BG110556A - Метод и сензор за имунометричен наноанализ - Google Patents

Abstract

Методът и сензорът са приложими за клинична диагностика в медицината, в науките за живота, за контрол в биопроизводства, за екологичен биоконтрол, за биобезопасността и др. Съчетани във функционална връзка биохимичен метод с пресмятащи процедури, микросензор с висока чувствителност, апаратура (лабораторна и полева) със специфични пресмятащи процедури и метод на мерене съвместно постигат едно привично за специалистите измерване на имунните реакции с точност, зададена само от фундаменталните ограничения, произтичащи от самата природа на задачите, както и регистрация на микроскопични биочастици - вируси, бионаночастици, бактерии и бактериални спори, клетъчни органели и т.н. Предимството се състои в поединичното измерване на необратими имунни реакции в естествената им реакционна среда, с използване на количества молекули от само една отделна жива клетка.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Изобретението е приложимо: за клинична диагностика в медицината; в научно-изследователската и развойна дейност в науките за живота; за контрол в био-технологичните производства; за контрол и опазване на околната био-среда; за контрол при обезпечаване на био-безопасгността и т.н.

Живота, в по-голямата си част, е базиран на ограничен клас стереоконформни биохимични реакции (имунни) и има еднотипна първична организация (клетъчна). Милиардите години еволюция обаче, са породили невероятно разнообразие от биомолекули, регулаторни цикли и реакции. Анализът на имунните реакции с цел тяхното измерване, разбиране и каталогизиране е основна текуща дейност в тази област, а основната трудност е в наномолните количества биомолекули, които трябва да се измерят/регистрират, за да се анализират процесите в отделната жива клетка.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА ©Науките за живота са в центъра на съвременното технологично и научно развитие и за тях се отделят най-много средства. Всяка година изследователите, медиците и биолозите каталогизират хиляди нови биомакромолекули (антитела, биомаркери, антигени и т.н.) използвайки имунните биохимични реакции [1]. Тази активност (по исторически причини) е базирана на молекулярно-биологични химични методи, които вече не са съвсем адекватни. В тях се използват значителни количества биомолекули и/или био-частици и тяхното събиране/набавяне налага сепариране или намножаване, които са многоетапни, продължителни и сложни процедури добавящи най-различни несвойствени влияния, артефакти, промени и др. Отделянето на резултатите става също чрез несвойствени за имунните реакции процеси - дифузия, електрофореза, свързване с оптически активни молекули, гравитационна/инерционна сепарация и т.н. - които допълнително добавят нови артефакти, селективности, химични промени и др. Регистрацията се извършва със слабо чувствителни методи, исторически ориентирани в крайна сметка, към наблюдаване с човешко око или негови съвременни еквиваленти: изображения от CCD камери; сканирани микрофотографии или микропластини и др.

Био-сензорите [2,3] са съвременното направление на развитие. Понастоящем, най-перспективните и най-чувствителните сензори за откриване и измерване на наноразмерни биоагенти (био-макромолекули, вируси, бактериални спори и т.н.) са микроконзолните MEMS (Micro Electro-Mechanical Systems) сензори [4]. Интензивно се развиват и технологиите за функционализирането на тези сензори.

Патентовани са редица сходни по наименования устройства, които обаче са съществено различни от настоящото изобретение. Известен е “Пиезоимуносензор” [9] имащ близката задача за имунно химично детектиране на “аналити”, но използващ напълно различен тип сензор. Известен е и “Автоматичен имунен анализатор” [10], който е сложна роботизирана инсталация имаща задачата да автоматизира работата на оператора (да замести оператора) и в който се прилагат ортодоксалните молекулярно биологични тестове. Известен е също така и “Имуноанализатор” [11], който е компютъризирано лабораторно оборудване (“интелигентна мебел”) имащ задачата да предотвратява неправилното опериране и да обезпечи безопасността на оператора.

Известни са много химични и биохимични реакции, които са използвани за детектиране, анализиране и измерване на био молекулите и техните реакции в различни методи и методики за различни типове микро кантилевърни сензори. Известни са и много способи за функционализация [4, 6, 7, 8] на сензори, но никой от тях не се предвижда да се извършва от оператора, а не от производителя, за еднократна функционализация на сензора преди всяко едно измерване за целите на конкретно изследване Q непосредствено от изследователя в неговата собствена лаборатория, нито пък да позволява изследването на необратими реакции.

Всички ОТДЕЛНИ елементи на сензора са известни: сензори с няколко микроконзоли (от 2 до 256) [7, 8], но при тези сензори микроконзолите или са всичките еднакви или всичките различни; микроконзоли във формата на издължена буква “П” [13];

микроконзоли с активни участъци [6, 7]; вградени пиезорезистори [6] и микроконзоли самите те едновременно пиезорезистори [13]; сензори с референтни микроконзоли [6], но не и сензори с референтна двойка микроконзоли чието отношение да е референтната величина; възбуждащи резонансните колебания на микроконзолите отделни актуатори (вибратори, излъчватели ...), както и магнитни или електромагнитни микроактуатори [14].

Известни са най-различни конструкции на носачи на микроконзолните структури [6]. Известни са и методи за създаване на хидрофилни зони [12] върху хидрофобна повърхност с найразлични предназначения, но използването им за фиксиране/задържане на подходящото място на реакционен обем, в който се извършват биохимични действия необходими за работата на сензор, не са публикувани.

КОМПЛЕКСНА ЦЕЛ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Универсално и комплексно решение за имунометричен анализ, което точно да съответства, и на утвърдилите се привични начини на работа на специалистите, и на естеството на биохимичните процеси в природата.

Съществена съпътстваща цел е регистрацията на микроскопични биочастици (вируси, бактерии и бактериални спори, © био-наночастици, клетъчни органели и т.н.), чрез имунни реакции между разположени на повърхността на биочастиците структурни групи и антитела специфични към тези групи.

ЗАДАЧА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Постигането на комплексната цел на изобретението чрез съчетани във функционална връзка: Сензор с висока чувствителност; Метод с пресмятаща процедура; Апаратура със специфични метод на мерене и пресмятащи процедури; които ©съвместно да постигат нов единен ефект - “привично” измерване на имунните реакции, както и регистрация на микроскопични биочастици с точност зададена само от фундаменталните ограничения произтичащи от самата природа на задачата. Подчертаните елементи от задачата са съществени за изобретението, а именно:

Универсален, сменяем, многократно-използваем, резонансен микроконзолен сензор, който оперативно и на място се подготвя (функционализира) за всяко измерване и/или диагностика самостоятелно от оператора (а не от производителя!!) непосредствено преди използване/измерване и се възстановява веднага след това.

Метод използващ такъв сензор за поединично измерване на необратими имунни реакции изхабяващи предхождащата функционализация, в естествената им реакционна среда (разтвори, серуми, плазма), като се използват нано-размерни образци съдържащи количества молекули съответстващи на количествата намиращи се в само една отделна жива клетка.

Малогабаритна, надеждна и проста в употреба апаратура [5] работеща при полеви условия и в лаборатории, която използва специфичен метод на мерене и пресмятащ алгоритъм, чиято точност е ограничена само и единствено от случайния неотстраним природен фазов шум на сензора.

“РЕШАВАЩ” ПРОБЛЕМ И ТРУДНОСТ

Имунните реакции са високо специфични стереоконформни биохимични реакции - т.е. реакции между два реагента, чиято пространствена структура/форма е точно “тримерно” огледална (точно съответстваща в пространството), като всяка разлика и/или несъответствие предотвратяват реакцията. От своя страна пространствената структура на био-реагентите (антитела, антигени, био-макромолекули и т.н.) често е много променлива и силно зависи от околната среда (температура, разтворени йони, рн, примеси, физични условия, други активни био-молекули и т.н.).

Общото при всички имунни реакции е техният резултат двата реагента се обединяват (необратимо) в нова обща пространствена структура. Безкрайното разнообразие от имунни реакции обаче, поражда безкрайно разнообразие от резултатни пространствени структури, всяка от които има свой специфични характеристики и химичен афинитет и изисква индивидуален, високо специфичен начин на регистрация. Единствения универсален резултат от стерео конформните (обединяващи) реакции е възникването на структури с маса равна на сумата от масите на двата реагента и това е единствената възможна база за универсален подход.

Изобретението измерва имунните реакции именно чрез тази тяхна универсална черта. Трудността обаче е в това, че въпреки че имаме “двойно” увеличение на масата на обединената структура спрямо реагентите, в абсолютен смисъл увеличението на масата си остава свръх-малко. Масата и на най-големите биомакромолекули е нищожна в сравнение с привичните лабораторни обеми (микро литри), както и в сравнение с масата на сензорите. О Необходими са микро сензори от най-чувствителния вид, като отклика им трябва да се измерва с възможно най-високата точност - т.е. точност ограничена само от неотстранимия природен шум.

Комплексния характер и на целта и на решението е втората половина от “решаващата” трудност - т.е. трудно е намирането на балансиран подход към толкова разнороден набор елементи. Използваните действия, биохимични процедури, похвати, изчисления, сензори, конструкции и т.н. въпреки различията си е необходимо да бъдат съчетани изравнено във функционалната си ©връзка, така че да се обезпечи “съгласувано обединяване”.

СЪЩНОСТ И ДЕЙСТВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Задачата на изобретението се решава чрез метод състоящ се от четири последователни действия от биохимичен характер, сензор представляващ микроконзолна структура (фигура 1) върху носач (фигура 2), измерваща сензора апаратура [5] реализираща точност ограничена само от неотстранимия природен фазов шум на сензора и процедура (пето действие от метода) за пресмятане на търсения краен резултат (неизвестните параметри на имунната реакция).

Биохимичните протоколи (наборите от операции) на всяко от ДЕЙСТВИЯТА НА МЕТОДА, макар и ясно специфицирани се характеризират главно със своята цел/задача, и не са фиксирани във всички свой детайли. Това е пряко следствие от универсалната приложимост на изобретението към имунните реакции - т.е. към всяка възможна двойка “антиген-антитяло” от безкрайното природно разнообразие. Така например, за някои от приложенията на изобретението, задължителните операции може да се извършват със специфични реагенти и/или да се извършват на два или повече етапа, без това да променя тяхната същност или предназначение. Възможни са и приложения на изобретението, при които да са необходими допълнителни, специфични операции от спомагателен характер спрямо задължителните операции. Тези два типа допълнения обаче, не се явяват изменение на метода, а само специфично детайлизиране за конкретно приложение, за конкретна двойка биомолекули. Тази характерна за този универсален метод особеност е съществено предимство на изобретението - операторът има свободата да нагласява операциите на метода съобразно текущото конкретно изследване.

Всяко от биохимичните действия на метода се състой от една или повече операции, всяка последвана от триетапно, биохимически неактивно, еднотипно ПРОМИВАНЕ за отстраняване на остатъците от химикали и ненужни реакционни продукти от повърхността на работната зона, от цялата микроконзолна структура, както и от държателя на сензора. Първия етап е промиване със струя от реагент отмиващ всички не химичносвързани молекули (протеини, полипептиди, олигонуклеотиди и т.п.) от повърхността. Следва двуетапно промиване със струя от двойно дестилирана (дейонизирана) вода.

Всяко от биохимичните действия на метода завършва с отстраняване на задържаната от капилярните сили вода ПОДСУШАВАНЕ, чрез промиване със струя от алкохол, като остатъците от алкохола се самоизпаряват.

След всяко действие на метода, промитият и подсушен сензор се ИЗМЕРВА от апаратурата описана в [51 по еднотипна, но сложна и многостъпкова автоматична измерителна процедура (съгласно метода описан в [51), като събраните резултати (осреднени отделни измервания) се използват в пресмятащ алгоритъм [5] до получаване на коригиран “обобщен резултат” отнасящ се за приключилата биохимична стъпка.

За повишаване на точността, измерванията и пресмятанията за дадено действие могат да бъдат многократно повтаряни, като получения набор “обобщени резултати” на свой ред се осреднят.

Всички биохимични действия на метода се извършват с използването на точни реакционни количества/обеми доставяни към сензора чрез (ръчна или автоматична) микропипета. Тези количества реагенти се захващат/фиксират/задържат от капилярни сили като капка течност върху една хидрофилна зона (9) позиционирана върху повърхността на носача (7) на сензора (фигура 2). Останалата част от повърхността на носача (7) е направена хидрофобна - например покрита с тънък, но цялостен тефлонов слой. Размерите на хидрофилната зона са подбрани така, че работното количество течност (воден разтвор, серум, плазма и т.п.) е достатъчно да омокря цялата зона, но да не надхвърля максималният възможен обем на една, оформена от капилярните сили, капка покриващата цялата хидрофилна зона (9).

Така, реакционните количества/обеми БЕЗ ЗАГУБИ се задържат надеждно, на точното място върху носача (7).

Микроконзолната структура (10) е монтирана на подходящо място върху носача (7) на сензора (фигура 2), така че всичките й четири микроконзоли (двете двойки) навлизат в хидрофилната (9) зона (надвисват над нея), и се покриват от (проникват във) капилярната капка. Така, повърхностите на микроконзолите стават директно изложени на въздействието на биохимичните реакции протичащи в обема на капилярната капка.

Обема на капилярната капка е реакционния обем, в който се извършват биохимичните действия на метода.

Всички действия на метода се осъществяват/извършват непосредствено от ОПЕРАТОРА използващ апаратурата и това представлява важно предимство на изобретението.

Методът започва с това, че почистеният (промития) и подсушен сензор се измерва, а получения резултат се регистрира като началното, стартовото му състояние (т.е. - началните маси на микроконзолите). Всяко от следващите биохимични действия увеличава МАСИТЕ на двете микроконзоли на “измерителната” двойка-микроконзоли, а съответните измервания регистрират тези увеличения. Масите на двете микроконзоли на “референтната” двойка-микроконзоли остават постоянни.

Първото биохимично действие на метода има за цел АКТИВАЦИЯ на повърхностите на работните зони на двете микроконзоли на “измерителната” двойка-микроконзоли и съдържа две задължителни операции:

· Активация на неорганичната (металната) повърхност само на работните зони на двете микроконзоли на “измерителната” двойка-микроконзоли на сензора непосредствено последвана от;

2. Изграждане върху така активираната повърхност на органичен базов слой (протеинов) в един или повече етапа.

Това действие не трябва да повлиява никоя повърхност извън работните зони, нито повърхностите на двете микроконзоли на “референтната” двойка-микроконзоли, нито пък да създава базов слой върху някоя от тях.

Второто биохимично действие има за цел специфична ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ на работните зони на двете микроконзоли на “измерителната” двойка-микроконзоли и съдържа също две задължителни операции:

1. Изграждане/активиране на специфичен междинен слой, закрепващ антителата (или антигените, или първия реагент) върху покритите с базовия слой повърхности на работните зони;

2. Закрепване върху работните зони на конкретни антитела (или антигени, или първия реагент) от точен работен обем с известна концентрация.

Това действие не трябва да повлиява никаква част от повърхността на двете микроконзоли на “референтната” двойкамикроконзоли, нито да прикрепва молекули на реагента върху тях.

Третото биохимично измерващо действие провежда между закрепените върху работните зони антитела (или антигени, или първия реагент) на ИМУННА РЕАКЦИЯ с антигените (или антителата, или втория реагент) и фиксира резултата от нея. Реакцията протича в точен работен обем от изследвания разтвор, или серум, или плазма, при точен контрол на температурата в работния обем и прецизно регистриране на времето, през което реакцията протича.

Реакцията се прекратява (т.е. текущия резултат се фиксира) чрез рязко промиване със струя от двойно дестилирана (дейонизирана) вода с много по-ниска температура от тази в работния обем, като точното времетраене на реакцията се определя по момента на рязкото спадане на температурата на микроконзолите на сензора.

Това действие и имунната реакция не трябва да въздействат върху никаква част от повърхността на двете микроконзоли на “референтната” двойка-микроконзоли, тъй като върху тяхната повърхност няма прикрепени молекули от първия реагент.

ф Четвъртото химично действие на метода има за цел

ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ на сензора чрез отстраняване на всички биомолекули заедно с образувалите се през предходните действия био-структури от повърхностите на работните зони, от цялата микроконзолна структура, както и от държателя на сензора. Действието възстановява сензора в състоянието му от преди първото действие на метода - приготвя го за ново използване.

Допълнително се осъществява и КОНТРОЛ, като ако след почистването на сензора, резултата от измерването му се различава значимо от резултата от първоначалното му измерване ^w от преди първото действие, то това е индикация или за необратимо изменение/повреда на сензора, или за съществена грешка на оператора при извършването на действията на метода. В такъв случай, събраните от предходните три действия резултати се отхвърлят, сензора се подменя ако е повреден и действията на метода се повтарят от началото.

Петото действие на метода е ИЗЧИСЛЯВАНЕ на търсения краен резултат (неизвестните параметри на имунната реакция) чрез процедура за пресмятане. В тази процедура се използват вече събраните пет “обобщени резултата”, които са 3 “измерителни” резултата характеризиращи първите три биохимични действия, и 2 “контролни” резултата (преди първото и след четвъртото действие) получени от апаратурата [5].

Връзката между периода ( Р ) на основния резонанс на една микроконзола и нейната ефективна маса ( М) е: Μ = α Р², където “а” е събирателен коефициент специфичен за конструкцията на сензора и едновременно отразяващ (като поправки) моментното влияние на околната среда и производствените отклонения на конкретния екземпляр. Тъй като всичките четири микроконзоли на сензора са създадени едновременно в един и същ производствен процес и се измерват едновременно в обща околна среда, то те имат еднакъв коефициент а (но ефективните им маси са съществено различни). Всяко от първите три биохимични действия увеличава в различна степен (или не увеличава) масата на всяка от микроконзолите, а четвъртото “почистващо” действие възстановява първоначалните им значения.

При всяко измерване на сензора се определят точните отношения на квадратите на периодите на резонансните честоти на всичките 4 микроконзоли. Тези отношения директно съответстват на моментните отношения на масите, така че събраните след първите 3 биохимични действия 12 “измерени” периода пораждат система от 12 уравнения (доста обемисти и не напълно независими, но очевидни равенства). В тази система уравнения експерименталните значения на периодите са свързани с масите чрез 15 величини от различен тип:

а) 5 бр. величини характеризиращи изследваната имунна реакция - молекулярната маса на антителата “mb”; молекулярната маса на антигените “ml” ; брой антитела имобилизирани върху активните участъци “N” ; общия брой молекули антиген в изследвания реакционния обем “Т” ; и константата на реакцията антитяло - антиген “С” .

б) 3 бр. коефициенти си , а₂ и а₃ отразяващи влиянието на околната среда в моментите на извършване на трите измервания, като всеки от тях участва по еднакъв начин и в четирите уравнения произлезли от съответното измерване;

в) 3 бр. съобщавани от производителя на сензори константи специфични за конкретната конструкция и 2 бр. измерими от производителя индивидуални константи отразяващи евентуалните малки (<1%) индивидуални вариации на всеки екземпляр сензор;

г) 2 бр. много малки величини (« 0.1%) от случаен характер и нулево средно значение (статистически флуктуации на експеримента), които могат да се направят произволно малки чрез многократното му повтаряне.

Трите коефициента от точка “б” се самоизключват при използване на отношения. Петте константи от точка “в” са известни и се въвеждат в компютъра на апаратурата [5] (но могат и да се определят от оператора в серия измервания без биохимични действия). Флуктуационните величини от точка “г” оказват слабо влияние или въобще могат да се пренебрегнат. Така системата от 12 не_независими_уравнения се редуцира до 9 уравнения свързващи петте съществени величини от точка “а” и двете от точка “г” с експерименталните значения на периодите, като поне една от величините от точка “а” е известна предварително. В резултат, системата става преопределена и се решава лесно (от компютъра в [5]), което дава неизвестните параметри на имунната реакция заедно с грешката с която те са определени.

Микроконзолната структура на СЕНЗОРА (Фигура 1) се състои от две еднакви двойки-микроконзоли (1 и 2) създадени едновременно в един и същ производствен процес. Всяка от четирите микроконзоли може да е изградена от един или повече сегменти с форма на паралелепипед, например от Збр. във формата на издължена буква “П”. Всяка от двойкитемикроконзоли (1 и 2) се състои от две отделни микроконзоли различаващи се само по своята дължина. Резонансната честота на микроконзолите намалява с увеличаването на тяхната дължина и/или тяхната маса. Разликата в дължините на двете отделни микроконзоли от двойките-микроконзоли (1 и 2) трябва да е такава, че да обезпечава необходимата разлика в резонансните честоти за премахване на акустичното взаимовлияние/взаимовръзка между тях. Двете еднакви двойки-микроконзоли (1 и 2) са разположени на разстояние помежду им върху обща основа (6). Само на едната от двойките-микроконзоли (2 - измерителната), върху подходящо място върху двете й отделни микроконзоли, се създават два напълно еднакви активни участъка (3), повърхността на които участъци позволява (или е подходяща за) прикрепване на биомолекулите или микроскопичните био-частици от интерес. Останалата част от повърхността на тези две микроконзоли, както и цялата повърхност на двете микроконзоли на другата (1 референтната) двойка-микроконзоли не позволява (не е подходяща за) прикрепване на био-молекулите или микроскопичните био-частици от интерес.

Създаването на активните участъци (3) се извършва едновременно в един производствен процес еднакво за двата участъка (чрез селективно добавяне на един или няколко допълнителни слоя от подходящи материали/вещества) по начин, който съществено увеличава масата на микроконзолите на тази (измерителната) двойна-микроконзола, така че резонансната честота и на двете нейни микроконзоли да се понижи достатъчно, с което да се обезпечи необходимата разлика в резонансните честоти за премахване на акустичното взаимодействие с микроконзолите на другата (референтната) двойна-микроконзола.

На Фигура 2 е показано как микроконзолната структура (10) е монтирана върху носача (7), така че двете еднакви двойкимикроконзоли (1 и 2) да се разположат непосредствено над хидрофилната зона (9), която е с подходяща форма и размери.

Резонансните колебания на всяка от четирите микроконзоли трябва да се регистрират чрез “сензорни устройства”, които да изработват сигнал, пропорционален на тяхното огъване. Те могат да бъдат реализирани като отделни устройства (оптични/лазерни измерители на преместване, капацитивни сензори за дистанция/разстояние и др.), както и да бъдат създадени/разположени непосредствено върху или вътре в микроконзолите. Микроконзолната структура (10) има четири “сензорни устройства” във вид на вградени в четирите микроконзоли “индивидуални” пиезорезистори (4) или самите структурни елементи на микроконзолите могат да изпълняват функциите на пиезорезистори. Пиезорезисторите могат да имат отделни електрически изводи (8 броя изводи) или изводите им да бъдат частично свързани помежду си като образуват схема с намален брой изводи (“звезда” с 5 извода, “мост” с 4 извода и т.н.). Електрическите изводи от пиезорезисторите (4) достигат до контактните площадки (5) и от там се прехвърлят върху носача (7) и се свързват с неговите електрически изводи (8) - позлатените контактни пера в неговия край.

Прехвърлянето на електрическите изводи от пиезорезисторите (4) към контактни площадки върху долната повърхност на общата основа (6) може да става чрез изолирани (например с р-п преходи) вертикални проводящи “стълбчета” или “отвори с проводящи стени” разположени вътре в нея. Тези непоказани на фигурите “долни” контактни площадки могат директно да се запояват към съответни контактни площадки върху повърхността на носача (7), а от там да се свързват към електрическите му изводи (8). Така може да се осъществи едновременно и електрическо свързване и механично закрепване на микроконзолна структура към носача.

Като сменяем елемент, носача (7) се вкарва в държател, който едновременно е електрически съединител свързващ контактите (8) с измерващата Апаратура [5].

Възбудителят (не показан на фигурите) създава акустични вълни с контролируема честота, които вълни възбуждат във всяка от микроконзолите на двойките микроконзоли (1 и 2) механични трептения, включително и необходимите за работата на сензора трептения на резонансната честота на отделните микроконзоли. Възбудителят може да е отделно устройство в акустична връзка с микроконзолната структура (10) или с носача (7) - например: пиезоизлъчвател, високоговорител, електромагнитен вибратор, електростатичен вибратор и т.н., или да бъде разположен/създаден непосредствено върху микроконзолната структура - например: магнитен микроактуатор, електромагнитен микроактуатор, биморфен термоактуатор, електростатичен или пиезомеханичен микроактуатор и т.н.

Носача (7) заедно с микроконзолната структура (10) се поставя в реактор свързан с компютърната апаратура [5], която автоматично многократно измерва сензора с точност ограничена само от неговия неотстраним природен фазов шум и допълнително извършва изчисляване на неизвестните параметри на имунната реакция от събраните междинни резултати чрез процедурата за пресмятане от петото действие на метода от това изобретение.

ПРИЗНАЦИ ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретението несъмнено е промишлено приложимо и вече е реализирано.

Стъпка напред е разработването на метод за еднократна индивидуална функционализация на сензори, директно от изследователя, в неговата собствена лаборатория и за конкретното негово изследване.

Универсален, сменяем и многократно използваем сензор съдържащ вграден еталон от типа “разлика между две разлики” и съответна апаратура [5] ограничена само от неотстранимия природен фазов шум, съвместно достигащи чувствителност от няколко БРОЙКИ от молекулите на използваните реагенти (например < 10 антитела) е значима стъпка.

Поотделно, всеки от елементите на конструкцията на сензора е известен. Микроконзолите, микроконзолите във формата на буква “П”, пиезорезисторите (обикновени и от микросегменти), допълнителните участъци и слоеве вкл. контактните площадки, “вертикални” съединения, най-различните микроактуатори и носачи, хидрофилни и хидрофобни участъци и др. - всички те могат да се намерят в известни конструкции. Познати са и много от отделните елементи (похватите) на метода: химичните реакции почистващи, повърхностни полимеризации, активиращи, функционализиращи; изчислителните процедури; и т.н.

Новостта на изобретението е в балансираната комбинация от известни елементи и (методични) похвати съчетани във функционална връзка и съответстващи на специфичния набор изисквания и особености, характерен само за тази задача. Съвместното прилагане на биохимичния метод, сензора, измерителната апаратура [5] и пресмятащите процедури води до постигането на нов единен ефект - измерване на стереоконформни реакции между количества молекули съдържащи се в само една единствена жива клетка.

Новост е и самата постановка на задачата - “личен” универсален прибор за всички молекулярно биологични задачи.

ПРЕДИМСТВА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението е универсално - т.е. МЕТОДЪТ е приложим към всякакви стереоконформни реакции в тяхната естествена реакционна среда, а СЕНЗОРЪТ е подходящ за всякакви варианти на биохимичните действия (протоколи) на метода.

Изобретението може да се прилага и за регистрация на микроскопични биочастици - вируси, бактерии и бактериални спори, био наночастици, клетъчни органели и т.н.

Предимство на изобретението е възможността за провеждане на всички стандартни (стандартизирани) клинични изследвания с лесно сравними “абсолютни” стойности на резултатите.

Изобретението създава и възможност за самостоятелност при прилагането му за изследвания и/или измервания, тъй като не е задължително биохимичните реагенти (антигени, антитела ....) вече да се произвеждат и продават, а могат да се създават за целите на дадено конкретно изследване непосредствено в процеса на работата (събират, изолират, намножават...) директно от изследователя, при това в неговата собствена лаборатория.

Предимство на изобретението е извършването от оператора, а не от производителя, на еднократна функционализация на сензора преди всяко едно измерване, което обезпечава възможността за изследване на необратими реакции, реакции които иначе биха веднага изхабили един перманентно функционализиран сензор.

Важно предимство на изобретението, прилагано съвместно с измерителната апаратура [5], е достижимата чувствителност от единици БРОЙКИ от молекулите на използваните реагенти - сензор специално конструиран за максимална чувствителност може да обезпечи ±1 антитяло. Такава висока чувствителност позволява да се изследват нано размерни образци съдържащи количества молекули съответстващи на количествата намиращи се в само една единствена жива клетка.

Изобретението обезпечава и съществени експлоатационни предимства: 1) сензора е универсален, сменяем, многократно използваем и самокалибрируем; 2) действията на метода са привични за специалистите, работи се със стандартни реакционни обеми, не е необходимо специално обучение или тренировка на оператора, използват се обикновени лабораторни приспособления; 3) реактора в който се поставя сензора и измерителната апаратура [5] са автоматични, малогабаритни и икономични, пригодни са както за лабораторна употреба така и за полеви (експедиционни) условия, а компютърната система на измерителната апаратура [5] позволява оперативното добавяне на нови методики и усъвършенстване на измерителните действия и/или процедури.

ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Задачата на това “не оптимизирано” примерно изпълнение е провеждането и измерването на имунната реакция между имобилизирани върху сензора антитела (Rabbit IgG) и серум съдържащ човешки албумин (Human Serum Albumin - HSA).

Всяка операция в биохимичните действия на примерното изпълнение се следва от триетапно Промиване - с първи етап измиване със струя от 1% разтвор на натриев додецил сулфат (sodium dodecyl sulphate - SDS), и два етапа на измиване със струя от двойно дестилирана и дейонизирана вода. Непосредствено следва Подсушаване с метилов алкохол (СН₃ОН) и Измерване промените в масите на микроконзолите на сензора по метода и с устройството съгласно Г51.

Използван е биохимичен протокол, при който първата операция на Активационното действие се осъществява с първи етап протичащ в реакционен обем от 25μΙ активационен разтвор съдържащ 1% от бета-меркаптоетанол (β-mercaptoetanol - ВМЕ) последван от втори етап протичащ в реакционен обем от 25μΙ съдържащ редуциращ разтвор от Tris(2-carboxy-ethyl)phosphine hydrochloride (ТСЕР) в 5тМ концентрация. Втората операция (изграждането на базовия протеинов слой) се осъществява/протича в реакционен обем от 30μΙ (15μΙ + 15μΙ) чрез полимеризационна повърхностна реакция между два протеина: 1) мономерен външномембранен пурин намножен от плазмида pOR-LA18 E.coli BL21 (DE3); 2) Z-domain на Staphylococcus aureus protein A (SpA), в съвместна концентрация от 0.2 и 0.5 mg/ml съответно. Достатъчното време за полимеризация при 37°С е 20 минути.

Първата операция на Функционализиращото действие (създаване на активиран свързващ слой) се извършва в продължение на 10 минути при 37°С в реакционен обем от 25μΙ от 1% разтвор от n-Octylglucoside към който е добавено 0.25mg/ml HS-(CH₂)_ir(OCH₂CH₂)₃-OH (trioPEG), който разтвор е активиран в процеса на приготвянето му чрез повишаване на температурата до 55°С и последващо естествено изстиване до 37°С. Втората операция (закрепване на антителата) се осъществява в продължение на 20 минути при 37°С в реакционен обем от 20μΙ съдържащ фосфатен буфер с разреден до 1:100 препарат от антитела - в това примерно изпълнение от антителата Rabbit IgG against HSA.

Реализиращото Имунната реакция действие се провежда в реакционен обем от 10μΙ на изследвания серум, съдържащ човешки албумин (HSA), приготвен/обработен съобразно произхода му. Температурата и времето за протичане на реакцията са експериментални променливи, които всеки път се подбират съобразно целите на изследването. Реакцията се прекратява чрез струя охладена дейонизирана вода с температура под 10°С .

Възстановяващото сензора действие се осъществява чрез измиване със слаба струя от 2.5М разтвор от citric acid - (pH 3.2) в продължение на 2-3 минути.

Използва се MEMS сензор с размери на общата основа 4900x3200x250 pm, и микроконзоли с дължини от 310 и 325 pm, ширини от 76 pm и дебелини от 3.5 pm. Площта на всеки от активните участъци е 50x50 pm с нанесен слой злато (Au) с дебелина от ~0.4 pm. Еластичността на микроконзолите е около ~3.5 N/m. Резонансните честоти на четирите микроконзоли са в диапазона 50-80 kHz (средно -65kHz). Пиезорезисторите са по

1.5 kOhm ±10% с максимално ниво на генерирания сигнал от ~1mV/V/pm. Измерената с 24-битова точност температурна промяна на съпротивлението на пиезорезисторите, след калибровка, се използва за определяне на индивидуалните температури на микроконзолите и температурата на протичане на биохимичните реакции, като се постига точност по-добра от ±0.1°С.

Носача е тефлонова (PTFE) платка с размери 25x10x0.8 mm имаща девет (1 от основата и 8 от пиезорезисторите) електрически изводи - позлатени контактни пера в задния край. Микроконзолната структура на сензора е запоена с долната си страна, чрез безоловен SMD припой, към позлатена площадка (по-малка от долната страна) в предния му край. Позлатените контактни площадки върху горната страна на микроконзолната структура (изводите от пиезорезисторите) се бондират със златни (Au) жички към позлатени площадки за бондиране свързани с позлатените контактни пера в задния край на носача. Оголения метал получил се при това свързване (злато Au) се покрива с химически неактивен изолиращ слой (силиконова солдер маска - “240 SB”).

Носача се вкарва в 9-контактен, газово-плътен куплунг, монтиран наклонено и по X, и по Y, на ъгли от 30°, така че при измиване със струя същата да се стича от предния ляв ъгъл. Върху хидрофобната повърхност на носача е създадена, чрез локална електрохимична обработка [12], хидрофилна зона с капкообразна форма и площ от 20mm², което обезпечава използването/фиксацията на удобните работни обеми от 10 - 30μΙ.

Възбуждането на колебанията на микроконзолите се осъществява от ултразвуков капацитивен пиезоизлъчвател (USP-1nF), плътно притиснат към носача за добра акустична връзка, който излъчва едновременно, но с различна амплитуда, всичките резонанси и честоти.

Апаратурата [5] измерва резонансните честоти на сензора с точност от 0.56ррт, която се определя само от неотстранимия природен фазов шум (-114dBc/Hz @ ~65kHz) на колебанията на микроконзолите. С автоматични повторения точността може да се увеличи до -0.1 ppm (~10‘⁷ или ~7mHz @~65 kHz). Микроконзолите на сензора променят резонансната се честота с около 3 Hz при увеличение на масата им с 10’¹⁵ грама - т.е. имат чувствителност от - 3 Hz/fg (- 3.3 10’¹⁶ g за 1Hz), което означава че е достижима чувствителност от 2.3 10‘¹⁸ g (7mHz при 3 Hz/fg).

Молекулите на използваните антитела - мономерен имуноглобулин “Rabbit IgG against HSA” имат приблизително триъгълна форма със страни от -15 nm и дебелина от -4 nm. Те се прикрепват под ъгъл от -45° спрямо повърхността на активните участъци покривайки площ от -140 nm², но се разполагат на разстояние помежду си. Върху площта от 50x50 pm на всеки от активните участъци се прикрепват само около 1.8 10⁶ броя, директно покривайки само около 10% от площта им.

Масата на мономерния имуноглобулин “Rabbit IgG against HSA” е -150 kDa (-2.5 10’¹⁹ g), а масата на протеина-антиген човешки албумин “HSA” е 67 kDa (1.1 10'¹⁹g). Изследваната имунна реакция IgG + HSA създава нова молекулна структура с маса от -217 kDa (-3.6 10'¹⁹g) - т.е. увеличава масата с - 44%.

За молекулите от примерното изпълнение максималната чувствителност от 2.3 10'¹⁸ g означава точност от ± 9 броя антитела и ± 20 броя протеинови молекули.

Случайните статистически флуктуации на броя на прикрепените антитела (при второто действие на метода) са едва ±0.075% или ±3 10‘¹⁶д (при пълно покритие от-1.8 10⁶ антитела), които 130 пъти надхвърлят разделителната способност на примерното изпълнение ( 2.3 10'¹⁸ д) - т.е. ограниченията за изобретението са фундаменталните природни граници.

ЦИТИРАНА ЛИТЕРАТУРА

1. “The Immunoassay Handbook”, Third Edition, Ed. by D. Wild, Elsevier, 2005, 930 p.

2. “Biosensors”, Second Edition, Eds. by J. Cooper and T. Cass, Oxford University Press, 2004,251 p.

3. “Fluorescence Sensors and Biosensors”, Ed. by R.B. Thompson, Taylor & Francis, 2006, 394 p.

4. Sapsford K.E., et al., 2008, Sensors for detecting biological agents”, Materials Today 11 (2): 38-49.

5. Минчев Г., Минчева T., Заявка за патент №110557/17.12.2009г., “Метод и устройство за пределно точно измерване на отношения на честоти на еднотипни периодични процеси”.

6. Baller М.К. et al., “Cantilever sensors and transducers”, Patent WO 01/33226 A1, 2001.

7. Boisen A. and Thundat T., 2009, “Design & fabrication of cantilever array biosensors”, Materials Today 12 (9): 32-38.

8. Lang H. et al., 2005, ’’Cantilever array sensors”, Materials Today 8 (4): 30-36.

9. Zong et al., “Piezoimmunosensor”, USA Patent 7,329,536 B2, 2008.

10. Babson et al., “Automated immunoassay analizer”, USA Patent 5,885,530, 1999.

11. Mitsuru O. et al., “Immunoanalyzer”, Japan Patent 11316234 A, 1999.

12. Combellas C. et al., “Method for Electrochemically Realizing a Hydrophilic Area on a Hydrophobic Substrate”, Patent application US2009/0101508A1.

13. Harkey J. et al., “High-sensitivity piezoresistive cantilevers under 1000 angstrom thick”, Appl. Phys. Lett., 75,289-291 (1999).

14. Then D. et al., “A higly sensitive self-oscilating cantilever array for the quantitative and qualitative analysis of organic vapor mixtures”, Sensors and Actuators B, 117,1-9 (2006).

Claims (8)

1. АВТОРСКИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Метод за имунометричен анализ използващ универсален, сменяем, многократно използваем и самокалибрируем сензор съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че се състои от пет действия, като първите четири от тях имат биохимичен характер и се извършват в точен реакционен микро обем фиксиран като капилярна капка на точно място (9) върху носача (7) на сензора, като първото действие химически активира повърхностите на активните участъци (3) на измерителната двойка микроконзоли (1) , второто действие създава върху активните участъци (3) една изразходваща се, еднократна за всяко изпълнение на метода, функционализация на сензора, в третото действие в реакционен микро обем се осъществява анализираната имунна реакция при точно подържане на температурата и при точно отчитане на протеклото реакционно време, а четвъртото действие премахва остатъците от първите три действия и възстановява сензора в първоначалното му състояние, като всяко от биохимичните действия се последва от еднотипно мерене [5] на сензора, резултатите на което измерване се отнасят за това биохимично действие, като резултатите за четвъртото действие служат за контрол, а резултатите за първите три биохимични действия се използват в петото действие в пресмятаща процедура за неизвестните параметри на имунната реакция, която процедура използва като еталон постоянното отношение на резонансните честоти на двете микроконзоли от еталонната двойка микроконзоли (2) , чиито маси не се променят от биохимичните действия, тъй като повърхността им не е подходяща за прикрепване на биомолекули и/или микроскопични био частици.
2. 2. Сензор използван в метода съгласно претенция 1 представляващ микроконзолна структура (10) върху носач (7) характеризираща се с това, че се състои от четири микроконзоли групирани в две еднакви двойки-микроконзоли (1 и 2) създадени едновременно в един и същ производствен процес, като всяка от двойките-микроконзоли (1 и 2) се състои от две различаващи се само по своята дължина отделни микроконзоли, която разлика в дължините е достатъчна да обезпечи различие в резонансните честоти изключващо акустичното взаимовлияние между микроконзолите, като двете еднакви двойки-микроконзоли (1 и 2) са симетрично разположени на подходящо разстояние върху обща основа (6), като само на едната от двойките-микроконзоли (2), на едно и също място върху повърхностите и на двете нейни микроконзоли, се произвеждат, чрез селективно добавяне на един или няколко допълнителни слоя от подходящи материали, два напълно еднакви активни участъка (3), повърхността на които участъци (3) е подходяща за прикрепване на биомолекули и/или микроскопични биочастици от интерес, докато останалата част от повърхността на тази двойка микроконзоли (2), както и цялата повърхност на двете микроконзоли на другата двойка микроконзоли (1) се произвежда такава, че да не е подходяща за прикрепване на биомолекули и/или микроскопични биочастици от интерес, като всяка от четирите микроконзоли притежава вграден пиезорезистор (4) изработващ сигнал, пропорционален на нейното огъване, които пиезорезистори (4) имат по два електрически извода свързани към изолирани контактни площадки (5) върху горната повърхност на общата основа (6), а електрическият извод от проводящата обща основа (6) е изведен на изолирана контактна площадка върху долната повърхност на общата основа (6), като микроконзолната структура (10) е разположена върху носач (7), който е плосък сменяем елемент с подходяща форма, хидрофобна повърхност и контактни пера (8) вкарващ се в електрически съединител контактуващ към перата (8), имащ контактни площадки електрически свързани с контактните пера (8), към една от които контактни площадки се запоява и с това механично се закрепва общата основа (6), а към останалите контактни площадки се свързват изводите (5) от пиезорезисторите (4), като върху хидрофобната повърхност на носача (7) на подходящо място е създадена хидрофилна зона (9) с подходяща форма и размери, над която се намират двойките микроконзоли (1 и 2) и върху която Q хидрофилна зона (9) да се задържа от капилярните сили работния обем течност в който протичат химичните реакции от действията на метода от претенция 1.
3. 3. Сензор съгласно претенция 2, представляващ микроконзолна структура (10) характеризираща се с това, че всяка от четирите микроконзоли на двете й двойки-микроконзоли (1 и 2) е изградена от по три проводящи структурни елемента образуващи издължена буква “П” с по два изолирани електрически • извода (5) от двата края на “буквите” и активни участъци (3) разположени върху напречните елементи на едната двойка микроконзоли (2), като при протичане на ток през трите структурни елемента се изработва сигнал пропорционален на огъването им и следователно на огъването на цялата микроконзола, с което структурните елементи функционират и като пиезорезистори.
4. 4. Сензор съгласно претенция 2 характеризиращ се с това, че върху всичките четири микроконзоли от двойките микроконзоли (1 и 2), върху цялата им повърхност или само върху част от нея, допълнително са нанесени слой от магнитен материал и последваш изолиращ слой, като слоя от магнитен материал, в променливо магнитно поле с подходяща честота, създава променлива сила с която се възбуждат резонансните колебания на микроконзолите.
5. 5. Сензор съгласно претенция 2 характеризиращ се с това, че по повърхността на всичките четири микроконзоли от двойките микроконзоли (1 и 2) последователно преминава една изолирана проводяща допълнителна пътечка разположена така, че протичащия по тази пътечка променлив ток с подходяща честота, в едно подходящо постоянно магнитно поле, създава променлива сила с която се възбуждат резонансните колебания на микроконзолите.
6. 6. Сензор съгласно претенция 2 характеризиращ се с това, че възбуждането на резонансните колебания на четирите му микроконзоли се извършва от излъчващо акустични вълни отделно устройство в акустична връзка с носача (7) и чрез него в акустична връзка с микроконзолната структура (10).
7. 7. Сензор съгласно претенция 2, представляващ микроконзолна структура (10) върху носач (7) характеризираща се с това, че електрическите изводи от пиезорезисторите (4) са съединени към контактни площадки върху долната повърхност на общата основа (6) чрез изолирани вертикални електрически връзки, като контактните площадки върху долната повърхност директно се запояват към съответни контактни площадки разположени върху горната повърхност на носача (7), с което се осъществява електрическо свързване на пиезорезисторите (4) към електрическите изводи от носача (8) и механично закрепване на общата основа (6) към носача (7).
8. 8. Сензор съгласно претенция 2, представляващ микроконзолна структура (10) характеризираща се с това, че електрическите изводи от пиезорезисторите (4) са частично свързани помежду си като образуват схема “звезда” с един общ извод и по един индивидуален извод от всеки пиезорезистор (4).