Perfectionnements à la thérapie par l'interleukine
Revendication des priorités des demandes de brevet déposées en Grande-Bretagne le 9 avril 1984 sous le n[deg.]. 8409125, le 9 avril 1984 sous le n[deg.]. 8409126,1e 9 avril 1984 sous le n[deg.]. 8409127, le 9 avril 1984 sous le n[deg.]. 8409128, le 10 août sous le n[deg.]. 8420381, le 19 septembre 1984 sous le n[deg.]. 8423700 et le 19 septembre 1984 sous le n[deg.]. 8423701.
La présente invention concerne La thérapie par l'interleukine.
L'interleukine 2 (ci-après IL-2) est un facteur protéiné naturel découvert pour La première fois en 1976. Elle est produite à partir des cellules T activées par un antigène ou lectine et constitue un facteur essentiel de la prolifération des cellules T. On a isolé des IL-2 de diverses structures à partir d'un certain nombre d'espèces animales, par exemple souris, primates comme le gibbon,le singe et l'homme. Les IL-2 humaines et d'autres ont été purifiées à partir de diverses sources, telles que les lymphocytes
de sang périphérique, les lymphocytes amygdaliens, les lymphocytes
de la rate, les cellules T leucémiques et les cultures d'hybridomes de cellules T.
Comme indiqué ci-dessus, l'IL-2 est un facteur essentiel à la prolifération des cellules T, elles-mêmes intimement impliquées dans Les mécanismes de réponse immune de l'organisme. On suppose que l'IL-2 possède un potentiel thérapeutique extrêmement vaste. En particulier, elle peut être intéressante dans la thérapie des tumeurs,puisqu'elle conduit à la prolifération de cellules T spécifiques d'un antigène, par exemple contre les antigènes tumuraux, et ces cellules T peuvent inhiber la croissance tumorale. On sait également que l'IL-2 induit la production de gamma-interféron et active les cellules tueuses naturelles. On s'attend également que l'IL-2 possède diverses applications contre Les troubles immunologiques, tels que les maladies néoplasiques, les infections bactériennes ou virales, les maladies immunodéficitaires, les
<EMI ID=1.1>
Adv. Immunopharm. (1980) 507).
Comme avec d'autres produits naturels comme les interférons, l'IL-2 n'était disponible qu'en faibles quantités avant l'apparition du génie génétique.
Cependant, en suivant une méthodologie semblable à ceLLe préalablement publiée pour d'autres protéines (par exemple le gamma-interféron), on a déterminé et exprimé la structure d'un gène cloné pour L'IL-2 humaine (voir S. Taniguchi et autres, Nature
(1983) 302, pages 305-310 et publication de brevet européen 91539 dont le contenu est incorporé à titre de référence. Cette IL-2 particulière est dénommée ci-après IL-2 connue.
On a déduit de La série de codage des nucléotides
La série d'aminoacides du polypeptide de l'IL-2 humaine, à savoir celle comprenant les aminoacides numérotés de 1 à 153 dans la figure 3a de l'article de Nature ci-dessus. On a supposé,cependant, que les 20 premiers aminoacides de cette série pouvaient être séparés Lors de transports à travers une membrane. L-IL-2 humaine mûre consisterait alors en 133 aminoacides commençant par l'Ala en position 21.
Cette structure de l'IL-2 humaine a été confirmée dans nos laboratoires et d'autres.
Il est également possible de produire des IL-2 de structures différentes en utilisant les techniques d'ADN recombinant. Par exemple, on peut produire des modifications du polypeptide de l'IL-2 humaine ayant un ou plusieurs aminoacides absents ou remplacés par d'autres aminoacides, par exemple comme décrit dans la publication de brevet européen mentionnée ci-dessus, en particulier pages
23 à 25, par modification correspondante du gène de L'IL-2 humaine. Par exemple, on peut, si on le désire, remplacer Les résidus cystéine par d'autres aminoacides, par exemple La sérine, comme décrit dans
La publication de brevet européen 109748 au nom de Cetus et le brevet belge 898016, par exemple l'IL-2-sérine-125, dont Le contenu est incorporé ici à titre de référence.
D'autres exemples de ces interleukines sont décrits dans La publication de brevet PCT WO 85/00817, dont le contenu est incorporé à titre de référence. Celles-ci comprennent l'IL-2 Gln-26, L'IL-2 Phe-121 et l'IL-2 Stop 121.
En outre, on peut produire des IL-2 de différentes sources comme le gibbon par des techniques à l'ADN recombinant et
on peut aussi produire une modification de celles-ci de manière semblable. En outre,comme on L'a indiqué, les IL-2 peuvent être isolées (quoiqu'en quantités relativement faibles) à partir de sources natureLLes et peuvent différer des produits obtenus par La technologie de l'ADN recombinant, par exemple dans la glucosylation. En outre, toutes les variantes peuvent être produites.
Les IL-2 peuvent aussi être produites par culture
de cellules humaines, par exemple en présence d'un inducteur. On citera à titre d'exemples l'IL-2 A-1, l'IL-2 A-2, l'IL-2 B-1,
L'IL-2 B-2 comme définies dans la demande de brevet danois n[deg.] 3317/84 et la publication de brevet européen n[deg.] 132359, dont le contenu est incorporé comme référence.
On entend ci-après par "interleukine" tout polypeptide y compris, mais sans limitation,ceux décrits ci-dessus, qu'ils soient isolés à partir de sources naturelles ou produits par une technique synthétique ou biosynthétique et qui possèdent une activité d'IL-2. Selon la présente invention, L'interLeukine préférée est l'IL-2 humaine ou L'une de ses modifications, produite de préférence par
des techniques à l'ADN recombinant. Des essais ont été effectués jusqu'à présent avec l'interleukine par injection, par exemple par voie intraveineuse. Ceux-ci ont montré par exemple que l'IL-2 a une très courte demi- vie de moins de 5 min.On a nettement besoin d'une forme parentérale d'interleukine à libération modifiée donnant une durée d'action suffisamment longue; cependant, il n'y a jusqu'à présent que peu de publicationsconcernant des formulations galéniques spécifiques d'interleukines.
En outre, des essais effectués dans nos laboratoires
<EMI ID=2.1>
liposomiques qui présentent encore une activité d'IL-2 par administration par exemple par voie intraveineuse. En outre, les Liposomes
de la présente invention ont une demi-vie prolongée,ils sont passivement dirigés sur la cible dans la rate, le poumon, la moelle
osseuse ou les ganglions lymphatiques.
La présente invention propose en conséquence des
<EMI ID=3.1>
Les Liposomes selon l'invention peuvent être préparés par encapsulation d'une interleukine dans une substance formant
un Liposome.
Les liposomes sont des membranes à double couche complètement fermées contenant une phase aqueuse avec l'interleukine. L'interleukine peut être dans La phase aqueuse et/ou dans la membrane. Ils peuvent être sous la forme de vésicule unilamellaire ou de vésicule oligo ou multi-lamellaire sous la forme de doubles couches à membranes concentriques séparées chacune L'une de L'autre par une couche d'eau.
On peut Les préparer par diverses techniques différentes - voir F. Szoka et D. Papahadjopoulos, "Liposomes and their uses in biology and medicine" Ann. N.Y. Acad. Sci. 308, 1-462, (1978); R.L. Juliano & D. Layton, "Liposomes as a drug delivery system" dans Drug delivery systems, pages 189-236, Oxford University Press, New York, 1980, dont La description est incorporée comme référence, mais Le procédé de L'invention est préféré car iL donne des Liposomes ayant des propriétés particulièrement intéressantes. Ainsi, Les Liposomes produits par ce procédé sont spécialement stables, par exemple contre la fuite de l'interleukine,et Le procédé de L'invention est approprié pour La production industrielle.
Les Liposomes peuvent être fabriqués à partir de divers Lipides capables de former des parois de vésicules. Les Lipides préférés sont les phospholipides, tels que La lécithine naturelle (par exemple Lécithine d'oeuf ou de soja), les lécithines synthétiques, les céphalines et les sphingomyélines. On peut également utiliser d'autres phosphatidyLchoLines, des acides phosphatidiques, Les LysophosphatididyLchoLines, des sphingolipides, Le phosphatidyLgLycéroL, Les cardiolipines, Les glucolipides, Les gangliosides et les cérébrosides.
Des exemples de lécithines comprennent les "EPIKURONS" fabriqués par Lucas Meyer, Hambourg 28, Allemagne Fédérale. La composition en phospholipides est, par exempLe, La suivante :
phosphatidylchoLine 44-7%, phosphatidyléthanolamine 22-25%, phosphatidylinositol 0-2%, teneur en acidesgras : saturés, acide palmitique 9-11%, acide stéarique 2-4%, insaturés, acide linoléique
63-67%, acide linolénique 5-8%, acide oléique 14-18%, connu sous
Le nom "EPIKURON 145 V". Un autre produit contient plus de 95% de phosphatidycholine, par exemple 95-98%,et des acides principalement insaturés, par exemple acide oléique 10-12%, acide linoléique
62-65%, acide linolénique 5-6%, ainsi que des acides saturés, par exemple acide palmitique 15-17%, acide stéarique 3-4%, comme celui vendu sous Le nom "EPIKURON 200".
On préfère qu'il y ait une teneur élevée en acides insaturés.On peut,si on le désire,utiliser une lécithine à teneur élevée en acides saturés,par exemple acide stéarique,et à 95% ou plus de phosphatidylcholine,par exemple "SOJA PHOSPHITID NC 95" ou des équivalents purs appropriés pour l'usage pharmaceutique, fournis par exemple
par NATTERMANN CHEMIE GmbH, CoLogne, Allemagne Fédérale.
Les phospholipides synthétiques peuvent contenir des portions aliphatiques modifiées, telles que des groupes hydroxyles, des chaînes carbonées ramifiées, des dérivés cycliques, des dérivés aromatiques, des éthers, des amides, des dérivés polyinsaturés, des dérivés halogénés ou des portions hydrophiles modifiées contenant
des groupes carbohydrate, gLycoL, phosphate, phosphonate, ammonium quaternaire, sulfate, sulfonate, carboxy, amine, sulfhydryle et imidazole, par exemple comme dans les dérivés de dimyristoyl-, dipalmitoyl- ou distéaroyL-phosphatochoLine.
Si on Le désire, dans Le Liposome final, La double couche peut contenir, par exemple, jusqu'à 50 moles % d'autres Lipides, par exemple des stéroides comme Le cholestérol.
De préférence, Le Liposome final contient un stéroïde, teL que Le cholestérol. Les rapports pondéraux appropriés lipidestéroïde peuvent être de 6:1 à 1:1.
Si on Le désire, La double couche peut comprendre
une Lécithine, par exemple La céphaline ou La sphingomyéline contenant jusqu'à 10 moles % d'un additif pour augmenter l'incorporation, par exemple des composés anioniques, tels que des acides, par exemple phosphate de dicétyle, acide phosphatidique, taurocholate de sodium, phosphatidylsérine (Merck) ou des composés cationiques, par exemple des amines, telles que La stéarylamine. On préfère utiliser La phosphatidylsérine (disponible chez Merck, Allemagne FédéraLe).
Lorsque Le Lipide contient des excipients supplémentaires, il peut être préféré d'évaporer une solution du Lipide et
des excipients, par exemple dans Le chlorure de méthylène dans un récipient réactionnel pour former un film lipidique sur La surface
du récipient avant de mélanger le Lipide avec l'interleukine.
Les Liposomes peuvent être produits par des techniques
<EMI ID=4.1>
par les ultrasons, en utilisant des conditions douces pour éviter
<EMI ID=5.1>
peuvent être produits par formation d'une solution de lipide, par exemple lécithine et cholestérol, dans un solvant organique convenable, par exemple le chloroforme. La solution est ensuite évaporée dans un récipient de réaction pour former un film lipidique.
Les liposomes peuvent être isolés et stérilisés de manière classique.
Dans les liposomes résultants selon l'invention, La concentration de l'interleukine est de préférence d'environ 5 à
<EMI ID=6.1>
La concentration en Lipide est de préférence d'environ
1 à environ 200 mg/ml de phase aqueuse, spécialement de 10 à 100 mg/ml.
Le diamètre moyen des Liposomes pour L'utilisation ultérieure est de préférence d'environ 25 nm à 20 pm, de préférence
de 100 à 500 nm.
La préparation finale de Liposomes est de préférence stockée à basses températures, par exemple de -20 à +5[deg.]C.
En vue d'améliorer Leur stockage, Les Liposomes
selon l'invention peuvent être LyophiLisés en une poudre sèche,
par exemple par lyophilisation, en utilisant par exemple Le mannitol, Le saccharose, La polyvinylpyrrolidone ou La gélatine comme matière
de support. Ceci peut être effectué dans les mêmes conditions que pour La lyophilisation indiquée ci-dessous dans l'étape Ab. Avant l'utilisation, on peut Les reconstituer par addition d'eau stérile. On
peut alors les mélanger avec des systèmes appropriés, par exemple
pour l'injection intraveineuse ou la perfusion.
La pureté des liposomes peut être déterminée par des techniques analytiques classiques.
Les Liposomes résultants peuvent, si on Le désire, contenir un antioxydant, par exemple jusqu'à 1% du Lipide, de préférence 0,1%. Des antioxydants préférés comprennent la vitamine E
(acétate de tocophèrol), le palmitate de vitamine C et Le BHT
(hydroxytoluène butylé).
<EMI ID=7.1>
présents, par exemple un sucre, tel que mannitol, arabinose, sorbitol ou saccharose, des albumines, par exemple La sérum-albumine humaine, etc. Ceux-ci peuvent être incorporés dans Le tampon avant La formation du liposome. Ils sont présents de préférence jusqu'à 20 moles % en poids du Lipide dans Le Liposome résultant.
Un procédé préféré pour la formation du Liposome est Le procédé a) suivant qui comprend
Aa) La formation d'une solution d'une interleukine et d'un lipide
dans un solvant organique,
Ab) l'élimination du solvant de La solution pour donner un résidu, Ac) la mise en suspension du résidu dans une solution d'un tampon, Ad) l'agitation et l'homogénéisation de la suspension jusqu'à
production de liposomes, et
Ae) l'isolement des Liposomes.
Dans l'étape Aa), le terme "solution" couvre également Les "pseudo-solutions" comme Les suspensions. Cependant, on préfère produire une solution homogène, Limpide. On peut utiliser n'importe quel solvant qui dissolve ou solubilise l'interleukine et Le Lipide. Le système peut être un solvant unique ou un mélange de solvants.
IL peut contenir par exemple jusqu'à 15% d'eau. Le système solvant peut, si on le désire, contenir un tensioactif. Le système solvant peut comprendre n'importe quel solvant organique approprié qui puisse être éliminé du Lipide par évaporation. On peut utiliser une grande variété d'éthers, tels qu'éther diéthylique et éther diisopropylique, d'esters tels que L'acétate d'éthyle, d'aLcooLs tels
que méthanol et tert-butanol et d'hydrocarbures halogénés tels que chlorure de méthylène et chloroforme. Si on le désire, Le système solvant peut contenir de l'acide acétique. On préfère utiliser L'éther diéthylique, le chlorure de méthylène ou Le tert-butanol.
Nous avons trouvé que le tert-butanol est préféré Lorsque L'on utilise un vide poussé et Le chlorure de méthylène avec un vide faible dans l'étape Ab).
Dans L'étape Ab), Le solvant peut être éliminé par de nombreux moyens classiques en tenant compte de la sensibilité
de L'interLeukine. Des moyens préférés comprennent l'évaporation sous vide faible, par exemple 10 à 50 mm Hg, ou la lyophilisation sous vide poussé, par exemple à moins de 5 mm Hg, par exemple à
0,1 mm Hg.
Nous avons trouvé que La lyophilisation est spécialement préférée.
L'étape est avantageusement mise en oeuvre à une température inférieure à La température ambiante et Le vide et La température sont réglés de telle manière que Le mélange évaporé soit
à environ 1-3[deg.]C au-dessous du milieu ambiant. Ce réglage peut s'effectuer de manière classique. Un programme typique de lyophilisation démarre à environ -60[deg.]C et La température augmente jusqu'à
-15[deg.]C en 12 h. La température est ensuite augmentée à +10[deg.]C et maintenue pendant 2 h.
Dans L'étape Ac), le tampon utilisé est de préférence
un tampon au phosphate, par exemple à pH 4-7, par exemple 5-6,5. La phase aqueuse est de préférence hypotonique, c'est-à-dire à moins
de 300 milliosmoles/litre, spécialement moins de 290 milliosmoles/litre. La suspension résultante contient de préférence environ 0,001 à
environ 0,2 g de Lipide par ml. -
Dans L'étape Ad), L'homogénéisation peut être obtenue par traitement par Les ultrasons. Des fréquences convenables pour ce traitement peuvent être par exemple de 30 à 80 kHz.Une puissance typique est de 200 à 400 W pour environ 10 mL du mélange à homogénéiser ou à agiter. Bien entendu, on préfère que Le mélange homogénéisé soit séparé de tout métal, tel que titane ou autre, associé avec Le générateur d'ultrasons pour éviter La contamination par Le métal.
La température est de préférence d'environ 10 à 70[deg.]C.
On préfère la température ambiante pour les Lipides insaturés et
de 60 à 70[deg.]C pour Les Lipides saturés.
Pendant cette étape, iL peut se former une émulsion
de liposomes avec des agglomérats.
Si on le désire, Le traitement par ultrasons peut
être suivi d'agitation avec un agitateur mécanique à haute vitesse,
par exemple à 10 000-27 000 tr/min. On préfère cependant supprimer cette étape et effectuer L'agitation également par les ultrasons
dans Les mêmes conditions que pour L'homogénéisation.
Dans L'étape Ae), Les Liposomes selon l'invention peuvent être isolés selon des techniques classiques, par exemple par ultrafiltration, centrifugation, échange d'ions ou chromatographie sur gel, dialyse, etc. Les liposomes peuvent être filtrés et stérilisés à travers un filtre à petites ouvertures convenables, par
<EMI ID=8.1>
effectuée au-dessus du point de transition de phase du Lipide, par exemple de 30 à 70[deg.]C. Les liposomes sont de préférence isolés par centrifugation à vitesse élevée, par exemple à 10 000-20 000 g.
Un exemple du procédé a) est le suivant :
a'a) mélange d'une solution hydrophile d'une interleukine avec un
Lipide dans un solvant organique,
a'b) élimination de l'eau et du solvant organique par évaporation, a'c) reprise du résidu dans une solution tampon à pH 4-7 pour former
une suspension,
a'd) traitement de la suspension par les ultrasons pour former des
liposomes, et
a'e) isolement des Liposomes.
Un autre exemple du procédé a) est Le suivant :
a"a) mélange d'une solution hydrophile d'une interleukine avec un
Lipide dans un solvant organique,
a"b) lyophilisation du mélange pour donner un lyophilisât,
a"c) mise en suspension du mélange de lyophilisation dans une
solution d'un tampon (pH 4-7),
a"d) agitation de La solution jusqu'à production de Liposomes et/ou
d'agglomérats,
a"e) homogénéisation du mélange par des moyens mécaniques, et
a"f) isolement des liposomes.
Ces procédés peuvent être mis en oeuvre de manière analogue au procédé a).
Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé b) pour produire des liposomes contenant l'interleukine, qui comprend Les étapes suivantes :
ba) mélange d'une solution à base aqueuse d'une interleukine et
d'une solution organique d'un Lipide,
bb) traitement du mélange par Les ultrasons jusqu'à formation d'un
peu de Liposomes et/ou d'agglomérats, et
bc) récupération des liposomes du mélange, par exemple par bi) élimination du solvant organique du mélange pour former une
phase intermédiaire gélatineuse, et
bii) transformation de La phase intermédiaire gélatineuse en
liposomes.
Dans L'étape ba), Le terme "solution" vise également les "pseudo-solutions", teLLes que les émulsions. Cependant, on préfère produire une solution homogène,limpide. On peut utiliser n'importe quel système solvant qui dissolve ou solubilise Le Lipide. Le système peut être un solvant unique ou un mélange de solvants. IL peut contenir, par exemple,jusqu'à 15% d'eau. Le système solvant peut contenir, si on le désire, un tensioactif. Le système solvant peut comprendre n'importe quel solvant organique approprié qui puisse être éliminé du Lipide par évaporation. On peut utiliser une grande variété d'éthers comme L'éther éthylique et L'éther isopropylique,
<EMI ID=9.1>
et Le tert-butanol et d' hydrocarbures halogénés comme le chlorure de méthylène ou Le chloroforme.
Si on le désire, Le système solvant peut contenir
de L'acide acétique. On préfère utiliser Le tert-butanol ou de préférence l'éther éthylique ou Le chlorure de méthylène.
L'interleukine peut être dissoute dans l'eau ou de préférence dans un système tampon aqueux à pH 4-7,4, par exemple à 5-6,5.
Le tampon aqueux est de préférence hypotonique, c'est-à-dire à moins de 300 miLLiosmoLes/Litre, spécialement moins
de 290 miLLiosmoLes/Litre. Le mélange résultant contient de préférence environ 0,001 à environ 0,2 g de Lipide par mL.
Dans L'étape bb), Le traitement du mélange peut s'effectuer par Les ultrasons. Des fréquences convenables peuvent être, par exemple, de 30 à 80 kHz.Une puissance typique est de 200
à 400 W pour chaque 10 mL du mélange traité. Bien entendu, on préfère que le mélange traité soit séparé de tout métal, teL que titane ou autre, associé au générateur d'ultrasons pour éviter la contamination par Le métal.
La température est de préférence d'environ 10 à 70[deg.]C. On préfère La température ambiante pour les lipides insaturés et une température de 60-70[deg.]C pour Les Lipides saturés.
Pendant cette étape, iL peut se former une émuLsion
de Liposomes avec des agglomérats.
Les liposomes peuvent être récupérés de manière classique et L'on peut prévoir des étapes pour optimiser le rendement.
Dans l'étape i), le solvant organique est convenablement éliminé sous faible vide, par exemple de 10 à 600 mm Hg,
tandis que La majeure partie de la phase aqueuse est encore conservée. On utilise de préférence de basses températures, par exemple la température ambiante ou des températures légèrement élevées, par exemple à 45[deg.]C.
Dans L'étape ii), la phase intermédiaire gélatineuse résultante peut être traitée par l'eau, facultativement une solution tampon, comme décrit ci-dessus pour produire Les Liposomes.
Selon un autre aspect, L'invention propose un procédé c)
<EMI ID=10.1>
Les étapes suivantes :
ca) mélange d'une interleukine, d'un tampon à base aqueuse à pH 4-8
et d'un Lipide dans un solvant organique,
cb) traitement de la suspension résultante par les ultrasons pour
former des Liposomes ou agglomérats, et
cc) récupération des liposomes du mélange, par exemple par
ci) évaporation du solvant du mélange, par exemple par une phase
intermédiaire gélatineuse, et
cii)transformation de la phase intermédiaire gélatineuse en liposomes. Dans L'étape ca), Le terme "solvant" vise également les "pseudo-solutions" comme Les émulsions. Cependant, on préfère produire une solution homogène, limpide. On peut utiliser n'importe quel système solvant qui dissolve ou solubilise le lipide. Le système peut être un solvant unique ou un mélange de solvants. IL peut contenir, par exemple, jusqu'à 15% d'eau. Si on le désire, iL peut contenir un tensioactif. Le système solvant peut comprendre n'importe quel solvant organique approprié qui peut être éliminé du lipide par évaporation.
On peut utiliser une grande variété d'éthers comme l'éther éthylique et L'éther isopropylique, d'esters comme L'acétate d'éthyle, d'alcools comme Le méthanol et le tert-butanol et d'hydro-carbures halogénés comme Le chlorure de méthylène et le chloroforme. Si on le désire, Le système peut contenir de L'acide acétique. On préfère utiliser l'éther éthylique, Le chlorure de méthylène ou Le tert-butanol.
L'interleukine peut être utilisée sous forme de poudre, par exemple ayant avantageusement une dimension maximale de particules
<EMI ID=11.1>
Dans l'étape ca), Le tampon est de préférence un
tampon au phosphate, par exemple à pH 4-7,4, teL que 4 à 7, par exemple 5-6,5. De préférence, La phase aqueuse est hypotonique, c'est-à-dire à
<EMI ID=12.1>
Litre. La suspension résultante contient de préférence d'environ 0,001 à environ 0,2 g de lipide par mL.
Dans L'étape cb), Le traitement peut être effectué par les ultrasons. Des fréquences convenables sont par exemple de 30 à
80 kHz. Une puissance typique est de 200 à 400 W pour environ 10 mL
du mélange traité. Bien entendu, on préfère que Le mélange traité
soit séparé de tout métal du type titane ou autre associé au générateur d'ultrasons pour éviter La contamination par le métal.
La température est de préférence d'environ 10 à 70[deg.]C. On préfère La température ambiante pour Les Lipides insaturés et
une température de 60-70[deg.]C pour Les Lipides saturés.
Pendant cette étape, il peut se former une émulsion
de Liposomes avec des agglomérats.
Les Liposomes peuvent être récupérés de manière classique et L'on peut prévoir des étapes pour optimiser les rendements en Liposomes. Dans L'étape ci), Le solvant organique est convenablement éliminé sous un faible vide, par exemple de 10 à 600 mm Hg, par exemple à La trompe à eau, tout en conservant La majeure partie de
La phase aqueuse. De préférence, on utilise de basses températures, par exemple La température ambiante ou des températures Légèrement élevées, par exemple à 45[deg.]C.
Dans L'étape cii), on peut traiter La phase intermédiaire gélatineuse par l'eau, facultativement une solution de tampon comme décrit ci-dessus pour produire les liposomes.
IL peut se former une suspension. Si on Le désire, on peut effectuer une évaporation supplémentaire pour éliminer Les traces de solvant organique et La formation de Liposomes acides.
Les Liposomes selon L'invention peuvent encore être isolés selon des techniques classiques, par exemple comme dans L'étape ae) du procédé.
La pureté des Liposomes peut être déterminée par
des techniques cLassiques.
Pour déterminer L'incorporation de L'interLeukine dans Les Liposomes, Le mélange brut de prépurification peut être dilué et centrifugé, par exemple pendant 3 à 24 h, et on détermine La quantité d'interleukine dans le surnageant.
L'interLeukine restante est considérée comme incorporée dans
le sédiment de liposomes.
En outre, on peut déterminer l'incorporation d'interleukine dans les liposomes purifiés par des techniques chromatographiques en phase Liquide à haute performance classiques, comme décrit dans Les exemples ci-après.
On peut également suivre La distribution des Liposomes selon L'invention après L'administration par des techniques pharmacocinétiques classiques, par exemple dans des essais sur Les animaux. On prépare L'interLeukine radioactive par réaction d'iode 125 avec L'interLeukine ou par production de L'interLeukine à partir d'aminoacides qui ont été marqués,par exemple par Le soufre 35. On incorpore cette interleukine dans des Liposomes, qui sont produits à partir de Lipides radioactifs marqués,par exempLe par Le carbone 14, et
on L'injecte à des souris. Après 1 h, on sacrifie Les souris et on mesure La quantité et Le type de radioactivité dans chacun des organes, par exempLe La rate.
Les Liposomes de l'invention peuvent être utilisés dans diverses applications connues des interleukines. Ces applications comprennent L'utiLisation pour faciliter la croissance des cellules animales dans Les cultures et d'autres applications in vitro et également L'utilisation thérapeutique dans Le traitement de divers états.
Dans un test ci-après dénommé test de dosage biologique, on effectue un dosage biologique de l'interleukine reposant sur la stimulation, dépendant de La concentration de l'interleukine,de La prolifération d'une série de lymphocytes T de souris (ceLLuLes CTLL, voir S. Gilles et autres J. Immunol.
(1978), 120, pages 1027-2032).
On Lave les cellules T d'une culture de cellules
<EMI ID=13.1>
par des Liposomes selon l'invention et on fait incuber dans un milieu sans IL-2. Les cellules d'essai sont ensuite soumises à un test classique de dilution en série (milieu de dilution RPMI-1640, additionné de 10% de sérum de foetus de veau). On mesure la prolifération des ceLLuLes après 24 h d'incubation en fonction de La concentration croissante en liposomes. On utilise 2.10 cellules pour chaque dilution.
On mesure la prolifération par L'incorporation de
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
des ceLLuLes vivantes est transformé en formazanne bleu foncé correspondant qui est mesuré spectrophotochimiquement après dissolution dans l'isopropanol acide.
On mesure la dilution d'un échantillon donnant 50% du taux maximum de prolifération. L'activité des Liposomes selon L'invention est d'environ 1,2 à 20 fois inférieure à ceLLe de L'interLeukine pure. De préférence, on utilise Les Liposomes qui
ont une activité de plus de 1,3 ng/mL dans le test ci-dessus.
L'activité peut aussi être confirmée dans des tests classiques in vivo d'activité d'IL-2, par exemple chez des souris dont on a supprimé Les Lymphocytes T, par exemple des souris nudes. Dans un test, on produit ces souris par administration journalière de 90 mg/kg de cyclosporine A, après quoi on réduit de 80 à 97% après immunisation par des érythrocytes de mouton (GRM) Le nombre de ceLLuLes d'anticorps spécifiques (PFC) dans La rate selon l'essai de Jerne de cellules formant plaques. Après injection i.v.
de l'antigène, Les souris sont divisées en deux groupes (6-7 animaux par groupe)et on leur administre des préparations d'IL-2 à des doses contenant environ 2 à 5 microgrammes d'IL-2 par voie sous-cutanée
ou de préférence par injection i.v. 2 fois par jour pendant 5 jours. On détermine La réapparition de L'immunité des animaux en mesurant
Le nombre de ceLLuLes d'anticorps spécifiques dans La rate selon
Le test de Jerne. L'activité des Liposomes de L'invention est du même ordre que ceLLe de L'interLeukine non encapsuLée.
On préfère utiliser Les Liposomes de L'invention
dans des applications thérapeutiques d'intérêt particulier reposant sur Les propriétés reconnues d'immuno-régulation des interleukines, par exempLe comme mentionné à La page 1 de La présente description, en particulier Leur utilisation dans Le traitement d'états dus à
des déficiences immunitaires comme Le syndrome immunodéficitaire combiné grave (SIDCG), Le syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA), Les états immunodéficitaires des vieiLLards et immunodéficitaires congénitaux. Cependant, L'interLeukine peut aussi être utilisée comme agent antimyotique dans Le traitement de diverses maladies viraLes comme Les infections à cytomégalovirus et Les infections
à virus d'herpès et dans Le traitement d'infections bactériennes, teLLes que tuberculose et Léprose. Les doses nécessaires pour cette utilisation thérapeutique des Liposomes varient seLon des facteurs connus, teLs que L'état traité, La gravité de L'état et La puissance et La quantité de L'interLeukine incorporée, etc.
Cependant, on peut en général obtenir des résuLtats satisfaisants par administration à des mammifères, par exempLe chez L'homme, à des doses journalières d'interleukine variant de 0,1 à
30 �g/kg de poids corporel. On préfère en général L'administration intraveineuse dans un véhicule stérile convenabLe.
Parmi La grande variété d'utiLisationsparticuLières de L'interLeukine reposant sur son aptitude à provoquer La croissance des ceLLuLes T en cuLture, on citera ceLLes qui trouvent des applications dans Les diagnostics et comme auxiliaires dans Les traitements thérapeutiques. L'utilisation dans Les diagnostics repose
sur L'aptitude connue à déceler La présence de certaines maladies par détermination du degré de croissance des Lymphocytes T in vitro
<EMI ID=16.1>
L'absorption de La thymidine radioactive dans Les ceLLuLes. Comme auxiliaire dans Les traitements thérapeutiques, par exemple un traitement antitumoral, l'interleukine peut être utilisée pour faciliter in vitro La croissance de lymphocytes T obtenus chez le patient ou chez un autre donneur compatible et Les Lymphocytes proliférants résultants sont ensuite réinjectés au patient pour
aider à combattre son état. En général, la quantité d'interleukine
à utiliser pour faciliter la croissance des cellules T en culture et dans d'autres applications in vitro peut être déterminée d'après Les données générales de la littérature sur son activité et sa comparaison avec l'interleukine humaine dans ces systèmes, et peut être optimisée pour des conditions particulières par des études classiques.
Les exemples suivants illustrent L'invention.
Le terme "Lécithine" s'entend ci-après pour désigner
la lécithine de soja.
Le traitement par Les ultrasons s'effectue à 50 kHz
et 350 W, sauf autre indication.
PROCEDE A
<EMI ID=17.1>
On dissout 2 mg d'IL-2 humaine dans 1 mL d'acide acétique. On dissout séparément 1 g de lécithine purifiée dans 5 mL de tert-butanol. On mélange ensemble Les deux solutions et on lyophilise à -30[deg.]C pour donner un lyophilisat. On reprend Le LyophiLisat par un tampon au phosphate 0,05 M (pH 5) jusqu'à 10 ml pour donner une suspension.
On traite La suspension par Les ultrasons dans un bain pendant 5 min. On homogénéise ensuite la suspension pendant
15 min avec un agitateur à grande vitesse à 15 000 tr/min (Type PoLytron 10-30) sous atmosphère d'azote.
On essore ensuite La solution de Liposomes sur un
<EMI ID=18.1>
transition de phase de La lécithine, par exemple à 20[deg.]C. On Lyophilise ensuite La solution de LiposomesrésuLtante.
Si on le désire, on peut supprimer L'étape avec l'agitateur à grande vitesse et continuer le traitement aux ultrasons pendant 15 min et/ou isoler les liposomes par centrifugation.
ANALYSE DES LIPOSOMES
On peut analyser Les liposomes de l'invention en utilisant des techniques classiques de chromatographie Liquide à haute performance (CLHP) à inversion de phase.
On préfère utiliser un matériau de support hydrocarboné
o
<EMI ID=19.1>
colonne de 20 x 4,6 mm d'Aquapore RP 300 fournie par Browlee Laboratories Inc. USA).
Un système éluant préféré est un gradient eau/acétonitrile avec 0,1% d'acide trifluoroacétique, par exemple utilisant
deux systèmes éluants.
Système A : acétonitrile à 50% dans H20 (+ 0,1% d'acide trifluoro-
acétique)
Système B : acétonitrile à 70% dans H20 (+ 0,1% d'acide trifluoro-
acétique).
Les débits typiques sont de 3 ml/min avec un gradient du système à 100% de A au système à 100% de B en 10 min. Dans ces conditions préférées, l'IL-2 humaine est éluée avec une durée de rétention d'environ 7,5 min et La quantité d'interleukine peut être obtenue par intégration du pic de manière classique.
Les Liposomes de L'invention sont prétraités avant
la CLHP.
i) par dilution par Le tampon à L'acétate à pH 2,5-4 puis dégradation
des Liposomes sur la colonne de CLHP Libérant L'interLeukine,
ii) par élimination exhaustive de L'excipient des Liposomes de
L'interLeukine incorporée dans les liposomes, par exemple L'eau et le mélange méthanoL/chLorure de méthylène pour éliminer les phospholipides et ensuite injection de La solution aqueuse
<EMI ID=20.1>
iii) par la technique de commutation des colonnes où on sépare les
excipients des Liposomes de L'interLeukine incorporée dans Les liposomes de L'invention sur une résine échangeuse de cations.
<EMI ID=21.1>
de cations sur une colonne à inversion de phase où elle est chromatographiée de La manière habitueLLe.
Une colonne échangeuse de cations appropriée est une colonne de
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
On trouve que L'IL-2 humaine est incorporée à 50% environ dans les liposomes.
ACTIVITE ET UTILITE
On trouve que les liposomes ont à peu près une activité du même ordre que L'IL-2 elle-même dans le test de dosage biologique mentionné ci-dessus.
<EMI ID=24.1>
On dissout 0,5 mg d'IL-2 humaine dans 1 ml d'acide acétique. On dissout séoarément 500 mg de lécithine (EPIKURON 145 V) dans 50 mL de t-butanol. On mélange Les deux solutions ensemble et on lyophilise à -15[deg.]C en environ 16 h pour obtenir un lyophilisât. On reprend Le lyophilisât par un tampon au phosphate 0,05 M (pH 6,5) jusqu'à 10 mL pour donner une suspension.
On traite La suspension par les ultrasons dans un bain pendant 5 min à La température ambiante (environ 20[deg.]C). On homogénéise ensuite La suspension pendant 10 min avec un agitateur
à grande vitesse à environ 15 000 tr/min (Type PoLytron PT 15) à
La température ambiante.
<EMI ID=25.1>
à 4[deg.]C pendant 4 h.
<EMI ID=26.1>
On répète L'exempLe A2 avec traitement par Les ultrasons et homogénéisation par L'agitateur à grande vitesse à 70[deg.]C au lieu de la température ambiante. La Lécithine utilisée est le "Soja phosphatid NC 95 H". La durée de centrifugation est de 2 h.
<EMI ID=27.1>
On mélange ensemble 0,5 mg d'IL-2 humaine, 450 mg de lécithine (EPIKURON 145 V) et 50 mg de phosphatidylsérine dans 10 mL
<EMI ID=28.1> ambiante pour former une solution. On lyophilise la solution à -40[deg.]C
<EMI ID=29.1>
On reprend Le lyophilisât par un tampon au phosphate 0,05 M (pH 6,3) jusqu'à 10 ml pour donner une suspension. On traite la suspension par les ultrasons dans un bain pendant 10 min à La température ambiante (20[deg.]C) et ensuite on L'homogénéise comme à l'exemple 2 pendant 10 min. On isole Les Liposomes par centrifugation à 150 000 g à 4[deg.]C pendant 4 h.
<EMI ID=30.1>
On répète l'exemple A4 en utilisant 500 mg de lécithine au Lieu de 450 mg de lécithine et 50 mg de phosphatidylsérine.
<EMI ID=31.1>
On répète L'exempLe A4 en utilisant 425 mg de lécithine et 75 mg de cholestérine au Lieu de 450 mg de lécithine et 50 mg de phosphatidylsérine.
<EMI ID=32.1>
On répète L'exempLe A2 sans l'étape d'agitation à grande vitesse. On continue le traitement par les ultrasons pendant
15 min.
<EMI ID=33.1>
On répète chacun des exemples A3-6 sans l'étape d'agitation à grande vitesse.
ANALYSE DES LIPOSOMES
Liquide surnageant
On analyse le liquide surnageant après centrifugation par des techniques de chromatographie liquide à haute performance à inversion de phase comme décrit ci-dessus : iL contient moins de 10% de L'IL-2 humaine initiale.
Activité biologique
On analyse Les liposomes selon Le test de dilution en série pour déterminer L'incorporation de [<3>H]-thymidine dans des cellules CTLL-(16) dépendantes de l'IL-2, dans Le test décrit cidessus (S. Gilles et autres). On mesure immédiatement après la préparation la concentration d'IL-2 qui produit 50% de la croissance maxi-
<EMI ID=34.1>
l'IL-2 humaine elle-même utilisée comme matière première pour La formation des Liposomes a une valeur de 0,2 ng/ml.
RésuLtats
<EMI ID=35.1>
* stockage après 4 semaines à 4[deg.]C
** charge d'IL-2 initiale, activité 0,8 ng/mL
nd =non déterminée
Dans le test in vivo ci-dessus, on obtient les résultats suivants avec un Lot stocké de liposomes de l'exemple A2 ayant une activité in vitro de 1,7 ng/mL dans Le test ci-dessus :
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
On dissout 0,5 mg d'IL-2 humaine dans 1 ml d'acide acétique et on ajoute La solution à une solution de 500 mg de lécithine (EPIKURON 145 V) dans 50 mL de chlorure de méthylène.
On évapore le mélange dans un évaporateur rotatif à
30[deg.]C sous un vide de 10 à 50 mm Hg pendant 1 h et ensuite à 50[deg.]C pendant 3 h pour donner un film lipidique. On disperse Le film dans
10 ml de tampon au phosphate (0,02 M) à pH 5. On traite ensuite La dispersion dans un bain ultrasonique pendant 30 min à La température ambiante (20[deg.]C) pour former des Liposomes.
On isole Les liposomes par centrifugation à 15 000 g à 40[deg.]C pendant 4 h.
<EMI ID=38.1>
On répète l'exemple A9 avec Le traitement par Les ultrasons à 70[deg.]C au Lieu de La température ambiante. La Lécithine utilisée est Le "Soja phosphatid NC 95 H". La centrifugation est effectuée pendant 2 h.
ANALYSE DES LIPOSOMES
Analogue à L'anaLyse effectuée pour L'exempLe A4. Résultats
<EMI ID=39.1>
PROCEDE B
<EMI ID=40.1>
On dissout 100 mg de lécithine dans 5 ml de chlorure de méthylène dans un baLLon à fond rond. On ajoute une solution aqueuse de 0,2 mg d'IL-2 humaine et 20 mg de L-cystéine dans 1 mL de tampon au phosphate 0,05 M (pH 5). On émulsifie Le mélange dans un bain ultrasonique pendant 5 min à 20[deg.]C (fréquence 80 kHz).
On concentre ensuite l'émulsion (contenant un peu des Liposomes et agglomérats préformés) à 20[deg.]C sous vide (20 à
30 mm Hg) pour donner un gel auquel on ajoute 2 mL de La solution tampon en agitant lentement le mélange. On obtient une suspension aqueuse de liposomes.
On sépare Les Liposomes de l'agent actif non incorporé par les étapes suivantes : <EMI ID=41.1> reste dans Le Liquide surnageant et le sédiment de liposomes est remis en suspension, b) chromatographie sur colonne de geL (Biogel A 1,5 ou Séphadex G 50).
L'éluat contenant les liposomes est concentré par ultrafiltration ou dialyse contre une solution de saumure à 0,9%.
On lyophilise la suspension de Liposomes résultante.
ANALYSE
On trouve que L'IL-2 humaine est incorporée à environ
50-90% dans les Liposomes.
ACTIVITE ET UTILITE
On trouve que Les liposomes ont une activité du même ordre que ceLLe de L'IL-2 humaine eLLe-même dans le test de dosage biologique mentionné ci-dessus.
<EMI ID=42.1>
On dissout 500 mg de lécithine (EPIKURON 145 V) dans
200 mL de chlorure de méthylène dans un baLLon à fond rond. On ajoute une solution aqueuse de 0,5 mg d'IL-2 humaine et 100 mg de L-cystéine dans 10 ml de tampon au phosphate 0,05 M (pH 5).
On émulsifie Le mélange dans un bain ultrasonique pendant 10 min à La température ambiante (20[deg.]C). On concentre ensuite l'émulsion résultante (contenant un peu des Liposomes et agglomérats préformés) à 35[deg.]C pendant 10 min sous vide (20 à 30 mm Hg) pour donner un geL auquel on ajoute 10 mL de solution tampon. On agite
Le mélange pendant 30 min à La température ambiante.
On isole Les Liposomes par centrifugation à 150 000 g à 4[deg.]C pendant 4 h.
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
concentre à 80[deg.]C pendant 5 min au Lieu de 35[deg.]C pendant 10 min. La lécithine utilisée est du"Soja phosphate NB 95 H". On effectue La centrifugation pendant 2 h au Lieu de 4 h.
<EMI ID=45.1>
On opère de manière analogue aux exemples 2 et 3, mais sans L-cystéine.
ANALYSE DES LIPOSOMES
Liquide surnageant
Après centrifugation, on analyse Le liquide surnageant par des techniques de chromatographie Liquide à haute performance à inversion de phase comme décrit ci-dessus : il contient moins de
10% de L'IL-2 humaine initiale.
Activité biologique
On analyse les liposomes selon le test de dilution en série décrit ci-dessus (S. GiLLes et autres) pour déterminer
<EMI ID=46.1>
dépendantes de L'IL-2. On mesure la concentration d'IL-2 qui produit
50% de La croissance maximale de 104 cellules après 24 h immédiatement après La préparation (valeur A[deg.] en ng/mL) et après 2 semaines de stockage à 4[deg.]C (valeur A<2> en ng/ml). Dans ce test, L'IL-2 ellemême a une valeur de 0,2 ng/ml.
RésuLtats
-3
<EMI ID=47.1>
PROCEDE C
<EMI ID=48.1>
On dissout 50 micromoles de lécithine purifiée et
50 micromoles de cholestérol dans 20 ml de chloroforme et on évapore dans un évaporateur rotatif sous azote. On reprend le résidu dans <EMI ID=49.1>
<EMI ID=50.1>
solution 1,5 mL de tampon au phosphate 0,05 molaire.
On traite ensuite le mélange avec une sonde à ultrasons à 5[deg.]C pendant 5 min pour donner un homogénéisat. On concentre l'émulsion résultante dans un évaporateur rotatif en deux stades. Dans le premier stade, La pression est d'environ 400 mm Hg et on La maintient jusqu'à obtenir un geL visqueux. On traite ce gel par 1,5 mL de tampon au phosphate 0,05 M (pH 5) et on secoue légèrement Le récipient pour obtenir une suspension aqueuse. On soumet ensuite La suspension aqueuse à une seconde étape d'évaporation à la température ambiante sous pression normale pendant 15 min pour obtenir une suspension de Liposomes non transparente.
Pour éliminer les dernières traces de solvant organique, on peut effectuer une ultrafiltration sur une colonne échangeuse d'ions (Séphadex 650).
ANALYSE DES LIPOSOMES
,On trouve que L'IL-2 humaine est incorporée à environ
50-90% dans Les Liposomes.
ACTIVITE ET UTILITE
On trouve que Les Liposomes ont une activité du même ordre que L'IL-2 humaine elle-même dans le test de dosage biologique mentionné ci-dessus.
<EMI ID=51.1>
On dissout 500 mg de lécithine (EPIKURON 145 V) et 0,5 mg d'IL-2 humaine dans 20 ml de chlorure de méthylène. On ajoute
10 mL de tampon au phosphate 0,05 molaire.
On traite ensuite Le mélange dans un bain à ultrasons pendant 5 min à La température ambiante (environ 20[deg.]C). On concentre l'émulsion résultante dans un évaporateur rotatif à 35[deg.]C pendant
<EMI ID=52.1>
solution tampon au phosphate 0,05 M (pH 5) et on fait tourner Le récipient pendant 30 min à la température ambiante.
On isole Les Liposomes par centrifugation à 150 000 g à 4[deg.]C pendant 4 h.
<EMI ID=53.1>
<EMI ID=54.1>
5 min au lieu de 35[deg.]C pendant 10 min. La lécithine est le "Soja phosphatic NC 95 H". On effectue La centrifugation pendant 2 h.
ANALYSE DES LIPOSOMES
Liquide surnageant
Après centrifugation, on analyse le liquide surnageant par Les techniques de chromatographie Liquide à haute performance à inversion de phase comme décrit ci-dessus : iL contient moins de 10% de l'IL-2 humaine initiale.
Activité biologique
On analyse Les liposomes selon Le test de dilution en série décrit ci-dessus (S. GiLLes et autres) pour déterminer l'incor-
<EMI ID=55.1>
de L'IL-2. On détermine La concentration d'IL-2 qui produit 50% de
La croissance maximale de 104 cellules après 24 h immédiatement après La préparation (valeur A[deg.] en ng/ml) et après stockage pendant
2 semaines à 4[deg.]C (valeur A<2> en ng/mL). Dans ce test, L'IL-2 humaine eLLe-même a une valeur de 0,2 ng/mL.
RésuLtats
<EMI ID=56.1>
Dans L'un quelconque des exemples ci-dessus des
<EMI ID=57.1>
sérine 125, L'IL-2 A-1, l'IL-2 A-2, L'IL-2 B-1, l'IL-2 B-2, l'IL-2
<EMI ID=58.1>
REVENDICATIONS
<EMI ID=59.1>
Improvements to interleukin therapy
Claim to the priority of patent applications filed in Great Britain on April 9, 1984 under the number [deg.]. 8409125, April 9, 1984 under number [deg.]. 8409126,1e 9 April 1984 under n [deg.]. 8409127, April 9, 1984 under number [deg.]. 8409128, August 10 under number [deg.]. 8420381, September 19, 1984 under number [deg.]. 8423700 and on September 19, 1984 under number [deg.]. 8423701.
The present invention relates to interleukin therapy.
Interleukin 2 (hereinafter IL-2) is a natural protein factor first discovered in 1976. It is produced from T cells activated by an antigen or lectin and is an essential factor in the proliferation of T cells IL-2s of various structures have been isolated from a number of animal species, for example mice, primates such as the gibbon, monkey and man. Human IL-2 and others have been purified from a variety of sources, such as lymphocytes
peripheral blood, tonsil lymphocytes, lymphocytes
spleen, leukemic T cells and T cell hybridoma cultures
As indicated above, IL-2 is an essential factor in the proliferation of T cells, which are themselves intimately involved in the body's immune response mechanisms. It is assumed that IL-2 has an extremely broad therapeutic potential. In particular, it can be useful in tumor therapy, since it leads to the proliferation of T cells specific for an antigen, for example against tumor antigens, and these T cells can inhibit tumor growth. It is also known that IL-2 induces the production of gamma-interferon and activates natural killer cells. IL-2 is also expected to have various applications against immunological disorders, such as neoplastic diseases, bacterial or viral infections, immunodeficiency diseases,
<EMI ID = 1.1>
Adv. Immunopharm. (1980) 507).
As with other natural products such as interferons, IL-2 was only available in small quantities before the advent of genetic engineering.
However, following a methodology similar to that previously published for other proteins (for example gamma-interferon), the structure of a gene cloned for human IL-2 has been determined and expressed (see S. Taniguchi and others, Nature
(1983) 302, pages 305-310 and publication of European patent 91539, the content of which is incorporated by reference. This particular IL-2 is hereinafter referred to as known IL-2.
We deduced from the nucleotide coding series
The series of amino acids of the human IL-2 polypeptide, namely that comprising the amino acids numbered from 1 to 153 in FIG. 3a of the article in Nature above. It has been assumed, however, that the first 20 amino acids in this series could be separated when transported through a membrane. Mature human L-IL-2 would then consist of 133 amino acids starting with Ala at position 21.
This structure of human IL-2 has been confirmed in our laboratories and others.
It is also possible to produce IL-2 of different structures using recombinant DNA techniques. For example, modifications to the human IL-2 polypeptide may be produced having one or more amino acids absent or replaced by other amino acids, for example as described in the European patent publication mentioned above, in particular pages
23 to 25, by corresponding modification of the human IL-2 gene. For example, one can, if desired, replace the cysteine residues with other amino acids, for example serine, as described in
European patent publication 109748 in the name of Cetus and Belgian patent 898016, for example IL-2-serine-125, the content of which is incorporated here for reference.
Other examples of these interleukins are described in PCT patent publication WO 85/00817, the content of which is incorporated by reference. These include IL-2 Gln-26, IL-2 Phe-121 and IL-2 Stop 121.
In addition, IL-2 can be produced from different sources such as gibbon by recombinant DNA techniques and
one can also produce a modification of these in a similar manner. In addition, as noted, IL-2 can be isolated (albeit in relatively small quantities) from natural sources and may differ from products obtained by recombinant DNA technology, for example in glucosylation . In addition, all variants can be produced.
IL-2 can also be produced by culture
of human cells, for example in the presence of an inducer. Examples of IL-2 A-1, IL-2 A-2, IL-2 B-1,
IL-2 B-2 as defined in Danish patent application no [deg.] 3317/84 and European patent publication no [deg.] 132359, the content of which is incorporated by reference.
The term "interleukin" is intended to mean any polypeptide including, but not limited to, those described above, whether they are isolated from natural sources or produced by a synthetic or biosynthetic technique and which have IL activity -2. According to the present invention, the preferred InterLeukin is human IL-2 or One of its modifications, preferably produced by
recombinant DNA techniques. Tests have so far been carried out with interleukin by injection, for example by intravenous route. These have shown, for example, that IL-2 has a very short half-life of less than 5 min. There is a clear need for a parenteral form of interleukin modified release giving a sufficiently long duration of action; however, there have so far been few publications on specific dosage formulations of interleukins.
In addition, tests carried out in our laboratories
<EMI ID = 2.1>
liposomes which still exhibit IL-2 activity by administration, for example intravenously. In addition, Liposomes
of the present invention have an extended half-life, they are passively directed at the target in the spleen, lung, marrow
bone or lymph nodes.
The present invention therefore provides
<EMI ID = 3.1>
The liposomes according to the invention can be prepared by encapsulation of an interleukin in a substance forming
a Liposome.
Liposomes are completely closed double layer membranes containing an aqueous phase with interleukin. Interleukin can be in the aqueous phase and / or in the membrane. They can be in the form of a unilamellar vesicle or of an oligo or multi-lamellar vesicle in the form of double layers with concentric membranes each separated from each other by a layer of water.
They can be prepared by various different techniques - see F. Szoka and D. Papahadjopoulos, "Liposomes and their uses in biology and medicine" Ann. N.Y. Acad. Sci. 308, 1-462, (1978); RL Juliano & D. Layton, "Liposomes as a drug delivery system" in Drug delivery systems, pages 189-236, Oxford University Press, New York, 1980, the description of which is incorporated by reference, but the method of the invention is preferred because iL gives liposomes having particularly interesting properties. Thus, the liposomes produced by this process are especially stable, for example against leakage of interleukin, and the process of the invention is suitable for industrial production.
Liposomes can be made from various lipids capable of forming walls of vesicles. The preferred lipids are phospholipids, such as natural lecithin (for example egg or soy lecithin), synthetic lecithins, cephalins and sphingomyelins. Other phosphatidyLchoLines, phosphatidic acids, LysophosphatididyLchoLines, sphingolipids, PhosphatidyLgLyceroL, Cardiolipins, Glucolipids, Gangliosides and cerebrosides can also be used.
Examples of lecithins include "EPIKURONS" made by Lucas Meyer, Hamburg 28, Federal Germany. The phospholipid composition is, for example, the following:
phosphatidylchoLine 44-7%, phosphatidylethanolamine 22-25%, phosphatidylinositol 0-2%, fatty acid content: saturated, palmitic acid 9-11%, stearic acid 2-4%, unsaturated, linoleic acid
63-67%, linolenic acid 5-8%, oleic acid 14-18%, known as
The name "EPIKURON 145 V". Another product contains more than 95% phosphatidycholine, for example 95-98%, and mainly unsaturated acids, for example 10-12% oleic acid, linoleic acid
62-65%, linolenic acid 5-6%, as well as saturated acids, for example palmitic acid 15-17%, stearic acid 3-4%, like that sold under the name "EPIKURON 200".
It is preferred that there is a high content of unsaturated acids. It is possible, if desired, to use a lecithin with a high content of saturated acids, for example stearic acid, and with 95% or more of phosphatidylcholine, for example "SOYBEANS". PHOSPHITID NC 95 "or pure equivalents suitable for pharmaceutical use, supplied for example
by NATTERMANN CHEMIE GmbH, CoLogne, Federal Germany.
Synthetic phospholipids may contain aliphatic modified portions, such as hydroxyl groups, branched carbon chains, cyclic derivatives, aromatic derivatives, ethers, amides, polyunsaturated derivatives, halogenated derivatives or modified hydrophilic portions containing
carbohydrate, gLycoL, phosphate, phosphonate, quaternary ammonium, sulfate, sulfonate, carboxy, amine, sulfhydryl and imidazole groups, for example as in the dimyristoyl-, dipalmitoyl- or distearoyL-phosphatochoLine derivatives.
If desired, in the final Liposome, the double layer may contain, for example, up to 50 mole% of other lipids, for example steroids such as cholesterol.
Preferably, the final Liposome contains a steroid, such as cholesterol. The appropriate lipidesteroid weight ratios can be from 6: 1 to 1: 1.
If desired, the double layer can include
a lecithin, for example cephalin or sphingomyelin containing up to 10 mol% of an additive to increase the incorporation, for example anionic compounds, such as acids, for example diketyl phosphate, phosphatidic acid, sodium taurocholate , phosphatidylserine (Merck) or cationic compounds, for example amines, such as stearylamine. It is preferred to use phosphatidylserine (available from Merck, Federal Germany).
When the Lipid contains additional excipients, it may be preferable to evaporate a solution of the Lipid and
excipients, for example in Methylene chloride in a reaction vessel to form a lipid film on the surface
container before mixing Lipid with interleukin.
Liposomes can be produced by techniques
<EMI ID = 4.1>
by ultrasound, using mild conditions to avoid
<EMI ID = 5.1>
can be produced by the formation of a lipid solution, for example lecithin and cholesterol, in a suitable organic solvent, for example chloroform. The solution is then evaporated in a reaction vessel to form a lipid film.
Liposomes can be isolated and sterilized in a conventional manner.
In the resulting liposomes according to the invention, the concentration of interleukin is preferably about 5 to
<EMI ID = 6.1>
The lipid concentration is preferably around
1 to about 200 mg / ml of aqueous phase, especially from 10 to 100 mg / ml.
The average diameter of the liposomes for subsequent use is preferably about 25 nm to 20 µm, preferably
from 100 to 500 nm.
The final preparation of Liposomes is preferably stored at low temperatures, for example from -20 to +5 [deg.] C.
In order to improve their storage, Liposomes
according to the invention can be freeze-dried in a dry powder,
for example by lyophilization, using for example mannitol, sucrose, polyvinylpyrrolidone or gelatin as material
of support. This can be carried out under the same conditions as for the lyophilization indicated below in step Ab. Before use, they can be reconstituted by adding sterile water. We
can then mix them with suitable systems, for example
for intravenous injection or infusion.
The purity of the liposomes can be determined by standard analytical techniques.
The resulting Liposomes can, if desired, contain an antioxidant, for example up to 1% of the Lipid, preferably 0.1%. Preferred antioxidants include vitamin E
(tocopherol acetate), vitamin C palmitate and BHT
(butylated hydroxytoluene).
<EMI ID = 7.1>
present, for example a sugar, such as mannitol, arabinose, sorbitol or sucrose, albumins, for example human serum albumin, etc. These can be incorporated into the buffer before the liposome is formed. They are preferably present up to 20 mol% by weight of the Lipid in the resulting Liposome.
A preferred method for the formation of the Liposome is The following method a) which comprises
Aa) The formation of a solution of an interleukin and a lipid
in an organic solvent,
Ab) removing the solvent from the solution to give a residue, Ac) suspending the residue in a solution of a buffer, Ad) stirring and homogenizing the suspension until
liposome production, and
Ae) isolation of Liposomes.
In step Aa), the term "solution" also covers "pseudo-solutions" such as suspensions. However, it is preferred to produce a homogeneous, clear solution. Any solvent that dissolves or solubilizes interleukin and Lipid can be used. The system can be a single solvent or a mixture of solvents.
It can for example contain up to 15% water. The solvent system can, if desired, contain a surfactant. The solvent system can include any suitable organic solvent which can be removed from the lipid by evaporation. A wide variety of ethers can be used, such as diethyl ether and diisopropyl ether, esters such as ethyl acetate, alcohol, such as
than methanol and tert-butanol and halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform. If desired, the solvent system may contain acetic acid. It is preferred to use diethyl ether, methylene chloride or tert-butanol.
We have found that tert-butanol is preferred when using a high vacuum and methylene chloride with a low vacuum in step Ab).
In Step Ab), The solvent can be removed by many conventional means, taking into account the sensitivity
of InterLeukin. Preferred means include evaporation under low vacuum, for example 10 to 50 mm Hg, or freeze-drying under high vacuum, for example at less than 5 mm Hg, for example at
0.1 mm Hg.
We have found that lyophilization is especially preferred.
The step is advantageously carried out at a temperature below ambient temperature and the vacuum and the temperature are adjusted in such a way that the evaporated mixture is
at about 1-3 [deg.] C below the ambient environment. This adjustment can be carried out in a conventional manner. A typical freeze-drying program starts at around -60 [deg.] C and the temperature increases to
-15 [deg.] C in 12 h. The temperature is then increased to +10 [deg.] C and maintained for 2 h.
In step Ac), the buffer used is preferably
a phosphate buffer, for example at pH 4-7, for example 5-6.5. The aqueous phase is preferably hypotonic, that is to say unless
300 milliosmoles / liter, especially less than 290 milliosmoles / liter. The resulting suspension preferably contains about 0.001 to
about 0.2 g of Lipid per ml. -
In step Ad), homogenization can be obtained by treatment with ultrasound. Frequencies suitable for this treatment can be, for example, 30 to 80 kHz. A typical power is 200 to 400 W for approximately 10 ml of the mixture to be homogenized or stirred. Of course, it is preferred that the homogenized mixture is separated from any metal, such as titanium or the like, associated with the ultrasonic generator to avoid contamination by the metal.
The temperature is preferably about 10 to 70 [deg.] C.
Room temperature is preferred for unsaturated fats and
from 60 to 70 [deg.] C for Saturated Lipids.
During this step, iL can form an emulsion
liposomes with agglomerates.
If desired, ultrasound treatment can
be followed by agitation with a high speed mechanical agitator,
for example at 10,000-27,000 rpm. However, we prefer to omit this step and perform the agitation also by ultrasound.
under the same conditions as for homogenization.
In Step Ae), the liposomes according to the invention can be isolated according to conventional techniques, for example by ultrafiltration, centrifugation, ion exchange or gel chromatography, dialysis, etc. The liposomes can be filtered and sterilized through a filter with suitable small openings, by
<EMI ID = 8.1>
performed above the phase transition point of the Lipid, for example from 30 to 70 [deg.] C. The liposomes are preferably isolated by centrifugation at high speed, for example at 10,000-20,000 g.
An example of process a) is as follows:
a'a) mixing a hydrophilic solution of an interleukin with a
Lipid in an organic solvent,
a'b) removal of water and organic solvent by evaporation, a'c) taking up the residue in a buffer solution at pH 4-7 to form
a suspension,
a'd) treatment of the suspension with ultrasound to form
liposomes, and
a'e) isolation of Liposomes.
Another example of process a) is as follows:
a "a) mixing a hydrophilic solution of an interleukin with a
Lipid in an organic solvent,
a "b) lyophilization of the mixture to give a lyophilisate,
a "c) suspending the lyophilization mixture in a
buffer solution (pH 4-7),
a "d) stirring of the solution until production of liposomes and / or
agglomerates,
a "e) homogenization of the mixture by mechanical means, and
a "f) isolation of liposomes.
These methods can be carried out analogously to method a).
According to another aspect, the invention provides a method b) for producing liposomes containing interleukin, which comprises the following steps:
ba) mixture of an aqueous-based solution of an interleukin and
an organic solution of a Lipid,
bb) treatment of the mixture by ultrasound until a
few Liposomes and / or agglomerates, and
bc) recovery of the liposomes from the mixture, for example by bi) elimination of the organic solvent from the mixture to form a
gelatinous intermediate phase, and
bii) transformation of the gelatinous intermediate phase into
liposomes.
In step ba), the term "solution" also refers to "pseudo-solutions", such as emulsions. However, it is preferred to produce a homogeneous, clear solution. Any solvent system that dissolves or solubilizes Lipid can be used. The system can be a single solvent or a mixture of solvents. It can contain, for example, up to 15% water. The solvent system may contain, if desired, a surfactant. The solvent system can include any suitable organic solvent which can be removed from the lipid by evaporation. We can use a wide variety of ethers such as ethyl ether and isopropyl ether,
<EMI ID = 9.1>
and Tert-butanol and halogenated hydrocarbons such as methylene chloride or Chloroform.
If desired, the solvent system may contain
Acetic acid. It is preferred to use tert-butanol or preferably ethyl ether or methylene chloride.
Interleukin can be dissolved in water or preferably in an aqueous buffer system at pH 4-7.4, for example at 5-6.5.
The aqueous buffer is preferably hypotonic, that is to say less than 300 ml / ml, especially less
of 290 miLLiosmoLes / Liter. The resulting mixture preferably contains about 0.001 to about 0.2 g of Lipid per mL.
In step bb), the treatment of the mixture can be carried out by ultrasound. Suitable frequencies can be, for example, 30 to 80 kHz; a typical power is 200
at 400 W for each 10 mL of the treated mixture. Of course, it is preferred that the treated mixture is separated from any metal, such as titanium or the like, associated with the ultrasonic generator to avoid contamination by the metal.
The temperature is preferably about 10 to 70 [deg.] C. Room temperature is preferred for unsaturated lipids and a temperature of 60-70 ° C. for saturated lipids.
During this stage iL may form an emulsion
Liposomes with agglomerates.
The liposomes can be recovered in a conventional manner and steps can be provided to optimize the yield.
In step i), the organic solvent is suitably removed under low vacuum, for example from 10 to 600 mm Hg,
while the major part of the aqueous phase is still preserved. Low temperatures are preferably used, for example ambient temperature or slightly elevated temperatures, for example at 45 [deg.] C.
In Step ii), the resulting gelatinous intermediate phase can be treated with water, optionally a buffer solution, as described above to produce Liposomes.
According to another aspect, the invention proposes a process c)
<EMI ID = 10.1>
The following steps:
ca) mixture of an interleukin, an aqueous-based buffer at pH 4-8
and a Lipid in an organic solvent,
cb) treatment of the resulting suspension with ultrasound to
form Liposomes or agglomerates, and
cc) recovery of the liposomes from the mixture, for example by
ci) evaporation of the solvent from the mixture, for example by a phase
gelatinous intermediate, and
cii) transformation of the gelatinous intermediate phase into liposomes. In step ca), the term "solvent" also refers to "pseudo-solutions" such as emulsions. However, it is preferred to produce a homogeneous, clear solution. Any solvent system which dissolves or solubilizes the lipid can be used. The system can be a single solvent or a mixture of solvents. It can contain, for example, up to 15% water. If desired, iL can contain a surfactant. The solvent system can include any suitable organic solvent which can be removed from the lipid by evaporation.
A wide variety of ethers such as ethyl ether and isopropyl ether can be used, esters such as ethyl acetate, alcohols such as methanol and tert-butanol, and halogenated hydrocarbons such as Methylene chloride and chloroform. If desired, the system may contain acetic acid. It is preferred to use ethyl ether, methylene chloride or tert-butanol.
Interleukin can be used in powder form, for example advantageously having a maximum particle size
<EMI ID = 11.1>
In step ca), the buffer is preferably a
phosphate buffer, for example at pH 4-7.4, teL only 4 to 7, for example 5-6.5. Preferably, the aqueous phase is hypotonic, that is to say
<EMI ID = 12.1>
Liter. The resulting suspension preferably contains from about 0.001 to about 0.2 g of lipid per mL.
In step cb), the treatment can be carried out by ultrasound. Suitable frequencies are for example 30 to
80 kHz. Typical power is 200 to 400 W for about 10 mL
of the treated mixture. Of course, it is preferred that the treated mixture
is separated from any metal of the titanium or other type associated with the ultrasonic generator to avoid contamination by the metal.
The temperature is preferably about 10 to 70 [deg.] C. Room temperature is preferred for unsaturated lipids and
a temperature of 60-70 [deg.] C for Saturated Lipids.
During this step, an emulsion can form
Liposomes with agglomerates.
Liposomes can be recovered in a conventional manner and steps can be provided to optimize the yields of Liposomes. In step ci), the organic solvent is suitably removed under a low vacuum, for example from 10 to 600 mm Hg, for example with a water pump, while retaining most of
The aqueous phase. Preferably, low temperatures are used, for example ambient temperature or slightly elevated temperatures, for example at 45 [deg.] C.
In step cii), the gelatinous intermediate phase can be treated with water, optionally a buffer solution as described above to produce the liposomes.
It can form a suspension. If desired, additional evaporation can be carried out to remove traces of organic solvent and the formation of acidic liposomes.
The Liposomes according to the invention can also be isolated according to conventional techniques, for example as in step ae) of the process.
The purity of Liposomes can be determined by
classic techniques.
To determine the incorporation of InterLeukin in Liposomes, the crude prepurification mixture can be diluted and centrifuged, for example for 3 to 24 h, and the amount of interleukin in the supernatant is determined.
The remaining InterLeukin is considered to be incorporated into
the liposome sediment.
In addition, the incorporation of interleukin into the purified liposomes can be determined by conventional high performance liquid chromatographic techniques, as described in The Examples below.
The distribution of the liposomes according to the invention can also be followed after administration by standard pharmacokinetic techniques, for example in tests on animals. The radioactive InterLeukin is prepared by reaction of iodine 125 with InterLeukin or by production of InterLeukin from amino acids which have been labeled, for example with sulfur 35. This interleukin is incorporated into Liposomes, which are produced from labeled radioactive lipids, e.g. carbon 14, and
it is injected into mice. After 1 h, the mice are sacrificed and the amount and type of radioactivity in each of the organs are measured, for example the spleen.
The liposomes of the invention can be used in various applications known to interleukins. These applications include the use to facilitate the growth of animal cells in cultures and other in vitro applications and also the therapeutic use in the treatment of various conditions.
In a test hereinafter called a biological assay test, a biological assay of interleukin based on stimulation is carried out, dependent on the concentration of interleukin, on the proliferation of a series of mouse T lymphocytes (ceLLuLes CTLL , see S. Gilles and others J. Immunol.
(1978), 120, pages 1027-2032).
Wash T cells from a cell culture
<EMI ID = 13.1>
by Liposomes according to the invention and incubated in a medium without IL-2. The test cells are then subjected to a standard serial dilution test (RPMI-1640 dilution medium, supplemented with 10% fetal calf serum). The proliferation of cells is measured after 24 h of incubation as a function of the increasing concentration of liposomes. 2.10 cells are used for each dilution.
The proliferation is measured by the incorporation of
<EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
living cells is transformed into the corresponding dark blue formazanne which is measured spectrophotochemically after dissolution in acidic isopropanol.
The dilution of a sample is measured, giving 50% of the maximum rate of proliferation. The activity of the Liposomes according to the invention is approximately 1.2 to 20 times lower than that of pure InterLeukin. Preferably, Liposomes are used which
have an activity of more than 1.3 ng / mL in the above test.
The activity can also be confirmed in standard in vivo tests of IL-2 activity, for example in mice from which T lymphocytes have been deleted, for example nude mice. In a test, these mice are produced by daily administration of 90 mg / kg of cyclosporin A, after which it is reduced by 80 to 97% after immunization with sheep erythrocytes (GRM) The number of specific antibody cells (PFC) in the spleen according to Jerne's test of plaque-forming cells After i.v.
antigen, The mice are divided into two groups (6-7 animals per group) and are given preparations of IL-2 at doses containing about 2 to 5 micrograms of IL-2 subcutaneously
or preferably by i.v. injection 2 times a day for 5 days. The reappearance of animal immunity is determined by measuring
The number of this specific antibody in the spleen according to
Jerne's test. The activity of the liposomes of the invention is of the same order as that of unencapsulated interLeukin.
It is preferred to use the liposomes of the invention
in therapeutic applications of particular interest based on the recognized immunoregulatory properties of interleukins, for example as mentioned on page 1 of this description, in particular their use in the treatment of conditions due to
immune deficiencies such as severe combined immunodeficiency syndrome (SIDCG), acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), immunodeficiency in the elderly and congenital immunodeficiency. However, InterLeukin can also be used as an antimyotic agent in the treatment of various viral diseases such as cytomegalovirus infections and infections
with herpes virus and in the treatment of bacterial infections, such as tuberculosis and Leprosis. The doses required for this therapeutic use of liposomes vary depending on known factors, such as the condition treated, the severity of the condition and the strength and amount of the interLeukin incorporated, etc.
However, satisfactory results can generally be obtained by administration to mammals, for example in humans, at daily doses of interleukin varying from 0.1 to
30 g g / kg body weight. In general, intravenous administration in a suitable sterile vehicle is preferred.
Among the wide variety of special uses of InterLeukin based on its ability to cause the growth of T cells in culture, we will cite those which find applications in diagnostics and as auxiliaries in therapeutic treatments. The use in Diagnostics is based
on The known ability to detect the presence of certain diseases by determining the degree of growth of T lymphocytes in vitro
<EMI ID = 16.1>
Absorption of radioactive thymidine in cells. As an aid in therapeutic treatments, for example an antitumor treatment, interleukin can be used to facilitate in vitro The growth of T lymphocytes obtained from the patient or from another compatible donor and the resulting proliferating lymphocytes are then reinjected into the patient to
help fight his condition. In general, the amount of interleukin
to be used to facilitate the growth of T cells in culture and in other in vitro applications can be determined from general literature data on its activity and comparison with human interleukin in these systems, and can be optimized for particular conditions by conventional studies.
The following examples illustrate the invention.
The term "Lecithin" is understood below to designate
soy lecithin.
Ultrasound treatment is performed at 50 kHz
and 350 W, unless otherwise indicated.
PROCESS A
<EMI ID = 17.1>
2 mg of human IL-2 are dissolved in 1 ml of acetic acid. 1 g of purified lecithin is dissolved separately in 5 ml of tert-butanol. The two solutions are mixed together and lyophilized at -30 [deg.] C to give a lyophilisate. The LyophiLisat is taken up in a 0.05 M phosphate buffer (pH 5) up to 10 ml to give a suspension.
The suspension is treated with ultrasound in a bath for 5 min. The suspension is then homogenized for
15 min with a high speed agitator at 15,000 rpm (Type PoLytron 10-30) under a nitrogen atmosphere.
The Liposomes solution is then spun on a
<EMI ID = 18.1>
lecithin phase transition, for example at 20 [deg.] C. The liposomesresuLtante solution is then lyophilized.
If desired, the step can be omitted with the high speed agitator and continue the ultrasonic treatment for 15 min and / or isolate the liposomes by centrifugation.
LIPOSOME ANALYSIS
The liposomes of the invention can be analyzed using standard high performance liquid phase chromatography (HPLC) techniques.
We prefer to use a hydrocarbon support material
o
<EMI ID = 19.1>
20 x 4.6 mm column of Aquapore RP 300 supplied by Browlee Laboratories Inc. USA).
A preferred eluent system is a water / acetonitrile gradient with 0.1% trifluoroacetic acid, for example using
two elusive systems.
System A: 50% acetonitrile in H20 (+ 0.1% trifluoro-acid
acetic)
System B: 70% acetonitrile in H20 (+ 0.1% trifluoro-acid
acetic).
Typical flow rates are 3 ml / min with a gradient from the system at 100% A to the system at 100% B in 10 min. Under these preferred conditions, human IL-2 is eluted with a retention time of approximately 7.5 min and the amount of interleukin can be obtained by integration of the peak in a conventional manner.
The Liposomes of the Invention Are Pretreated Before
the HPLC.
i) by dilution with acetate buffer at pH 2.5-4 then degradation
Liposomes on the HPLC column Releasing InterLeukin,
ii) by exhaustive elimination of the liposome excipient from
InterLeukin incorporated into the liposomes, for example water and the methanol / methylene chloride mixture to remove the phospholipids and then injection of the aqueous solution
<EMI ID = 20.1>
iii) by the column switching technique where the
excipients of the InterLeukin liposomes incorporated in the liposomes of the invention on a cation exchange resin.
<EMI ID = 21.1>
cations on a phase inversion column where it is chromatographed in the usual way.
A suitable cation exchange column is a column of
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
Human IL-2 is found to be approximately 50% incorporated into liposomes.
ACTIVITY AND UTILITY
The liposomes are found to have roughly the same activity as IL-2 itself in the above mentioned biological assay test.
<EMI ID = 24.1>
0.5 mg of human IL-2 is dissolved in 1 ml of acetic acid. 500 mg of lecithin (EPIKURON 145 V) are dissolved in a separate manner in 50 ml of t-butanol. The two solutions are mixed together and lyophilized at -15 [deg.] C in about 16 h to obtain a lyophilisate. The lyophilisate is taken up in a 0.05 M phosphate buffer (pH 6.5) up to 10 ml to give a suspension.
The suspension is treated by ultrasound in a bath for 5 min at room temperature (about 20 [deg.] C). The suspension is then homogenized for 10 min with an agitator
at high speed at around 15,000 rpm (Type PoLytron PT 15) at
Room temperature.
<EMI ID = 25.1>
at 4 [deg.] C for 4 h.
<EMI ID = 26.1>
Example A2 is repeated with treatment with ultrasound and homogenization by the high speed agitator at 70 [deg.] C instead of room temperature. The lecithin used is "Soy phosphatid NC 95 H". The centrifugation time is 2 h.
<EMI ID = 27.1>
0.5 mg of human IL-2, 450 mg of lecithin (EPIKURON 145 V) and 50 mg of phosphatidylserine are mixed together in 10 mL
<EMI ID = 28.1> ambient to form a solution. The solution is lyophilized at -40 [deg.] C
<EMI ID = 29.1>
The lyophilisate is taken up in a 0.05 M phosphate buffer (pH 6.3) up to 10 ml to give a suspension. The suspension is treated by ultrasound in a bath for 10 min at room temperature (20 [deg.] C) and then it is homogenized as in Example 2 for 10 min. The Liposomes are isolated by centrifugation at 150,000 g at 4 [deg.] C for 4 h.
<EMI ID = 30.1>
Example A4 is repeated using 500 mg of lecithin instead of 450 mg of lecithin and 50 mg of phosphatidylserine.
<EMI ID = 31.1>
Example A4 is repeated using 425 mg of lecithin and 75 mg of cholesterin instead of 450 mg of lecithin and 50 mg of phosphatidylserine.
<EMI ID = 32.1>
Example A2 is repeated without the high speed stirring step. We continue treatment with ultrasound for
15 min.
<EMI ID = 33.1>
Each of Examples A3-6 is repeated without the high speed stirring step.
LIPOSOME ANALYSIS
Supernatant
The supernatant liquid is analyzed after centrifugation by high performance liquid phase inversion chromatography techniques as described above: iL contains less than 10% of the initial human IL-2.
Biological activity
The liposomes are analyzed according to the serial dilution test to determine the incorporation of [ <3> H] -thymidine in CTLL- (16) cells dependent on IL-2, in The test described above (S. Gilles et al.). The concentration of IL-2 which produces 50% of the maximum growth is measured immediately after preparation.
<EMI ID = 34.1>
Human IL-2 itself used as a raw material for the formation of liposomes has a value of 0.2 ng / ml.
Results
<EMI ID = 35.1>
* storage after 4 weeks at 4 [deg.] C
** initial IL-2 load, activity 0.8 ng / mL
na = not determined
In the above in vivo test, the following results are obtained with a stored batch of liposomes from Example A2 having an in vitro activity of 1.7 ng / ml in the above test:
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
0.5 mg of human IL-2 is dissolved in 1 ml of acetic acid and the solution is added to a solution of 500 mg of lecithin (EPIKURON 145 V) in 50 ml of methylene chloride.
The mixture is evaporated in a rotary evaporator at
30 [deg.] C under a vacuum of 10 to 50 mm Hg for 1 h and then at 50 [deg.] C for 3 h to give a lipid film. The film is dispersed in
10 ml of phosphate buffer (0.02 M) at pH 5. The dispersion is then treated in an ultrasonic bath for 30 min at room temperature (20 [deg.] C) to form Liposomes.
The liposomes are isolated by centrifugation at 15,000 g at 40 [deg.] C for 4 h.
<EMI ID = 38.1>
Example A9 is repeated with Ultrasonic treatment at 70 [deg.] C instead of ambient temperature. The lecithin used is "Soy phosphatid NC 95 H". Centrifugation is carried out for 2 h.
LIPOSOME ANALYSIS
Analogous to the analysis performed for example A4. Results
<EMI ID = 39.1>
PROCESS B
<EMI ID = 40.1>
100 mg of lecithin are dissolved in 5 ml of methylene chloride in a round bottomed flask. An aqueous solution of 0.2 mg of human IL-2 and 20 mg of L-cysteine in 1 mL of 0.05 M phosphate buffer (pH 5) is added. The mixture is emulsified in an ultrasonic bath for 5 min at 20 [deg.] C (frequency 80 kHz).
The emulsion is then concentrated (containing a little liposomes and preformed agglomerates) at 20 [deg.] C under vacuum (20 to
30 mm Hg) to give a gel to which 2 ml of the buffer solution are added while slowly mixing the mixture. An aqueous suspension of liposomes is obtained.
The liposomes are separated from the active agent which is not incorporated by the following steps: <EMI ID = 41.1> remains in the supernatant liquid and the liposome sediment is resuspended, b) chromatography on a geL column (Biogel A 1.5 or Sephadex G 50).
The eluate containing the liposomes is concentrated by ultrafiltration or dialysis against a 0.9% brine solution.
The resulting Liposome suspension is lyophilized.
ANALYSIS
Human IL-2 is found to be incorporated into approximately
50-90% in Liposomes.
ACTIVITY AND UTILITY
Liposomes are found to have an activity of the same order as that of human IL-2 itself in the biological assay test mentioned above.
<EMI ID = 42.1>
500 mg of lecithin (EPIKURON 145 V) are dissolved in
200 mL of methylene chloride in a round bottom flask. An aqueous solution of 0.5 mg of human IL-2 and 100 mg of L-cysteine in 10 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 5) is added.
The mixture is emulsified in an ultrasonic bath for 10 min at room temperature (20 [deg.] C). The resulting emulsion is then concentrated (containing a small amount of preformed liposomes and agglomerates) at 35 [deg.] C for 10 min under vacuum (20 to 30 mm Hg) to give a geL to which 10 ml of buffer solution are added. We shake
Mix for 30 min at room temperature.
The Liposomes are isolated by centrifugation at 150,000 g at 4 [deg.] C for 4 h.
<EMI ID = 43.1>
<EMI ID = 44.1>
concentrates at 80 [deg.] C for 5 min instead of 35 [deg.] C for 10 min. The lecithin used is "Soy phosphate NB 95 H". Centrifugation is carried out for 2 h instead of 4 h.
<EMI ID = 45.1>
The procedure is analogous to Examples 2 and 3, but without L-cysteine.
LIPOSOME ANALYSIS
Supernatant
After centrifugation, the supernatant liquid is analyzed by chromatography techniques. High performance liquid with phase inversion as described above: it contains less
10% of the initial human IL-2.
Biological activity
The liposomes are analyzed according to the serial dilution test described above (S. GiLLes and others) to determine
<EMI ID = 46.1>
dependent on IL-2. The concentration of IL-2 which produces
50% of the maximum growth of 104 cells after 24 h immediately after preparation (value A [deg.] In ng / mL) and after 2 weeks of storage at 4 [deg.] C (value A <2> in ng / ml). In this test, IL-2 itself has a value of 0.2 ng / ml.
Results
-3
<EMI ID = 47.1>
PROCESS C
<EMI ID = 48.1>
50 micromoles of purified lecithin are dissolved and
50 micromoles of cholesterol in 20 ml of chloroform and evaporated in a rotary evaporator under nitrogen. We take the residue in <EMI ID = 49.1>
<EMI ID = 50.1>
1.5 mL 0.05 molar phosphate buffer solution.
The mixture is then treated with an ultrasonic probe at 5 [deg.] C for 5 min to give a homogenate. The resulting emulsion is concentrated in a rotary evaporator in two stages. In the first stage, the pressure is approximately 400 mm Hg and it is maintained until a viscous freeze is obtained. This gel is treated with 1.5 mL of 0.05 M phosphate buffer (pH 5) and the container is gently shaken to obtain an aqueous suspension. The aqueous suspension is then subjected to a second stage of evaporation at room temperature under normal pressure for 15 min to obtain a suspension of non-transparent Liposomes.
To remove the last traces of organic solvent, an ultrafiltration can be carried out on an ion exchange column (Sephadex 650).
LIPOSOME ANALYSIS
, Human IL-2 is found to be incorporated into approximately
50-90% in Liposomes.
ACTIVITY AND UTILITY
Liposomes are found to have an activity of the same order as human IL-2 itself in the biological assay test mentioned above.
<EMI ID = 51.1>
500 mg of lecithin (EPIKURON 145 V) and 0.5 mg of human IL-2 are dissolved in 20 ml of methylene chloride. We add
10 mL of 0.05 molar phosphate buffer.
The mixture is then treated in an ultrasonic bath for 5 min at room temperature (about 20 [deg.] C). The resulting emulsion is concentrated in a rotary evaporator at 35 [deg.] C for
<EMI ID = 52.1>
0.05 M phosphate buffer solution (pH 5) and the container is rotated for 30 min at room temperature.
The Liposomes are isolated by centrifugation at 150,000 g at 4 [deg.] C for 4 h.
<EMI ID = 53.1>
<EMI ID = 54.1>
5 min instead of 35 [deg.] C for 10 min. Lecithin is "Soy phosphatic NC 95 H". The centrifugation is carried out for 2 h.
LIPOSOME ANALYSIS
Supernatant
After centrifugation, the supernatant is analyzed by phase inversion high performance liquid chromatography techniques as described above: iL contains less than 10% of the initial human IL-2.
Biological activity
The liposomes are analyzed according to the serial dilution test described above (S. GiLLes and others) to determine the incor-
<EMI ID = 55.1>
of IL-2. The concentration of IL-2 which produces 50% of
Maximum growth of 104 cells after 24 h immediately after Preparation (A value [deg.] In ng / ml) and after storage for
2 weeks at 4 [deg.] C (value A <2> in ng / mL). In this test, human IL-2 itself has a value of 0.2 ng / mL.
Results
<EMI ID = 56.1>
In any of the above examples of
<EMI ID = 57.1>
serine 125, IL-2 A-1, IL-2 A-2, IL-2 B-1, IL-2 B-2, IL-2
<EMI ID = 58.1>
CLAIMS
<EMI ID = 59.1>