, biocatalyst concentration, enzymatic activity, column residence time). It is possible by varying the process conditions to obtain solutions at the column outlet containing only glucose and fructose or a mixture of sucrose, fructose and glucose enriched with up to 8% fructooligosaccharides. This product is suitable for the food industry, for functional, prebiotic and high soluble dietary fiber products.

Exemplo 1: Produção da inulinase por fermentação Para a fermentação do microrganismo Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus ATCC 16045, utilizando um meio composto de 30g/L de sacarose, lOg/L de extrato de levedura, 20g/L de peptona e 5g/L de K2HPO4, com 0 pH ajustado para 3,5, e incubando a 30 C por um período de 72 horas. A fermentação é realizadas em fermentadores com uma velocidade de agitação de 450 rpm e aeração de 0,5 wm. Durante todo 0 processo fermentativo a temperatura é mantida constante a 30°C. Não é necessário realizar um controle do pH durante a fermentação, pois a variação do mesmo não é significativa. Verifica-se que com 72 horas de fermentação a enzima atinge a máxima atividade enzimática.Example 1: Inulinase production by fermentation For the fermentation of the microorganism Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus ATCC 16045, using a medium composed of 30g / L sucrose, 10g / L yeast extract, 20g / L peptone and 5g / L K2HPO4, with pH adjusted to 3.5, and incubating at 30 ° C for a 72 hour period. Fermentation is carried out in fermenters with a stirring speed of 450 rpm and aeration of 0.5 wm. Throughout the fermentation process the temperature is kept constant at 30 ° C. It is not necessary to perform a pH control during the fermentation, because its variation is not significant. With 72 hours of fermentation the enzyme reaches the maximum enzymatic activity.

Exemplo 2 Recuperação da inulinase com etanol: O caldo fermentado é centrifugado a 1 OOOOg por 15 minutos a 4°C, em centrífuga refrigerada Usa-se 0 sobrenadante para a recuperação da enzima, descartando-se 0 precipitado. Inicialmente é determinado a atividade enzimática do sobrenadante para 0 cálculo do rendimento. Para a recuperação da enzima 0 etanol a -20°C é adicionado lentamente até atingir uma concentração de 70% com auxílio de uma bomba peristáltica. Todo processo é realizado a baixa temperatura, controlado com banho termostático, sob agitação branda de maneira tal que não ocorra uma desnaturação da enzima. Após adição do etanol, a solução é centrifugada a 1 OOOOg por 15 minutos a 4°C, utilizando-se centrífuga refrigerada. O precipitado contendo a enzima é ressuspendido em tampão fosfato 0,05M, pH 5,2. Os resultados obtidos com a recuperação da enzima estão apresentados a seguir: Atividade total do caldo bruto: 268,72 UI/mLExample 2 Recovery of Inulinase with Ethanol: The fermented broth is centrifuged at 100,000g for 15 minutes at 4 ° C in a refrigerated centrifuge. The supernatant is used for enzyme recovery and the precipitate discarded. Initially, the enzymatic activity of the supernatant is determined for yield calculation. For enzyme recovery Ethanol at -20 ° C is slowly added to 70% with the aid of a peristaltic pump. The whole process is carried out at low temperature, controlled with a thermostatic bath, under gentle agitation such that the enzyme is not denatured. After addition of ethanol, the solution is centrifuged at 100,000g for 15 minutes at 4 ° C using refrigerated centrifuge. The enzyme-containing precipitate is resuspended in 0.05M phosphate buffer, pH 5.2. The results obtained with enzyme recovery are as follows: Total broth activity: 268.72 IU / mL

Atividade total da enzima recuperada com etanol: 910,72 UI/mL Rendimento de recuperação da enzima: 85% Exemplo 3;Total enzyme activity recovered with ethanol: 910.72 IU / mL Enzyme recovery yield: 85% Example 3;

Purificação da enzima por cromatografia troca iônica O caldo bruto isento de células é filtrado em filtro 0,45 pm. Antes de injetar a amostra, a coluna é lavada com tampão fosfato de sódio 0,05M para a resina Q-sepharose FF, vazão de 2,0cm /min correspondendo a duas vezes o volume da coluna. A coluna é equilibrada com um volume correspondendo a 5 vezes o volume da coluna é ajustado o pH para 6,0. A amostra é mjetada num fluxo de 0,5cm /min. A eluição da enzima é realizada com tampão fosfato de sodto 0,05M pH 6,0, seguido de um gradiente salino linear ascendente 0-90% de NaC! 1M em tampao fosfato de sódio 0,05M a pH 6,0, com um fluxo de l,0cm3/min. O processo é monitorado a 280nm. Durante a eluição da enzima, são coletadas frações utilizando um coletor de frações. Nas frações são determinadas a atividade enzimática e o teor de proteína para o ca culo da atividade específica, fator purificação, rendimento e caracterização da enzima (S/I) Us resultados estão apresentados na tabelaOl e figura 01.Purification of the enzyme by ion exchange chromatography The cell-free crude broth is filtered through 0.45 pm filter. Before injecting the sample, the column is washed with 0.05M sodium phosphate buffer for Q-sepharose FF resin, flow rate 2.0cm / min corresponding to twice the column volume. The column is equilibrated with a volume corresponding to 5 times the column volume adjusted to pH 6.0. The sample is injected at a flow rate of 0.5cm / min. Elution of the enzyme is performed with 0.05M sodate phosphate buffer pH 6.0, followed by an upward linear salt gradient 0-90% NaCl. 1 M in 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 6.0, with a flow rate of 1.0 cm3 / min. The process is monitored at 280nm. During enzyme elution, fractions are collected using a fraction collector. In the fractions the enzymatic activity and the protein content for the specific activity calculation, purification factor, yield and characterization of the enzyme (S / I) are determined. The results are presented in table 01 and figure 01.

Exemplo 4: Produção do xarope contendo frutooligossacarídeos a partir da sacarose com inulinase de λluyveromyces marxianus var. bulgaricus Produção de xarope de açúcar contendo glicose e frutose, enriquecido ou não com frutooligossacarídeos, a partir de sacarose: a inulinase imobilizada em alginato de cálcio com atividade de 6 UI/mL foi empacotada numa coluna encamizada com a temperatura da coluna controlada por agua aquecida passando pela camisa da coluna a 50°C. A coluna é alimentada com solução de sacarose de 50%, com o pH da solução ajustado para 5,0.0 produto obtido no processo foram analisandos por cromatografia de íons (HPLC-PAD). Variou-se o tempo de residência na coluna de 0,5 a 7 horas. A composição centesimal após um período de 4 horas é a seguinte composição. Os resultados estão apresentados na Figura 2. Valores de tempo de residência entre 3 e 4 horas fornecem o máximo de oligossacarídeos (50g/L) com 150g/L de glicose e de fruiose e150 g/L de sacarose. Para tempos de residência acima de 8 horas obtêm-se somente glicose e fruiose. A Tabela 01: Apresenta os resultados da purificação da inulinase de Kluyveromyces maxianm /, 7™’Êm díeren!eS Val°reS de pH aPresen,ando: atividade total (U), proteína total enzfmat'Vldade fat0r de purificaçâo’ rendimento e S/I (caracterização da A Figura 01 :Apresenta um perfil cromatográfico da purificação da inulinase de bulgaHcUS em coiuna de troca aniônica Q-Sepharose FF pre en^do .bsorbanca (280nm), atividade em sacarose e em inulina e gradiente salino com Ml 1M em tampão fosfato de sódio 0.05M a pH6,0.Example 4: Production of fructooligosaccharide-containing syrup from sucrose with λluyveromyces marxianus var. Bulgaricus Production of glucose and fructose-containing sugar syrup, whether or not enriched with fructooligosaccharides, from sucrose: Inulinase immobilized on 6 IU / mL calcium alginate was packed in a column with the column temperature controlled by heated water. passing through the column jacket at 50 ° C. The column is fed with 50% sucrose solution, the pH of the solution adjusted to 5.0.0 product obtained in the process was analyzed by ion chromatography (HPLC-PAD). The residence time in the column was varied from 0.5 to 7 hours. The proximate composition after a period of 4 hours is the following composition. The results are shown in Figure 2. Residency time values between 3 and 4 hours provide the maximum oligosaccharides (50g / L) with 150g / L glucose and fruiose and 150g / L sucrose. For residence times over 8 hours only glucose and fruiosis are obtained. Table 01: Presents the results of Kluyveromyces maxianm / 7 ™ inulinase purification in pH values, with: total activity (U), total protein purification factor, yield and S Figure 1: Shows a chromatographic profile of the purification of bulgaHcUS inulinase in Q-Sepharose FF anion exchange column (280nm), sucrose and inulin activity and saline gradient with Ml 1M in 0.05M sodium phosphate buffer at pH 6.0.

Referências Citadas U.S. Patentes 4- 681-771 Julho, 1987 Adachi et al 5- 916-789 Junho, 1999 Webberseía/ 5-998,183 Dezembro,1999 LeFevree/a/ 5.541.097 -Julho, 1996 Lantero et al 4-397-949 Agosto, 1983 Peters etalCited References US Patents 4-681-771 July, 1987 Adachi et al 5- 916-789 June, 1999 Webberseía / 5-998,183 December, 1999 LeFevree / a / 5,541,097 -July, 1996 Lantero et al 4-397-949 August 1983 Peters etal

Claims

1. PRODUCTION OF SUGAR SYRUP CONTAINING FRUCTOSE AND GLUCOSE, ENRICHED OR NOT WITH FRUTOOLIGOSACARIDES, FROM SACAROSE, characterized by the following steps: - Production of the enzyme inulinase from Kluyvermyces sp. steps of: a) inoculation of the microorganism Kluyvermyces sp in a culture medium containing 1.4 to 3.0% molasses; from 1.0 to 2.0% prodex lac; 1.0 to 2.0 maize maceration water; and 1.0 to 5.0% K2HP04 in a pH range of 3 to 5 and incubated in a temperature range of 20 to 35 ° C in biofermentors at 150 rpm for a period of 72 hours; b) obtaining a fermented broth; c) centrifuging the fermented broth obtained in step (b) at 1100,000g x 10 minutes over a temperature range of 4 to 6 ° C; and d) obtaining the extracellular enzyme and a supernatant; - Recovery of the enzyme inulase using ethanol and the steps of: e) slowly adding ethanol at -15 ° C to the supernatant obtained in (d) maintained at 4 ° C until the solution reached a 70% ethanol saturation for enzyme precipitation; f) centrifuging the solution obtained in step (e) at 11.100g x 15 minutes over a temperature range of 4 to 6 ° C; g) obtaining a precipitate and a supernatant; and h) distilling the supernatant obtained in (g) for ethanol recovery, whereby the resulting vinasse is discarded and the precipitate resuspended in 0.05M sodium phosphate buffer apH 5.0. Purification of the enzyme inulinase employing ion chromatography and the steps of: i) filtration of the enzyme solution resuspended in sodium phosphate buffer; j) washing the ion exchange column with 0.1 M sodium phosphate buffer at pH 6.0 with a flow rate of 2.0 cm3 / min. until equilibrium of said column; k) injection of the enzyme solution filtered in step (i) into the column at a flow rate of 0.5 cm / min .; l) elution of the enzyme with 0.1 M sodium phosphate buffer at pH 6.0, followed by a linear 0-90% ascending NaCl salt gradient, during which different fractions are collected, in which activity is determined. enzymatic; m) pooling, in a single fraction, all fractions collected in step (1) that showed enzymatic activity; and n) Obtaining a fraction containing the purified inulinase enzyme. - Immobilization of the purified inulinase enzyme obtained from step (n) on solid support employing calcium alginate; - Assembly of fixed bed column containing biocatalyst; - Conversion of sucrose syrup into fructose and glucose containing syrup, whether or not enriched with fructooligosaccharides; and - Obtaining sucrose syrup containing fructose and glucose, whether or not enriched with fructooligosaccharides.

Process according to Claim 1, characterized in that step (1) comprises a 280nm monitoring.

Process according to claim 1, characterized in that the different fractions collected in step (1) comprise three fractions.

Process according to Claim 1, characterized in that the inulinase enzyme purification step preferably comprises a pH range between 5 and 7.

Process according to Claim 1, characterized in that the inulinase enzyme purification step preferably comprises a temperature range between 15 and 20 ° C.

Process according to Claim 1, characterized in that the step of immobilizing the solid-inulinase enzyme employing calcium alginate preferably comprises the steps of: i. Heating to approximately 80 ° C a mixture comprising 3,5% water-solubilized calcium alginate until the alginate has completely dissolved; ii. cool to 40 ° C, the mixture obtained in (i); iii. adding 2% of the enzyme solution obtained in () to the cooled mixture in (ii); iv. pumping the solution obtained in (iii) over a 0.2 M calcium chloride solution in 0.1 M acetate buffer under agitation; and v. obtaining a biocatalyst comprising calcium alginate beads containing the immobilized enzyme.

Process according to Claims 1 and 6, characterized in that the step of assembling the fixed-bed column comprises packaging a jacketed column with the biocatalyst obtained in step (v).

Process according to Claims 1 and 7, characterized in that the sucrose syrup conversion step comprises the steps of: • controlling the temperature of the jacketed column with the biocatalyst with heated water passing through the column jacket; and • feeding the spine with 40 to 70% sucrose solution.

Process according to Claim 8, characterized in that the temperature of the sucrose syrup conversion step may be set within a range of 40 to 60 ° C.

Process according to Claim 9, characterized in that it preferably comprises a temperature of 50 ° C.

Process according to Claim 8, characterized in that the concentration of the sucrose solution comprises a range of 40 to 70%.

Process according to Claim 11, characterized in that the concentration of the sucrose solution preferably comprises 60%.

Process according to Claim 8, characterized in that the sucrose solution may be in a pH range from 5 to 6.

Process according to Claim 13, characterized in that the pH of the sucrose solution preferably comprises pH 5.