"Ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang" Ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang.
La présente invention concerne des ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre chacune des trois protéines humaines sui-
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psine. Ces trois protéines sont impliquées dans la fibrinolyse et/ou la coagulation du sang.
L'antithrombine III (AT III) est une glycoprotéine de Mw
58000 daltons (425 acides aminés), synthétisée dans le foie et présente dans le plasma (demi-vie : 2,7 jours). Dans de nombreuses circonstances, le taux d'AT III dans le sang peut diminuer, entraînant des états pathologiques graves. Une déficience en AT III est souvent associée à des troubles hépatiques, à l'apparition généralisée de micro-caillots dans le système circulatoire (coagulation intravasculaire disséminée), à la protéinurie et à la leucémie aiguë. De plus après intervention chirurgicale, un taux réduit d'AT III accompagne souvent un état thrombotique. Le taux d'AT III constitue dès lors un révélateur efficace de troubles des processus de coagulation et de fibrinolyse.
Outre les différentes conditions du milieu qui peuvent affecter le taux d'antithrombineIII, il existe des cas de déficience héréditaire à relativement haute fréquence (de 1 à 2,5 pour mille). Actuellement, une partie des problèmes liés à un taux réduit d'antithrombine III peut être surmonté par l'administration de plasma enrichi en cette enzyme.
A cet égard, la disponibilité d'un système de dosage de l'antithrombine III dans les fluides biologiques, basé sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre elle, facilite la détection précoce des troubles des processus de coagulation et de fibrinolyse. En outre, la mise au point d'un système simple de purification de l'antithrombine III au départ de plasma ou de toute autre source appropriée au moyen de l'ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III humaine permettrait des essais cliniques approfondis de l'AT III en tant qu' agent thérapeutique.
<EMI ID=2.1> de plasma de Mw 65 000 daltons dont la déficience héréditaire con-
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complexant rapidement la plasmine circulante et en bloquant ses activités protéolytiques.
La mise au point de systèmes simples de dosage et de purifi-
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monoclonaux dirigés contre elle pourrait conduire à la détection précoce de troubles fibrinolytiques et à l'emploi thérapeutique de
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ma sanguin est synthétisée dans le foie et sécrétée dans le plasma ou sa demi-vie est de 6 jours. Cette enzyme fonctionne essentiellement en tant qu'inhibiteur d'enzymes protéolytiques. La cible
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pour la plasmine et la thrombine; c'est là que se situe son rôle dans le processus de fibrinolyse. Par ailleurs, la déficience héréditaire en cette enzyme, phénomène assez fréquent, s'accompagne de troubles de dégénérescence précoce du poumon et, dans certains cas, de troubles hépatiques. Il semble que des facteurs génétiques et de l'environnement participent ensemble à l'apparition des problèmes de santé.
Si pour des raisons génétiques ou autres, le taux d�l-antitrypsine dans le plasma tombe sous un certain seuil, des troubles pulmonaires graves se déclarent. La perte d'élasticité des poumons conduit à des dégâts irréversibles, caractéristiques de l'emphysème. Une des causes principales de l'emphysème trouve son origine dans le tabagisme; l'exposition des poumons à la fumée du tabac induit une activité protéolytique accrue dans les macrophages des alvéoles pulmonaires et la concentration de leucocytes riches en élastase s'accroît dans celles-ci. Ces deux phénomènes conduisent
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tabagisme résulte d'un déséquilibre entre protéase et anti-proté-ase.
La compréhension de la pathogénèse des troubles pulmonaires fournit la base de nouveaux concepts comme, par exemple, la thérapie par remplacement d'anti-protéase. Une telle voie suppose no-
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l'on pourrait administrer aux emphysémateux.
A cet égard, la mise au point de systèmes simples de dosage et de purification de l�l-antitrypsine basés sur l'utilisation de l'ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre elle conduit à la détection des troubles liés à la déficience en cette enzyme et
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Dans le cadre de l'invention, on a trouvé des ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés respectivement contre l'antithrombine-
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bles, en raison de la diversité des anticorps qui les composent peuvent être utilisés comme agent diagnostique et constituent un moyen de réaliser les objectifs de dosage et de purification des trois protéines sus-mentionnées.
L'invention concerne trois ensembles distincts d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang. Ces ensembles contiennent 15 anticorps monoclonaux dirigés contre l'antitrombine III,
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Par "ensemble" on comprend la totalité des anticorps qui le constitue.
Selon un aspect particulier de l'invention, les anticorps monoclonaux de chaque ensemble sont sécrétés par différents hybridomes.
Dans le cadre de l'invention, on a aussi montré que divers anticorps monoclonaux, au sein de chaque ensemble, ne sont pas mutuellement inhibants, c'est-à-dire se lient ensemble soit à l'AT
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En outre, on a montré que chaque ensemble se compose de grou-pes d'anticorps monoclonaux dont les éléments reconnaissent différents déterminants antigéniques (épitopes) soit de l'AT III, soit de 1�2-AP, soit l'�l-AT.
Suivant la présente invention, l'ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III contient 15 anticorps monoclonaux répartis en 7 groupes d'anticorps dont la spécificité d'épitope est différente et comporte six anticorps monoclonaux qui inhibent l'activité enzymatique de l'AT III humaine.
Cet ensemble comporte 8 anticorps qui présentent une structure IgGl et 7 anticorps qui présentent une structure IgG2. Tous
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se répartissent en 7 groupes d'anticorps de spécificités d'épitope différentes.
Un autre caractère de l'ensemble AT III, selon l'invention, tient à ce que six anticorps inhibent l'activité enzymatique de l'anthitrombine III humaine.
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humaine, contient 23 anticorps monoclonaux répartis en 11 groupes d'anticorps dont la spécificité d'épitope est différente. 14 anticorps sont de structure IgGlet 9 anticorps sont de structure IgG2.
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micro-organismes portant l'information génétique correspondant à cette protéine. Les 26 anticorps monoclonaux de cet ensemble reconnaissent l'o�l-antitrypsine humaine.
La préparation des anticorps monoclonaux s'effectue selon une technologie de fusion cellulaire, dérivée de celle publiée par
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Suivant la présente invention, le procédé pour produire les ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang
/ est caractérisé par la fusion cellulaire de cellules de souris,
un sousclone sélectionné de SP 2/0-Ag 14 avec des cellules de
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soit avec l' 1-AT, par la sélection des hybridomes sécréteurs d'anticorps, par le clonage de ces dernièrs hybridomes, par leur production en culture ou en ascite, par l'identification des anticorps secrétés par ces clones et par la caractérisation des classes d'immunoglobulines de ces anticorps, de leur affinité relative
et de leur spécificité.
Pour mieux comprendre le procédé, faisant l'objet de la présente invention, l'exemple non limitatif suivant décrit la préparation des trois ensembles d'anticorps monoclonaux sus-mentionnés.
1.Cellules de myélome de souris.
On a sélectionné des cellules de myélome de souris possédant les propriétés suivantes : croissance rapide in vivo et in vitro, capacité de pouvoir être clonées sans le support de cellules nourricières et en milieu semi-solide ,capacité de fusionner à taux élevé. Cette lignée a été développée par Shulamn,M; Wilde,C.D
and Koller,G (1978) Nature 276,269-270.
Dans ce but, les cellules myelomateuses SP 2/0-AG 14 ont été clonées en agar. Les cellules capables de pousser dans ces conditions ont alors été reclonées en agar puis injectées par voie intrapéritonéale dans des souris syngéniques. Après une à deux semaines, les cellules myelomateuses se développent sous forme de tumeur dans les souris injectées. Les cellules sont alors collectées dans la cavité péritonéale, resélectionnées, reclonées en agar et essayées dans une expérience de fusion cellulaire. Le cycle décrit ci-dessus est recommencé 3 fois. A l'issue du procédé,
on obtient des sous-clones sélectionnés de la lignée myélomateuse
SP 2/0-Agl4 possédant les propriétés voulues pour leur fusion cellulaire ultérieure suivant le procédé revendiqué. On trouvera dans Franssen,J.D.;Hérion,P et Urbain,J.(1981,Proc.XXIX Colloquium
on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed.) le détail de la méthode appliquée.
2.Immunisation des souris.
Les antigènes utilisés ont été obtenus comme suit. L'anti-thrombine III a été purifiée par la méthode de MACKAY,E.J., Thrombosis Research, 21, 1981, 375-382 au départ d'un pool de plasma citraté.
L'� 2-antiplasmine pure a été fournie par le Dr D. COLLEN de la Katolieke Universiteit Leuven.
L' �l-antitrypsine a été purifiée par la méthode de Mahoney, W.C.; Kurachi, K. et Hermodson,M.A. Eur. J. Biochem,105,545-542,-
1980 au départ d'un pool de plasma citraté.
Ces différentes préparations purifiées ont été utilisées pour immuniser des souris femelles (souches Balb/c, A/J and AKR) âgées de 8 semaines.
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fié dans l'adjuvant complet de Freund et on injecte le mélange par voie sous-cutanée et intra-péritonéale. Trois semaines plus tard, les souris reçoivent une injection de rappel, 100�g d'antigène dans l'adjuvant incomplet de Freund, par voie intraperitonéale. Après une période de repos de 6 semaines, les souris reçoivent au
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NaCl 0,15 M) par voies intra-péritonéale et sous-cutanée.
Au jour zéro, on sacrifie les souris et on prélève la rate pour la préparation des cellules destinées aux fusions cellulaires.
3.Fusions cellulaires.
Pour effectuer les fusions, on utilise les matières et milieux suivants. On obtient chez GIBCO le milieu DMEM que l'on complète avec du sérum de cheval (10%), du sérum de veau (5%), des acides aminés non essentiels, du pyruvate de sodium (lmM), de la
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Le milieu de sélection complet (HAT) se compose du milieu décrit ci-dessus ainsi que d'hypoxanthine (10-4 M),d'aminoptérine
<EMI ID=21.1>
nant de l'agar (1,5%) comporte les ingrédients décrits ci-dessus. Les cellules sont cultivées à 37[deg.]C dans une atmosphère humide de 5% C02 et 95% d'air.
La fusion avec des cellules provenant d'une lignée cellulaire de myélome de souris (sous-clones sélectionnés SP2/0 - Ag 14) est réalisée selon le procédé de Franssen, J.D., Herion, P.and Urbain J.-1981-Proc. XXIX Colloquium on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed.
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SP2/0-Ag 14. Pour chaque fusion, on distribue les cellules fusionnées dans des plaques de microculture à 96 puits en effectuant des dilutions de 10 en 10 fois. Les cultures sont alimentées au jour 5,8,11 et 13 après la fusion en remplaçant la moitié du milieu dans le puits par du milieu frais. Au jour 15 après la fusion, 50
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dans du tampon NaCl 0.15M, acétate 0,02 M PH5 sont incubés dans des puits de plaques LINBRO en PVC à 96 puits durant une nuit à 4[deg.]C. Les sites d'absorption restants sont alors bloqués par incu-
<EMI ID=24.1>
val et 1% d'albumine bovine. Les plaques sont alors lavées plusieurs fois avec du tampon PBS, puis les surnageants de culture ou des dilutions d'antise�um de souris sont mis à réagir avec l'antigène adsorbé, durant une nuit à 4[deg.]C.
Les anticorps fixés sont alors révélés par l'une des deux procédures suivantes :
a) des Fab d'anticorps de chèvre antiimmunoglobuline de <EMI ID=25.1>
une nuit dans les puits qui sont ensuite lavés, séchés et comptés dans un compteur à scintillation-( b) des immunoglobulines de chèvre antiimmunoglobuline de souris marquées à la peroxydase (O'Sullivan, M.J. and Marks, V., Me- <EMI ID=26.1>
tampon PBS 7.5 contenant 10% de sérum de cheval, 1% d'albumine bovine et 0.1% de tween 80 sont incubés durant 4 heures à température ambiante dans les puits qui sont ensuite lavés plusieus fois. L'enzyme confugué fixé est alors mis en évidence par addition de
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ce est lue à 492 nm dans un lecteur automatique (Dynatech AM 120).
5.Clonage et Identification.
Les cellules des puits positifs dans l'immuno essai caracté-
<EMI ID=28.1>
gées dans le milieu approprié puis clonées en agar mou. Les lignées qui secrètent des Ig ont été reclonées et retestées dans l' immunoessai. Ce protocole a permis de récupérer 15 hybridomes distincts secrétant des anticorps monoclonaux dirigésd contre l'AT III, 23 hybridomes distincts secrétant des anticorps
<EMI ID=29.1> lement dans des souris (syngéniques ou FI progeny) qui ont été préalablement traitées au pristane.
7.Purification des anticorps monoclonaux au départ de liquide ascitique.
Le procédé décrit par Staehelin, T., Mobbs, D.S., Hsiang-Fu, K., Chun-yen, L. and Pestka, S., 1981, J.Biol. Chem. 256, 9750, a été suivi dans sa totalité si ce n'est que la DEAE a été remplacée par la DEAE Affi-gel Blue (Biorad) pour éliminer les protéases. Toutes les opérations se font à 4[deg.]C. Les fractions d'anticorps monoclonaux sont recueillies, précipitées deux fois au sulfate de
<EMI ID=30.1>
pH 8,5.
8.Caractéristiques des anticorps monoclonaux.
a)anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III.
La classe d'Ig à laquelle appartiennent les 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble fut déterminée par test d'Ouchterlony sur le surnageant de culture des cellules. 8 anticorps monoclo-
<EMI ID=31.1>
Table 1
<EMI ID=32.1>
(1) Rapport AC 1 où AC 1 et AC 2 représentent les concentra-
AC 2
tions en anticorps donnant une même densité optique en ELISA sur des phases solides préparées avec des solutions contenant respec-
<EMI ID=33.1>
n'ont qu'une valeur qualitative.
(2) Densité optique en ELISA avec du surnageant de culture non dilué.
Pour tous les 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III, les chaînes légères sont de type K.
En outre, l'affinité relative des 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble a été déterminée par un test ELISA sur phases solides
<EMI ID=34.1>
et 6,0�g/ml d'antithrombine III (table 1).
D'autre part, la spécificité des 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble a été évaluée dans un système ELISA en phase solide ou on mesure la compétition entre l'antigène AT III et des protéines
<EMI ID=35.1>
plasmine (table 1).
On a aussi déterminé la spécificité d'épitope
des 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble dans des expériences de compétition entre chaque anticorps monoclonal(marqué à la methionine 35S et les 14 autres anticorps monoclonaux de l'ensemble pour la fixation sur l'antigène AT III immobilisé en phase solide. Ces expériences ont mis en évidence l'existence de sept groupes d'anticorps monoclonaux caractérisés par leur spécificité d'épitope
(table 2).
Table 2
Spécificité d'épitope des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antithrombine III humaine.
<EMI ID=36.1>
On a aussi déterminé l'effet des anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III sur l'activité enzymatique de l'antithrombine III en utilisant un test indirect qui consiste à mesurer l'activité neutralisante de l'antithrombine III, en présence et en absence d'héparine, vis à vis de l'activité enzymatique de la thrombine. Cet essai repose sur l'emploi d'un substrat chromogénique de la thrombine (Chromozym TH, Boehringer). On a montré que six anticorps monoclonaux de l'ensemble inhibent l'activité enzymatique de l'antithrombine III, en présence ou en absence de l'héparine qui est un accélérateur de l'activité enzymatique de l'AT III (table
3).
Table 3
Inhibition de l'activité enzymatique de l'antithrombine III par les anticorps monoclonaux
<EMI ID=37.1>
Effet des anticorps monoclonaux sur l'activité enzymatique de l'AT III; l'AT III fut incubée en présence des anticorps monoclonaux puis mise en contact avec la thrombine en présence ou en absence d'héparine. L'activité résiduelle de la thrombine fut mesurée par le substrat chomogénique (chromozym TH).
Table 4
Anticorps monoclonaux dirigés contre 1�2-antiplasmine
<EMI ID=38.1>
(1) Rapport AC 1 où AC 1 et AC 2 représentent les concentra-
AC 2
tions en anticorps donnant une même densité optique en ELISA sur des phases solides préparées avec des solutions contenant respec-
<EMI ID=39.1>
n'ont qu'une valeur qualitative.
(2) Densité optique en ELISA avec du surnageant non dilué.
<EMI ID=40.1>
nent à la classe IgGl et 9 anticorps à la classe IgG2. (table 4). Pour tous les anticorps monoclonaux de l'ensemble, les chaînes
<EMI ID=41.1>
des anticorps monoclonaux de l'ensemble ont été déterminées par un test Elisa indirect, utilisant des matrices solides recouvertes de
<EMI ID=42.1>
On a aussi déterminé la spécificité d'épitope des anticorps monoclonaux de l'ensemble en réalisant des expériences de compétition entre chaque anticorps marqué et chacun des autres anticorps
<EMI ID=43.1>
tiplasmine fixé sur support solide. Ces expériences ont mis en évidence l'existence de 11 groupes d'anticorps monoclonaux caractérisés par leur spécificité d'épitope (table 5).
Table 5
Spécificité d'épitope des anticorps monoclonaux dirigés
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
Le test d'Ouchterlohy a montré que tous les 26 anticorps monoclonaux de l'ensemble, ont une structure de type IgGl (table 6). En outre, l'emploi d'un test Elisa en phase solide où l'on mesure la fixation de chaque anticorps monoclonal sur l'antigène
<EMI ID=47.1>
et 1,2 �g/ml) a permis de mesurer l'affinité relative de chacun des anticorps monoclonaux de l'ensemble (table 6). On a aussi déterminé la spécificité des anticorps monoclonaux de l'ensemble en réalisant des expériences où l'on mesure la fixation de ces anti-
<EMI ID=48.1>
On a montré dans un test Elisa en phase solide (dont le principe est décrit dans.le Brevet belge n[deg.]89596l) que les 26 anti-
<EMI ID=49.1>
naissent cette protéine de manière spécifique et de façon comparable quelle que soit l'origine de l'�l-antitrypsine humaine, qu'elle provienne de plasma humain ou d'extraits de micro-organismes exprimant l'information génétique correspondant à l'�l-antitrypsine (table 7).
Table 6
Anticorps monoclonaux dirigés contre 1�1-antitrypsine
humaine.
<EMI ID=50.1>
(1) Rapport AC 1 où AC 1 et AC 2 représentent les concentra-
AC 2
tions en anticorps donnant une même densité optique en ELISA sur des phases solides préparées avec des solutions contenant respec-
<EMI ID=51.1>
n'ont qu'une valeur qualificative.
(2) Densité optique obtenue en ELISA avec du surnageant non dilué
Table 7
Identification à l'aide d'anticorps monoclonaux de
<EMI ID=52.1>
bactériens.
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REVENDICATIONS
1) Ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang, caractérisés en ce que ces ensembles contiennent 15 anticorps monoclonaux dirigés contre l'antithrombine III humaine, 23 anticorps monoclonaux dirigés
<EMI ID=54.1>
2) Procédé pour produire ces ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la
"Sets of monoclonal antibodies directed against human proteins involved in blood clotting and fibrinolysis" Set of monoclonal antibodies directed against human proteins involved in blood clotting and fibrinolysis.
The present invention relates to sets of monoclonal antibodies directed against each of the following three human proteins.
<EMI ID = 1.1>
psine. These three proteins are involved in fibrinolysis and / or blood clotting.
Antithrombin III (AT III) is an Mw glycoprotein
58,000 daltons (425 amino acids), synthesized in the liver and present in the plasma (half-life: 2.7 days). In many circumstances, the level of AT III in the blood can decrease, leading to serious medical conditions. AT III deficiency is often associated with liver problems, generalized appearance of micro-clots in the circulatory system (disseminated intravascular coagulation), proteinuria and acute leukemia. In addition, after surgical intervention, a reduced level of AT III often accompanies a thrombotic state. The level of AT III therefore constitutes an effective indicator of disorders of the coagulation and fibrinolysis processes.
In addition to the various environmental conditions which can affect the level of antithrombin III, there are cases of hereditary impairment at relatively high frequency (from 1 to 2.5 per thousand). Currently, part of the problems associated with a reduced level of antithrombin III can be overcome by the administration of plasma enriched with this enzyme.
In this regard, the availability of an antithrombin III assay system in biological fluids, based on the use of monoclonal antibodies directed against it, facilitates the early detection of disorders of the coagulation and fibrinolysis processes. In addition, the development of a simple system for purifying antithrombin III from plasma or any other appropriate source using the set of monoclonal antibodies directed against human AT III would allow clinical trials. of AT III as a therapeutic agent.
<EMI ID = 2.1> of plasma of Mw 65,000 daltons whose inherited deficiency
<EMI ID = 3.1>
rapidly complexing the circulating plasmin and blocking its proteolytic activities.
The development of simple dosing and purification systems
<EMI ID = 4.1>
monoclonals directed against it could lead to the early detection of fibrinolytic disorders and the therapeutic use of
<EMI ID = 5.1>
my blood is synthesized in the liver and secreted in the plasma where its half-life is 6 days. This enzyme basically works as an inhibitor of proteolytic enzymes. Target
<EMI ID = 6.1>
for plasmin and thrombin; this is where its role is located in the fibrinolysis process. In addition, the hereditary deficiency in this enzyme, a fairly frequent phenomenon, is accompanied by disorders of early degeneration of the lung and, in some cases, liver disorders. It seems that genetic and environmental factors together contribute to the onset of health problems.
If for genetic or other reasons, the level of l-antitrypsin in the plasma falls below a certain threshold, serious pulmonary disorders are declared. The loss of elasticity in the lungs leads to irreversible damage, characteristic of emphysema. One of the main causes of emphysema has its origin in smoking; exposure of the lungs to tobacco smoke induces increased proteolytic activity in the macrophages of the pulmonary alveoli and the concentration of elastase-rich leukocytes increases in these. These two phenomena lead
<EMI ID = 7.1>
smoking results from an imbalance between protease and anti-prote-ase.
Understanding the pathogenesis of pulmonary disorders provides the basis for new concepts such as, for example, anti-protease replacement therapy. Such a path presupposes no-
<EMI ID = 8.1>
one could administer to emphysematosus.
In this respect, the development of simple systems for the determination and purification of l-antitrypsin based on the use of all the monoclonal antibodies directed against it leads to the detection of disorders linked to deficiency in this enzyme and
<EMI ID = 9.1>
In the context of the invention, sets of monoclonal antibodies have been found, directed respectively against antithrombin-
<EMI ID = 10.1>
Because of the diversity of antibodies that compose them, they can be used as a diagnostic agent and constitute a means of achieving the objectives of assay and purification of the three proteins mentioned above.
The invention relates to three distinct sets of monoclonal antibodies directed against human proteins involved in blood clotting and fibrinolysis. These sets contain 15 monoclonal antibodies directed against antitrombin III,
<EMI ID = 11.1>
By "set" is meant all of the antibodies which constitute it.
According to a particular aspect of the invention, the monoclonal antibodies of each set are secreted by different hybridomas.
In the context of the invention, it has also been shown that various monoclonal antibodies, within each set, are not mutually inhibiting, that is to say bind together either to AT
<EMI ID = 12.1>
In addition, it has been shown that each set consists of groups of monoclonal antibodies whose elements recognize different antigenic determinants (epitopes) either of AT III, or of 1-2-AP, or the � l-AT.
According to the present invention, the set of monoclonal antibodies directed against AT III contains 15 monoclonal antibodies divided into 7 groups of antibodies whose epitope specificity is different and comprises six monoclonal antibodies which inhibit the enzymatic activity of the Human AT III.
This set contains 8 antibodies which have an IgG1 structure and 7 antibodies which have an IgG2 structure. All
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fall into 7 groups of antibodies with different epitope specificities.
Another characteristic of the AT III set, according to the invention, is that six antibodies inhibit the enzymatic activity of human anthitrombin III.
<EMI ID = 14.1>
human, contains 23 monoclonal antibodies divided into 11 antibody groups with different epitope specificity. 14 antibodies are of IgGlet structure 9 antibodies are of IgG2 structure.
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microorganisms carrying the genetic information corresponding to this protein. The 26 monoclonal antibodies in this set recognize human o-antitrypsin.
The preparation of the monoclonal antibodies is carried out according to a cell fusion technology, derived from that published by
<EMI ID = 16.1>
According to the present invention, the method for producing the sets of monoclonal antibodies directed against human proteins involved in blood coagulation and fibrinolysis
/ is characterized by cell fusion of mouse cells,
a selected subclone of SP 2/0-Ag 14 with cells from
<EMI ID = 17.1>
either with 1-AT, by the selection of antibody-secreting hybridomas, by the cloning of these latter hybridomas, by their production in culture or in ascites, by the identification of the antibodies secreted by these clones and by the characterization of the immunoglobulin classes of these antibodies, their relative affinity
and their specificity.
To better understand the process, which is the subject of the present invention, the following nonlimiting example describes the preparation of the three sets of monoclonal antibodies mentioned above.
1.Mice myeloma cells.
Mouse myeloma cells with the following properties were selected: rapid growth in vivo and in vitro, ability to be cloned without the support of feeder cells and in semi-solid medium, ability to fuse at high rate. This line was developed by Shulamn, M; Wilde, C.D
and Koller, G (1978) Nature 276,269-270.
For this purpose, the myeloma cells SP 2/0-AG 14 were cloned into agar. The cells capable of growing under these conditions were then recloned into agar and then injected intraperitoneally into syngeneic mice. After one to two weeks, the myeloma cells develop as a tumor in the injected mice. The cells are then collected in the peritoneal cavity, reselected, recloned in agar and tested in a cell fusion experiment. The cycle described above is repeated 3 times. At the end of the process,
we obtain selected subclones of the myeloma line
SP 2/0-Agl4 having the properties desired for their subsequent cell fusion according to the claimed process. Found in Franssen, J.D .; Hérion, P and Urbain, J. (1981, Proc. XXIX Colloquium
on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed.) details of the method applied.
2.Mouse immunization.
The antigens used were obtained as follows. Anti-thrombin III was purified by the method of MACKAY, E.J., Thrombosis Research, 21, 1981, 375-382 from a pool of citrated plasma.
The � 2-pure antiplasmin was supplied by Dr D. COLLEN from the Katolieke Universiteit Leuven.
� l-Antitrypsin was purified by the method of Mahoney, W.C .; Kurachi, K. and Hermodson, M.A. Eur. J. Biochem, 105,545-542, -
1980 from a citrated plasma pool.
These various purified preparations were used to immunize female mice (Balb / c, A / J and AKR strains) 8 weeks old.
<EMI ID = 18.1>
into the complete Freund's adjuvant and the mixture is injected subcutaneously and intraperitoneally. Three weeks later, the mice received a booster injection, 100 µg of antigen in Freund's incomplete adjuvant, intraperitoneally. After a resting period of 6 weeks, the mice receive at
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0.15 M NaCl) intraperitoneally and subcutaneously.
On day zero, the mice are sacrificed and the spleen is removed for the preparation of cells intended for cell fusions.
3. Cell mergers.
The following materials and media are used to perform the mergers. DMEM medium is obtained from GIBCO, which is supplemented with horse serum (10%), calf serum (5%), non-essential amino acids, sodium pyruvate (lmM),
<EMI ID = 20.1>
The complete selection medium (HAT) consists of the medium described above as well as hypoxanthine (10-4 M), aminopterin
<EMI ID = 21.1>
The agar content (1.5%) contains the ingredients described above. The cells are cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere of 5% CO 2 and 95% air.
Fusion with cells from a mouse myeloma cell line (selected subclones SP2 / 0 - Ag 14) is carried out according to the method of Franssen, J.D., Herion, P.and Urbain J.-1981-Proc. XXIX Colloquium on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed.
<EMI ID = 22.1>
SP2 / 0-Ag 14. For each fusion, the fused cells are distributed in 96-well microculture plates, making 10-fold dilutions. The cultures are fed on day 5,8,11 and 13 after the fusion by replacing half of the medium in the well with fresh medium. On day 15 after the merger, 50
<EMI ID = 23.1>
in 0.15M NaCl buffer, 0.02 M PH5 acetate are incubated in wells of 96-well PVC LINBRO plates overnight at 4 [deg.] C. The remaining absorption sites are then blocked by incu-
<EMI ID = 24.1>
val and 1% bovine albumin. The plates are then washed several times with PBS buffer, then the culture supernatants or dilutions of antise um μm of mice are reacted with the adsorbed antigen, overnight at 4 [deg.] C.
The attached antibodies are then revealed by one of the following two procedures:
a) Fabs of goat anti-immunoglobulin antibodies of <EMI ID = 25.1>
overnight in the wells which are then washed, dried and counted in a scintillation counter - (b) goat anti-mouse immunoglobulin immunoglobulin labeled with peroxidase (O'Sullivan, MJ and Marks, V., Me- <EMI ID = 26.1>
PBS 7.5 buffer containing 10% horse serum, 1% bovine albumin and 0.1% tween 80 are incubated for 4 hours at room temperature in the wells which are then washed several times. The fixed confused enzyme is then highlighted by adding
<EMI ID = 27.1>
it is read at 492 nm in an automatic reader (Dynatech AM 120).
5.Cloning and Identification.
Cells from positive wells in the immunoassay character-
<EMI ID = 28.1>
aged in the appropriate medium and then cloned in soft agar. The lines which secrete Ig were recloned and retested in the immunoassay. This protocol made it possible to recover 15 distinct hybridomas secreting monoclonal antibodies directed against AT III, 23 distinct hybridomas secreting antibodies
<EMI ID = 29.1> also in mice (syngeneic or FI progeny) which have been previously treated with pristane.
7.Purification of monoclonal antibodies from ascites fluid.
The method described by Staehelin, T., Mobbs, D.S., Hsiang-Fu, K., Chun-yen, L. and Pestka, S., 1981, J. Biol. Chem. 256, 9750, was followed in its entirety except that DEAE was replaced by DEAE Affi-gel Blue (Biorad) to eliminate the proteases. All operations are done at 4 [deg.] C. The monoclonal antibody fractions are collected, precipitated twice with sulphate
<EMI ID = 30.1>
pH 8.5.
8.Characteristics of monoclonal antibodies.
a) monoclonal antibodies directed against AT III.
The Ig class to which the 15 monoclonal antibodies belong was determined by an Ouchterlony test on the cell culture supernatant. 8 monoclonal antibodies
<EMI ID = 31.1>
Table 1
<EMI ID = 32.1>
(1) Report AC 1 where AC 1 and AC 2 represent the concentra-
AC 2
antibodies giving the same optical density in ELISA on solid phases prepared with solutions containing respec-
<EMI ID = 33.1>
have only a qualitative value.
(2) Optical density in ELISA with undiluted culture supernatant.
For all 15 monoclonal antibodies of all the monoclonal antibodies directed against AT III, the light chains are of type K.
In addition, the relative affinity of the 15 monoclonal antibodies in the set was determined by an ELISA test on solid phases.
<EMI ID = 34.1>
and 6.0 g g / ml antithrombin III (Table 1).
On the other hand, the specificity of the 15 monoclonal antibodies of the set was evaluated in an ELISA system in solid phase where the competition between the antigen AT III and proteins is measured.
<EMI ID = 35.1>
plasmin (table 1).
We also determined the specificity of an epitope
of the 15 monoclonal antibodies of the set in competition experiments between each monoclonal antibody (labeled with methionine 35S and the 14 other monoclonal antibodies of the set for binding to the AT III antigen immobilized in solid phase. These experiments were highlighted the existence of seven groups of monoclonal antibodies characterized by their epitope specificity
(table 2).
Table 2
Epitope specificity of monoclonal antibodies directed against human antithrombin III.
<EMI ID = 36.1>
The effect of monoclonal antibodies directed against AT III on the enzymatic activity of antithrombin III was also determined by using an indirect test which consists in measuring the neutralizing activity of antithrombin III, in the presence and in the absence of heparin, with respect to the enzymatic activity of thrombin. This test is based on the use of a chromogenic substrate for thrombin (Chromozym TH, Boehringer). We have shown that six monoclonal antibodies in the set inhibit the enzymatic activity of antithrombin III, in the presence or absence of heparin which is an accelerator of the enzymatic activity of AT III (table
3).
Table 3
Inhibition of the enzymatic activity of antithrombin III by monoclonal antibodies
<EMI ID = 37.1>
Effect of monoclonal antibodies on the enzymatic activity of AT III; AT III was incubated in the presence of monoclonal antibodies and then brought into contact with thrombin in the presence or absence of heparin. The residual activity of thrombin was measured by the chomogenic substrate (chromozym TH).
Table 4
Monoclonal antibodies to 1 2 2-antiplasmin
<EMI ID = 38.1>
(1) Report AC 1 where AC 1 and AC 2 represent the concentra-
AC 2
antibodies giving the same optical density in ELISA on solid phases prepared with solutions containing respec-
<EMI ID = 39.1>
have only a qualitative value.
(2) Optical density in ELISA with undiluted supernatant.
<EMI ID = 40.1>
are of the IgGl class and 9 antibodies of the IgG2 class. (table 4). For all the monoclonal antibodies in the set, the chains
<EMI ID = 41.1>
monoclonal antibodies of the set were determined by an indirect Elisa test, using solid matrices covered with
<EMI ID = 42.1>
The epitope specificity of the monoclonal antibodies of the set was also determined by carrying out competition experiments between each labeled antibody and each of the other antibodies.
<EMI ID = 43.1>
tiplasmin fixed on a solid support. These experiments demonstrated the existence of 11 groups of monoclonal antibodies characterized by their epitope specificity (table 5).
Table 5
Epitope specificity of directed monoclonal antibodies
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
<EMI ID = 46.1>
The Ouchterlohy test showed that all of the 26 monoclonal antibodies in the set have an IgG1-like structure (Table 6). In addition, the use of an Elisa solid phase test in which the binding of each monoclonal antibody to the antigen is measured.
<EMI ID = 47.1>
and 1.2 (g / ml) made it possible to measure the relative affinity of each of the monoclonal antibodies of the set (table 6). The specificity of the monoclonal antibodies of the set was also determined by carrying out experiments in which the binding of these anti-
<EMI ID = 48.1>
It has been shown in an Elisa test in solid phase (the principle of which is described in. Belgian Patent n [deg.] 89596l) that the 26 anti
<EMI ID = 49.1>
This protein is born in a specific and comparable way whatever the origin of human l-antitrypsin, whether it comes from human plasma or from extracts of microorganisms expressing the genetic information corresponding to � l-Antitrypsin (Table 7).
Table 6
Monoclonal antibodies to 1 1 1-antitrypsin
human.
<EMI ID = 50.1>
(1) Report AC 1 where AC 1 and AC 2 represent the concentra-
AC 2
antibodies giving the same optical density in ELISA on solid phases prepared with solutions containing respec-
<EMI ID = 51.1>
have only a qualifying value.
(2) Optical density obtained by ELISA with undiluted supernatant
Table 7
Identification using monoclonal antibodies
<EMI ID = 52.1>
bacteria.
<EMI ID = 53.1>
CLAIMS
1) Sets of monoclonal antibodies directed against human proteins involved in blood clotting and fibrinolysis, characterized in that these sets contain 15 monoclonal antibodies directed against human antithrombin III, 23 monoclonal antibodies directed
<EMI ID = 54.1>
2) Process for producing these sets of monoclonal antibodies directed against human proteins involved in the