BG2786U1 - Device for differential counting of microparticle in biological liquids - Google Patents
Device for differential counting of microparticle in biological liquids Download PDFInfo
- Publication number
- BG2786U1 BG2786U1 BG3717U BG371717U BG2786U1 BG 2786 U1 BG2786 U1 BG 2786U1 BG 3717 U BG3717 U BG 3717U BG 371717 U BG371717 U BG 371717U BG 2786 U1 BG2786 U1 BG 2786U1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- lens
- chip
- sample
- counting
- liquid
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Description
(54) УСТРОЙСТВО ЗА ДИФЕРЕНЦИАЛНО БРОЕНЕ НА МИКРОЧАСТИЦИ В БИОЛОГИЧНИ ТЕЧНОСТИ (57) Полезният модел се отнася до устройство за диференциално броене на биологични клетки, суспендирани в течност, което може да се използва като флуоресцентна автоматизирана система за броене на клетки и може да намери приложение при броене и диференциране на микрочастици в биологични течности като мляко, кръв, урина, включително различаване на клетки от други частици, както и на различни видове клетки в сурови млечни проби. Състои се от корпус, в който са разположени обектив, под който е поместен чип с микрофлуидни камери, в които е поместена проба от биологична течност, подлежаща на изследване, заснемаща CCD камера, преброяваща част и механизъм за(54) DEVICE FOR DIFFERENTIAL COUNTING OF MICROPARTICLES IN BIOLOGICAL LIQUIDS (57) The utility model refers to a device for differential counting of biological cells suspended in a liquid that can be used as an automated fluorescent system in counting and differentiating microparticles in biological fluids such as milk, blood, urine, including distinguishing cells from other particles, as well as different cell types in raw milk samples. It consists of a housing in which a lens is located, under which a chip with microfluidic chambers is placed, in which a sample of biological liquid to be tested is placed, a CCD camera, a counting part and a mechanism for
2786 UI преместване на пробата, при което към пробата е насочен осветител, а в обектива (2) е разположена най-малко една течна леща (7), а чипът (4) е изпълнен като CD базиран чип, с кръгла форма, по която са оформени микрофлуидни камери (21), разположени по периферията на чипа (4), който е свързан директно със задвижващ двигател (24), при което осветителят (3) е разположен над равнината, в която е разположен CD базираният чип (4), като е ориентиран под ъгъл така, че да осигурява ъгъл на осветяване с минимално отражение, а преброяващата част е изпълнена като микропроцесор (25), свързан с генератор (8), управляващ течните лещи (7).2786 UI displacement of the sample, in which an illuminator is directed to the sample, and at least one liquid lens (7) is located in the lens (2), and the chip (4) is made as a CD-based chip, with a round shape, on which are formed microfluidic chambers (21) located on the periphery of the chip (4), which is directly connected to the drive motor (24), wherein the illuminator (3) is located above the plane in which the CD-based chip (4) is located, being oriented at an angle so as to provide an angle of illumination with minimal reflection, and the counting part is made as a microprocessor (25) connected to a generator (8) controlling the liquid lenses (7).
претенции, 14 фигуриclaims, 14 figures
2786 UI (54) УСТРОЙСТВО ЗА ДИФЕРЕНЦИАЛНО БРОЕНЕ НА МИКРОЧАСТИЦИ В БИОЛОГИЧНИ ТЕЧНОСТИ2786 UI (54) DEVICE FOR DIFFERENTIAL COUNTING OF MICROPARTICLES IN BIOLOGICAL LIQUIDS
Област на техникатаField of technology
Полезният модел се отнася до устройство за броене на биологични клетки, суспендирани в течност, което може да използва като флуоресцентна автоматизирана система за броене на клетки и може да намери приложение при броене и диференциране на микрочастици в биологични течности като мляко, кръв, урина, включително различаване на клетки от други частици, както и на различни видове клетки в сурови млечни проби.The utility model refers to a device for counting biological cells suspended in a liquid, which can be used as a fluorescent automated cell counting system and can find application in counting and differentiating microparticles in biological fluids such as milk, blood, urine, including distinguishing cells from other particles, as well as different cell types in raw milk samples.
Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION
Сред много параметри, определящи качеството на млякото, бактериалните (ВСС) и броят на соматичните клетки (SCC) са от изключително значение, тъй като те оказват значително влияние върху качеството на млечните продукти, като едновременно с това предоставят актуална информация за здравословното състояние на кравите.Among the many parameters that determine milk quality, bacterial (SJC) and somatic cell count (SCC) are of paramount importance, as they have a significant impact on the quality of dairy products, while providing up-to-date information on the health of cows. .
Общият брой на соматични клетки (SCC) е признат показател за здравето на кравите и качеството на млякото. Соматични клетки са бели кръвни клетки, известни като левкоцити (лимфоцити, гранулоцити, моноцити и макрофаги) и произхождат от вимето на животното, като броят им зависи от клетъчна имунна защита. Броят на тези клетки може да се увеличи в отговор на бактериални инфекции, които могат да причинят мастит. Именно по тази причина преброяването на соматични клетки, диференциално броене и идентификация на левкоцити в млякото е от съществено значение за диагнозата на мастит. SCC е показател за наличието на инфекция и възпаление на млечната жлеза на млечните крави, наречени мастит.Total somatic cell count (SCC) is a recognized indicator of cow health and milk quality. Somatic cells are white blood cells known as leukocytes (lymphocytes, granulocytes, monocytes and macrophages) and originate from the udder of the animal, the number of which depends on cellular immune protection. The number of these cells may increase in response to bacterial infections that can cause mastitis. It is for this reason that somatic cell counting, differential counting and identification of leukocytes in milk are essential for the diagnosis of mastitis. SCC is an indicator of the presence of infection and inflammation of the mammary gland of dairy cows, called mastitis.
Обикновено мляко от здрави крави има помалко от 100,000 клетки/ml, стойности по-високи от 300,000 клетки/ml показват заразени крави, а стойности над 1,000,000 клетки/ml са типичен показател за болни крави. Граничната стойност за консумация от човека или за по-нататъшна преработка в хранителни продукти за консумация от човека, е под 400,000 клетки/ml в Европа, но може да бъде по-висока в САЩ. Като цяло, крави с SCC по-висок от 300,000 клетки/ml се разглеждат като заразени (Smith, KL, в стандарти за соматични клетки в млякото: физиологични и Уредба (1996), Международната федерация на млечен мастит, бюлетин септември, стр. 7).Typically, milk from healthy cows has less than 100,000 cells / ml, values higher than 300,000 cells / ml indicate infected cows, and values above 1,000,000 cells / ml are typical for sick cows. The limit for human consumption or for further processing into food for human consumption is below 400,000 cells / ml in Europe, but may be higher in the United States. In general, cows with an SCC higher than 300,000 cells / ml are considered infected (Smith, KL, in somatic cell standards in milk: Physiological and Regulation (1996), International Federation of Milk Mastitis, September Bulletin, p. 7). ).
За да се оцени качеството на млякото е необходимо да се използват апарати, които позволяват да се извърши надеждно и точно броене на соматични клетки. През последните години са разработени преносими автоматични анализатори, по-специално флуоресцентни образни цитометри, на базата на директен микроскопски флуоресцентен метод за броене на соматични клетки, като по-известни устройства за такъв анализ са „ADAM SCC“, използващ цифрова технология за целите на броене и анализ; NucleoCounter SCC 100 Chemometec; DCC на DeLaval; и флуоресцентни устройства, базирани на проточна цитометрия; Somacount 150 Bentley инструменти; SomascopeTM на Delta Instruments, FossoMatic 4000TM на Foss Electric).In order to assess the quality of milk, it is necessary to use devices that allow reliable and accurate counting of somatic cells. In recent years, portable automatic analyzers, in particular fluorescent imaging cytometers, have been developed on the basis of a direct microscopic fluorescent method for somatic cell counting, with more well-known devices for such analysis being the ADAM SCC using digital technology for counting purposes. and analysis; NucleoCounter SCC 100 Chemometec; DeLaval DCC; and fluorescent devices based on flow cytometry; Somacount 150 Bentley tools; SomascopeTM by Delta Instruments, FossoMatic 4000TM by Foss Electric).
Споменатите проточни автоматични анализатори се основават на монохромна флуоресценция и определят само общият брой на клетките. При тях пробата на потока минава през много малък диаметър, което позволява преминаване само на една клетка и прилагане на преброяването (Gunasekera Т. S. и др. 2003 г., Фън W. и др. 2004 г.). При споменатите анализатори като маркери се използват флуоресцентни багрила: етидиев бромид, пропидиев йодид и DAPI (Gonzalo В. et AL 2004, Wallen СА сътр 1982.).Said flow-through automatic analyzers are based on monochrome fluorescence and determine only the total number of cells. In them, the flow sample passes through a very small diameter, which allows the passage of only one cell and the application of the count (Gunasekera T. S. et al. 2003, Feng W. et al. 2004). In the mentioned analyzers fluorescent dyes are used as markers: ethidium bromide, propidium iodide and DAPI (Gonzalo B. et AL 2004, Wallen CA et al. 1982).
Пробите се вземат от индивидуални животни във фермите и се изпращат в централизирани лаборатории, оборудвани с проточни цитометри за изброяване на общия брой соматични клетки.Samples are taken from individual farm animals and sent to centralized laboratories equipped with flow cytometers to count the total number of somatic cells.
Скъпите анализи са свързани основно с наличните в момента технологии и автоматични анализаторни апарати, които са конструирани на базата на оптични или електрически измервания.Expensive analyzes are mainly related to currently available technologies and automatic analyzers, which are constructed on the basis of optical or electrical measurements.
Известни са апарати, при които се извършват оптични измервания, като за целта е необходимо първоначално, преди анализа, клетките да бъдат етикетирани, поради което обикновено тези апарати използват скъпи химически реагенти или са предназначени за еднократна употреба.Apparatus for performing optical measurements are known, and for this purpose it is necessary to label the cells first before the analysis, which is why these apparatuses usually use expensive chemical reagents or are intended for single use.
Известни са също така апарати, които работят на принципа на електрически измервания, при които резултатът се получава чрез анализ на съпротивление, при което наличието на други клетъчни млечни частици пречи и по тази причина те трябва да бъдат отстранени чрезApparatus operating on the principle of electrical measurements are also known, in which the result is obtained by resistance analysis, in which the presence of other cellular milk particles interferes and therefore they must be removed by
2786 UI прилагане на няколко етапа на центрофугиране. Именно поради това, такива устройства не могат да бъдат използвани директно, на място, при млекопроизводителя и се правят много усилия за опростяване на методите и намаляване на разходите за анализ.2786 UI application of several stages of centrifugation. That is why such devices cannot be used directly, on site, at the dairy farmer and a lot of effort is made to simplify the methods and reduce the cost of analysis.
Известни са и се използват в практиката електронни инструменти, каквито са така наречените Coulter броячи, които могат да разчитат клетки и ги дискриминират по размер. Тъй като суровото мляко съдържа много частици, предимно мастни глобули с размер подобен на левкоцитите (5-10 μΜ), тези инструменти не осигуряват надеждно клетъчно броене, тъй като тези частици са повече от соматичните клетки и силно затрудняват точното измерване. Следователно, тези частици трябва да бъдат отделени от соматичните клетки преди измерването. Това се постига чрез центрофугиране, при което клетките се утаяват и мастните глобули се отделят от супернатантата.Electronic instruments, such as the so-called Coulter counters, are known and used in practice, which can read cells and discriminate against them in size. Because raw milk contains many particles, mostly fat globules similar in size to leukocytes (5-10 μΜ), these instruments do not provide reliable cell counting, as these particles are larger than somatic cells and make it very difficult to measure accurately. Therefore, these particles must be separated from the somatic cells before measurement. This is achieved by centrifugation, in which the cells are precipitated and the fat globules are separated from the supernatant.
Значителен брой методи са разработени за диференциално определяне на клетки с помощта на специфични антитела, които обаче имат приложение в областта на хуманната медицина, по-специално при обработване на кръвни проби. Тези методи дават много по-добра селективност и чувствителност на измерване, която се дължи на специфична имунна реакция антитяло-антиген. Herzenberg и Loken са разработили метод за преброяване на клетките с помощта на моноклонални антитела (Herzenberg Loken et all. 1976 & 1977), който се нарича двуцветна имунофлуоресценция.A significant number of methods have been developed for the differential determination of cells using specific antibodies, which, however, have applications in the field of human medicine, in particular in the processing of blood samples. These methods give much better selectivity and sensitivity to measurement due to a specific antibody-antigen immune response. Herzenberg and Loken developed a method for counting cells using monoclonal antibodies (Herzenberg Loken et al. 1976 & 1977), which is called bicolor immunofluorescence.
Известни са множество апарати, базирани на образна цитометрия, за броене и диференциране на микрочастици в биологични течности като мляко, кръв, урина и др. Тези апарати използват микрофлуидни камери за пробата и флуоресцентен микроскоп за заснемане на изображенията чрез CCD или CMOS сензор на микрочастиците. С помощта на процесорни устройства се извършва анализ на изображенията, броене и диференциране на микрочастиците в изследваната проба.Numerous devices based on image cytometry for counting and differentiating microparticles in biological fluids such as milk, blood, urine, etc. are known. These devices use microfluidic sample chambers and a fluorescence microscope to capture images using a CCD or CMOS microparticle sensor. With the help of processor devices the analysis of the images, counting and differentiation of the microparticles in the examined sample is performed.
При използване на няколко осветителя, обикновено е нужно периодично да се променя емисионния филтър в оста на обектива, за да осигури преминаване на нужната дължина на вълната до сензора. Филтърните блокове могат да се заменят ръчно или с помощта на механично устройство, което сменя филтрите в обектива, и което най-често се управлява по електронен начин, както това е описано и показано на фигура 7 в патентна публикация US 9046489В2.When using several luminaires, it is usually necessary to periodically change the emission filter in the lens axis to ensure that the required wavelength passes to the sensor. The filter blocks can be replaced manually or by means of a mechanical device which replaces the filters in the lens, and which is most often controlled electronically, as described and shown in Figure 7 in patent publication US 9046489B2.
Освен това част от тези апарати заснемат само едно изображение от пробата, а това води до нисък коефициент на вариация. Коефициентът на вариация, според разпределението на Поасон, зависи от броя на изброените частици в пробата. За проби с ниско съдържание на частици, под 10000 в ml кръв, /например при пациенти със СПИН/ или за силно разредени проби заснемането на едно, две или три изображения върху различни места на пробата /както е описано в US 20120223260 и US 20120314092/ не е достатъчно за получаването на приемливи коефициенти на вариация. Следователно, за получаването на измерване с по-висока степен на точност, е подходящо да се извърши заснемане на по-голям брой полета от пробата, като за целта чипът с изследваната проба трябва да се премества.In addition, some of these devices capture only one image of the sample, which results in a low coefficient of variation. The coefficient of variation, according to the Poisson distribution, depends on the number of particles listed in the sample. For samples with a low particle content of less than 10,000 in ml of blood (for example in AIDS patients) or for highly diluted samples, the capture of one, two or three images at different sample sites (as described in US 20120223260 and US 20120314092) it is not sufficient to obtain acceptable coefficients of variation. Therefore, in order to obtain a measurement with a higher degree of accuracy, it is appropriate to capture a larger number of fields from the sample, for which purpose the chip with the test sample must be moved.
В известните устройства се използват оптични системи, които имат дълбочина на фокуса от 20-100 pm, при което, ако пробата излиза от този диапазон, заснемането на изображение на фокус не е възможно. Едновременно с това, при оптимална дълбочина на микрофлуидната камера в рамките на 50 pm и по-малко, е необходимо да се използва система за фокусиране. В зависимост от конкретното изпълнение на устройството е възможно да се използват системи с ръчно или механично фокусиране, като в последните се използват микродвигатели или ръчни системи. Недостатък на механичните системи за фокусиране, осигуряващи необходимата микронна прецизност, е тяхната висока стойност.Known devices use optical systems that have a focal depth of 20-100 pm, in which case, if the sample is out of this range, it is not possible to capture an image in focus. At the same time, at an optimal depth of the microfluidic chamber within 50 pm or less, it is necessary to use a focusing system. Depending on the specific design of the device, it is possible to use systems with manual or mechanical focusing, the latter using micromotors or manual systems. A disadvantage of mechanical focusing systems, providing the necessary micron precision, is their high value.
Известно е, че коефициентът на вариации зависи, според разпределението на Поасон, от броя на преброени частици. При големи увеличения, например 10 пъти, сканираният обем проба пред обектива е недостатъчен за достигане на необходимия коефициент на вариация. При тази ситуация е необходимо да се увеличи броят на заснетите полета. Това води до неприемливо нарастване на времето за анализ. От друга страна, при морфологичен анализ на клетките и/или двуцветно диференциално броене на левкоцити, например в кръв или мляко, трябва да се използва оптично увеличение 10 или повече. Когато е нужно прецизно броене с нисък коефициент на вариация, без диференциране, се използва увеIt is known that the coefficient of variation depends, according to the Poisson distribution, on the number of particles counted. At high magnifications, for example 10 times, the scanned sample volume in front of the lens is insufficient to reach the required coefficient of variation. In this situation it is necessary to increase the number of captured fields. This leads to an unacceptable increase in analysis time. On the other hand, in the morphological analysis of the cells and / or the two-color differential count of leukocytes, for example in blood or milk, an optical magnification of 10 or more must be used. When precise counting with a low coefficient of variation without differentiation is required, an uve is used
2786 UI личение от 1 до 4 пъти. Обикновено познатите системи използват заменяеми оптични обективи с фиксирано увеличение или скъпи механични системи за зум.2786 UI reading 1 to 4 times. Commonly known systems use interchangeable fixed-magnification optical lenses or expensive mechanical zoom systems.
Известна е патентна публикация US 2012 0223260, отнасяща се до метод и система за определяне на частици в течна проба, при което се заснема само едно поле от пробата, като при такива системи практически отсъства необходимост от автофокусиране на изображението. В случай че при изследване на пробата тя трябва да се премества, това автоматично изисква фокусиране на изображението. При преместване на чипа с пробата чрез XY маса е задължително да е предвидено фокусиране на изображението поради факта, че при преместването на чипа с пробата се наблюдава натрупване на грешка по оста Z, която се формира от грешка при преместване на XY масата и грешка от деформиране на пластмасовите микрофлуидни чипове, като грешката най-често надвишава 100 pm по оста Z, което от своя страна води до неточност на броенето на клетките.Patent publication US 2012 0223260 is known, which relates to a method and system for determining particles in a liquid sample, in which only one field of the sample is captured, and in such systems there is practically no need for autofocusing of the image. In case the sample needs to be moved when examining the sample, this automatically requires focusing the image. When moving the chip with the sample through XY mass, it is mandatory to provide image focusing due to the fact that when moving the chip with the sample there is an accumulation of error along the Z axis, which is formed by error when moving XY mass and deformation error. of plastic microfluidic chips, the error most often exceeding 100 pm along the Z axis, which in turn leads to inaccurate cell counts.
Известна е патентна публикация US 7411680, в която е описано устройство за броене на микрочастици. Устройството се състои от източник на светлина; чип, съдържащ проба е микрочастици; обектив на микроскоп, микрофлуидна камера, заснемаща CCD камера, преброяваща част и механизъм за преместване на позицията на чипа. Преместването на чипа с пробата се извършва чрез маса, която е с възможност за преместване по осите XY чрез винтов или друг механизъм, като в този случай фокусирането на изображението е задължително, основно поради натрупването на грешката по оста Z, която се формира от грешката при придвижването масата и грешката при деформиране на пластмасовите микрофлуидни чипове, като грешката често надвишава 100 pm по оста Z.Patent publication US 7411680 is known, which describes a device for counting microparticles. The device consists of a light source; a chip containing a sample is microparticles; microscope lens, microfluidic camera, CCD camera, counting part and mechanism for moving the position of the chip. The movement of the chip with the sample is done by a mass that can be moved along the XY axes by a screw or other mechanism, in which case the focusing of the image is mandatory, mainly due to the accumulation of error along the Z axis, which is formed by the error at mass displacement and deformation error of plastic microfluidic chips, the error often exceeding 100 pm along the Z axis.
С помощта на споменатият винтов механизъм позицията на чипа се премества на предварително определени координати, през предварително определен интервал от време, за да може дадена област от чипа, която се намира в непосредствена близост до заснеманият район, да бъде изместена до точката, където пада светлината от източникът на светлина и е в обхвата на полезрението на обектива. По този начин отделните подобласти в чипа се заснемат последователно, като се изчис лява броят на микрочастици във всяка подзона и впоследствие се сумират, за да се изчисли общия брой на микрочастици в дадена проба.Using said screw mechanism, the position of the chip is moved to predetermined coordinates, at a predetermined time interval, so that an area of the chip adjacent to the imaged area can be shifted to the point where the light falls. from the light source and is in the field of view of the lens. In this way, the individual sub-areas in the chip are imaged sequentially, calculating the number of microparticles in each subband, and then summed to calculate the total number of microparticles in a sample.
При друго вариантно изпълнение на описания апарат се заснемат повече изображения, като микрофлуидна камера с изследваната проба се придвижва пред обектива на микроскопа, като за целите на заснемане на по-голям обем проба придвижването се извършва посредством подвижна по XY маса.In another variant embodiment of the described apparatus, more images are taken, as a microfluidic chamber with the examined sample is moved in front of the microscope lens, and for the purposes of capturing a larger sample volume, the movement is performed by means of a moving XY mass.
Известното устройство за броене на микрочастици има редица конструктивни недостатъци, които не позволяват да се постигне точно измерване и изброяване на микрочастиците поради следното: дори и при много прецизно изпълнение на механизмите за преместване на чипа, повърхността на XY масата има отклонение спрямо обектива над 10 pm, което заедно с технологичната кривина на микрофлуидния чип определя отклонение, което обикновено надвишава 50 pm. Такова отклонение от равнината на обектива води до изображение, което не е «на фокус» и влияе на софтуерното броене на микрочастиците, като снижава значително прецизността. В коментираното тук устройство не е предвиден механизъм за фокусиране на изображението.The known microparticle counting device has a number of design flaws that do not allow to achieve accurate measurement and enumeration of microparticles due to the following: even with a very precise implementation of the mechanisms for moving the chip, the XY table surface has a deviation from the lens over 10 pm , which together with the technological curvature of the microfluidic chip determines a deviation that usually exceeds 50 pm. Such a deviation from the plane of the lens results in an image that is out of focus and affects the software counting of microparticles, significantly reducing accuracy. The device discussed here does not provide a mechanism for focusing the image.
Друг недостатък на известното устройство, описано в US 7411680 е свързан с взаимното разположение на някои от съществените елементи, а именно, че осветителят е разположен пред обектива и зад микрофлуидната камера. Такава компановка има няколко недостатъка като това, че задължително трябва да се използва микрофлуиден чип съставен от две прозрачни повърхности.Another disadvantage of the known device described in US 7411680 is related to the relative position of some of the essential elements, namely that the illuminator is located in front of the lens and behind the microfluidic chamber. Such an arrangement has several disadvantages, such as the need to use a microfluidic chip composed of two transparent surfaces.
Подходящо е да се обърне внимание на обстоятелството, че за целите на получаване на качествено изображение при тази конфигурация на осветител и обектив трябва да се използва микрофлуидна камера, която е прозрачна за дължината на възбуждащия осветител. Използването на микрофлуидни камери, изпълнени с две прозрачни повърхности значително увеличават стойността на консуматива, тъй като за слепването на споменатите прозрачни повърхности се използват скъпи, сложни и ненадеждни методи за слепване, обикновено чрез лепене с течни или сухи лепила, каквито са описани в патентни публикации US 20120223260, US 7842157 В2,It is appropriate to pay attention to the fact that in order to obtain a quality image in this configuration of the luminaire and lens, a microfluidic chamber must be used, which is transparent for the length of the excitation luminaire. The use of microfluidic chambers filled with two transparent surfaces significantly increases the cost of consumables, as expensive, complex and unreliable gluing methods are used for gluing said transparent surfaces, usually by gluing with liquid or dry adhesives, as described in patent publications. US 20120223260, US 7842157 B2,
2786 UI2786 UI
US 8808642.US 8808642.
Друг недостатък на известното устройство за броене на микрочастици е свързан отново с описаното вече взаимно разположение на елементите, както и с вида им. Така например при попадане на част от емитираната светлина в равнината на обектива с ъгъл 90°, съответно попадането и през филтъра на CCD или CMOS матрица, съотношението сигнал-шум драстично намалява. Като се има предвид факта, че някои от флуоресцентните багрила, като например масово използвания пропидиум йодид, имат висока собствена флуоресценция в разтвор, това предопределя недобро качество на заснемането, съответно силно затруднява последващата софтуерна обработка на изображението.Another disadvantage of the known device for counting microparticles is again related to the already described mutual arrangement of the elements, as well as their type. For example, when part of the emitted light enters the plane of the lens at an angle of 90 °, respectively falls through the filter of a CCD or CMOS matrix, the signal-to-noise ratio decreases dramatically. Given the fact that some of the fluorescent dyes, such as the widely used propidium iodide, have a high intrinsic fluorescence in solution, this predetermines poor image quality, respectively greatly complicates the subsequent software processing of the image.
Допълнително се усложнява конструктивното изпълнение на устройството, свързано и с използваната за преместване на изследваната проба XY маса. За да се осигури преминаването на светлината през XY масата и чипа, трябва да се освободи цялата заснемана площ под микрофлуидния чип. Такова преместване е особено сложно при необходимост от осветяване с няколко ©светителя, с различна дължина на вълната.The design of the device is further complicated by the XY mass used to move the test sample. To ensure that light passes through the XY table and the chip, the entire imaged area under the microfluidic chip must be freed. Such relocation is particularly complicated when lighting with several luminaires of different wavelengths is required.
Техническа същност на полезния моделTechnical essence of the utility model
Описаното дотук известно ниво на техниката в разглежданата област показва необходимост да се предложи устройство за диференциално броене на микрочастици в биологични течности, което да позволява висока точност и детайлно анализиране на различни проби, съдържащи биологични микрочастици - мляко, ферментируеми течности, кръв, сперма и др., включително диференциално броене на биологични микрочастици, като соматични клетки в мляко, левкоцити в кръвта, телесни клетки, алги и дрожди.The prior art described in the field shows the need to offer a device for differential counting of microparticles in biological fluids, which allows high accuracy and detailed analysis of various samples containing biological microparticles - milk, fermentable fluids, blood, semen, etc. , including differential counting of biological microparticles, such as somatic cells in milk, leukocytes in the blood, body cells, algae and yeast.
Друга задача на полезния модел е да се предложи устройство, което да е технологично, изградено от евтини и достъпни елементи, чието взаимно разполагане да позволява оптимизиране качествата на оптичната система по отношение на автофокусиране и увеличаване на изображението, което е от съществено значение при анализа на различни по вид и състав биологични течности, както и да използва чип, чието преместване гарантира точно позициониране на образец от пробата спрямо обектива и камерите за заснемане.Another task of the utility model is to propose a device that is technological, built of cheap and affordable elements, the mutual arrangement of which allows optimizing the qualities of the optical system in terms of autofocus and image magnification, which is essential in the analysis of different in type and composition of biological fluids, as well as to use a chip, the movement of which ensures accurate positioning of the sample of the sample relative to the lens and cameras.
Задачата се решава с устройство за диференциално броене на микрочастици в биологични течности, състоящо се от корпус, в който са разположени: обектив, под който е поместен чип с микрофлуидни камери, в които е поместена проба от биологична течност, подлежаща на изследване, заснемаща CCD или CMOS камера, преброяваща част и механизъм за преместване на пробата, при което към пробата е насочен осветител.The problem is solved with a device for differential counting of microparticles in biological fluids, consisting of a housing in which they are located: a lens under which is placed a chip with microfluidic chambers, which houses a sample of biological fluid to be examined, capturing CCD or a CMOS camera, a counting part and a mechanism for moving the sample, in which an illuminator is aimed at the sample.
Съгласно полезният модел, в обектива е разположена най-малко една течна леща, а чипът е изпълнен като CD базиран чип, с кръгла форма, по която са оформени микрофлуидни камери, разположени по периферията на чипа, който е свързан директно със задвижващ двигател, при което осветителят е най-малко един и е разположен над равнината, в която е разположен CD базираният чип, като е ориентиран под ъгъл така, че да осигурява ъгъл на осветяване с минимално отражение, а преброяващата част е изпълнена като микропроцесор, свързан и с генератор, управляващ течните лещи.According to the utility model, at least one liquid lens is located in the lens, and the chip is made as a CD-based chip, with a round shape on which are formed microfluidic chambers located on the periphery of the chip, which is directly connected to the drive motor. which the illuminator is at least one and is located above the plane in which the CD-based chip is located, being oriented at an angle so as to provide an illumination angle with minimal reflection, and the counting part is designed as a microprocessor connected to a generator controlling liquid lenses.
Съгласно едно вариантно изпълнение на устройството, в горната част на обектива са разположени една под друга две течни лещи, а в долния край на обектива е разположена една течна леща, при което между горно разположените течни лещи и долно разположените течни лещи е монтиран оптичен филтър и обектив от две ахроматични лещи.According to a variant embodiment of the device, two liquid lenses are arranged one below the other in the upper part of the lens, and one liquid lens is located at the lower end of the lens, where an optical filter is mounted between the upper liquid lenses and the lower liquid lenses. lens of two achromatic lenses.
За предпочитане е оптичният филтър да е еднолентов или многолентов оптичен филтър.Preferably, the optical filter is a single-band or multi-band optical filter.
Течната леща е свързана с генератор с променливо стъпаловидно напрежение от 0-70 V и честота 1kHz.The liquid lens is connected to a generator with an alternating step voltage of 0-70 V and a frequency of 1kHz.
Осветителят се състои от последователно разположени един пред друг източник на светлина, колимираща леща, лентов филтър и фокусираща леща.The luminaire consists of a sequentially located light source, a collimating lens, a bandpass filter and a focusing lens.
За предпочитане е в качеството на източник на светлина да се използва LED, например Luxeon, или диодно лазерен източник на светлина.It is preferable to use an LED, for example Luxeon, or a diode laser light source as the light source.
Съгласно едно предпочитано изпълнение CD базираният чип се състои от горна част, изпълнена от РММА полимер, с оптически прозрачна повърхност и долна, непрозрачна част, изпълнена от черен ABS полимер, като двете части са свързани помежду си чрез лазерно заваряване, сAccording to a preferred embodiment, the CD-based chip consists of an upper part made of PMMA polymer with an optically transparent surface and a lower, opaque part made of black ABS polymer, the two parts being connected to each other by laser welding, with
2786 UI дължина на вълната на лазера 800-1050 nm, при което между тях са оформени микрофлуидни канали с височина 50 pm, в които е поместена смес от проба, флуоресцентни багрила и други аналити.2786 UI laser wavelength 800-1050 nm, in which microfluidic channels with a height of 50 pm are formed between them, in which a mixture of sample, fluorescent dyes and other analytes is placed.
Устройството работи ефективно и при използване на чип, с правоъгълна форма, съставен от две части, съответно горна прозрачна част и долна непрозрачна част, като между повърхностите им са оформени камери, съдържащи сухи флуоресцентни багрила или други аналити, в които се пипетира пробата, при което правоъгълният чип е поместен върху подвижна XY маса, разположена под ©светителите и обектива, в който са монтирани многолентов оптичен филтър и течна леща.The device also works efficiently using a rectangular chip consisting of two parts, the upper transparent part and the lower opaque part, respectively, with chambers containing dry fluorescent dyes or other analytes in which the sample is pipetted formed between their surfaces. which the rectangular chip is placed on a movable XY table located under the © luminaires and the lens in which the multi-band optical filter and liquid lens are mounted.
Съгласно едно вариантно изпълнение CD базираният чип се състои от две части, съответно горна с прозрачна повърхност и долна с непрозрачна повърхност, като между повърхностите на споменатите две части са оформени смесителни камери, запълнени с проба и сухи флуоресцентни багрила и/или други аналити, при което смесителните камери са свързани чрез хидрофобни канали с микрофлуидна камера, a CD базираният чип е монтиран към въртяща се ос, свързана със задвижващ двигател.According to one variant embodiment, the CD-based chip consists of two parts, respectively an upper with a transparent surface and a lower with an opaque surface, and between the surfaces of said two parts are formed mixing chambers filled with sample and dry fluorescent dyes and / or other analytes. which the mixing chambers are connected by hydrophobic channels to a microfluidic chamber, and the CD-based chip is mounted to a rotating axis connected to a drive motor.
Задвижващият двигател е стьпков двигател и е свързан директно със CD базирания чип.The drive motor is a stepper motor and is connected directly to the CD based chip.
Устройството за диференциално броене на микрочастици в биологични течности, съгласно полезният модел се отличава с компактна конструкция, като взаимното разполагане на елементите позволява точно измерване и анализ на микрочастиците в обработваните проби. Използват се елементи с високо качество и ниска стойност, в резултат на което се получава апарат, който осигурява технически възможности за получаване на качествени изображения при заснемане и обработване на проби. За подобряване на качеството на изображението се използват течни лещи, с малки размери, като са разположени в обектива на микроскопа по начин, по който осигуряват едновременно фокусиране и увеличение на изображението.The device for differential counting of microparticles in biological fluids, according to the utility model, has a compact design, as the mutual arrangement of the elements allows accurate measurement and analysis of microparticles in the processed samples. High quality and low value elements are used, as a result of which an apparatus is obtained, which provides technical possibilities for obtaining quality images when capturing and processing samples. To improve the quality of the image, small liquid lenses are used and are located in the lens of the microscope in a way that provides both focus and magnification of the image.
Същевременно, управлението на течната леща позволява времето за автофокус да е от порядъка на милисекунди. Размерът на течната леща позволява още и да се вгражда и при конструирането на мобилни и «ханд хелд» уреди за измерване на малки частици.At the same time, the liquid lens control allows the autofocus time to be in the order of milliseconds. The size of the liquid lens also allows it to be built into the construction of mobile and "hand held" devices for measuring small particles.
В предложеното устройство се използва принципно нов и различен модел чип със CD базирани микрофлуидни камери, чието позициониране пред обектива за заснемането на изображение зависи само от точността на изработка на микрофлуидната камера, което от своя страна автоматично води до намаляване изискванията към автофокусиращата система. Едновременно с това значително е опростено позиционирането на микрофлуидната камера пред обектива - само чрез завъртане на CD базираният чип, като само в определени случаи се налага минимално преместване по оста X, което може да се извърши с достъпни технически средства, например: мини-стъпков мотор NEMA8 за въртящата се ос и мини-серво двигател DS-5001HV по оста X, като този начин на преместване на X оста може да осигури преместване до 10 mm.The proposed device uses a fundamentally new and different chip model with CD-based microfluidic cameras, whose positioning in front of the lens for imaging depends only on the accuracy of the microfluidic camera, which in turn automatically reduces the requirements for the autofocus system. At the same time, the positioning of the microfluidic camera in front of the lens is significantly simplified - only by rotating the CD-based chip, and only in certain cases a minimum movement along the X axis is required, which can be done with available technical means, for example: mini-stepper motor NEMA8 for the rotating axle and mini-servo motor DS-5001HV on the X axis, this way of moving the X axis can provide displacement up to 10 mm.
Пояснение на приложените фигуриExplanation of the attached figures
По-нататък ще бъде описано едно примерно изпълнение на устройство за диференциално броене на микрочастици в биологични течности, което е представено с помощта на придружаващите описанието чертежи, където:Hereinafter, an exemplary embodiment of a device for differential counting of microparticles in biological fluids will be described, which is represented by the accompanying drawings, where:
фигура 1 - външен вид на устройството съгласно полезния модел;Figure 1 - appearance of the device according to the utility model;
фигура 2 - принципна схема на устройство съгласно полезния модел, с частичен изглед на CD базиран чип с микрофлуидни камери;Figure 2 is a schematic diagram of a device according to the utility model, with a partial view of a CD based chip with microfluidic chambers;
фигура 3 - схема на устройството с частичен изглед на CD базиран чип, със смесителни и микрофлуидни камери;Figure 3 is a diagram of the device with a partial view of a CD based chip, with mixing and microfluidic chambers;
фигура 4 - схема на устройството съгласно полезния модел с правоъгълен чип, с горна прозрачна повърхност и долна непрозрачна повърхност.Figure 4 is a diagram of a utility model with a rectangular chip, with an upper transparent surface and a lower opaque surface.
фигура 5 - аксонометричен изглед на CD базиран чип с микрофлуидни камери;Figure 5 is an axonometric view of a CD based chip with microfluidic chambers;
фигура 6 - напречен разрез на CD базиран чип от фигура 5;Figure 6 is a cross-sectional view of a CD based chip of Figure 5;
фигура 7 - аксонометричен изглед на вариантно изпълнение на CD базиран чип с микрофлуидни камери;Figure 7 is an axonometric view of a variant embodiment of a CD based chip with microfluidic chambers;
фигура 7а - аксонометричен изглед на CD базиран чип от фигура 7 с разполагане на пробата при завъртане на стьпковия двигател;Figure 7a is an axonometric view of the CD based chip of Figure 7 with the location of the sample when the stepper motor is rotated;
фигура 76 - аксонометричен изглед на CD базиран чип със запълнени микрофлуидни камериFigure 76 is an axonometric view of a CD based chip with filled microfluidic chambers
2786 UI за заснемане на пробата;2786 UI for sampling;
фигура 8 - схематичен изглед отпред на устройството, с монтирана в обектива течна леща за автофокусиране;Figure 8 is a schematic front view of the device with a liquid autofocus lens mounted in the lens;
фигура 9 - принципна схема на устройство съгласно полезния модел, с две допълнителни течни лещи, подходящо за едновременно сканиране на голям обем проба 10 μΐ, т.е проби с < 10000 клетки на ml и диференциално морфологично измерване;Figure 9 is a schematic diagram of a device according to the utility model, with two additional liquid lenses, suitable for simultaneous scanning of a large sample volume of 10 μΐ, ie samples with <10000 cells per ml and differential morphological measurement;
фигура 10а - примерно изпълнение на устройство съгласно полезния модел, използващо мембрано проникващо багрило и приложимо за броене на живи/мъртви клетки в една проба;Figure 10a is an exemplary embodiment of a utility model device using a membrane penetrating dye and applicable for counting living / dead cells in a sample;
фигура 106 - примерно изпълнение на устройство съгласно полезния модел, използващо BO-PR03 и FITC багрило и приложимо за броене на живи/мъртви клетки в една проба;Figure 106 is an exemplary embodiment of a utility model device using BO-PR03 and FITC dye and applicable for counting living / dead cells in a sample;
фигура 11 - примерно изпълнение на устройство, приложимо за диференциално броене на соматични клетки в мляко, с един осветител и дихроично цветоотделително огледало в обектива;Figure 11 is an exemplary embodiment of a device applicable to the differential counting of somatic cells in milk, with a single illuminator and a dichroic color-separating mirror in the lens;
фигура 12 - общ вид на “Hand Held” вариант на устройство съгласно полезния модел;Figure 12 - General view of the “Hand Held” variant of a device according to the utility model;
фигура 13 - представя схематично устройството от фигура 12;Figure 13 shows schematically the device of Figure 12;
фигура 14а, б, в - графично изобразяване на резултати от изследване на пробата и визуализирането им върху дисплей на устройството.Figure 14a, b, c - graphical representation of the results of the sample examination and their visualization on the display of the device.
Примерно изпълнение на полезния моделExemplary implementation of the utility model
Едно примерно изпълнение на устройството съгласно полезния модел е представено по-детайлно, като описаното конструктивно решение не ограничава използването и на други технически елементи, които имат подобно конструктивно оформяне и еквивалентно функционално въздействие, при което цялостната компановка на устройството ще запази идеята и духа на полезния модел.An exemplary embodiment of the device according to the utility model is presented in more detail, as the described design solution does not limit the use of other technical elements that have a similar design and equivalent functional impact, where the overall layout of the device will retain the idea and spirit of the utility. model.
Устройството за диференциално броене на микрочастици в биологични течности се състои от корпус 1, в който са разположени един под друг вертикално ориентиран микроскоп с обектив 2, странично на който е монтирана система от два осветителя 3, разположени под ъгъл, над равнината, в която е разположен микрофлуиден чип 4, съдържащ проба 5 от биологичен материал.The device for differential counting of microparticles in biological fluids consists of a housing 1, in which are arranged one below the other a vertically oriented microscope with a lens 2, laterally on which is mounted a system of two luminaires 3 located at an angle above the plane in which located microfluidic chip 4 containing a sample 5 of biological material.
Обективът 2 е изпълнен с оптичен филтър 6, за предпочитане еднолентов тънкослоен филтър и разположена в долната му част течна леща 7, захранвана и управлявана от генератор с променливо напрежение 8, за предпочитане от 0-70 V и честота 1 kHz. Чрез вградената и управлявана чрез генератора 8 течна леща 7 обективът 2 осъществява автофокусиране с дълбочина 1 mm, като времето за автофокусиране е много кратко, в рамките на милисекунди.The lens 2 is provided with an optical filter 6, preferably a single-band thin film filter and a liquid lens 7 located in its lower part, powered and controlled by an alternator with an alternating voltage 8, preferably of 0-70 V and a frequency of 1 kHz. Through the built-in and controlled by the generator 8 liquid lens 7, the lens 2 performs autofocus with a depth of 1 mm, and the autofocus time is very short, within milliseconds.
При едно вариантно изпълнение на устройството, в обектива 2 са предвидени допълнително две течни лещи 5’, 5”, /фигура 9/, разположени една под друга в горната част на обектива 2. Такова конструктивно решение на обектива 2, с общо три течни лещи 5, 5’, 5” осигурява променливо регулируемо увеличение и автофокус в диапазона от 1 до 10 пъти, например 2 пъти увеличение (фигура 9) и 10 пъти увеличение (фигура 9) и е подходящо да се прилага в устройства при броене и диференциране на проби с малък брой клетки в ml.In one variant of the device, in the lens 2 are additionally provided two liquid lenses 5 ', 5 ", (figure 9), located one below the other in the upper part of the lens 2. Such a design of the lens 2, with a total of three liquid lenses 5, 5 ', 5 ”provides variable adjustable magnification and autofocus in the range of 1 to 10 times, for example 2 times magnification (Figure 9) and 10 times magnification (Figure 9) and is suitable for use in counting and differentiation devices. samples with a small number of cells in ml.
Както вече беше изложено по-горе, осветителите 3 са разположени странично на обектива 2 и са ориентирани така, че да осигуряват ъгъл на осветяване, осигуряващ минимално отражение на възбуждащата светлина, например близък до ъгъла на Брустер. Всеки осветител 3 се състои от последователно разположени източник на светлина 9, тип LED, например Luxeon, колимираща леща 10, лентов филтър 11 и фокусираща леща 12.As already stated above, the luminaires 3 are located on the side of the lens 2 and are oriented so as to provide an angle of illumination providing minimal reflection of the exciting light, for example close to the Brewster angle. Each luminaire 3 consists of a series of light sources 9, of the LED type, for example Luxeon, a collimating lens 10, a bandpass filter 11 and a focusing lens 12.
Описаната компановка на устройството позволява разполагането на повече от един осветител, като е възможно алтернативно да се използват диодно лазерни източници на светлина, каквито са необходими и подходящи при многоцветно флуоресцентно заснемане, например при диференциално броене на биологични микрочастици, като соматични клетки в мляко, левкоцити в кръвта, телесни клетки и дрожди. Разполагането на осветителя над равнината, в която е разположен CD базираният микрофлуиден чип осигурява гарантирано голяма част от светлина да се насочи и попадне през горната прозрачна повърхност 13 намикрофлуидния чип 4,4’ върху пробата 5 и само много малка част от отразената от горната повърхност 13,17 на чипа 4, 4’ светлина да премине през течната леща 5, обектива и да попадне в заснемащите камери 2а CCD или CMOS 1 сензор .The described arrangement of the device allows the placement of more than one illuminator, and it is possible to alternatively use diode laser light sources, as necessary and suitable for multicolor fluorescent imaging, for example in differential counting of biological microparticles, such as somatic cells in milk, leukocytes in the blood, body cells and yeast. The positioning of the luminaire above the plane in which the CD-based microfluidic chip is located ensures that a large part of the light is directed and enters through the upper transparent surface 13 the microfluidic chip 4,4 'on the sample 5 and only a very small part of the reflected from the upper surface 13 , 17 of the chip 4, 4 'light to pass through the liquid lens 5, the lens and enter the camera 2a CCD or CMOS 1 sensor.
Под осветителя е разположен CD базиранUnder the luminaire is a CD based
2786 UI микрофлуиден чип 4, който съдържа проба 5 с микрочастици, подлежащи на изследване.2786 UI microfluidic chip 4, which contains sample 5 with microparticles to be tested.
Съгласно едно предпочитано изпълнение, чипът 4 се състои от две части, съответно горна част 13, изпълнена от РММА полимер, с оптически прозрачна повърхност и долна част 14, за предпочитане непрозрачна, изпълнена от черен ABS полимер. Двете части 13 и 14 са свързани помежду си чрез лазерно заваряване на двете повърхности, за предпочитане с дължина на вълната на лазера 1050 nm и осево приложена притискаща сила. След заваряването на двете части се образуват микрофлуидни канали 15 с височина 50 pm, в които се пипетират предварително смесена проба 5, съдържаща флуоресцентни багрила 16 и други аналити, като например флуоресцентно маркирани антитела. Описаният чип 4 е подходящ за анализ на различни проби, съдържащи биологични микрочастици - мляко, ферментируеми течности, кръв, сперма и др.According to a preferred embodiment, the chip 4 consists of two parts, respectively an upper part 13 made of PMMA polymer, with an optically transparent surface and a lower part 14, preferably opaque, made of black ABS polymer. The two parts 13 and 14 are connected to each other by laser welding of the two surfaces, preferably with a laser wavelength of 1050 nm and an axially applied compressive force. After welding the two parts, 50 [mu] m microfluidic channels 15 are formed, in which a premixed sample 5 containing fluorescent dyes 16 and other analytes, such as fluorescently labeled antibodies, is pipetted. The described chip 4 is suitable for analysis of various samples containing biological microparticles - milk, fermentable liquids, blood, semen and others.
В едно вариантно изпълнение на устройството за диференциално броене може да се използва чип 4” /фигура 4/, с правоъгълна форма, съставен от две части, съответно горна прозрачна част и долна непрозрачна част, като между повърхностите им са оформени камери, съдържащи сухи флуоресцентни багрила или други аналити, в които се пипетира пробата 5. Правоъгълният чип 4” е поместен и се премества за заснемане на пробата чрез XY маса, която е разположена под осветителите 3 и обектива 2, в който са монтирани многолентов оптичен филтър 6 и течна леща 7.In one variant embodiment of the differential counting device, a 4 ”chip / figure 4 / can be used, with a rectangular shape, consisting of two parts, respectively an upper transparent part and a lower opaque part, and chambers containing dry fluorescents are formed between their surfaces. dyes or other analytes in which the sample is pipetted 5. The rectangular chip 4 ”is placed and moved to capture the sample by XY table, which is located under the lamps 3 and the lens 2, in which are mounted a multi-band optical filter 6 and a liquid lens 7.
В едно вариантно изпълнение на устройството за диференциално броене може да се използва чип 4’, чието конструктивно изпълнение е представено по-детайлно на фигури 7, 7а, 76. Чипът 4’ представлява CD базиран чип, съставен от две части, съответно горна 17 и долна 18 , като между повърхностите им са оформени смесителни камери 19, съдържащи сухи флуоресцентни багрила или други аналити, в които се пипетира пробата 5. Смесителните камери 19 са свързани чрез хидрофобни канали 20 с микрофлуидна камера 21 за заснемане на образец от пробата 5. Микрофлуидната камера 21 е изпълнена с допълнителен отвор 22, предназначен за освобождаване на въздуха, съдържащ се в камерата 21, при запълването й с изтласканата от центробежните сили течна проба 5. CD базираният чип 4, 4’ е поставен върху въртяща се ос 23 и свързан със стъпков двигател 24, като при завъртането му образецът на пробата 5 се премества пред повърхнината на обектива 2. Стъпковият двигател 24 е свързан с микропроцесорно устройство 25, в чиято памет са въведени данни и координати, определящи преместването на пробата 5, като в нея се записва и заснетото изображение на пробата 5.In a variant embodiment of the differential counting device, a chip 4 'can be used, the design of which is shown in more detail in Figures 7, 7a, 76. The chip 4' is a CD-based chip consisting of two parts, respectively upper 17 and bottom 18, between their surfaces are formed mixing chambers 19 containing dry fluorescent dyes or other analytes in which the sample 5 is pipetted. The mixing chambers 19 are connected via hydrophobic channels 20 with a microfluidic chamber 21 for capturing a sample of the sample 5. The microfluidic chamber 21 is provided with an additional opening 22 for releasing the air contained in the chamber 21 when filling it with the liquid sample 5 expelled by the centrifugal forces 5. The CD-based chip 4, 4 'is placed on a rotating axis 23 and connected to stepper motor 24, and when it is rotated, the sample of the sample 5 is moved in front of the surface of the lens 2. The stepper motor 24 is connected to a microprocessor device 25, in which data and coordinates determining the movement of the sample 5 are entered in the memory, and the captured image of the sample 5 is recorded in it.
На фигури 10а, 1 Об е представено едно примерно изпълнение на устройство за диференциално броене на клетки в биологични течности, чиято конструкция съответства на описаната дотук компановка на устройството, което е подходящо да се използва за броене на живи и мъртви клетки в една проба на биологични течности, съдържащи клетки. В обектива 2 се използва двулентов тънкослоен оптичен филтър 6, за предпочитане тип Semrock FFO1 -527/645-25, а странично на обектива 2, под ъгъл са разположени два осветителя 3, със светлинен източник тип LED LUXEON 475nm /фигура 10а/ и лентов филтър 6, с параметри 470/30, както и алтернативно светлинен източник 9 тип LED LUXEON 565 nm, с лентов филтър 3’, с параметри 560/30 /фигура 106/, за двуцветно багрене. В пробата 5 се използва мембранно проникващо багрило 16 FITC багрещо ДНК на живи и мъртви клетки /фигура 10а/ 10 и BO-PR03 багрило 16 ДНК само на мъртви клетки /фигура 106/.Figures 10a, 1b show an exemplary embodiment of a device for differential cell counting in biological fluids, the construction of which corresponds to the arrangement of the device described so far, which is suitable for use for counting living and dead cells in a sample of biological cell-containing fluids. The lens 2 uses a two-band thin-film optical filter 6, preferably type Semrock FFO1 -527 / 645-25, and on the side of the lens 2, at an angle, there are two luminaires 3, with a light source type LED LUXEON 475nm / figure 10a / and a band filter 6, with parameters 470/30, as well as alternatively light source 9 type LED LUXEON 565 nm, with bandpass filter 3 ', with parameters 560/30 / figure 106 /, for two-color dyeing. In sample 5, membrane penetrating dye 16 FITC staining DNA of living and dead cells (Figure 10a / 10) and BO-PR03 dye 16 DNA of dead cells only (Figure 106) were used.
На фигура lie представено едно примерно изпълнение на устройство, което е подходящо да бъде използвано за диференциално броене на соматични клетки в мляко и е особено изгодно в случаите, когато клетките се преместват междувременно от брауновото движение в течността. Устройството е конфигурирано по-специално за използване на изследвания, при които се определя съотношението между неутрофили и лимфоцити в мляко или кръв. Обективът 2 е изпълнен е един лентов филтър 6, разположен в горната му част и една течна леща 7, разположена в долната част на обектива 2. В близост до лентовия филтър 6 и под него, в оста на обектива 2 е монтирано под ъгъл дихроично цветоотделително огледало 26, а перпендикулярно на оста на обектива 2 е разположена втора камера CCD или CMOS сензор. Странично на обектива 2 е разположен един осветител 3, снабден с източник на светлина 9, с дължина на вълната 675Figure 1a shows an embodiment of a device which is suitable for use in the differential counting of somatic cells in milk and is particularly advantageous in cases where the cells are moved in the meantime by the Brownian motion in the liquid. The device is configured in particular for the use of tests to determine the ratio of neutrophils to lymphocytes in milk or blood. The lens 2 is made of a strip filter 6 located in its upper part and a liquid lens 7 located in the lower part of the lens 2. Near the strip filter 6 and below it, in the axis of the lens 2 is mounted at an angle dichroic color separation mirror 26, and perpendicular to the axis of the lens 2 is a second CCD camera or CMOS sensor. On the side of the lens 2 there is a luminaire 3, equipped with a light source 9, with a wavelength of 675
2786 UI nm, тип LED LUXEON 675. В чипа 5 се използва флуоресцентно багрило акредин оранж, което оцветява ДНК и РНК на живи и мъртви клетки, като се използва само една дължина на вълната за възбуждане, а емисиите за ДНК и РНК са с различни дължини на вълната. При осветяване на клетките от пробата 5, с дължина на вълната 675 nm, свързаното с ДНК /DNA/ в ядрото багрило “акредин оранж” има зелена емисия 530 nm, а свързано с РНК /RNA/ в цитоплазмата на клетките емитира с дължина на вълната 620 nm - с червена светлина. По този начин, е описаната по-горе конфигурация на устройството, без използване на скъпи подвижни механични устройства, могат да се правят едновременно две снимки на пробата с различна дължина на вълната. Впоследствие снимките се обединяват от процесорното устройство 25, а чрез използването на програмното осигуряване, на база на интензитета и съотношението на зелената и червена емисия се извършва диференциране на клетките.2786 UI nm, type LED LUXEON 675. Chip 5 uses a fluorescent dye Acredin Orange, which stains DNA and RNA of living and dead cells, using only one wavelength for excitation, and the emissions for DNA and RNA are different wavelengths. When the cells of sample 5, with a wavelength of 675 nm, are illuminated, the DNA (DNA) bound in the nucleus has a green emission of 530 nm, and the RNA bound in the cytoplasm of the cells emits a wavelength 620 nm - with red light. Thus, the device configuration described above, without the use of expensive mobile mechanical devices, two samples of the sample with different wavelengths can be taken simultaneously. Subsequently, the images are combined by the processor device 25, and by using the software, cell differentiation is performed based on the intensity and ratio of green and red emissions.
В зависимост от вида на изследваните биологични течности, както и от необходимостта от бързо и точно изследване, възможно е да се реализира „Ханд Хелд” вариант на устройството за диференциално броене съгласно изобретението, което по същество представлява образен цитометър, каквото е показано на фигури 12, 13. В долната част на корпуса 1 е разположено захранващ модул 27 на устройството, което е с батерийно захранване. В корпуса 1 са разположени още обектив 2, тип SUNEX-M 12x0,5, като е подходящо да се използва течна леща тип Arctic 16F, с увеличение Х4, което позволява да се конфигурира реверсиран обектив 2, за CCD или CMOS камера с автофокус. Този обектив е специално проектиран, с възможност да събира светлина от значителни по големина ъгли, като съдържа до 6 асферични стъклени миниатюрни лещи, непоказани на фигурите, позволяващи да работят с мегапикселови сензори, с големи диагонали, в резултат на което обектива 2 има пространствена разделителна способност около 2 pm, при минимални аберации. Такива обективи като правило, се използват в микроскопи, позволяващи увеличение до 10 пъти. Използва се CD базиран чип 4, който е директно свързан с миниатюрен стъпков двигател, тип NEMA8, като чипът се монтира върху ротора на стьпковия двигател 24, с непрозрачната повърхност от горната му страна. Заедно със защитния непрозрачен борд околната светлина се изолира от обектива и по такъв начин устройството може да бъде изпълнено без горен защитен капак.Depending on the type of biological fluids tested, as well as the need for rapid and accurate testing, it is possible to implement a "Hand Held" variant of the differential counting device according to the invention, which is essentially a figurative cytometer, as shown in Figures 12. , 13. In the lower part of the housing 1 is located a power supply module 27 of the device, which is battery-powered. In the housing 1 there is also a lens 2, type SUNEX-M 12x0.5, and it is suitable to use a liquid lens type Arctic 16F, with magnification X4, which allows to configure a reversed lens 2, for CCD or CMOS camera with autofocus. This lens is specially designed to collect light from significant angles, containing up to 6 aspherical glass miniature lenses, not shown in the figures, allowing to work with megapixel sensors, with large diagonals, as a result of which the lens 2 has a spatial separation ability about 2 pm, with minimal aberrations. Such lenses are generally used in microscopes, allowing magnification up to 10 times. A CD based chip 4 is used, which is directly connected to a miniature stepper motor, type NEMA8, and the chip is mounted on the rotor of the stepper motor 24, with the opaque surface on its upper side. Together with the opaque protective board, the ambient light is isolated from the lens and thus the device can be made without an upper protective cover.
Описаното ханд хелд устройство /цитометьр/ може да работи в автономен режим, като автофокусирането, осигурявано чрез течната леща 5, позиционирането, управлението на LED осветителя 3, изпълнен с лентов филтър 6 и полусферична колимираща леща 10 и дихроично огледало 26 се управляват от микропроцесора 25, като след обработката на изображенията резултатът се извежда на дисплей 28. Цитометърът е снабден още и със стандартни комуникационни изводи /USB/, непоказани на фигурите, /фигура 12/, чрез които устройството може да бъде свързано с външно базиран миникомпютър 29, със специално разработена програма за управление работата на устройството, включително графична обработка и визуализиране на резултатите от анализа на обработваните проби 5. Посредством описаните интерфейси, устройството може да се управлява дистанционно, чрез мобилни комуникационни устройства /смартфон, таблет, базирани на Wondows или Android/, на които е инсталирана управляваща програма /фигури 14 а, б, в,/, като цялата информация е достъпна онлайн, в облачна услуга. Програмното осигуряване на устройството позволява обработване на изображенията получени от заснемащите камери CMOS или CCD, при което се определя броя на биологични микрочастици (соматични клетки в мляко, левкоцити в кръвта, телесни клетки, и дрожди) - в ml, както и се извършва оценка на размера частиците и графичното им разпределение. Използвайки метода на диференциално броене и оценка на размерите може да се определя и броят локални максимуми в интензивността на изображението, както и бинаризация на изображението чрез локален хистограмен анализ. Последното се прави с цел повишаване на отношението сигнал/шум чрез елиминиране на неравномерностите на фона по цялото изображение.The described hand-held device / cytometer / can operate in autonomous mode, as the autofocus provided by the liquid lens 5, the positioning, the control of the LED illuminator 3 filled with a bandpass filter 6 and a hemispherical collimating lens 10 and a dichroic mirror 26 are controlled by the microprocessor 25 , and after image processing the result is displayed 28. The cytometer is also equipped with standard communication ports / USB /, not shown in the figures / figure 12 /, through which the device can be connected to an externally based minicomputer 29, with special developed a program for managing the operation of the device, including graphical processing and visualization of the results of the analysis of the processed samples 5. Through the described interfaces, the device can be controlled remotely via mobile communication devices / smartphone, tablet based on Wondows or Android /. which is installed driver / figures 14 a, b, c, /, as the whole info is available online in a cloud service. The software of the device allows processing of images obtained by CMOS or CCD imaging cameras, which determines the number of biological microparticles (somatic cells in milk, leukocytes in the blood, body cells, and yeast) - in ml, and evaluates the particle size and graphical distribution. Using the method of differential counting and size estimation, the number of local maxima in the image intensity can be determined, as well as the binarization of the image by local histogram analysis. The latter is done in order to increase the signal-to-noise ratio by eliminating background irregularities throughout the image.
Устройството за диференциално броене съгласно полезния модел се използва по следния начин: приготвя се CD базирания чип 4,4’ с образец от пробата, която подлежи на изследване. Със задействането на стъпковия двигател 24, пробата 5 се смесва с флуоресцентните багрилаThe differential counting device according to the utility model is used as follows: a 4.4 'CD-based chip is prepared with a sample of the sample to be tested. With the operation of the stepper motor 24, the sample 5 is mixed with the fluorescent dyes
2786 UI и аналитите, като при повишаване на оборотите на стъпковия двигател 24 до 500-1000 об/min, върху смесената с багрила 16 проба 5 действа центробежна сила. В резултат течната проба 5 /фигура 7а/ преодолява съпротивлението на хидрофобния канал 20 /фигура 7а/ и попада в микрофлуидната камера за заснемане 21 /фигура 76/, при което през допълнителния отвор 22 се освобождава изтласкания от преместването на пробата 5 въздух. Последователно, чрез въртене със стъпковия двигател 24, пробата 5 се премества пред обектива 2 по точно определени координати, предварително въведени в паметта на микропроцесорно устройство 25, като позицията за заснемане на изображението на пробата 5 не се измества или отклонява спрямо обектива 2. В този случай разстоянието на микрочастиците от пробата 5 до обектива 2 зависи в голяма степен от точността на изработка на микрофлуидната камера 21, в резултат на което значително се намаляват изискванията към автофокусиращата система. Едновременно с това се увеличава драстично съотношението сигнал-шум, решаващо за откриване и софтуерно изброяване на слабо светещи микрочастици от пробата.2786 UI and the analytes, and when increasing the speed of the stepper motor 24 to 500-1000 rpm, a centrifugal force acts on the sample 5 mixed with dyes 16. As a result, the liquid sample 5 (figure 7a) overcomes the resistance of the hydrophobic channel 20 (figure 7a) and enters the microfluidic imaging chamber 21 (figure 76), whereby the air expelled from the movement of the sample 5 is released through the additional opening 22. Sequentially, by rotating with the stepper motor 24, the sample 5 is moved in front of the lens 2 at precisely defined coordinates, previously entered in the memory of the microprocessor device 25, the position for capturing the image of the sample 5 is not shifted or deviated from the lens 2. In this case, the distance of the microparticles from the sample 5 to the lens 2 depends to a large extent on the manufacturing accuracy of the microfluidic chamber 21, as a result of which the requirements for the autofocus system are significantly reduced. At the same time, the signal-to-noise ratio increases dramatically, crucial for the detection and software enumeration of dimly lit microparticles from the sample.
Индустриална приложимостIndustrial applicability
Едно вариантно мобилно изпълнение на цитометьра е подходящо да се използва от фермери директно във фермата, например за целите на откриване на доклиничен мастит, чрез броене на соматични клетки в млякото.An alternative mobile embodiment of the cytometer is suitable for use by farmers directly on the farm, for example for the purpose of detecting preclinical mastitis, by counting somatic cells in milk.
Друго приложение на мобилния вариант на устройството е в телемедицината, по-специално в неотложната медицинска помощ, когато е необходимо на място, при пациента, да се преброят и диференцират левкоцитите в кръвта. Поради ниската цена, батерийното захранване и възможността за използване от неквалифициран персонал е особено удобен за приложение в страните, където се извършват голям брой изследвания и диагностициране на болести като СПИН. Такъв апарат е особено необходим за използване в полеви условия, доколкото може да сканира кръвна проба до 10 μΐ, като при такива изследвания на кръвта левкоцитите намаляват до 500 бр./ml. Резултатите могат да бъдат наблюдавани дистанционно от специалист, намиращ се във всяка точка на земята, с възможност за бързо и точно определяне на диагноза. Устройството може да намери приложение и в центровете за приемане на кръв, където обикновено първо се приема кръвта, а после се изпраща за изследване в централизирани лаборатории. При вземане на 20 μΐ кръв от пръст на донора, пробата може да се изследва на място, съответно веднага да се прецени дали даден пациент е годен за кръводарител.Another application of the mobile version of the device is in telemedicine, in particular in emergency medical care, when it is necessary to count and differentiate leukocytes in the blood on the spot. Due to the low cost, battery power and the possibility of use by unqualified personnel, it is particularly convenient for use in countries where a large number of tests and diagnoses of diseases such as AIDS are performed. Such a device is especially needed for use in the field, as it can scan a blood sample up to 10 μs, and in such blood tests the white blood cells are reduced to 500 units / ml. The results can be monitored remotely by a specialist located anywhere on earth, with the ability to quickly and accurately diagnose. The device can also be used in blood collection centers, where blood is usually first taken and then sent for testing to centralized laboratories. When taking 20 μΐ of blood from a donor's finger, the sample can be tested on site, respectively immediately to assess whether a patient is suitable for blood donation.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG3717U BG2786U1 (en) | 2017-04-26 | 2017-04-26 | Device for differential counting of microparticle in biological liquids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG3717U BG2786U1 (en) | 2017-04-26 | 2017-04-26 | Device for differential counting of microparticle in biological liquids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG2786U1 true BG2786U1 (en) | 2017-09-26 |
Family
ID=61226142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG3717U BG2786U1 (en) | 2017-04-26 | 2017-04-26 | Device for differential counting of microparticle in biological liquids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG2786U1 (en) |
-
2017
- 2017-04-26 BG BG3717U patent/BG2786U1/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11499908B2 (en) | Urine analysis system, image capturing apparatus, urine analysis method | |
| JP5129347B2 (en) | Method and apparatus for analyzing particles in a liquid sample | |
| US10983104B2 (en) | Microfluidic chamber assembly for mastitis assay | |
| US10032270B2 (en) | System and methods for the in vitro detection of particles and soluble chemical entities in body fluids | |
| JP5184697B2 (en) | Method and apparatus for detecting and counting platelets individually and as aggregates | |
| US20090185734A1 (en) | Apparatus and method for analysis of particles in a liquid sample | |
| BG113017A (en) | Device for differential counting of microparticles in biological liquids | |
| EP2843410B1 (en) | Sample analyzing method and sample analyzer | |
| WO2014099629A1 (en) | Rapid blood testing platform for use with mobile electronic devices | |
| EP1329706A1 (en) | Rapid imaging of particles in a large fluid volume through flow cell imaging | |
| CN103443625A (en) | Internal focus reference beads for imaging cytometry | |
| WO2015173774A2 (en) | A microscopy system and a method for analyzing fluids | |
| CN207816777U (en) | Equipment for carrying out counting and differential counting to the particle in biofluid | |
| WO2021116955A1 (en) | Detecting platelets in a blood sample | |
| EP2843409B1 (en) | Urine sample analyzing method and sample analyzer | |
| BG2786U1 (en) | Device for differential counting of microparticle in biological liquids | |
| CN112113895A (en) | Blood cell analyzer | |
| JP2010054426A (en) | Observation method of disease | |
| RU2797528C1 (en) | Accounting for errors in optical measurements | |
| BG2604U1 (en) | Automated flow fluorescence cell counter in biological liquids | |
| CN116625914A (en) | Portable counter and counting method for lactogenesis somatic cells |