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MEMOIRE DESCRIPTIF déposé à l'appui d'une demande de
BREVET D'INVENTION formée par
Société dite :
ABBOTT LABORATORIES pour : "Procédé de détection immunologique d'une substance fixante et suspension aqueuse d'agrégats de particules utile dans ce procédé" Priorité d'une demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique déposée le 28 juin 1982, sous le No 392.970 au nom de Joy Kathryn Anderson.
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La présente invention concerne un procédé de détection immunologique d'une substance fixante spécifique multivalente ou monovalente et une suspension aqueuse d'agrégats de particules utile dans ce procédé.
Le dosage immunologique par comptage de particules est une technique non radiologique de dosage ino1ogique bien connue, J. IMMUNOL. METHODS, 18, 33-44 (1977). Cette technique repose sur l'agglutination de particules de latex ou de particules semblables revêtues d'une substance fixable de façon spécifique à une substance à déterminer. On mesure l'agglutination par emploi d'un compteur optique ou électrique, tel que ceux conçus pour le comptage de cellules sanguines, pour déterminer la diminution du nombre des particules non agglutinées. Cette technique a été employée pour déterminer des antigènes, des anticorps et des complexes immuns.
J. AUTO. CHEM., 149-152 (1980) ; J. IMMUNOL. METHODS, 23, 29-50 (1978) ; et-J. 13-23 (1979). Une variante de cette technique a été employée pour déterminer de petites molécules telle que la digoxine, CLIN. CHEM. 27/1, 1205-1209 (1981). Le comptage du nombre de particules agglutinées est également bien connu.
Des variantes des techniques par comptage de particules ont été mises au point pour résoudre des problèmes qui sont apparus. Par exemple, l'emploi de deux stades d'incubation et de particules de tailles différentes a été décrit pour résoudre le problème que pose le phénomène de prozone (les échantillons ayant des teneurs très élevées en antigène semblent être négatifs, car l'agglutination est minime). Voir les demandes de brevets de la République Fédérale d'Allemagne P 30 6 déposée en septembre 1980 par la société TECHNICO INSTRUMENT et P 29 18 342. 4 déposée le 20 novembre 1980 par BEHRINGWERKE AG.
L'invention se différencie particulièrement de l'art antérieur en ce qu'elle emploie des particules qui ont des propriétés détectables différentes, telles que la taille et la fluorescence. Au lieu de mesurer la disparition des particules non agrégées, on mesure la formation des agrégats des deux particules différentes et de la substance à doser par détermination dans les agrégats des propriétés différentes des particules associées par
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exemple à de grosses particules (c'est-à-dire la taille) et à de petites particules fluorescentes (c'est-à-dire la fluorescence).
On effectue cette mesure dans un compteur de cellules électrooptique à double canal, du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 198 160 ou avec un microscope à fluorescence.
L'invention comprend un procédé pour la détection d'une substance fixante spécifique multivalente dans un liquide biologique. Des premières et des secondes particules microscopiques ayant des propriétés détectables différentes et revêtues d'une substance fixable à la substance fixante spécifique multivalente pour que des agrégats contenant lesdites premières et secondes particules microscopiques se forment en présence de la substance fixante multivalente,
sont détectées par mesure des propriétés différentes associées aux premières et aux secondes particules microscopiques dans les agrégats.' De façon typique l'invention comprend la détection d'antigènes multivalents dans la solution par emploi de particules de deux tailles différentes revêtues d'anticorps-des particules non fluorescentes ayant une taille de 4 à 50hum et des particules fluorescentes ayant une taille de 0, 08 à 10pu. Dans un échantillon sans antigène, les particules fluorescentes et non fluorescentes ne sont pas fixées, tandis que, dans un échantillon contenant un antigène, les grosses particules non fluorescentes portent des particules fluorescentes attachées pour former des agrégats.
L'invention comprend les nouveaux agrégats de particules non fluorescentes de 4-50um et de particules fluorescentes de 0, 08-10 revêtues chacune d'une substances fixable à une substance fixante spécifique multivalente et fixées entre elles par cette substance fixante spécifique multivalente.
L'invention comprend également des procédés pour détecter les substances fixantes spécifiques multivalentes.
L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée.
Le terme substance fixante spécifique multivalente dans le contexte de l'invention désigne des antigènes, des anticorps et d'autres molécules biologiques ayant plus d'un site de fixation spécifique. Les antigènes viraux, tels que ceux associés à l'hépatite (antigènes de surface de l'hépatite B, antigène de l'hépatite A et
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antigène nucléocapsidique de l'hépatite), à l'herpès et à d'autres maladies virales associées, ainsi que leurs anticorps sont des exemples de substances fixantes spécifiques multivalentes. Les bactéries et les antigènes bactériens tels que Neisseria gonorrheae et Streptococcus sont d'autres substances fixantes spécifiques multivalentes.
Les antigènes associés au cancer, tels que l'antigène carcinoembryonnaire (CEA) sont également des substances fixantes spécifiques multivalentes que l'on peut déterminer selon les procédés de l'invention. Le spécialiste du dosage immunologique connaît une grande diversité de substances fixantes spécifiques multivalentes.
Les substances fixantes spécifiques monovalentes peuvent également être déterminées selon les procédés et avec les réactifs de l'invention par emploi de polymères ayant de nombreuses molécules de substances fixantes spécifiques monovalentes fixées et de particules revêtues d'une substances fixable à la substance fixante spécifique monovalente. La substance fixante spécifique monovalente dans l'échantillon à analyser entre en compétition avec les sites de fixation sur les particules et inhibe l'agglutination entre les particules et le polymère auquel est fixée la substance fixante spécifique monovalente.
On conjugue ainsi des médicaments et des hormones à des polymères, par exemple des protéines telles que la sérum-albumine bovine ou des polysaccharides, tels que le dextran pour former des substances fixantes spécifiques multivalentes synthétiques qui sont capables de fixer des particules microscopiques du type précédemment décrit, de préférence des particules microscopiques non fluorescentes revêtues d'une substance fixable aux substances fixantes spécifiques multivalentes synthétiques et de petites particules fluorescentes microscopiques revêtues de façon semblable. Les agrégats obtenus sont détectés comme précédemment décrit.
L'invention utilise au moins deux types de particules microscopiques ayant chacun des propriétés détectables distinctes.
Les particules sont généralement faites de polymères synthériques tels que le polystyrène, le polypropylène, le polyacrylate et similaires. Des globules rouges du type décrit dans le brevet des EtatsUnis d'Amérique n 3 715 427 sont également des particules
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appropriées à l'emploi dans l'invention. Une matière particulaire préférée est constituée de polystyrène et on l'appelle également particules de latex de polystyrène. Les particules appropriées sont connues de façon générale dans le domaine des microparticules. On préfère également employer des particules de deux tailles différentes ! les grosses particules ayant une taille de 4 à 50um et les parti-
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cules plus petites ayant une taille de 0, à 10 uni.
On préfère éga- lement que les petites particules aient un marquage fluorescent. Ce marquage est réalisé par incorporation d'une matière fluorescente aux particules ou fixation de molécules fluorescentes à la surface des particules.
Chaque particule est revêtue d'une substance fixable de façon spécifique à la substance fixante multivalente. De façon typique, si on veut détecter un antigène multivalent, on revêt les particules d'un anticorps dirigé contre l'antigène. Plus particulièrement, si on doit détecter l'antigène de surface de l'hépatite B, on revêt les particules d'un anticorps ou d'un fragment F (ab') 2 de l'anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B.
Des systèmes courants sont les suivants : Revêtement des grosses Substance fixante Revêtement des petites particules multivalente particules 6um-IgG de cobaye Antigène de surface 0, 49nm- F (ab') 2* de anti-HBsAg de l'hépatite B chèvre anti-HBsAg
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6 0, 49 um-anticorps monoctonal I anti-CEA clonal II anti-CEA pm - anticorps mono- CEA6um-antigène de surface Anti-HBsAG 0, 49um- antigène de de l'hépatite B surface de l'hépatite
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Anticorps monoclonal I Chlamydia 0, 9um- monoanti-Chlamydia clonal anti-Chlamydia Hématies fixées-IgG HBsAg 0, 624 ? m - F (ab') 2* de de cobaye anti- HBsAg chèvre anti-HBsAg 6um-anticorps contre Sérum-albumine bovine 0,
49 um-anticorps la digoxine ayant plusieurs mole-contre la digoxine cules de digoxine qui lui sont fixées 6um-anticorps contre Dextran ayant plu-0, 49um-anticorps la digoxine sieurs molécules de contre la digoxine digoxine qui lui sont fixées * F (ab') fragment d'IgG anti-HBsAg actif contre l'HBsAg.
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On revêt les particules par adsorption ou par liaison covalente en employant l'un quelconque des nombreux procédés de revêtement connus.
En pratique, la présence de la substance fixante spécifique multivalente dans l'échantillon à analyser provoque l'agglutination (agrégation) des particules. Donc des particules ayant des propriétés détectables différentes sont présentes dans les agrégats et les agrégats sont détectés par mesure de ces propriétés.
Plus particulièrement, plusieurs petites particules fluorescentes sont fixées à une grosse particule non fluorescente et on détecte l'agrégat par mesure de cette combinaison unique en son genre de taille et de fluorescence. On peut également détecter les agrégats par marquage des grosses particules et des petites particules avec des colorants fluorescents différentes et détection de la fluorescence double des agrégats. Le système à deux paramètres (volume + fluorescence ou deux particules fluorescentes) est particulièrement avantageux en ce qu'il évite les réponses faussement positives dues à une agrégation non spécifique de chaque type de particules.
Les réponses faussement positives sont également réduites par le prétraitement du sérum avec de la pepsine pour digérer les substanves sériques gênantes non spécifiques. Ainsi, l'incubation de volumes égaux de sérum et de pepsine à 1% dans l'acide chlorhydrique 0,15 M pendant 15 min à 37 C, puis neutralisation de la solution avec de l'hydroxyde de sodium 0,5 M constitue un prétraitement efficace. Le traitement par la pepsine est particulièrement utile dans les analyses relatives à l'hépatite, en ce que l'antigène de l'hépatite résiste à la digestion par la pepsine.
La demanderesse a également découvert que l'agglutination non spécifique des deux types de particules au cours du stockage ainsi que pendant le dosage est réduite par la mise en suspension des particules dans un tampon optimalisé. Par exemple une solution 0, 1 1 en glycine et 0,15 M en chlorure de sodium temponnée à pH 9,2 et contenant 1% de sérum-albumine bovine 1 M en chlorure de sodium et à 10% de diméthylformamide réduit l'agglutination non spécifique et améliore le dosage.
L'invention est illustrée par les exemples suivants.
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I Revêtement de microparticules avec des anticorps anti-HBsAg On lave des particules de polystyrène (6um ; suspension à 10%) pour les débarrasser des agents tensioactifs par lavage répété dans l'eau, puis trois lavages dans le méthanol. On ajoute Q 6 g d'IgG de cobaye anti-HBsAg à une suspension de 6 x par- ticules dans du tampon salé phosphaté (PBS) à pH 7,4 (volume total 14 ml). On agite le mélange pendant une nuit (20 h) à la température ordinaire en utilisant un barreau magnétique d'agitation. On lave deux fois les particules avec du PBS et on remet en suspension
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à 6 x particules/ml dans du PBS contenant 1% de sérum-albumine bovine et 0, 1% d'azide de sodium.
De façon semblable, on revêt des particules fluorescentes de 0, 49um (Polysciences Inc. ; 4 x 10 au total) avec 300 ug de F (ab')2 2 de chèvre anti-HBsAg purifié par affinité (volume de revêtement total 1 ml). Après revêtement, on lave les particules deux fois avec du PBS et on remet en suspension à la concentration
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Q de 6 x particules/ml dans du PBS contenant 1% de sérum-albumine bovine et 0, 1% d'azide de sodium.
EXEMPLE II MODE DE DETERMINATION DE L'HBsAg
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Prétraitement
A 100 ul de sérum ou de plasma, on ajoute 100 ul de solution à 1% de pepsine dans du HC1 0,15 M. On laisse la digestion du mélange s'effectuer pendant 15 min dans un bain-marie à 37 C avant de neutraliser avec de l'hydroxyde de sodium 0,5 M.
Dosage :
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On ajoute à l'échantillon prétraité 50 de par- 5 ticules de 6um revêtues d'IgG de cobaye anti-HBsAg (3x au total). On agite le mélange (220 tr/min) pendant 1 h à la température ordinaire sur un agitateur rotatif Tektator. On ajoute ensuite de petites microparticules fluorescentes (0, 49um ; 3 x au total) revêtues de fragments F (ab') 2 chèvre anti-HBsAg. On centrifuge le mélange à la température ordinaire à environ 1 500 x g pendant 5 min pour mélanger les grosses particules et les petites.
Dans des échantillons contenant de l'HBsAg, il se forme des agrégats de particules de 6um et des petites particules
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fluorescentes. Dans les échantillons HBsAg négatifs, il se forme seulement une faible teneur d'agrégats de particules de 6um et de 0, 49um. On peut déterminer la présence ou l'absence de ces agrégats par emploi d'un microscope à fluorescence ou d'un appareil conçu pour mesurer de façon coïncidente les signaux de volume et de fluorescence.
EXEMPLE III Revêtement de microparticules avec des anticorps monoclonaux anti-CEA Q On lave cinq fois des microparticules (6pm ; 2 x au total ; Microspheres Research) dans du PBS à pH 8, 3. On ajoute aux particules lavées 2001g d'anticorps monoclonal I anti-CEA et 200 de PBS à pH 8, 3. On agite les particules pendant une nuit à la température ordinaire et on lave trois fois dans du tampon 0, 1 M en glycine et 0, 15 M en chlorure de sodium à pH 9, 2 contenant 1% de sérum-albumine bovine (GBS-BSA) et on remet en suspension dans 1 ml de GBS-BSA.
De façon semblable, on ajoute des particules de 0, 49um marqueur fluorescent (1, 6 x au total ; Polysciences Inc) à une solution de revêtement contenant 120 d'anticorps monoclonal II anti-CEA (90/g) et 120 de PBS à pH 8, 3. On agite le mélange pendant une nuit, on lave deux fois avec du GBS-BSA et on remet en suspension dans 1 ml de GBS-BSA.
EXEMPLE IV Détermination du CEA On dilue les particules revêtues au 1/30 dans du GBS-BSA. A 300 de sérum, on ajoute 50ul de particules de 6um 5 revêtues d'anticorps monoclonal 1 (3, 18 x au total) et 200 de tampon 1 M en glycine et 0, 5 1-1 en NaCl à pH 9. On incube le mélange pendant une nuit à 450C, puis on lave avec 1 ml de GBS.
On ajoute les particules de 0, 49um à marquage fluorescent (50us ; 2, 6 x au total) revêtues d'anticorps monoclonal II et on centrifuge le mélange à la température ordinaire à environ 1 500 x g pendant 5 min pour mélanger les particules de 6um et de 0, 49um. On dilue la suspension avec 1 ml de soluté salé normal et on détermine le nombre des agrégats de particules de 6um et de 0, Cette méthode permet de déterminer la quantité de CEA de façon quantitative, comme le montre le tableau ci-dessous.
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Courbe étalon pour le dosage selon une technique en écoulement du CEA avec des anticorps monoclonaux mélangés.
Concentration du CEA Nombre d'agrégats de particules
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de 6um et 0, 49um pour un total (ng/ml) de 10 000 particules de 6um Moyenne 0 6T5 1 709
2 850
5 942
10 1154
20 1541 EXEMPLE V
On emploie l'invention pour déterminer des substances fixantes monovalentes. On revêt des particules non fluorescentes de 6, 0um d'anticorps contre la digoxine. On incube l'échantillon à analyser avec des particules revêtues et de la sérum-albumine bovine à laquelle sont couplées plusieurs molécules de digoxine.
Après l'incubation, on ajoute de petites particules fluorescentes revêtues d'anticorps anti-digoxine. Dans un échantillon sans digoxine, la digoxine-BSA fixe ensemble les grosses particules et les petites.
Dans un échantillon contenant de la digoxine, ce médicament entre en compétition avec de la digoxine-BSA vis-à-vis des sites de fixation de la première phase solide et réduit ainsi le nombre des agrégats émettant des signaux de volume et de fluorescence formés.
De façon semblable, on peut fixer des substances monovalentes (un seul site de fixation spécifique), telles que des médicaments, des hormones et similaires à de la sérum-albumine bovine, du dextran ou des polymères synthétiques semblables pour effectuer des déterminations similaires
Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.
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DESCRIPTIVE MEMORY filed in support of a request for
PATENT OF INVENTION formed by
So-called company:
ABBOTT LABORATORIES for: "Method for the immunological detection of a fixing substance and aqueous suspension of particle aggregates useful in this process" Priority of a patent application in the United States of America filed on June 28, 1982, under No. 392.970 on behalf of Joy Kathryn Anderson.
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The present invention relates to a method for the immunological detection of a specific multivalent or monovalent fixing substance and an aqueous suspension of particle aggregates useful in this method.
Particle count immunoassay is a well known non-radiological inological assay technique, J. IMMUNOL. METHODS, 18, 33-44 (1977). This technique is based on the agglutination of latex particles or similar particles coated with a fixable substance specific to a substance to be determined. The agglutination is measured by using an optical or electric counter, such as those designed for counting blood cells, to determine the decrease in the number of non-agglutinated particles. This technique has been used to determine antigens, antibodies and immune complexes.
J. AUTO. CHEM., 149-152 (1980); J. IMMUNOL. METHODS, 23, 29-50 (1978); and-J. 13-23 (1979). A variant of this technique was used to determine small molecules such as digoxin, CLIN. CHEM. 27/1, 1205-1209 (1981). Counting the number of agglutinated particles is also well known.
Variants of particle counting techniques have been developed to solve problems that have arisen. For example, the use of two incubation stages and particles of different sizes has been described to solve the problem posed by the prozone phenomenon (samples with very high levels of antigen seem to be negative, since the agglutination is minimal). See the patent applications of the Federal Republic of Germany P 30 6 filed in September 1980 by the company TECHNICO INSTRUMENT and P 29 18 342. 4 filed on November 20, 1980 by BEHRINGWERKE AG.
The invention particularly differs from the prior art in that it employs particles which have different detectable properties, such as size and fluorescence. Instead of measuring the disappearance of the non-aggregated particles, the formation of the aggregates of the two different particles and of the substance to be measured is measured by determining in the aggregates the different properties of the particles associated by
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example to large particles (i.e. size) and to small fluorescent particles (i.e. fluorescence).
This measurement is carried out in a dual-channel electrooptical cell counter, of the type described in United States patent No. 4,198,160 or with a fluorescence microscope.
The invention comprises a method for the detection of a specific multivalent fixing substance in a biological fluid. First and second microscopic particles having different detectable properties and coated with a substance which is binding to the specific multivalent fixing substance so that aggregates containing said first and second microscopic particles are formed in the presence of the multivalent fixing substance,
are detected by measuring the different properties associated with the first and second microscopic particles in the aggregates. ' Typically, the invention comprises the detection of multivalent antigens in the solution by using particles of two different sizes coated with antibodies - non-fluorescent particles having a size of 4 to 50 µm and fluorescent particles having a size of 0, 08 to 10pu. In an antigen-free sample, the fluorescent and non-fluorescent particles are not fixed, while in a sample containing an antigen, the large non-fluorescent particles carry fluorescent particles attached to form aggregates.
The invention includes the new aggregates of non-fluorescent particles of 4-50 μm and of fluorescent particles of 0.08-10 each coated with a substance which can be fixed to a specific multivalent fixing substance and fixed together by this specific multivalent fixing substance.
The invention also includes methods for detecting specific multivalent fixing substances.
The invention will now be described in detail.
The term multivalent specific binding substance in the context of the invention designates antigens, antibodies and other biological molecules having more than one specific binding site. Viral antigens, such as those associated with hepatitis (hepatitis B surface antigens, hepatitis A antigen and
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nucleocapsid antigen of hepatitis), herpes and other associated viral diseases, as well as their antibodies are examples of specific multivalent fixing substances. Bacteria and bacterial antigens such as Neisseria gonorrheae and Streptococcus are other specific multivalent fixing substances.
Antigens associated with cancer, such as carcinoembryonic antigen (CEA) are also specific multivalent fixing substances which can be determined according to the methods of the invention. The specialist in immunoassay knows a great variety of specific multivalent fixing substances.
The specific monovalent fixing substances can also be determined according to the methods and with the reagents of the invention by the use of polymers having numerous molecules of specific fixing monovalent fixing substances and of particles coated with a substance binding to the specific monovalent fixing substance. The specific monovalent fixing substance in the sample to be analyzed competes with the binding sites on the particles and inhibits agglutination between the particles and the polymer to which the specific monovalent fixing substance is attached.
Medicines and hormones are thus conjugated with polymers, for example proteins such as bovine serum albumin or polysaccharides, such as dextran to form specific multivalent synthetic fixing substances which are capable of fixing microscopic particles of the type previously describes, preferably non-fluorescent microscopic particles coated with a fixable substance to synthetic multivalent specific fixing substances and small microscopic fluorescent particles coated in a similar manner. The aggregates obtained are detected as previously described.
The invention uses at least two types of microscopic particles each having distinct detectable properties.
The particles are generally made of synthetic polymers such as polystyrene, polypropylene, polyacrylate and the like. Red blood cells of the type described in U.S. Patent No. 3,715,427 are also particles
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suitable for use in the invention. A preferred particulate material is made of polystyrene and is also called polystyrene latex particles. Suitable particles are generally known in the field of microparticles. We also prefer to use particles of two different sizes! large particles with a size of 4 to 50um and the particles
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smaller cules having a size of 0, to 10 uni.
It is also preferred that the small particles have fluorescent labeling. This marking is carried out by incorporating a fluorescent material into the particles or fixing fluorescent molecules to the surface of the particles.
Each particle is coated with a fixable substance specific to the multivalent fixing substance. Typically, if a multivalent antigen is to be detected, the particles are coated with an antibody directed against the antigen. More particularly, if the hepatitis B surface antigen is to be detected, the particles are coated with an antibody or an F (ab ′) 2 fragment of the antibody directed against the surface antigen of the hepatitis B. 'Hepatitis B.
Common systems are as follows: Coating of large fixing substance Coating of small multivalent particles 6um-guinea pig IgG Surface antigen 0.49nm- F (ab ') 2 * anti-HBsAg hepatitis B goat anti-HBsAg
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6 0.49 µm - monoctonal antibody I anti-clonal CEA II anti-CEA pm - mono-CEA6um antibody - anti-HBsAG surface antigen 0.49um - hepatitis B antigen hepatitis surface
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Monoclonal antibody I Chlamydia 0,9um- monoanti-clonal Chlamydia anti-Chlamydia Fixed red cells-IgG HBsAg 0, 624? m - F (ab ') 2 * guinea pig anti-HBsAg goat anti-HBsAg 6um-antibody against bovine serum albumin 0,
49 um-digoxin antibody having several moles-against digoxin digoxin cules attached to it 6um-antibody against Dextran having greater than 0, 49um-digoxin antibody several molecules of digoxin against digoxin attached to it * F (ab ') fragment of anti-HBsAg IgG active against HBsAg.
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The particles are coated by adsorption or by covalent bond using any of the many known coating methods.
In practice, the presence of the specific multivalent fixing substance in the sample to be analyzed causes agglutination (aggregation) of the particles. Therefore particles with different detectable properties are present in the aggregates and the aggregates are detected by measuring these properties.
More particularly, several small fluorescent particles are attached to a large non-fluorescent particle and the aggregate is detected by measuring this unique combination of its size and fluorescence. Aggregates can also be detected by labeling large particles and small particles with different fluorescent dyes and detecting the double fluorescence of the aggregates. The two-parameter system (volume + fluorescence or two fluorescent particles) is particularly advantageous in that it avoids false positive responses due to non-specific aggregation of each type of particle.
False positive responses are also reduced by pretreatment of the serum with pepsin to digest non-specific annoying serum substanves. Thus, the incubation of equal volumes of serum and 1% pepsin in 0.15 M hydrochloric acid for 15 min at 37 ° C., then neutralization of the solution with 0.5 M sodium hydroxide constitutes a effective pretreatment. Pepsin therapy is particularly useful in hepatitis testing, in that the hepatitis antigen resists digestion by pepsin.
The Applicant has also discovered that the non-specific agglutination of the two types of particles during storage as well as during the assay is reduced by suspending the particles in an optimized buffer. For example, a 0.1 g glycine and 0.15 M solution of sodium chloride calibrated at pH 9.2 and containing 1% of bovine serum albumin 1 M in sodium chloride and 10% of dimethylformamide reduces agglutination non-specific and improves the dosage.
The invention is illustrated by the following examples.
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I Coating of microparticles with anti-HBsAg antibodies Polystyrene particles are washed (6 μm; 10% suspension) to rid them of surfactants by repeated washing in water, then three washes in methanol. Q 6 g of anti-HBsAg guinea pig IgG is added to a suspension of 6 × particles in phosphate-buffered saline buffer (PBS) at pH 7.4 (total volume 14 ml). The mixture is stirred overnight (20 h) at room temperature using a magnetic stir bar. The particles are washed twice with PBS and resuspended
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at 6 x particles / ml in PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.1% sodium azide.
Similarly, 0.49um fluorescent particles are coated (Polysciences Inc.; 4 x 10 in total) with 300 µg of affinity purified anti-HBsAg goat F (ab ') 2 2 (total coating volume 1 ml ). After coating, the particles are washed twice with PBS and resuspended to concentration
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Q of 6 x particles / ml in PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.1% sodium azide.
EXAMPLE II METHOD OF DETERMINING HBsAg
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Pretreatment
To 100 μl of serum or plasma, 100 μl of 1% pepsin solution in 0.15 M HCl is added. The mixture is allowed to digest for 15 min in a water bath at 37 ° C. before neutralize with 0.5 M sodium hydroxide
Dosage:
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To the pretreated sample are added 50 of 6 μm particles coated with anti-HBsAg guinea pig IgG (3 × in total). The mixture is stirred (220 rpm) for 1 h at room temperature on a Tektator rotary shaker. Small fluorescent microparticles (0.49 μm; 3 × in total) coated with fragments F (ab ′) 2 anti-HBsAg goat are then added. The mixture is centrifuged at room temperature at approximately 1500 x g for 5 min to mix the large and small particles.
In samples containing HBsAg, aggregates of 6um particles and small particles are formed
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fluorescent. In the negative HBsAg samples, only a low content of particle aggregates of 6um and 0.49um is formed. The presence or absence of these aggregates can be determined by the use of a fluorescence microscope or a device designed to measure the volume and fluorescence signals coincidentally.
EXAMPLE III Coating of Microparticles with Anti-CEA Q Monoclonal Antibodies Microparticles are washed five times (6pm; 2 x in total; Microspheres Research) in PBS at pH 8, 3. 2001g of monoclonal antibody I are added to the washed particles anti-CEA and 200 PBS at pH 8.3. The particles are stirred overnight at room temperature and washed three times in 0.1 M glycine buffer and 0.15 M sodium chloride pH 9 buffer. , 2 containing 1% bovine serum albumin (GBS-BSA) and are resuspended in 1 ml of GBS-BSA.
Similarly, 0.49um fluorescent marker particles (1.6 x total; Polysciences Inc) are added to a coating solution containing 120 anti-CEA monoclonal II antibodies (90 / g) and 120 PBS to pH 8, 3. The mixture is stirred overnight, washed twice with GBS-BSA and resuspended in 1 ml of GBS-BSA.
EXAMPLE IV Determination of CEA The coated particles are diluted 1/30 in GBS-BSA. To 300 of serum, 50 μl of 6um 5 particles coated with monoclonal antibody 1 (3.18 × in total) and 200 of 1 M glycine buffer and 0.5-1.5 NaCl at pH 9 are added. the mixture overnight at 450C, then washed with 1 ml of GBS.
The 0.49um fluorescently labeled particles (50us; 2.6x total) coated with monoclonal antibody II are added and the mixture is centrifuged at room temperature at approximately 1500 xg for 5 min to mix the 6um particles and 0.49um. The suspension is diluted with 1 ml of normal salt solution and the number of particle aggregates of 6 μm and 0 is determined. This method makes it possible to determine the quantity of CEA quantitatively, as shown in the table below.
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Standard curve for assay using a CEA flow technique with mixed monoclonal antibodies.
CEA concentration Number of particle aggregates
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of 6um and 0.49um for a total (ng / ml) of 10,000 particles of 6um Medium 0 6T5 1,709
2,850
5,942
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20 1541 EXAMPLE V
The invention is used to determine monovalent fixing substances. Non-fluorescent particles are coated with 6.0 µm of antibodies to digoxin. The sample to be analyzed is incubated with coated particles and bovine serum albumin to which several digoxin molecules are coupled.
After incubation, small fluorescent particles coated with anti-digoxin antibodies are added. In a sample without digoxin, digoxin-BSA binds large and small particles together.
In a sample containing digoxin, this drug competes with digoxin-BSA vis-à-vis the binding sites of the first solid phase and thus reduces the number of aggregates emitting volume and fluorescence signals formed.
Similarly, monovalent substances (a single specific binding site) can be attached, such as drugs, hormones, and the like to bovine serum albumin, dextran, or similar synthetic polymers to make similar determinations.
Of course, various modifications can be made by those skilled in the art to the devices or methods which have just been described only by way of nonlimiting examples without departing from the scope of the invention.