Nouvelles lignées cellulaires se prêtant à la
préparation de cellules hybrides.
La présente invention concerne de nouvelles lignées de cellules qui conviennent comme parents pour la préparation d'hybridomes et qui sont établies à partir de cellules tumorales humaines autres que celles issues de cellules de la moelle osseuse. L'invention concerne aussi un procédé pour établir ces nouvelles lignées cellulaires, de même que les nouveaux hybridomes préparés en fusionnant des cellules de ces lignées cellulaires parentes avec des cellules d'un autre parent (appelé ci-après partenaire) issues de cellules humaines ou animales. L'invention concerne, en outre, un procédé pour produire des substances utiles telles que des anticorps et des lymphokines par culture des nouveaux hybridomes.
Dans les domaines de l'immunologie, de la biologie, de la médecine et de la pharmacologie, des efforts importants ont été consacrés à l'utilisation, comme agents diagnostiques ou agents thérapeutiques, des anticorps homogènes et très hautement spécifiques
(anticorps monoclonaux) produits par des hybridomes qui peuvent être cultivés in vitro et qui ont l'aptitude de produire des anticorps à l'égard d'antigènes spécifiques. La possibilité de préparer les hybridomes et de les utiliser pour la production de substances biologiques in vitro a été démontrée pour la première fois en 1975 par Ceaser Milstein et Collaborateurs à l'Université de Cambridge (Milstein C. et Collaborateurs, "Nature", 256, 495). Ces auteurs ont préparé une lignée de cellules mutantes (P3-X63-Ag8) à partir d'une souche de myélome de souris (P3K) provenant du Leo Sacks of Salk Institute.
Les cellules mutantes ont ensuite été fusionnées avec des cellules de la rate de souris immunisées avec des globules rouges de lapin (SRBC). L'hybridome résultant s'est révélé capable de croître in vitro et de produire des anticorps monoclonaux
(MoAb) à l'égard des globules rouges de mouton. Un grand avantage des hybridomes est qu'ils constituent un moyen pour la production en masse de substances biologiquement actives lorsqu'on fusionne des cellules tumorales ayant un grand pouvoir de prolifération avec des cellules qui peuvent produire de telles substances biologiquement actives, mais qui n'ont habituellement pas ou guère d'aptitude à la prolifération in vitro.
A la suite de l'article de Milstein et Collaborateurs, de nombreux chercheurs ont conduit des études sur les hybridomes produisant des anticorps monoclonaux à l'égard d'antigènes spécifiques. Au cours de toutes ces études, les cellules parentes utilisées pour la préparation des hybridomes ont été des cellules tumorales issues de cellules de la moelle osseuse, comme des cellules de myélome et des cellules tumorales issues de cellules B. Les propriétés génétiques de cellules tumorales telles que les cellules de myélome qui sont nécessaires pour la préparation des hybridomes et l'aspect théorique de là préparation des hybridomes font l'objet d'une description plus détaillée ci-après.
La première condition pour la préparation d'un hybridome à partir de deux ou plusieurs espèces de cellules parentes est d'utiliser un système dans lequel seules les cellules hybrides survivent et où la survie des cellules parentes est empêchée. Par conséquent, dans la plupart des tentatives de préparation d'hybridomes, les cellules tumorales qui sont susceptibles d'une croissance vigoureuse in vitro sont des cellules mutantes qui sont déficientes en hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase (HGPRT) ou en thymidine kinae
(TK). Le comportement génétique et biochimique des deux mutants est essentiellement le même, de sorte que la description ci-après est faite avec référence aux cellules déficientes en HGPRT qui sont plus courantes.
Comme on le sait, l'HGPRT est l'une des enzymes qui est responsable dans toutes les cellules de la synthèse du DNA par un circuit de récupération dans la voie de la synthèse du DNA. Plus spécifiquement, si la synthèse du DNA dans le circuit de novo requérant des dérivés de purine ou de pyrimidine comme substrat pour la réaction enzymatique est supprimée par l'un ou l'autre inhibiteur (par exemple l'aminoptérine), l'HGPRT actionne le circuit de récupération comme voie de secours et permet la poursuite de la synthèse du DNA pour que les cellules restent en vie. Par conséquent, aucune cellule déficiente en HGPRT ne peut survivre dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine (milieu au HAT) en raison de la présence de l'aminoptérine qui est un inhibiteur pour le circuit de novo.
Les cellules partenaires pour la préparation d'un hybridome, par exemple des cellules de la rate (cellules B), sont capables de synthétiser le DNA par le circuit de novo et par le circuit de récupération. Par conséquent, l'hybridome produit en fusionnant des cellules de la rate avec des cellules parentes déficientes en HGPRT survit à l'inhibition du circuit de novo par l'aminoptérine du milieu au HAT et consomme efficacement l'hypoxanthine pour synthétiser le DNA grâce au circuit de récupération apporté par les cellules de la rate. En d'autres termes, l'hybridome a l'aptitude des cellules de myélome parentes de croître vigoureusement in vitro et aussi l'aptitude de synthétiser le DNA par le circuit de récupération apporté par les cellules de la rate, malgré l'inhibition du circuit de novo en présence d'aminoptérine dans le milieu au HAT.
En outre, l'hybridome contient l'information génétique apportée par les cellules de la rate pour produire des immunoglobulines (anticorps) à l'égard d'antigènes spécifiques, de sorte qu'il est capable de croître dans le milieu au HAT et de produire des immunoglobulines.
La souche déficiente en HGPRT qui est la souche parente pour la préparation de l'hybridome est habituellement choisie comme étant une lignée cellulaire qui est produite par une mutation génétique appropriée et qui résiste à la 8-azaguanine et est impropre à croître dans le milieu au HAT. Classiquement, les cellules parentes sont des cellules tumorales issues de la moelle osseuse, comme des cellules B de myélome ou des cellules B de lymphome. Néanmoins, la plupart des cellules tumorales qui peuvent être clonées pour la préparation d'un hybridome proviennent de la souris ou du rat, alors que les cellules de myléome humain sont d'usage rare.
Les raisons en sont : 1) les clones qui peuvent être soumis à la sélection dans le milieu au HAT (à laquelle il est parfois fait référence par le terme sélection au HAT) sont difficiles à préparer à partir de cellules de myélome humain; 2) les cellules de myélome humain n'ont pas la haute aptitude à la prolifération qui est nécesaire pour des cellules parentes, de sorte qu'un hybridome obtenu par fusionnement de ces cellules avec des cellules partenaires n'a qu'une aptitude limitée à la croissance et n'est de plus pas suffisamment stable pour produire une grande quantité de la substance recherchée, par exemple une immunoglobuline. Par conséquent, il a jusqu'à présent été impssible de préparer des hybridomes humain-humain ayant une aptitude à la croissance suffisante et produisant des substances utiles.
Les chercheurs ne sont pas à même de produire des immunoglobulines humaines en quantité utile à partir de cellules cultivées et ont donc utilisé des immunoglobulines provenant d'hybridomes animal-animal. Toutefois, les immunoglobulines produites par des hybridomes animal-animal sont des protéines étrangères à l'organisme humain, de sorte que leur pouvoir antigénique empêche leur application étendue chez l'homme. Il serait par conséquent hautement intéressant de produire des immunoglobulines à partir d'hybridomes humain-humain. Toutefois, comme déjà indiqué, la culture en masse d'hybridomes à partir de cellules de myélome humain expose à beaucoup de difficultés en raison de leur instabilité.
Les cellules de myélomes produisent de grandes quantités d'immunoglobulines appelées protéines de myélome. Toutefois, on ne sait pas si les immunoglobulines ainsi obtenues sont des anticorps à l'égard d'antigènes spécifiques quelconques et il est à peu près impossible de sélectionner des cellules de myélome produisant un anticorps à l'égard d'un antigène spécifique. Les spécialistes en ont conclu que la présence de protéines de myélome complique la recherches des hybridomes ou la purification des anticorps, de sorte que les cellules de myélome qui produisent des protéines de myélome sont remplacées par celles qui ne produisent pas de protéines de myélome. En d'autres termes, l'aptitude à la croissance in vitro est actuellement considérée comme un facteur plus important pour les cellules de myélome à prendre comme parents pour une préparation d'hybridomes.
Dans ces circonstances, il serait intéressant d'obtenir des cellules humaines comme lignées de cellules parentes pour la préparation d'un hybridome qui aurait une croissance vigoureuse et pourrait être soumis à la sélection au HAT après fusion avec des cellules partenaires, de même que des hybridomes humains qui restent suffisamment stables in vitro pour produire de grandes quantités des substances recherchées, par exemple des immunoglobulines. Il est généralement admis que les cellules parentes qui doivent être fusionnées avec des cellules partenaires pour une préparation d'hybridomes doivent être choisies parmi les cellules cancéreuses issues de cellules de myélome et de cellules B [pound]-notamment des cellules transformées par le virus d'Epstein Barr (EBV)7.
Toutefois, comme déjà indiqué, ces cellules parentes ont différents inconvénients qui font obstacle à leur utilisation généralisée dans des applications cliniques.
Par conséquent, l'un des buts de l'invention est d'établir un type entièrement nouveau de lignée de cellules humaines constantes pour les fusionner avec des cellules partenaires en vue de préparer des hybridomes, laquelle lignée de cellules est exempte des inconvénients de la ligne de cellules traditionnelles qui ont été utilisées comme cellules parentes. Ceci est fondé sur la proposition avancée par la Demanderesse que toute cellule qui est capable de croître vigoureusement in vitro peut être utilisée comme cellule parente pour la fusion avec des cellules partenaires lors d'une préparation d'hybridomes.
Plus spécifiquement, l'un des buts de l'invention est d'établir un nouveau type de lignée de cellules humaines à partir d'un mutant cellulaire obtenu par mutation naturelle ou induite de cellules cancéreuses issues de cellules autres que les cellules de myélome ou cellules B, comme des cellules tumorales dont des exemples sont des cellules du cancer épidermique (mélanome), de l'hépatome, du cancer gastrique, du cancer intestinal, du cancer pulmonaire et du cancer du sein, mais de préférence des cellules humaines de mélanome, d'hépatome et de cancer pulmonaire. Des exemples spécifiques du mutant sont des cellules génétiquement déficientes qui sont impropres à produire certaines des enzymes responsables de la synthèse du DNA.
L'invention a aussi pour but d'établir une lignée de cellules parentes qui prolifèrent davantage in vitro que les lignées de cellules traditionnelles issues de cellules tumorales provenant de la moelle osseuse (cellules de myélome) et qui peuvent être fusionnées avec des cellules produisant des anticorps
(cellules B) pour produire un hybridome qui prolifère comme la cellule parente et qui reste néanmoins suffisamment stable pour produire des immunoglobulines.
L'invention a de plus pour but de procurer un hybridome issu de cette lignée de cellules parentes qui restent suffisamment stable in vitro pour produire une substance utile telle qu'un anticorps. Plus spécifiquement, l'invention vise à la préparation d'un hybridome produisant un anticorps spécifique en fusionnant la lignée de cellules parentes, en particulier une lignée de cellules de tumeur humain, avec des cellules B provenant d'animaux autres que l'être humain et qui sont sensibilisées à l'égard d'un antigène spécifique.
L'invention a de plus pour but la préparation d'un hybridome humain-humain produisant un anticorps spécifique en fusionnant cette lignée de cellules parentes avec des cellules B issues de cellules du sang périphérique, de cellules d'amygdales, de cellules de ganglions lymphatiques ou de cellules de la rate d'êtres humains sensibilisées par un antigène particulier.
L'invention a de plus pour but la préparation d'un hybridome humain-humain produisant des immunoglobulines humaines et se prêtant à l'administration à l'être humain sans provoquer les inconvénients d'un pouvoir antigénique non désiré.
L'invention a de plus pour but la préparation d'un hybridome de cellules T en fusionnant cette lignée de cellules parentes avec des cellules T humaines capables de produire du gamma-interféron ou des lymphokines.
L'invention a de plus pour but de procurer un procédé pour produire une substance utile telle qu'un anticorps, un interféron ou des lymphokines, soit directement à partir d'un tel hybridome, soit à partir d'une culture de l'hybridome.
Les Fig. 1 et 2 sont des vues en plan montrant schématiquement le mode opératoire de l'épreuve d'Ouchterlony exécutée dans l'expérience 1, et
la Fig. 3 est un diagramme comprenant trois coupes de croissance, dont l'une pour le mélanome et les autres pour la lignée de cellules parentes (ME 1) conforme à l'invention pour la préparation d'un hybridome.
Le procédé de préparation de la nouvelle lignée de cellules tumorales pour la préparation d'un hybridome conformément à l'invention, le procédé de préparation d'un hybridome au moyen de cette lignée de cellules comme parentes et le procédé de production d'une substance biologiquement utile à partir de cet hybridome sont décrits ci-après. La lignée de cellules parentes pour la préparation de l'hybridome conforme à l'invention peut être obtenue par mutation naturelle ou par mutation induite de cellules tumorales autres que celles issues de cellules de la moelle osseuse, en particulier de cellules tumorales humaines, comme des cellules de mélanome humain, des cellules de cancer pulmonaire humain et des cellules d'hépatome humain.
L'hybridome conforme à l'invention peut être préparé en fusionnant cette nouvelle lignée de cellules avec une autre lignée de cellules parentes, c'est-à-dire des cellules partenaires issues, par exemple, des cellules B d'animaux, notamment l'être humain, immunisées par un antigène particulier. Pour des raisons de simplicité, l'invention est décrite ci-après avec référence particulière à la forme de réalisation qui est la production d'un anticorps monoclonal au départ de la culture d'un hybridome préparé en fusionnant des cellules tumorales humaines avec des cellules de la rate de souris. Il convient de noter cependant que l'invention n'est nullement limitée à cette forme de réalisation particulière.
Le procédé pour préparer des cellules tumorales humaines comme cellules parentes pour la préparation de l'hybridome débute par l'isolement d'un clone déficient en une enzyme (HGPRT) impliquée dans la synthèse du DNA dans le circuit de récupération afin de permettre ultérieurement la sélection au HAT de ces hybridomes. Cette opération peut être exécutée par l'un des deux procédés ci-après. Suivant l'un des procédés, une concentration appropriée en 8-azaguanine est établie directement dans un milieu de culture pour conduire à une souche qui résiste à la 8-azaguanine. Suivant l'autre procédé, des cellules cancéreuses sont traitées par irradiation aux U.V. ou à l'aide d'un inducteur de mutation, suivant la nature spécifique des cellules cancéreuses, et les cellules ainsi traitées sont ensuite transférées dans un milieu contenant de la 8-azaguanine.
L'irradiation aux U.V. est effectuée par exposition de ces cellules à une lampe U.V. (GL-15) depuis une hauteur de 30 cm pendant une durée de
15 secondes à 10 minutes. Un inducteur de mutation approprié est le méthanesulfonate d'éthyle ou la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine et est utilisé en une quantité de 0,05 à 10 /ug/ml. Après que les cellules ont été cultivées en présence de l'inducteur de mutation pendant une durée de quelques heures à 3 jours, la culture est lavée soigneusement avec un milieu exempt de sérum et transférée dans un milieu contenant de la 8-azaguanine. Quelle que soit la technique appliquée, la première opération du procédé se termine par l'apparition d'une ou plusieurs souches qui sont résistantes à la 8-azaguanine.
Le second stade consiste dans la vérification visant à savoir si les cellules de la souche résistante à la 8-azaguanine permettent la sélection au HAT ultérieure. Les cellules des souches résistantes à la 8-azaguanine sont cultivées dans un milieu convenable, qui est ensuite séparé par centrifugation. Les cellules sont ensuite lavées avec du milieu au HAT à deux reprises et transférées dans un milieu au HAT frais
(105 cellules par ml). Après cinq jours d'incubation, les cellules sont colorées au bleu trypan. S'il apparaît que la plupart des cellules sont mortes, des cellules de la même souche résistantes à la 8azaguanine (105 cellules par ml) sont appliquées sur une plaque Costar n[deg.] 3596 (microplaque à 96 cupules)
<EMI ID=1.1>
cellules de la rate) ont été introduites dans chaque cupule. Avant l'application sur la plaque, les cellules résistantes à la 8-azaguanine sont diluées jusqu'à une concentration qui assure qu'il n'y ait pas plus d'une cellule dans chaque cupule (par probabilité 0,1 cellule par cupule). On met les cellules que porte la plaque à incuber pendant environ une semaine. Les clones sont admis à augmenter en population cellulaire et au moment où ils atteignent environ 105 cellules par ml, ils sont à nouveau additionnés d'un milieu au HAT et ensuite mis à reposer jusqu'à ce que tous soient morts. L'opération ci-dessus est de préférence répétée au moins deux fois. Le second stade s'achève par la confirmation de la mort de toutes les cellules résistantes à la 8-azaguanine dans le milieu au HAT.
Il est nécesaire que de la 8azaguanine soit toujours ajoutée au milieu au HAT jusqu'à ce que la lignée de cellules désirée soit établie.
Au cours des opérations ci-dessus, la 8azaguanine peut être remplacée par le BudR lorsque des clones déficients en TK et à nouveau sensibles au milieu au HAT peuvent être obtenus. Après établissement de la lignée de cellules désirée, celle-ci est entretenue dans un milieu contenant de la 8-azaguanine, suivant les besoins. Le milieu pour la culture de la lignée de cellules établie peut être le même que celui qui a été utilisé avant la mutation des cellules tumorales humaines. De plus, la lignée de cellules établie peut être utilisée comme lignée de cellules parentes pour la préparation d'hybridomes sans qu'une composition spéciale du milieu soit nécessaire.
La lignée de cellules établie peut être conservée efficacement suivant une technique classique par mise en suspension dans un milieu contenant 10% de sérum foetal de veau (FCS) et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), qui est ensuite conservé sous azote liquide ou à l'armoire frigorifique à environ -80[deg.]C ou à une température plus basse.
La lignée de cellules établie conforme à l'invention est utile comme lignée de cellules parentes pour la préparation d'un hybridome. Si la lignée de cellules provient de cellules tumorales humaines, elles conviennent à titre de parentes pour la préparation d'un hybridome humain-humain. Les autres cellules parentes (cellules partenaires) peuvent être des cellules B du sang périphérique, des amygdales, des ganglions lymphatiques ou de la rate d'êtres humains immunisés par un antigène particulier. Un grand avantage de l'hybridome humain-humain est qu'il est à prévoir qu'il produise des immunoglobulines qui sont des protéines humaines et qui peuvent donc être administrées à l'être humain sans exposer aux inconvénients d'un caractère antigénique non désiré.
Chose plus importante, l'invention permet, croit-on, de préparer des hybridomes non seulement à partir de cellules B humaines, mais aussi à partir de cellules T humaines.
Dès lors, la lignée de cellules parentes conforme à l'invention peut être fusionnée avec des cellules partenaires qui sont des cellules T humaines capables de produire du gamma-interféron ou des lymphokines. Il est à prévoir que l'hybridome de cellules T résultant soit capable de produire le gamma-interféron et des lymphokines. Par conséquent, les lignées de cellules conformes à l'invention trouvent de nombreuses applications et se prêtent à la préparation de nombreux types d'hybridomes.
Le procédé pour préparer un hybridome à l'aide de cellules de la lignée établie comme cellules parentes est effectué de la manière suivante. Le milieu à utiliser peut être l'un quelconque des milieux courants, comme le milieu d'Eagle MEM, le milieu MEM de Dulbecco amélioré et le milieu RPMI 1640 qui contiennent 10% de sérum de veau (CS), 5% de FCS + 5% de CS ou
10% de FCS. Pour l'entretien de routine des cellules parentes, l'un quelconque de ces milieux convient, mais aux fins spécifiques de la préparation d'un hybridome, le milieu à 10% de FCS est préféré.
Au premier stade, les cellules parentes à savoir des cellules cancéreuses humaines, et les cellules partenaires, c'est-à-dire des cellules de la rate, sont fusionnées dans un rapport de 1:5 en présence de HVJ (virus d'hémagglutination du Japon dit aussi virus Sendai) ou de polyéthylèneglycol
(PEG) comme médiateur. Une solution à 30-50% de PEG 1000 est préférée. Les cellules fusionnées peuvent être soumises à une sélection au HAT suivant le mode opératoire qui a été décrit ci-dessus.
Le repérage des cellules hybrides résultantes est effectué principalement par détection des immunoglobulines dans le liquide surnageant de la culture, en vue de recueillir les hybridomes clones produisant des immunoglobulines par le procédé SPA-bind-SRBC (SPA : protéine A de Staphylococcus aureus; voir "Procédures of Immunological Experiments VII", page 2375) ou le procédé ELISA
(procédé Dynatech). Les clones sont mis à croîtrent graduellement en population cellulaire et au moment où ils atteignent 105 cellules par ml, ils sont soumis à un sous-clonage. Pour assurer que toutes les cellules de l'hybridome sont monoclonales, celles-ci sont déposées sur une microplaque à 96 cupules dans chacune desquelles environ 105 cellules normales de la rate ont été déposées comme couche d'alimentation.
Les cellules hybrides doivent être dilués jusqu'à une concentration telle qu'il n'y ait pas plus d'une cellule hybride dans chaque cupule (par probabilité nombre moyen de 0,1 cellule par cupule). Après environ une semaine d'inoculation, les clones résultants font l'objet d'une vérification de leur aptitude à produire un anticorps spécifique. L'opération ci-dessus est répétée jusqu'à obtention d'hybridomes monoclonaux.
Les immunoglobulines produites par l'hybridome peuvent faire l'objet d'une vérification aisée de leur appartenance à des classes et sous-classes suivant la technique d'Ouchterlony sur gel d'agarose. Les anticorps correspondant aux immunoglobulines dont la production par l'hybridome est à prévoir sont mis à réagir avec le liquide surnageant de la culture sur plaque d'agarose et une ligne de précipitation apparaissant 24 heures plus tard est observée. Des détails relatifs au procédé Ouchterlony sont donnés dans l'expérience 1.
Il ressort de façon évidente de la description ci-dessus que l'invention ruine la conclusion de Milstein et Collaborateurs, qu'une lignée de cellules parentes pour la préparation de l'hybridome doit être une lignée de cellules tumorales, comme des cellules de myélome ou des cellules B de lymphome provenant de cellules de la moelle osseuse. En d'autres termes, la Demanderesse a démontré que des cellules tumorales quelconques capables de croître in vitro peuvent être utilisées pour établir des lignées de cellules parentes pour la préparation d'hybridomes. La lignée de cellules tumorales humaines établie suivant l'invention peut être mise en culture plus simplement que les lignées de cellules de myélome traditionnelles et est néanmoins plus stable et plus proliférative que ces dernières.
Cette lignée de cellules utilisée comme cellules parentes permet de préparer un hybridome humain-souris suivant l'invention. Suivant la présente invention, non seulement un hybridome produisant un anticorps monoclonal, mais aussi des hybridomes produisant des lymphokimes ayant d'utiles activités physiologiques peuvent être obtenus également.
Le procédé de préparation de la lignée de cellules parentes conforme à l'invention pour une préparation d'hybridomes, le procédé de préparation d'un hybridome à partir de cette lignée de cellules parentes, de même que le procédé pour produire un anticorps à l'aide de l'hybridome résultant et le procédé pour l'identifier sont décrits ci-après au moyen d'exemples d'application et de données expérimentales.
EXEMPLE 1.-
Préparation d'une lignée de cellules parentes à partir de cellules tumorales humaines Colo 38 pour une préparation d'hybridome (Procédé A)
Dans les exemples d'application ci-après, toutes les cultures sont effectuées dans une atmosphère formée de 5% de C02 et 95% d'air dans une humidité relative (H.R.) d'environ 100% à 37[deg.]C.
On cultive des cellules humaines de mélanome malin (Colo 38) pendant deux ou trois jours jusqu'à ce qu'elles atteignent une phase logarithmique. On ajoute à ces cellules, jusqu'à une concentration finale de 0,05 à 10 /ug/ml, un inducteur de mutation, à savoir du MNNG (N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine de la Société Sigma Chemical Co.). Après 36 heures d'incubation à une concentration en MNNG de 5 /ug/ml, à peu près 20% des cellules de mélanome se révèlent tuées. On débarrasse la culture du MNNG en la lavant avec du RPMI 1640 exempt de sérum (de la Société Nissui Seiyaku Co., Ltd.) avec trois centrifugation. On ajoute au total 10 ml des cellules ainsi traitées (2 x 105 cellules par ml) à un milieu contenant de la 8-azaguanine à une concentration finale de 1-50 /ug/ml.
On poursuit la culture pendant au moins une semaine à des concentrations respectives en 8-azaguanine qui assurent qu'au moins 99% des cellules meurent dans le délai d'une semaine en présence de 20 /ug/ml de 8-azaguanine. A cette concentration en 8-azaguanine, on poursuit la culture pendant au moins deux semaines à partir du début avec observation quotidienne de la croissance des cellules. Environ deux semaines plus tard, on observe une croissance rapide des cellules. Pour cette raison, on recueille les cellules par centrifugation et on les introduit dans un milieu contenant de la 8-azaguanine en une concentration finale de 50 /ug/ml (le nombre des cellules ajoutées est le même que celui utilisé lors du premier traitement par la 8-azaguanine, à savoir 2 x 105 cellules par ml).
On sélectionne les cellules qui ont survécu à l'incubation de deux semaines dans le milieu comme étant des souches résistantes à la 8azaguanine.
On lave les cellules des souches résistantes à la 8-azaguanine avec un milieu exempt de sérum en opérant trois centrifugations et on les transfère dans 10 ml d'un milieu au HAT. Ce milieu consiste en milieu RPMI 1640 additionné de 10% de FCS (Société CSL Co., Australie), auquel on a ajouté de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine en concentrations finales de 10-4 M, 4 x 10-7 M et 1,6 x 10-5 M, respectivement. La concentration des cellules dans le milieu
<EMI ID=2.1>
l'incubation, on vérifie la survie des cellules en les colorant avec du bleu trypan. Si toutes les cellules apparaissent tuées dans le milieu au HAT, on applique une autre aliquote des cellules résistantes à la 8azaguanine appartenant à la même souche dans 96 cupules avec une probabilité de 0,1 cellule par cupule en présence de cellules de la rate qu'on a introduites dans chaque cupule comme couche d'alimentation à une
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une semaine d'incubation, on obtient 6 clones parmi les
96 cupules. En poursuivant l'incubation pendant encore une ou deux semaines, on augmente le nombre des cellules de chaque clone jusqu'à environ 105/ml. Ensuite, on soumet tous les clones à la sélection au HAT. Les cellules de tous les clones sont tuées dans les cinq jours. On introduit l'un des six clones à nouveau dans les 96 cupules de la même façon et on le divise en sous-clones pour obtenir 8 clones. On les laisse également augmenter en nombre et on les soumet à une sélection au HAT pour confirmer que toutes les cellules auraient été tuées dans le milieu au HAT.
On appelle lignée de cellules de la série ME 1 les cellules humaines de mélanome malin ainsi obtenues qui sont résistantes à la 8-azaguanine et sensibles à la sélection au HAT. On les conserve dans un milieu
<EMI ID=4.1>
ordinaire/ dans l'azote liquide ou au réfrigérateur à environ -80[deg.]C.
EXEMPLE 2.-
Préparation d'une lignée de cellules parentes à partir de cellules tumorales humaines Colo 38 pour une préparation d'hybridome (Procède B)
Le procédé B est différent du procédé A du fait qu'on induit une mutation par irradiation aux U.V. plutôt qu'à l'aide d'un inducteur chimique. On introduit les cellules humaines de mélanome malin en phase logarithmique dans une boîte de Petri (diamètre 10 cm) en une concentration de 2 x 105 cellules par ml (total
10 ml). Après irradiation sous une lampe U.V. (GL-15 de la Société Matshushita Electric Industrial Ltd.) distante de 30 cm, on ajoute de la 8-azaguanine aux cellules, jusqu'à une concentration finale de
20 /ug/ml. Au moins 99,5% des cellules sont mortes dans un délai d'environ une semaine. On poursuit l'incubation pendant environ deux semaines dans les mêmes conditions en effectuant des observations quotidiennes.
Environ trois semaines après la première addition de 8azaguanine, le nombre des cellules augmente rapidement et conduit à une suspension uniforme de cellules. On recueille celles-ci par centrifugation et on les introduit dans un milieu à une concentration de
<EMI ID=5.1>
une concentration finale de 50 /ug/ml. On sélectionne comme cellules résistantes à la 8-azaguanine celles qui survivent à une incubation de plus de deux semaines.
On soumet ces cellules ensuite à une sélection au HAT comme dans l'exemple 1 et on obtient ainsi trois lignées de cellules de série ME 1. La probabilité d'apparition de cellules résistantes à la 8-azaguanine se révèle être d'environ un cinquième de la valeur constatée dans l'exemple 1. Néanmoins, la probabilité avec laquelle les cellules résistantes à la 8-azaguanine sont sensibles à la sélection au HAT est la même dans les deux exemples.
EXEMPLE 3.-
Préparation d'une lignée de cellules parentes à partir de cellules tumorales humaines Colo 38 pour une préparation d'hybridome (Procédé C)
Le procédé C est différent des procédés A et B du fait que de la 8-azaguanine est ajoutée directement à un milieu de culture de cellules tumorales humaines. On met une culture (10 ml) contenant par ml 2 x 105 cellules humaines de mélanome malin (Colo 38) en phase logarithmique à incuber pendant cinq jours en présence de 8-azaguanine à une concentration de 5 /ug/ml. On augmente ensuite la quantité de 8azaguanine jusqu'à une concentration finale de
10 /ug/ml. Dans les dix jours de l'incubation, pratiquement toutes les cellules sont mortes. On poursuit toutefois l'incubation pendant encore environ vingt jours dans les mêmes conditions. La probabilité d'obtenir une croissance des cellules est faible, mais on constate une augmentation rapide du nombre des cellules dans l'un des 18 flacons sous observation.
On met une partie des cellules ainsi multipliées en culture pendant deux semaines encore en présence de 8azaguanine à une concentration finale de 50 /ug/ml. On sélectionne comme étant des cellules résistantes à la 8-azaguanine celles qui sont capables d'une croissance normale dans cette situation.
On soumet ces cellules ensuite à la sélection au HAT, comme dans l'exemple 1, et on recueille six lignées de cellules de série ME 1.
Dans les exemples 1 à 3, on obtient au total
17 lignées de cellules de série ME 1 à partir de cellules humaines de mélanome malin (Colo 38) suivant trois techniques différentes. Ces lignées de cellules sont identifiées SUN N-21-1 à SUN N-21-17.
EXEMPLE 4.-
Préparation d'une lignée de cellules parentes à partir de cellules tumorales humaines (M 21) pour une préparation d'hybridome
Le présent exemple prouve qu'une lignée de cellules parentes pour une préparation d'hybridome peut être obtenue aussi à partir de cellules tumorales humaines autres que Colo 38. Le procédé appliqué dans l'exemple 4 est sensiblement le même que dans l'exemple 1.
On met des cellules humaines de mélanome
(M 21) en culture pendant 60 heures jusqu'à ce qu'elles atteignent une phase logarithmique. On ajoute du MNNG comme inducteur de mutation aux cellules jusqu'à une concentration finale de 5 /ug/ml. Après 36 heures d'incubation, au cours desquelles 35% des cellules de mélanomes se révèlent avoir été tuées, on débarrasse la culture du MNNG par lavage avec du RPMI 1640 exempt de sérum en opérant trois centrifugations. On met 2 x 105 cellules viables par ml (10 ml) à incuber dans un milieu contenant de la 8-azaguanine à une concentration finale de 20 /ug/ml. Au moins 99,5% des cellules sont tuées dans un délai d'une semaine, mais on poursuit l'incubation pendant encore deux semaines dans les mêmes conditions.
On observe la culture une fois par jour au microscope pour déceler la croissance éventuelle des cellules. Environ 20 jours plus tard, on constate une augmentation graduelle du nombre des cellules et au cours des cinq jours suivants, une croissance rapide des cellules. On recueille les cellules en croissance par centrifugation et on met 2 x 105 cellules par ml en suspension dans un milieu (10 ml) contenant de la 8azaguanine à une concentration finale de 50 /ug/ml. On poursuit l'incubation pendant environ deux semaines et on sélectionne comme étant des cellules résistantes à la 8-azaguanine celles dont le nombre s'est augmenté.
On soumet ces cellules à une sélection au HAT et on répète la division en sous-clones, comme dans l'exemple 1. On obtient ainsi 6 lignées de cellules parentes pour une préparation d'hybridome qui sont résistantes à la 8-azaguanine et qui sont tuées dans le milieu au HAT, à partir de cellules humaines de mélanome M 21. Ces 6 lignées de cellules sont identifiées SUN N-22-1 à SUN N-22-6 de la série ME 2.
EXEMPLE 5.-
Préparation d'une lignée de cellules parentes à partir de cellules humaines d'hepatome pour une préparation d'hybridome (Procédé D)
On cultive pendant 24 heures dans du milieu RPMI 1640 des cellules humaines d'hépatome HC C-4. On ajoute à la culture l'inducteur de mutation EMS (méthanesulfonate d'éthyle, Société Sigma Chemical Co.) jusqu'à une concentration finale de 1 mM. Par 3 heures d'incubation, on induit une mutation dans les cellules humaines d'hépatome HC C-4. On lave les cellules ensuite trois fois avec du milieu RPMI exempt de sérum, on les remet en culture dans du milieu RPMI complet
(contenant du sérum) pour une durée de 48 à 72 heures et on les met en culture ensuite pendant 3 à 4 semaines dans du milieu RPMI 1640 contenant 2,0 /ug/ml de 8azaguanine. Environ trois semaines plus tard, on observe une augmentation rapide du nombre des cellules et la formation de clones uniformes de cellules adhérentes.
On met la culture à incuber pendant encore deux semaines dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 /ug/ml de 8-azaguanine. On sélectionne les cellules en croissance comme étant des cellules résistantes à la 8azaguanine.
On vérifie ensuite la sensibilité de ces cellules à la sélection au HAT, comme dans l'exemple 1. On obtient de la sorte 8 clones de lignées de cellules déficientes en HGPRT comme cellules parentes pour une préparation d'hybridome à partir de cellules humaines d'hépatome. Ces clones sont identifiés SUN N-31-1 à SUN N-31-8.
EXEMPLE 5.-
Préparation d'une lignée de cellules parentes à partir de cellules humaines d'hépatome pour une préparation d'hybridome (Procédé E)
En opérant comme dans l'exemple 5, on traite une culture de cellules humaines d'hépatome HC C-4 à l'aide de l'inducteur de mutation EMS. On débarrasse ensuite la culture de l'EMS par lavage avec du milieu RPMI exempt de sérum. On met la culture à incuber pendant trois à quatre semaines dans un milieu contenant 2,0 /ug/ml de BudR (bromodésoxyuridine, Société Sigma Chemical Co.). On transfère les cellules en croissance dans un milieu contenant 10 /ug/ml de BudR où on les maintient en incubation pendant environ deux semaines. On sélectionne comme étant des cellules résistantes au BudR les cellules qui réussissent à croître au cours de cette incubation.
On vérifie ensuite leur sensibilité à la sélection au HAT, comme dans l'exemple 1. On obtient de la sorte 6 clones de lignées de cellules déficientes en TK comme cellules parentes pour une préparation d'hybridome à partir de cellules humaines d'hépatome. Ces clones sont identifiés SUN N-32-1 à SUN N-32-6.
EXEMPLE 7.-
Préparation d'une lignée de cellules parentes à partir de cellules humaines de carcinome pulmonaire pour la préparation d'hybridome
On met des cellules humaines de carcinome pulmonaire A-549 en culture pendant 24 heures dans du milieu RPMI 1640. On ajoute à la culture l'inducteur de mutation EMS jusqu'à une concentration finale de 1 mM. Par trois heures d'incubation, on induit une mutation dans les cellules humaines de carcinome pulmonaire A 549. On lave les cellules ensuite à trois reprises avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum, on les met en culture dans du milieu RPMI 1640 complet pendant une durée de 48 à 72 heures et on les remet ensuite en culture pendant 3 à 4 semaines dans du milieu RPMI contenant 2,0 /ug/ml de BudR. Environ trois semaines plus tard, on observe une augmentation rapide du nombre des cellules et la formation d'une couche uniforme de cellules adhérentes. On met la culture à incuber pendant encore deus semaines dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 /ug/ml de BudR.
On sélectionne comme étant des cellules résistantes au BudR les cellules qui réussissent à croître.
On vérifie ensuite la sensibilité à la sélection au HAT de ces cellules, comme dans l'exemple 1. De la sorte, on obtient 5 clones de lignées de cellules déficientes en TK comme cellules parentes pour une préparation d'hybridome à partir de cellules humaines de carcinome pulmonaire. Ces clones sont identifiés SUN N-33-1 à SUN N-33-5.
Les lignées de cellules parentes établies dans les exemples 1 à 7 peuvent être fusionnées avec des cellules B, telles que des cellules de la rate, pour donner des hybridomes qui produisent des immunoglo-bulines par culture, comme illustré dans l'exemple ciaprès.
EXEMPLE 8.-
Préparation d'un hybridome par fusion de ME 1 de l'exemple 1 avec des cellules de la rate de souris immunisées au moyen de cellules humaines de carcinome pulmonaire (A-549) et confirmation de la sécrétion d'un anticorps monoclonal par l'hybridome
<EMI ID=6.1>
lules SUN N-21-2 (parentes) avec 5 x 107 cellules de la rate (partenaires) d'une souris femelle BALB/c (âgée de 4 semaines) à laquelle on a inoculé une fois par semaine des cellules humaines de carcinome pulmonaire
(A-549) pendant quatre semaines à la dose de
10 7 cellules par inoculation. On utilise du polyéthylèneglycol (PEG 1000, Société Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) comme médiateur de fusion à une concentration de 40%. La technique de fusion est la suivante. On mélange les cellules parentes et les cellules partenaires et on les centrifuge dans un tube de centrifugeuse, puis on rejette le liquide surnageant. On ajoute au culot de cellules environ 0,5 ml de PEG 1000 qu'on a préalablement dilué à 40% avec du milieu RPMI 1640. On laisse le mélange reposer pendant 3 minutes, puis on le centrifuge à 500 tours par minute pendant 3 minutes.
Ensuite, on ajoute lentement environ 5 ml d'un milieu et on centrifuge le nouveau mélange, puis on rejette le liquide surnageant. On transfère toutes les cellules lentement dans une fiole T-75
(Falcon n[deg.] 3024) et on ajoute un supplément de milieu pour porter le volume total à environ 40 ml. Après entretien en culture jusqu'au lendemain, on transfère la culture comprenant toutes les cellules dans un tube de centrifugeuse et on rejette le liquide surnageant après centrifugation. On ajoute un milieu au HAT (40 ml) au culot de cellules qu'on agite soigneusement. On répartit le mélange entre 96 cupules d'une microplaque à raison d'environ 100 /ulitre par cupule. On répète la même opération de manière à remplir les cupules de quatre microplaques à l'aide d'un mélange de cellules et de milieu au HAT.
Après une semaine d'incubation, des colonies sont formées d'environ 10% des cupules. Ces colonies ont une tendance à s'étaler plus à plat que la colonie des cellules parentes. A partir de la première semaine d'incubation, on introduit dans chaque cupule une goutte (environ 25 à 30 /ulitres) de milieu au HT (le même que le milieu au HAT, mais ne contenant pas d'aminoptérine). Après une croissance raisonnable des hybridomes (environ 10 à 14 jours plus tard), on vérifie la présence, dans le liquide surnageant de la culture, d'un anticorps monoclonal à l'égard du carcinome pulmonaire humain (A-549) suivant le procédé Protéine A-bind-SBRC. Sur les 45 clones formés, quatre se révèlent produire un anticorps monoclonal à l'égard de A-549. On divise en sous-clones l'un de ces quatre clones en opérant comme dans l'exemple 1.
Les quatre sous-clones se mettent en croissance et tous produisent un anticorps monoclonal à l'égard de A-549.
Ces hybridomes peuvent être conservés suivant les techniques connues, par exemple par mise en suspension dans un milieu (10% FCS, 10% DMSO et 80% de milieu ordinaire) et conservation dans l'azote liquide ou l'armoire frigorifique à environ -80[deg.]C.
Expérience 1
Détermination suivant le procédé Ouchterlony des classes et sous-classes des immunoglobulines produites par l'hybridome préparé dans l'exemple 8
On introduit une solution d'agarose à 15% (5 ml avec 0,01% de NaN3) dans quatre boîtes de Petri
(diamètre intérieur 52 mm), puis on laisse les boîtes reposer pendant environ 30 minutes jusqu'à solidification de l'agarose. On ménage au poinçon des cupules dans le gel d'agarose de chaque boîte, comme indiqué à la Fig. 1, à savoir six cupules de 2,5 mm notées 1 à 6 distantes chacune de 4,0 mm de la cupule centrale de 4,0 mm, dans un gel de 1,5 mm d'épaisseur. On introduit dans les cupules périphériques 5 /ulitres de chacun des anticorps indiqués au tableau I et dans les cupules centrales des gels d'agarose respectifs 15 /ulitres de chaque milieu de culture concentré dix fois contenant quatre anticorps monoclonaux (LAC 1, 2, 3 et 4) produits par l'hybridome préparé dans l'exemple 8.
On laisse reposer les gels pendant 24 heures et on détermine la classe de chaque anticorps monoclonal par formation de la ligne de précipitation.
TABLEAU 1
<EMI ID=7.1>
Les quatre anticorps monoclonaux examinés se révèlent IgG de souris parce que toutes les lignes de précipitation se forment entre la cupule 3 et la cupule centrale 7.
On détermine suivant le même mode opératoire la sous-classe de l'IgG. Comme le montre la Fig. 2, on poinçonne 5 cupules dans le gel d'agarose de chacune de quatre boites de Petri, à savoir quatre cupules de 2,5 mm distantes chacune de 4,0 mm de la cupule centrale de 4,0 mm, dans un gel de 1,5 mm d'épaisseur. On introduit dans les cupules périphériques 5 /ulitres de chacun des anticorps des sous-classes indiquées au tableau II et dans les cupules centrales des gels d'agarose respectifs 15 /ulitres de chacun des anticorps monoclonaux (LAC 1-4). On met les boîtes de Petri
<EMI ID=8.1>
TABLEAU II
<EMI ID=9.1>
Les quatre anticorps monoclonaux examinés se révèlent être IgG2a parce que leurs lignes de précipitation se forment entre les cupules 2 et 5.
Les quantités des anticorps monoclonaux que produisent les hybridomes de l'exemple 8 sont d'environ
<EMI ID=10.1>
tités d'anticorps monoclonaux que produisent les hybridomes préparés à l'aide de cellules de myélome de souris comme cellules parentes. On confirme par électrophorèse sur gel le caractère unitaire des anticorps produits par l'hybridome de l'exemple 8.
Les résultats ci-dessus démontrent que les lignées de cellules humaines parentes conformes à l'invention (par exemple SUN N-21-1 de la série ME 1) fusionnées avec les cellules B produisent des immuno-globulines exprimant l'information génétique apportée par les cellules B.
Les cellules humaines de myélome qu'on a essayé d'utiliser comme cellules parentes pour une préparation d'hybridomes présentent différents inconvénients, comme la difficulté de maintien en culture, la lenteur de croissance et l'instabilité. Toutefois, comme indiqué ci-après, la lignée de cellules faisant l'objet de l'invention est susceptible d'une croissance reproductible, ce qui est de la nature inhérente des cellules cancéreuses.
Expérience 2
Profils de croissance de cellules cancéreuses et de cellules de la lignée ME 1 conformes à l'invention
On met à incuber une culture (10 ml) de 2 x 105 cellules humaines de myélome (Colo 38) par ml dans du milieu RPMI 1640 + 10% FCS. On met à incuber aussi une culture (10 ml) de 2 x 105 cellules par ml de SUN N-21-1 de la série ME 1 issues de Colo 38 dans du milieu RPMI 1640 + 10% de FCS. On met une autre culture
(10 ml) d'un nombre égal de cellules SUN N-21-1 à incuber dans du milieu RPMI 1640 + 10% FCS contenant de la 8-azaguanine en une concentration finale de
20 /ug/ml. On prélève des prises et on détermine par comptage le nombre des cellules viables dans chaque culture. Les résultats sont reportés à la Fig. 3 dont on peut déduire que le profil de croissance des cellules SUN N-21-1 est semblable à celui des cellules humaines du mélanome Colo 38 et ne subit guère de modification, même en présence de 8-azaguanine.
Les quatre clones d'hybridomes préparés dans l'exemple 8 ont également des profils de croissance semblables à celui des cellules SUN N-21-1, bien que cela ne soit pas illustré par la Fig. 3.
New cell lines suitable for
preparation of hybrid cells.
The present invention relates to novel cell lines which are suitable as parents for the preparation of hybridomas and which are established from human tumor cells other than those derived from bone marrow cells. The invention also relates to a method for establishing these new cell lines, as well as the new hybridomas prepared by fusing cells of these parent cell lines with cells of another parent (hereinafter called partner) derived from human cells or animal. The invention further relates to a method for producing useful substances such as antibodies and lymphokines by culturing the new hybridomas.
In the fields of immunology, biology, medicine and pharmacology, significant efforts have been devoted to the use, as diagnostic agents or therapeutic agents, of homogeneous and very highly specific antibodies.
(monoclonal antibodies) produced by hybridomas which can be cultured in vitro and which have the ability to produce antibodies against specific antigens. The possibility of preparing hybridomas and using them for the production of biological substances in vitro was demonstrated for the first time in 1975 by Ceaser Milstein and Collaborators at the University of Cambridge (Milstein C. and Collaborators, "Nature", 256 , 495). These authors prepared a mutant cell line (P3-X63-Ag8) from a mouse myeloma strain (P3K) from the Leo Sacks of Salk Institute.
The mutant cells were then fused with spleen cells from mice immunized with rabbit red blood cells (SRBC). The resulting hybridoma has been shown to be able to grow in vitro and produce monoclonal antibodies
(MoAb) for sheep red blood cells. A great advantage of hybridomas is that they provide a means for the mass production of biologically active substances when tumor cells with high proliferative power are fused with cells which can produce such biologically active substances, but which do not usually have little or no ability to proliferate in vitro.
Following the article by Milstein and Collaborators, many researchers have conducted studies on hybridomas producing monoclonal antibodies against specific antigens. In all of these studies, the parent cells used for the preparation of the hybridomas were tumor cells derived from bone marrow cells, such as myeloma cells and tumor cells derived from B cells. The genetic properties of tumor cells such as that the myeloma cells which are necessary for the preparation of the hybridomas and the theoretical aspect of the preparation of the hybridomas are the subject of a more detailed description below.
The first condition for the preparation of a hybridoma from two or more species of parent cells is to use a system in which only the hybrid cells survive and where the survival of the parent cells is prevented. Therefore, in most attempts to prepare hybridomas, the tumor cells which are susceptible to vigorous growth in vitro are mutant cells which are deficient in hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) or thymidine kinae
(TK). The genetic and biochemical behavior of the two mutants is essentially the same, so the following description is made with reference to the more common HGPRT deficient cells.
As is known, HGPRT is one of the enzymes which is responsible in all cells for the synthesis of DNA by a recovery circuit in the path of DNA synthesis. More specifically, if the synthesis of DNA in the de novo circuit requiring purine or pyrimidine derivatives as substrate for the enzymatic reaction is suppressed by one or the other inhibitor (for example aminopterin), the HGPRT activates the recovery circuit as an emergency route and allows the further synthesis of DNA so that the cells remain alive. Therefore, no HGPRT deficient cell can survive in a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium) due to the presence of aminopterin which is an inhibitor for the circuit of novo.
Partner cells for the preparation of a hybridoma, for example spleen cells (B cells), are capable of synthesizing DNA by the de novo circuit and by the recovery circuit. Consequently, the hybridoma produced by fusing spleen cells with parent cells deficient in HGPRT survives the inhibition of the de novo circuit by aminopterin from the medium to HAT and efficiently consumes hypoxanthine to synthesize DNA thanks to recovery circuit provided by the spleen cells. In other words, the hybridoma has the ability of parent myeloma cells to grow vigorously in vitro and also the ability to synthesize DNA through the recovery circuit provided by spleen cells, despite inhibition of de novo circuit in the presence of aminopterin in the medium at the HAT.
In addition, the hybridoma contains the genetic information provided by the spleen cells to produce immunoglobulins (antibodies) against specific antigens, so that it is able to grow in the HAT medium and to produce immunoglobulins.
The strain deficient in HGPRT which is the parent strain for the preparation of the hybridoma is usually chosen as being a cell line which is produced by an appropriate genetic mutation and which is resistant to 8-azaguanine and is unfit to grow in the medium. HAT. Conventionally, the parent cells are tumor cells originating from the bone marrow, such as myeloma B cells or lymphoma B cells. However, most of the tumor cells which can be cloned for the preparation of a hybridoma come from the mouse or from the rat, while human myleoma cells are of rare use.
The reasons are: 1) clones which may be subject to selection in HAT medium (which is sometimes referred to by the term HAT selection) are difficult to prepare from human myeloma cells; 2) human myeloma cells do not have the high proliferative capacity which is necessary for parent cells, so that a hybridoma obtained by fusion of these cells with partner cells has only a limited capacity for growth and is moreover not sufficiently stable to produce a large quantity of the desired substance, for example an immunoglobulin. Therefore, it has hitherto been impossible to prepare human-human hybridomas having sufficient growth ability and producing useful substances.
Researchers are unable to produce human immunoglobulins in a useful quantity from cultured cells and therefore used immunoglobulins from animal-animal hybridomas. However, the immunoglobulins produced by animal-animal hybridomas are proteins foreign to the human organism, so that their antigenic power prevents their widespread application in humans. It would therefore be of great interest to produce immunoglobulins from human-human hybridomas. However, as already indicated, the mass culture of hybridomas from human myeloma cells exposes many difficulties due to their instability.
Myeloma cells produce large amounts of immunoglobulins called myeloma proteins. However, it is unknown whether the immunoglobulins thus obtained are antibodies against any specific antigens and it is almost impossible to select myeloma cells producing an antibody against a specific antigen. Experts have concluded that the presence of myeloma proteins complicates the search for hybridomas or the purification of antibodies, so that the myeloma cells that produce myeloma proteins are replaced by those that do not produce myeloma proteins. In other words, the ability to grow in vitro is currently considered to be a more important factor for myeloma cells to be taken as parents for a preparation of hybridomas.
Under these circumstances, it would be advantageous to obtain human cells as parent cell lines for the preparation of a hybridoma which would have vigorous growth and could be subjected to selection at HAT after fusion with partner cells, as well as Human hybridomas which remain sufficiently stable in vitro to produce large quantities of the desired substances, for example immunoglobulins. It is generally accepted that the parent cells which must be fused with partner cells for the preparation of hybridomas must be chosen from cancer cells originating from myeloma cells and B cells [pound], in particular cells transformed by the d virus. 'Epstein Barr (EBV) 7.
However, as already indicated, these parent cells have various drawbacks which hinder their widespread use in clinical applications.
It is therefore an object of the invention to establish an entirely new type of constant human cell line to merge with partner cells in order to prepare hybridomas, which cell line is free from the disadvantages of line of traditional cells that have been used as parent cells. This is based on the proposal put forward by the Applicant that any cell which is capable of growing vigorously in vitro can be used as a parent cell for fusion with partner cells during the preparation of hybridomas.
More specifically, one of the aims of the invention is to establish a new type of human cell line from a cellular mutant obtained by natural or induced mutation of cancer cells originating from cells other than myeloma cells or B cells, such as tumor cells, examples of which are epidermal cancer cells (melanoma), hepatoma, gastric cancer, intestinal cancer, lung cancer and breast cancer, but preferably human melanoma cells , hepatoma and lung cancer. Specific examples of the mutant are genetically deficient cells that are unable to produce some of the enzymes responsible for DNA synthesis.
The object of the invention is also to establish a parent cell line which proliferate more in vitro than the traditional cell lines derived from tumor cells originating from bone marrow (myeloma cells) and which can be fused with cells producing antibody
(B cells) to produce a hybridoma that proliferates like the parent cell and which nevertheless remains stable enough to produce immunoglobulins.
The invention further aims to provide a hybridoma from this line of parent cells which remain sufficiently stable in vitro to produce a useful substance such as an antibody. More specifically, the invention relates to the preparation of a hybridoma producing a specific antibody by fusing the parent cell line, in particular a human tumor cell line, with B cells from animals other than humans and who are sensitized to a specific antigen.
The invention further aims to prepare a human-human hybridoma producing a specific antibody by fusing this line of parent cells with B cells from peripheral blood cells, tonsil cells, lymph node cells. or human spleen cells sensitized by a particular antigen.
The invention further aims to prepare a human-human hybridoma producing human immunoglobulins and suitable for administration to humans without causing the disadvantages of an undesired antigenic power.
A further object of the invention is the preparation of a T cell hybridoma by fusing this parent cell line with human T cells capable of producing gamma-interferon or lymphokines.
The invention further aims to provide a method for producing a useful substance such as an antibody, an interferon or lymphokines, either directly from such a hybridoma, or from a culture of the hybridoma .
Figs. 1 and 2 are plan views schematically showing the procedure for the Ouchterlony test carried out in experiment 1, and
Fig. 3 is a diagram comprising three growth sections, one of which for melanoma and the others for the parent cell line (ME 1) according to the invention for the preparation of a hybridoma.
The method for preparing the new tumor cell line for the preparation of a hybridoma according to the invention, the method for preparing a hybridoma using this cell line as relatives and the method for producing a substance biologically useful from this hybridoma are described below. The parent cell line for the preparation of the hybridoma according to the invention can be obtained by natural mutation or by induced mutation of tumor cells other than those originating from bone marrow cells, in particular human tumor cells, such as human melanoma cells, human lung cancer cells and human hepatoma cells.
The hybridoma according to the invention can be prepared by fusing this new cell line with another line of parent cells, that is to say partner cells derived, for example, from animal B cells, in particular the human, immunized with a particular antigen. For reasons of simplicity, the invention is described below with particular reference to the embodiment which is the production of a monoclonal antibody from the culture of a hybridoma prepared by fusing human tumor cells with cells of the mouse spleen. It should be noted, however, that the invention is in no way limited to this particular embodiment.
The process for preparing human tumor cells as parent cells for the preparation of the hybridoma begins with the isolation of an enzyme deficient clone (HGPRT) involved in the synthesis of DNA in the recovery circuit in order to subsequently allow the selection at HAT of these hybridomas. This operation can be carried out by one of the two methods below. According to one of the methods, an appropriate concentration of 8-azaguanine is established directly in a culture medium to lead to a strain which is resistant to 8-azaguanine. According to the other method, cancer cells are treated by UV irradiation or using a mutation inducer, depending on the specific nature of the cancer cells, and the cells thus treated are then transferred to a medium containing 8 -azaguanine.
UV irradiation is carried out by exposure of these cells to a UV lamp (GL-15) from a height of 30 cm for a period of
15 seconds to 10 minutes. A suitable mutation inducer is ethyl methanesulfonate or N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine and is used in an amount of 0.05 to 10 µg / ml. After the cells have been cultured in the presence of the mutation inducer for a period of a few hours to 3 days, the culture is washed thoroughly with serum-free medium and transferred to a medium containing 8-azaguanine. Whatever the technique applied, the first operation of the process ends with the appearance of one or more strains which are resistant to 8-azaguanine.
The second stage consists in verifying whether the cells of the 8-azaguanine resistant strain allow selection for subsequent HAT. The cells of the 8-azaguanine resistant strains are cultured in a suitable medium, which is then separated by centrifugation. The cells are then washed with HAT medium twice and transferred to fresh HAT medium
(105 cells per ml). After five days of incubation, the cells are stained with trypan blue. If it appears that most of the cells are dead, cells of the same strain resistant to 8azaguanine (105 cells per ml) are applied to a Costar plate [deg.] 3596 (96-well microplate)
<EMI ID = 1.1>
spleen cells) were introduced into each well. Before application to the plate, the cells resistant to 8-azaguanine are diluted to a concentration which ensures that there is not more than one cell in each well (by probability 0.1 cells per well ). The cells on the plate are incubated for about a week. The clones are allowed to increase in cell population and when they reach approximately 105 cells per ml, they are again added with HAT medium and then allowed to stand until all are dead. The above operation is preferably repeated at least twice. The second stage ends with confirmation of the death of all 8-azaguanine resistant cells in the HAT medium.
It is necessary that 8azaguanine is always added to the medium at the HAT until the desired cell line is established.
During the above operations, 8azaguanine can be replaced by BudR when clones deficient in TK and again sensitive to the HAT medium can be obtained. After establishing the desired cell line, it is maintained in a medium containing 8-azaguanine, as required. The culture medium for the established cell line can be the same as that used before the mutation of human tumor cells. In addition, the established cell line can be used as the parent cell line for the preparation of hybridomas without the need for a special composition of the medium.
The established cell line can be efficiently conserved according to a conventional technique by suspension in a medium containing 10% fetal calf serum (FCS) and 10% dimethylsulfoxide (DMSO), which is then stored under liquid nitrogen or with 'refrigerated cabinet at around -80 [deg.] C or at a lower temperature.
The established cell line according to the invention is useful as a parent cell line for the preparation of a hybridoma. If the cell line is from human tumor cells, they are suitable as relatives for the preparation of a human-human hybridoma. The other parent cells (partner cells) can be peripheral blood B cells, tonsils, lymph nodes or spleen from humans immunized with a particular antigen. A great advantage of the human-human hybridoma is that it is expected to produce immunoglobulins which are human proteins and which can therefore be administered to humans without exposing the disadvantages of an undesired antigenicity .
More importantly, the invention allows, it is believed, to prepare hybridomas not only from human B cells, but also from human T cells.
Therefore, the parent cell line according to the invention can be fused with partner cells which are human T cells capable of producing gamma-interferon or lymphokines. The resulting T cell hybridoma is expected to be capable of producing gamma-interferon and lymphokines. Consequently, the cell lines according to the invention find numerous applications and lend themselves to the preparation of many types of hybridomas.
The process for preparing a hybridoma using cells of the established line as parent cells is carried out as follows. The medium to be used can be any of the common media, such as Eagle MEM medium, Dulbecco improved MEM medium and RPMI 1640 medium which contain 10% calf serum (CS), 5% FCS + 5% CS or
10% of FCS. Any of these media is suitable for routine maintenance of parent cells, but for the specific purpose of preparing a hybridoma, 10% FCS medium is preferred.
In the first stage, the parent cells, namely human cancer cells, and the partner cells, that is to say spleen cells, are fused in a ratio of 1: 5 in the presence of HVJ (hemagglutination virus). from Japan also known as Sendai virus) or polyethylene glycol
(PEG) as mediator. A 30-50% solution of PEG 1000 is preferred. The fused cells can be subjected to a selection at the HAT according to the procedure which has been described above.
The identification of the resulting hybrid cells is mainly carried out by detection of immunoglobulins in the culture supernatant, with a view to collecting the cloned hybridomas producing immunoglobulins by the SPA-bind-SRBC process (SPA: protein A of Staphylococcus aureus; see " Procedures of Immunological Experiments VII ", page 2375) or the ELISA process
(Dynatech process). The clones are gradually grown in cell population and when they reach 105 cells per ml, they are subjected to subcloning. To ensure that all cells in the hybridoma are monoclonal, these are deposited on a microplate with 96 wells in each of which approximately 105 normal spleen cells have been deposited as a feed layer.
Hybrid cells should be diluted to a concentration such that there is no more than one hybrid cell in each well (by probability average number 0.1 cells per well). After about a week of inoculation, the resulting clones are checked for their ability to produce a specific antibody. The above operation is repeated until monoclonal hybridomas are obtained.
The immunoglobulins produced by the hybridoma can be easily checked for their belonging to classes and subclasses according to the Ouchterlony technique on agarose gel. The antibodies corresponding to the immunoglobulins whose production by the hybridoma is to be expected are reacted with the culture supernatant liquid on an agarose plate and a precipitation line appearing 24 hours later is observed. Details relating to the Ouchterlony process are given in experiment 1.
It is evident from the above description that the invention ruins the conclusion of Milstein and Collaborators, that a parent cell line for the preparation of the hybridoma must be a tumor cell line, such as myeloma cells or lymphoma B cells from cells in the bone marrow. In other words, the Applicant has demonstrated that any tumor cells capable of growing in vitro can be used to establish parent cell lines for the preparation of hybridomas. The human tumor cell line established according to the invention can be cultured more simply than the traditional myeloma cell lines and is nevertheless more stable and more proliferative than the latter.
This cell line used as parent cells makes it possible to prepare a human-mouse hybridoma according to the invention. According to the present invention, not only a hybridoma producing a monoclonal antibody, but also hybridomas producing lymphokimes having useful physiological activities can also be obtained.
The method for preparing the parent cell line according to the invention for the preparation of hybridomas, the method for preparing a hybridoma from this parent cell line, as well as the method for producing an antibody to the The aid of the resulting hybridoma and the method for identifying it are described below by means of application examples and experimental data.
EXAMPLE 1.-
Preparation of a parent cell line from human tumor cells Colo 38 for a hybridoma preparation (Method A)
In the examples of application below, all the cultures are carried out in an atmosphere formed of 5% of CO 2 and 95% of air in a relative humidity (H.R.) of approximately 100% at 37 [deg.] C.
Human malignant melanoma cells (Colo 38) are grown for two or three days until they reach a logarithmic phase. A mutation inducer, namely MNNG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine from Sigma Chemical) is added to these cells, up to a final concentration of 0.05 to 10 μg / ml. Co.). After 36 hours of incubation at an MNNG concentration of 5 μg / ml, approximately 20% of the melanoma cells appear to be killed. The MNNG culture is cleared by washing with serum-free RPMI 1640 (from Nissui Seiyaku Co., Ltd.) with three centrifugations. A total of 10 ml of the cells thus treated (2 × 10 5 cells per ml) are added to a medium containing 8-azaguanine at a final concentration of 1-50 μg / ml.
The culture is continued for at least one week at respective concentrations of 8-azaguanine which ensure that at least 99% of the cells die within one week in the presence of 20 μg / ml of 8-azaguanine. At this concentration of 8-azaguanine, the culture is continued for at least two weeks from the start with daily observation of the growth of the cells. About two weeks later, rapid cell growth is observed. For this reason, the cells are collected by centrifugation and they are introduced into a medium containing 8-azaguanine in a final concentration of 50 μg / ml (the number of cells added is the same as that used during the first treatment with 8-azaguanine, i.e. 2 x 105 cells per ml).
The cells which survived the two-week incubation in the medium are selected as 8azaguanine resistant strains.
The cells of the 8-azaguanine resistant strains are washed with a serum-free medium by three centrifugations and they are transferred to 10 ml of HAT medium. This medium consists of RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS (Company CSL Co., Australia), to which hypoxanthine, aminopterin and thymidine have been added in final concentrations of 10-4 M, 4 x 10-7 M and 1.6 x 10-5 M, respectively. The concentration of cells in the medium
<EMI ID = 2.1>
incubation, the survival of the cells is checked by staining them with trypan blue. If all the cells appear killed in the medium at HAT, another aliquot of 8azaguanine resistant cells belonging to the same strain is applied in 96 wells with a probability of 0.1 cell per well in the presence of spleen cells than we introduced into each well as a feeding layer at a
<EMI ID = 3.1>
one week of incubation, 6 clones are obtained among the
96 cups. By continuing the incubation for another one or two weeks, the number of cells in each clone is increased to about 105 / ml. Then, all the clones are subjected to selection at the HAT. The cells of all the clones are killed within five days. One of the six clones is introduced again into the 96 wells in the same way and it is divided into subclones to obtain 8 clones. They are also allowed to increase in number and subjected to selection at the HAT to confirm that all of the cells would have been killed in the medium at the HAT.
Human cell melanoma cells thus obtained which are resistant to 8-azaguanine and sensitive to HAT selection are called the ME 1 cell line. We keep them in an environment
<EMI ID = 4.1>
regular / in liquid nitrogen or in the refrigerator at about -80 [deg.] C.
EXAMPLE 2.-
Preparation of a Parent Cell Line from Colo 38 Human Tumor Cells for a Hybridoma Preparation (Process B)
Method B is different from Method A in that it induces a mutation by UV irradiation rather than using a chemical inducer. Human cells of malignant melanoma in the log phase are introduced into a Petri dish (diameter 10 cm) in a concentration of 2 × 105 cells per ml (total
10 ml). After irradiation under a UV lamp (GL-15 from the company Matshushita Electric Industrial Ltd.) 30 cm apart, 8-azaguanine is added to the cells, until a final concentration of
20 / ug / ml. At least 99.5% of the cells died within about a week. The incubation is continued for approximately two weeks under the same conditions by making daily observations.
About three weeks after the first addition of 8azaguanine, the number of cells increases rapidly and leads to a uniform suspension of cells. These are collected by centrifugation and introduced into a medium at a concentration of
<EMI ID = 5.1>
a final concentration of 50 µg / ml. Those cells resistant to 8-azaguanine are selected to survive an incubation of more than two weeks.
These cells are then subjected to a selection at the HAT as in Example 1 and thus three lines of cells of series ME 1 are obtained. The probability of the appearance of cells resistant to 8-azaguanine appears to be approximately one fifth of the value found in Example 1. Nevertheless, the probability with which 8-azaguanine resistant cells are sensitive to HAT selection is the same in the two examples.
EXAMPLE 3.-
Preparation of a parent cell line from human tumor cells Colo 38 for a hybridoma preparation (Method C)
Method C is different from methods A and B in that 8-azaguanine is added directly to a culture medium for human tumor cells. A culture (10 ml) containing 2 × 10 5 human cells of malignant melanoma (Colo 38) in the log phase is incubated for five days in the presence of 8-azaguanine at a concentration of 5 μg / ml. The amount of 8azaguanine is then increased to a final concentration of
10 / ug / ml. Within ten days of incubation, virtually all of the cells are dead. However, the incubation is continued for another twenty days under the same conditions. The probability of cell growth is low, but there is a rapid increase in the number of cells in one of the 18 vials under observation.
A portion of the cells thus multiplied are placed in culture for two weeks still in the presence of 8azaguanine at a final concentration of 50 μg / ml. Those resistant to 8-azaguanine are selected to be those capable of normal growth in this situation.
These cells are then subjected to selection at the HAT, as in Example 1, and six cell lines of series ME 1 are collected.
In Examples 1 to 3, we obtain in total
17 ME 1 cell lines from human malignant melanoma cells (Colo 38) using three different techniques. These cell lines are identified SUN N-21-1 to SUN N-21-17.
EXAMPLE 4.-
Preparation of a parent cell line from human tumor cells (M 21) for a hybridoma preparation
The present example proves that a parent cell line for a hybridoma preparation can also be obtained from human tumor cells other than Colo 38. The method applied in Example 4 is substantially the same as in Example 1 .
We put human melanoma cells
(M 21) in culture for 60 hours until they reach a logarithmic phase. MNNG is added as a mutation inducer to the cells up to a final concentration of 5 µg / ml. After 36 hours of incubation, during which 35% of the melanoma cells appear to have been killed, the culture of the MNNG is freed by washing with RPMI 1640 free of serum by performing three centrifugations. 2x105 viable cells per ml (10 ml) are incubated in a medium containing 8-azaguanine at a final concentration of 20 µg / ml. At least 99.5% of the cells are killed within one week, but the incubation is continued for another two weeks under the same conditions.
The culture is observed once a day under the microscope to detect any growth of the cells. About 20 days later, there is a gradual increase in the number of cells and over the next five days, rapid cell growth. The growing cells are collected by centrifugation and 2 x 105 cells per ml are suspended in a medium (10 ml) containing 8azaguanine at a final concentration of 50 µg / ml. The incubation is continued for approximately two weeks and those cells which have increased in number are selected as 8-azaguanine resistant cells.
These cells are subjected to a selection at the HAT and the division into subclones is repeated, as in Example 1. This gives 6 parent cell lines for a hybridoma preparation which are resistant to 8-azaguanine and which are killed in the medium at HAT, from human M 21 melanoma cells. These 6 cell lines are identified SUN N-22-1 to SUN N-22-6 of the ME 2 series.
EXAMPLE 5.-
Preparation of a parent cell line from human hepatoma cells for a hybridoma preparation (Method D)
Human hepatoma HC C-4 cells are cultured for 24 hours in RPMI 1640 medium. The EMS mutation inducer (ethyl methanesulfonate, Company Sigma Chemical Co.) is added to the culture up to a final concentration of 1 mM. By 3 hours of incubation, a mutation is induced in human cells of hepatoma HC C-4. The cells are then washed three times with RPMI medium free of serum, they are re-cultured in complete RPMI medium
(containing serum) for a period of 48 to 72 hours and they are then cultured for 3 to 4 weeks in RPMI 1640 medium containing 2.0 μg / ml of 8azaguanine. About three weeks later, there is a rapid increase in the number of cells and the formation of uniform clones of adherent cells.
The culture is incubated for a further two weeks in RPMI 1640 medium containing 10 µg / ml 8-azaguanine. Growing cells are selected to be 8azaguanine resistant cells.
The sensitivity of these cells to selection for HAT is then checked, as in Example 1. 8 clones of HGPRT-deficient cell lines are thus obtained as parent cells for preparation of a hybridoma from human cells. hepatoma. These clones are identified SUN N-31-1 to SUN N-31-8.
EXAMPLE 5.-
Preparation of a parent cell line from human hepatoma cells for a hybridoma preparation (Method E)
By operating as in Example 5, a culture of human cells of hepatoma HC C-4 is treated using the EMS mutation inducer. The culture of the EMS is then freed by washing with serum-free RPMI medium. The culture is incubated for three to four weeks in a medium containing 2.0 µg / ml of BudR (bromodeoxyuridine, Company Sigma Chemical Co.). The growing cells are transferred to a medium containing 10 µg / ml BudR where they are kept in incubation for about two weeks. Those cells which succeed in growing during this incubation are selected as cells resistant to BudR.
Then their sensitivity to HAT selection is verified, as in Example 1. In this way, 6 clones of TK deficient cell lines are obtained as parent cells for a hybridoma preparation from human hepatoma cells. These clones are identified SUN N-32-1 to SUN N-32-6.
EXAMPLE 7.-
Preparation of a parent cell line from human lung carcinoma cells for the preparation of hybridoma
Human lung carcinoma A-549 cells are cultured for 24 hours in RPMI 1640 medium. The EMS mutation inducer is added to the culture up to a final concentration of 1 mM. By three hours of incubation, a mutation is induced in human cells of pulmonary carcinoma A 549. The cells are then washed three times with RPMI 1640 medium free of serum, they are cultured in complete RPMI 1640 medium for 48 to 72 hours and then re-cultured for 3 to 4 weeks in RPMI medium containing 2.0 µg / ml BudR. About three weeks later, there is a rapid increase in the number of cells and the formation of a uniform layer of adherent cells. The culture is incubated for a further two weeks in RPMI 1640 medium containing 10 µg / ml BudR.
Those cells which succeed in growing are selected as being cells resistant to BudR.
The sensitivity to HAT selection of these cells is then checked, as in Example 1. In this way, 5 clones of TK deficient cell lines are obtained as parent cells for preparation of a hybridoma from human cells. pulmonary carcinoma. These clones are identified SUN N-33-1 to SUN N-33-5.
The parent cell lines established in Examples 1 to 7 can be fused with B cells, such as spleen cells, to give hybridomas which produce immunoglobulins by culture, as illustrated in the example below.
EXAMPLE 8.-
Preparation of a hybridoma by fusion of ME 1 of Example 1 with spleen cells of mice immunized with human cells of pulmonary carcinoma (A-549) and confirmation of the secretion of a monoclonal antibody by the hybridoma
<EMI ID = 6.1>
SUN N-21-2 cells (parent) with 5 x 107 spleen cells (partners) from a BALB / c female mouse (4 weeks old) which has been inoculated with human lung carcinoma cells once a week
(A-549) for four weeks at a dose of
10 7 cells per inoculation. Polyethylene glycol (PEG 1000, Company Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is used as a fusion mediator at a concentration of 40%. The fusion technique is as follows. The parent cells and the partner cells are mixed and centrifuged in a centrifuge tube, then the supernatant is discarded. About 0.5 ml of PEG 1000 is added to the cell pellet, which has been diluted beforehand to 40% with RPMI 1640 medium. The mixture is left to stand for 3 minutes, then it is centrifuged at 500 rpm for 3 minutes. .
Then about 5 ml of medium are added slowly and the new mixture is centrifuged, then the supernatant is discarded. All cells are transferred slowly to a T-75 flask
(Falcon n [deg.] 3024) and an additional medium is added to bring the total volume to approximately 40 ml. After maintenance in culture overnight, the culture comprising all the cells is transferred to a centrifuge tube and the supernatant is discarded after centrifugation. HAT medium (40 ml) is added to the cell pellet which is shaken thoroughly. The mixture is distributed between 96 wells of a microplate at a rate of approximately 100 / uliter per well. The same operation is repeated so as to fill the wells with four microplates using a mixture of cells and HAT medium.
After a week of incubation, colonies are formed of approximately 10% of the wells. These colonies tend to spread more flat than the colony of parent cells. From the first week of incubation, a drop (approximately 25 to 30 / ul) of HT medium (the same as HAT medium, but containing no aminopterin) is introduced into each well. After a reasonable growth of the hybridomas (approximately 10 to 14 days later), the presence, in the supernatant of the culture, of the monoclonal antibody against human pulmonary carcinoma (A-549) is verified according to the method. Protein A-bind-SBRC. Of the 45 clones formed, four appear to produce a monoclonal antibody against A-549. One of these four clones is divided into subclones by operating as in Example 1.
The four subclones grow and all produce a monoclonal antibody against A-549.
These hybridomas can be preserved according to known techniques, for example by suspension in a medium (10% FCS, 10% DMSO and 80% of ordinary medium) and conservation in liquid nitrogen or the refrigerated cabinet at approximately -80 [deg.] C.
Experiment 1
Determination according to the Ouchterlony method of the classes and subclasses of the immunoglobulins produced by the hybridoma prepared in Example 8
A 15% agarose solution (5 ml with 0.01% NaN3) is introduced into four Petri dishes
(internal diameter 52 mm), then the dishes are left to stand for approximately 30 minutes until the agarose solidifies. The cups are cleaned with the punch in the agarose gel of each box, as shown in Fig. 1, namely six 2.5 mm cups noted 1 to 6 each 4.0 mm apart from the 4.0 mm central cup, in a gel 1.5 mm thick. Is introduced into the peripheral wells 5 / ulitres of each of the antibodies indicated in Table I and into the central wells of the respective agarose gels 15 / ulitres of each culture medium concentrated ten times containing four monoclonal antibodies (LAC 1, 2, 3 and 4) produced by the hybridoma prepared in Example 8.
The gels are left to stand for 24 hours and the class of each monoclonal antibody is determined by formation of the precipitation line.
TABLE 1
<EMI ID = 7.1>
The four monoclonal antibodies examined prove to be mouse IgG because all the precipitation lines form between well 3 and central well 7.
The IgG subclass is determined according to the same procedure. As shown in Fig. 2, 5 cups are punched in the agarose gel from each of four Petri dishes, namely four 2.5 mm cups each 4.0 mm apart from the 4.0 mm central cup, in a 1.5 mm thick. Is introduced into the peripheral wells 5 / ulitres of each of the antibodies of the subclasses indicated in Table II and into the central wells of the respective agarose gels 15 / ulitres of each of the monoclonal antibodies (LAC 1-4). We put the petri dishes
<EMI ID = 8.1>
TABLE II
<EMI ID = 9.1>
The four monoclonal antibodies examined turn out to be IgG2a because their precipitation lines form between wells 2 and 5.
The amounts of monoclonal antibodies produced by the hybridomas of Example 8 are approximately
<EMI ID = 10.1>
tites of monoclonal antibodies produced by hybridomas prepared using mouse myeloma cells as parent cells. The unit character of the antibodies produced by the hybridoma of Example 8 is confirmed by gel electrophoresis.
The above results demonstrate that the parent human cell lines in accordance with the invention (for example SUN N-21-1 of the ME 1 series) fused with the B cells produce immunoglobulins expressing the genetic information provided by B cells.
Human myeloma cells which have been tried to use as parent cells for the preparation of hybridomas have various drawbacks, such as difficulty in maintaining culture, slowness of growth and instability. However, as indicated below, the cell line which is the subject of the invention is capable of reproducible growth, which is of the inherent nature of cancer cells.
Experiment 2
Growth profiles of cancer cells and cells of the ME 1 line according to the invention
A culture (10 ml) of 2 x 105 human myeloma cells (Colo 38) per ml is incubated in RPMI 1640 medium + 10% FCS. A culture (10 ml) of 2 × 10 5 cells per ml of SUN N-21-1 of the ME 1 series from Colo 38 is also incubated in RPMI 1640 medium + 10% FCS. We put another culture
(10 ml) of an equal number of SUN N-21-1 cells to be incubated in RPMI 1640 medium + 10% FCS containing 8-azaguanine in a final concentration of
20 / ug / ml. Samples are taken and the number of viable cells in each culture is determined by counting. The results are shown in FIG. 3 from which it can be deduced that the growth profile of SUN N-21-1 cells is similar to that of human cells of melanoma Colo 38 and undergoes little modification, even in the presence of 8-azaguanine.
The four hybridoma clones prepared in Example 8 also have growth profiles similar to that of SUN N-21-1 cells, although this is not illustrated in FIG. 3.