BG65723B1

BG65723B1 - Method for determining the medicamentous stability of microorganisms of spec. micobacterium

Info

Publication number: BG65723B1
Application number: BG108464A
Authority: BG
Inventors: Тодор КАНТАРДЖИЕВ; Стефан ПАНАЙОТОВ
Original assignee: Тодор КАНТАРДЖИЕВ; Стефан ПАНАЙОТОВ
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2003-12-17
Publication date: 2009-08-31
Also published as: BG108464A

Abstract

By the method the medicamentous stability of microorganism of spec. Micobacterium is expressed in vitro in liquid nutritive medium. It can be used in TB dispensaries, hospitals and research institutes.

Description

Изобретението се отнася до областта медицинска микробиология и е широко приложимо в противотуберкулозните диспансери, болници и научноизследователски институти.The invention relates to the field of medical microbiology and is widely applicable in TB dispensaries, hospitals and research institutes.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Известно е, че нитрат-редуктазната активност се използва като биохимичен белег за идентифициране на някои микроорганизми от род Mycobacterium /2, 3/.Nitrate reductase activity is known to be used as a biochemical marker for the identification of certain microorganisms of the genus Mycobacterium (2,3).

На базата на нитрат-редуктазната активност е известен и метод за определяне на лекарствената устойчивост на Mycobacterium tuberculosis (Калфин, Е., Енгибаров А., 1989 /1/, рутинно използван за диагностика на туберкулозата в България. Този метод е модифициран от Panaiotov, St. и Kantardjiev, Т., /4/ и включва следната последователност от операции: в епруветки, съдържащи плътната хранителна среда на Lowenstein-Jensen /1,6/, се добавят противотуберкулозни лекарствени средства и калиев нитрат (KNO₃) и се стерилизира; прави се посявка на болестотворни микроорганизми, поспециално туберкулозни микобакгерии; култивира се в продължение на 8 до 10 дни при 37°С, добавят се малки количества кристален нитрат редуктазен реагент, описан от Lamps /2/ и Warren /3/ и в случай на устойчивост на микобактерията към съответното лекарствено средство, се получава вишневочервено оцветяване, резултат на редукцията на KNO₅.Based on nitrate reductase activity, a method for determining the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis is known (Kalfin, E., Engibarov A., 1989/1), routinely used for the diagnosis of tuberculosis in Bulgaria. This method is modified by Panaiotov, St. and Kantardjiev, T., (4) and includes the following sequence of operations: anti-tuberculosis drugs and potassium nitrate (KNO ₃ ) are added to tubes containing the Lowenstein-Jensen solid media (KNO ₃ ) and sterilized. ; sowing of pathogens, especially tuberculosis, is done cultivated for 8 to 10 days at 37 ° C, add small amounts of crystalline nitrate reductase reagent described by Lamps (2) and Warren (3) and in case of mycobacterium resistance to the respective drug, receives cherry red color resulting from the reduction of KNO ₅ .

В RU 2 099 425,1997 /5/, се описва метод за определяне на лекарствената устойчивост на туберкулозни микобакгерии, който се състои в това, че твърда хранителна среда на Попеску, съдържаща различни химиопрепарати и натриев нитрат, се залива с дестилирана вода, след което се посява с изследваната култура от туберкулозни микобакгерии и инкубирането продължава 4-7 дни. Наличието наръждивочервено оцветяване на дестилираната вода показва, че културата е устойчива на лекарственото средство, а отсъствието на такова оцветяване - че е чувст вителна спрямо дадения лекарствен препарат.In RU 2 099 425,1997 (5), a method for determining the drug resistance of tuberculosis mycobacteria is described, which consists in the fact that Popescu's solid nutrient medium containing various chemotherapeutic agents and sodium nitrate is flooded with distilled water, after which was inoculated with the tuberculosis mycobacterium culture tested and the incubation continued for 4-7 days. The presence of a reddish coloration of the distilled water indicates that the culture is drug resistant and the absence of such coloration is sensitive to the particular drug.

Общ недостатък на цитираните по-горе методи е, че се отнасят само за вида Mycobacterium tuberculosis; освен това, използваният реактив се приготвя в момента на прилагане, а резултата е нетраен и оцветяването изчезва за 30 до 60 s.A general disadvantage of the methods cited above is that they apply only to Mycobacterium tuberculosis; in addition, the reagent used is prepared at the time of administration and the result is imperfect and the coloration disappears within 30 to 60 s.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

Методът, съгласно изобретението, представлява in vitro определяне на лекарствената устойчивост на микроорганизми от род Mycobacterium и включва следната последователност от операции: хранителна среда с неутрално pH, съдържаща яйчен жълтък от 15 до 20 ml, глицерол от 1.5 до 2 ml, калиев нитрат от 0.1 до 0.2 g, соли на Middlebrook 7Н9 /6/ в количество 0.450.47 h и вода до 100 ml се стерилизира при 75°С за 90 min. След стерилизацията се добавят под формата на дискове противотуберкулозни лекарствени средства, избрани от групата, включваща стрептомицин, изониазид, етамбутол, рифампин и пиразинамид и непосредствено след това се извършва посяване на определената за изследване култура от микобакгерии. След 1- до 6дневно култивиране, в зависимост от изследвания микобактериален щам, се добавя 0.5 ml от 0.015% кристален нитрат редуктазен реагент на Lampe /2/, разтворени във вода. В резултат устойчивите на лекарственото средство микроорганизми реагират с трайно (повече от 5 h) вишневочервено оцветяване, а при чувствителните микроорганизми оцветяване не се наблюдава.The method according to the invention is the in vitro determination of drug resistance of Mycobacterium microorganisms and includes the following sequence of operations: neutral pH medium containing egg yolk 15 to 20 ml, glycerol 1.5 to 2 ml, potassium nitrate 0.1 to 0.2 g, Middlebrook 7H9 (6) salts in an amount of 0.450.47 h and water to 100 ml were sterilized at 75 ° C for 90 min. After sterilization, anti-tuberculosis drugs, selected from the group comprising streptomycin, isoniazid, ethambutol, rifampin and pyrazinamide, are added in the form of discs, and the culture of the mycobacterium culture assay determined for the test is performed immediately. After 1-6 days of cultivation, depending on the mycobacterial strain tested, 0.5 ml of 0.015% crystalline nitrate reductase reagent of Lampe (2) dissolved in water was added. As a result, drug-resistant microorganisms respond with persistent (more than 5 h) cherry red coloration, and no coloration is observed in susceptible microorganisms.

Предимствата на метода, съгласно изобретението се състоят на първо място в това, че реакцията протича в течна среда, което съкращава значително времето за отчитане на резултата (за бьрзорастящи микобакгериални видове с нитрат редуктазна активност отчитането става на 1-я до 3-ти ден); в съчетание с използването на реактива на Lampe, този резултат е трайно визуализиран в продължение на повече от 5 h; компонентите на средата, в съчетание с неутрално pH, съгласно изобретението, дава възможност за провеждане и на тест за чувствителност към пиразинамид, тъй като е известно, че киселото pH инхибира растежа на микобактериите; чрез метода се избягва стерилизирането на хранителната среда заедно с използваните лекарствени средства, като по този начин се избягва тяхнотоThe advantages of the process according to the invention are first of all that the reaction takes place in a liquid medium, which significantly shortens the time to read the result (for fast growing mycobacterial species with nitrate reductase activity, the counting takes place from day 1 to day 3) ; in combination with the use of a Lampe reagent, this result is permanently displayed for more than 5 hours; the components of the medium, in combination with the neutral pH according to the invention, also enables the pyrazinamide sensitivity test to be conducted, since acidic pH is known to inhibit the growth of mycobacteria; the method avoids sterilization of the culture medium with the medicines used, thus avoiding their sterilization.

65723 Bl инактивиране.65723 Bl inactivation.

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обхват:The invention is illustrated by the following exemplary embodiments, without limiting its scope:

Пример 1. Контролно изпитване за чувствителност наМ. tuberculosis към стрептомицинExample 1. Control test for sensitivity of M. tuberculosis to streptomycin

Към 15 ml яйчен жълтък се добавят 2 ml глицерол, 0.1 g KNO₃,0.47 g соли на Middlebrook 7Н9 /6/ и обема се допълва до 100 ml с дестилирана вода. Солите на Middlebrook 7Н9 представляват комбинация, използвана в среда за култивиране на микобактерии, включваща за 11 среда амониев сулфат 0.5 g, калиев фосфат 1.5 g, натриев фосфат 1.5 g, натриев цитрат 0.4 g и минимални количества други сулфати.To 15 ml of egg yolk was added 2 ml of glycerol, 0.1 g of KNO ₃ , 0.47 g of Middlebrook 7H9 / 6 / salts and the volume was made up to 100 ml with distilled water. Middlebrook 7H9 salts are a combination used in a mycobacterial culture medium, including for 11 media ammonium sulfate 0.5 g, potassium phosphate 1.5 g, sodium phosphate 1.5 g, sodium citrate 0.4 g and minimal amounts of other sulfates.

Средата се разбърква, филтрува и стерилизира в епруветки по 5 ml. Изследват се два международно признати щама на М. tuberculosis и по-специално H37Rv- чувствителен и АТСС 35820-резистентен на стрептомицин. Посредством обичайните микробиологични техники се посяват по 3 контролни епруветки без лекарствен препарат за всеки щам и по една епруветка, съдържаща съответно дискове от по 4 microg/ml и 10 microg/ml стрептомицин. След култивиране в продължение на 4 дни при 37°С, в първата контролна епруветка се добавят 0.5 ml от 0.015% разтвор на кристален нитрат редуктазен реагент на Lampe /2/ във вода.The medium was stirred, filtered and sterilized into 5 ml tubes. Two internationally recognized strains of M. tuberculosis, in particular H37Rv-sensitive and ATCC 35820-resistant streptomycin, are being studied. Using standard microbiological techniques, 3 non-drug control tubes are sown for each strain and one tube containing discs of 4 µg / ml and 10 µg / ml streptomycin, respectively. After culturing for 4 days at 37 ° C, 0.5 ml of 0.015% solution of crystalline nitrate reductase reagent of Lampe (2) in water was added to the first control tube.

Появата на вишневочервено оцветяване показва, че микроорганизмите са достигнали стадий на развитие, при който проявяват нитрат редуктазна активност и тогава към останалите епруветки също се добавя реактива на Lampe и резултата се отчита.The appearance of cherry red staining indicates that the microorganisms have reached a stage of development in which they exhibit nitrate reductase activity and then Lampe reagent is also added to the other tubes and the result is taken into account.

При липса на оцветяване, отчитането се повтаря с втората контрола на следващия ден. Крайното отчитане на контролните щамове трябва да показва, че щам H37Rv в присъствие на стрептомицин не дава оцветяване, т.е. той е чувствителен, а щам М. tuberculosis АТСС 35820 дава вишневочервено оцветяване, поради което е устойчив на стрептомицин.In the absence of staining, the reading is repeated with the second control the next day. The final reading of the control strains should indicate that the H37Rv strain in the presence of streptomycin does not produce a staining, i.e. it is sensitive, and the M. tuberculosis strain ATCC 35820 gives cherry red color, making it resistant to streptomycin.

Пример 2. Изпитване за чувствителност на клиничен изолат към пиразинамидExample 2. Clinical isolate susceptibility test for pyrazinamide

Към 15 ml яйчен жълтък се добавят 2 ml глицерол, 0.1 g KNO₃,0.47 g соли на средата на Middlebrook 7Н9 /6/ и обема се допълва до 100 ml с дестилирана вода. Средата се разбърква, филтрува и стерилизира в епруветки по 5 ml.To 15 ml of egg yolk was added 2 ml of glycerol, 0.1 g of KNO ₃ , 0.47 g of medium salts of Middlebrook 7H9 / 6 / and the volume was made up to 100 ml with distilled water. The medium was stirred, filtered and sterilized into 5 ml tubes.

Изследват се клинични изолати на М. tuberculosis, взети от болница Искрец, България. Посредством обичайните микробиологични техники се посяват по 3 контролни епруветки без лекарствен препарат за всеки щам и по една епруветка, съдържаща съответно дискове от по 4.5 mg/ml и 5 mg/ml пиразинамид. След култивиране в продължение на 4 дни при 37°С, в първата контролна епруветка се добавят 0.5 ml от 0.015% разтвор на кристален нитрат редуктазен реагент на Lampe /2/ във вода. Появата на вишневочервено оцветяване показва, че микроорганизмите са достигнали стадий на развитие, при който проявяват нитрат редуктазна активност и тогава към останалите епруветки също се добавя реактива на Lampe и резултата се отчита.Clinical isolates of M. tuberculosis, taken from Iskrets Hospital, Bulgaria, were investigated. Using conventional microbiological techniques, 3 non-drug control tubes are seeded for each strain and one tube containing 4.5 mg / ml and 5 mg / ml pyrazinamide respectively. After culturing for 4 days at 37 ° C, 0.5 ml of 0.015% solution of crystalline nitrate reductase reagent of Lampe (2) in water was added to the first control tube. The appearance of cherry red staining indicates that the microorganisms have reached a stage of development in which they exhibit nitrate reductase activity and then Lampe reagent is also added to the other tubes and the result is taken into account.

При липса на оцветяване, отчитането се повтаря с втората контрола на следващия ден. Изводът при крайното отчитане на резултатите от изпитване на клиничните изолати в присъствие на пиразинамид е аналогичен на този в Пример 1 - при липса на оцветяване микроорганизма е чувствителен, а при наличие на вишневочервено оцветяване, изследваният изолат е устойчив на пиразинамид.In the absence of staining, the reading is repeated with the second control the next day. The conclusion in the final reading of the clinical isolate test results in the presence of pyrazinamide is analogous to that in Example 1 - in the absence of staining, the microorganism is sensitive, and in the presence of cherry red color, the test isolate is resistant to pyrazinamide.

Пример 3. Изпитване за чувствителност на клиничен изолат към етамбутолExample 3. Clinical isolate susceptibility test for ethambutol

Изпитването се провежда при условията на Пример 1, с тази разлика, че противотуберкулозното лекарствено средство е етамбутол в концентрация 2 mg/ml и 3 mg/ml.The test was carried out under the conditions of Example 1, except that the anti-tuberculosis drug was ethambutol at a concentration of 2 mg / ml and 3 mg / ml.

Изводът при крайното отчитане на резултатите от изпитване на клинични изолати на М. tuberculosis в присъствие на етамбутол, е аналогичен на този в Пример 1 - при липса на оцветяване микроорганизма е чувствителен, а при наличие на вишневочервено оцветяване, изследваният изолат е устойчив на етамбутол.The conclusion in the final reading of the results of the test of clinical isolates of M. tuberculosis in the presence of ethambutol is similar to that in Example 1 - in the absence of staining, the microorganism is sensitive, and in the presence of cherry red color, the test isolate is resistant to ethambutol.

Пример 4. Изпитване за чувствителност на микобактериални видове, различни от М. tuberculosis, които проявяват нитратредукгазна активност към лекарствени средстваExample 4. Susceptibility test for mycobacterial species other than M. tuberculosis exhibiting nitroreducase activity against drugs

Изследват се добре охарактеризирани микобактериални щамове на М. kansasii от международни колекции, които проявяват нитратредуктазна активност.Well-characterized mycobacterial M. kansasii strains from international collections that exhibit nitreductase activity have been investigated.

Към 15 ml яйчен жълтък се добавят 2 ml глицерол 0.1 g KNO₃, 0.47 g соли на средата на Middlebrook 7Н9 /6/ и дестилирана вода до 100 ml. Средата се разбърква, филтрува и стерили3To 15 ml of egg yolk was added 2 ml of glycerol 0.1 g of KNO ₃ , 0.47 g of medium salts of Middlebrook 7H9 (6) and distilled water to 100 ml. The medium is stirred, filtered and sterile3

65723 Bl зира в епруветки по 5 ml. Изследват се два щама на М. kansasii, избрани от колекцията на АТСС. Посредством обичайните микробиологични техники се посяват по 3 контролни епруветки без лекарствен препарат за всеки щам и по една 5 епруветка, съдържаща съответно дискове от по 4 microg/ml и 10 microg/ml стрептомицин. След култивиране в продължение на 1 ден при 37°С, в първата контролна епруветка се добавят 0.5 ml от 0.015% разтвор на кристален нитрат редукта- 1 ( зен реагент на Lampe /2/ във вода. Появата на вишневочервено оцветяване показва, че микроорганизмите са достигнали стадий на развитие, при който проявяват нитрат редуктазна активност и тогава към останалите епруветки също се до- L бавя реактива на Lampe и резултата се отчита.65723 Bl in 5 ml tubes. Two M. kansasii strains selected from the ATSC collection were studied. Using standard microbiological techniques, 3 non-drug control tubes are seeded for each strain and one 5 tube containing discs of 4 µg / ml and 10 µg / ml streptomycin, respectively. After culturing for 1 day at 37 ° C, 0.5 ml of 0.015% solution of crystalline nitrate reductive-1 (Lampe / 2 / zen reagent in water) is added to the first control tube. The appearance of cherry red color indicates that the microorganisms are have reached a stage of development in which they exhibit nitrate reductase activity and then add Lamp reagent to the other tubes and report the result.

При липса на оцветяване, отчитането се повтаря с втората контрола на следващия ден. Изводът при крайното отчитане на резултатите от изпитване на щамовете М. kansasii в присъствие 21 на стрептомицин е аналогичен на този в Пример 1 - липсата на оцветяване за щам М. kansasii означава, че микроорганизма е чувствителен, а наличието на вишневочервено оцветяване за щам М. kansasii показва, че микроорганизма е ус- 2: тойчив на стрептомицин.In the absence of staining, the reading is repeated with the second control the next day. The conclusion from the final reading of the test results of M. kansasii strains in the presence of streptomycin 21 is similar to that in Example 1 - the lack of staining for M. kansasii strain means that the microorganism is sensitive and the presence of cherry red staining for M. strain. kansasii shows that the microorganism is successful: streptomycin-sensitive.

Патентни претенцииClaims

Claims

1. A method for determining the drug resistance of Mycobacterium microorganisms in an egg yolk-based culture medium with the participation of nitrate reductase reagent, characterized in that the culture medium containing egg yolk, glycerol, potassium nitrate, Middlebrook 7H9 salts and water is sterilized, tuberculosis drugs are added, and the microorganisms identified for the assay are sown, and after 1- to 6-day cultivation, an aqueous solution of Lampe crystalline nitrate reductase reagent is added.

A method according to claim 1, characterized in that the nutrient medium comprises the following components: egg yolk from 15 to 20 ml, glycerol from 1.5 to 2 ml, potassium nitrate from 0.1 to 0.2 g and 0.45 to 0.47 g of salts in the medium of Middlebrook 7H9 and water to 100 ml.

Method according to claim 1, characterized in that the anti-tuberculosis drugs are disposed in the nutrient medium in the form of disks and are selected from the group consisting of streptomycin, isoniazid, ethambutol, rifampin and pyrazinamide.

Literature

1. Kalfin, E., Engibarov, A. 1989. Collection of instructional materials on microbiological diagnostics of bacterial infections. Volume 1. pp. 118-127. Ed. Ministry of Public Health and Social Welfare, Sofia, Bulgaria.

2. Lampe, A. S. 1981. Nonliquid reagent for detecting nitrate reduction. J. Clin. Microbiol. 14: 452-454.

3. Warren, N. G., B. A. Body, and Η. P. Dalton. 1983. An improved reagent for mycobacterial nitrate reductase test. J. Clin. Microbiol. 18: 546-549.

4. Panaiotov, St., Kantardjiev, T., 2002. J. Clin. Microb., Oct. 2002, p. 3881-3882.

5. RU 2 099 425, 1997.