"PROCEDE POUR PRODUIRE EN UNE SEULE FUSION
CELLULAIRE PLUSIEURS ANTICORPS MONOCLONAUX
DE RAT ANTI-CALLA"
PROCEDE POUR PRODUIRE EN UNE SEULE FUSION CELLULAIRE PLU-SIEURS ANTICORPS MONOCLONAUX DE RAT ANTI-CALLA
La présente invention concerne un procédé pour obtenir des anticorps monoclonaux de rat anti-CALLA. Le CALLA ou Common Acute Lymphoblastic Leukaemia Antigen
(Greaves et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 4,67,1975)
est un antigène de différenciation des cellules lymphoïdes humaines.
<EMI ID=1.1>
Milstein en 1975 (Nature, 256,495,1975) d'obtenir des anticorps monoclonaux de souris par la fusion de cellules de myélome de souris et de cellules de rate de souris, préalablement immunisée avec un antigène.
Il est également connu depuis la publication de Ritz et al. en 1980 (Nature, 284,583,1980) d'obtenir des anticorps monoclonaux de souris anti-CALLA. Les inconvénients des hybridomes de souris anti-CALLA résident dans l'obtention de modestes quantités d'ascites, en général inférieures à 5 ml par animal. Cette faible rentabilité entraîne un coût élevé de production.
Il est connu depuis la publication de Galfré et al. en 1979 (Nature, 277,131, 1979) d'obtenir des anticorps monoclonaux de rat par la fusion de cellules de rate de rat préalablement immunisé avec des IgG de souris. Les hybridomes de rat ont l'avantage de fournir 20 à 40 ml d'ascite par animal, ce qui réduirait environ de moitié le coût de production.
La présente invention permet d'obtenir par fusion de cellules de myélome de rat et de cellules de rate de rat préalablement immunisé avec des cellules leucémiques humaines, des anticorps monoclonaux de rat anti-CALLA. De tels anticorps monoclonaux n'ont jamais été obtenus jusqu'à présent. De plus, il est possible d'obtenir en une seule fusion quatre anticorps monoclonaux de rat antiCALLA. Ils seront désignés dans la présente invention par AL2,AL3,AL4 et AL5.
La présente invention a pour objet de produireplusieurs anticorps monoclonaux de rat anti-CALLA en une seule fusion cellulaire.
Suivant la présente invention, le procédé est caractésé par la fusion cellulaire d'une lignée de myélome de rat Louvain et ce cellules de rate provenant d'un rat Louvain préalablement immunisé avec des cellules d'un patient leucémique, par la sélection et l'isolement des cellules hybrides obtenues, par le développement des clones hybrides sélectionnés sur rat Louvain et par l'extraction des anticorps monoclonaux de l'ascite et ces animaux.
Suivant la présente invention, la lignée de myélome de rat Louvain est déficiente en Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transférase (HGPRT) et non-sécrétrice d'immunoglobulines. Elle ne pollue donc pas le milieu par la sécrétion d'immunoglobulines non-anticorps. Elle a, en outre, un bon coefficient d'hybridation cellulaire, comme illustré plus loin dans l'exemple.
Suivant la présente invention, les cellules de rate proviennent de rats Louvain immunisés avec des cellules vivantes, isolées du sang d'un patient atteint de leucémie aiguë et cryopréservées dans l'azote liquide. Lesdites cellules ont beaucoup plus de CALLA que les lignées cellulaires CALLA positives utilisées par ceux qui ont obtenu des anticorps monoclonaux de souris anti-CALLA.
Suivant la présente invention, les cellules de rate proviennent de rats Louvain, préalablement immunisés avec des doses d'au moins 10 millions de cellules leucémiques humaines�par injection intra-péritonéale, ces cellules étant prélevés chez un patient leucémique et cryopréservées dans l'azote liquide. Ces doses sont plus élevées que celles utilisées en général chez la souris et sont indispensables pour réaliser une stimulation immunitaire adéquate de la rate de rat.
Suivant une réalisation préférentielle les cellules de rate proviennent de rats Louvain immunisés par des injections étalées sur au moins 4 mois. Ce type de schéma diffère de ceux de 4-5 jours à 4-5 semaines qui ont été utilisés pour l'obtention d'anticorps monoclonaux de souris anti-CALLA. Ce schéma d'immunisation appliqué permet l'obtention, en 1 seule fusion, de plusieurs anticorps monoclonaux distincts reconnaissant tous le CALLA. Il a été constaté que nous en obtenions uniquement 4 (AL2,AL3,AL4,AL5).
Suivant la présente invention, la sélection et l'isolement des cellules hybrides s'effectuent par clonage sur des sous-couches de cellules péritonéales de rat. Comme les sous-couches de thymocytes irradiés, ces dernières facilitent la croissance des hybrides à des dilutions cellulaires extrêmes.
Le développement des clones hybrides sélectionnés se fait sur rats LOUVAIN syngéniques, ou sur des hybrides de rats LOUVAIN et d'une autre souche de rat. Les méthodes utilisées sont connues et sont, par exemple, celles utilisées par H. Bazin et coll. pour développer in vivo les myélomes de rat (Int.J.Cancer, 10,568, 1972).
Les 4 anticorps monoclonaux de rat obtenus suivant les procédés de la présente invention reconnaissent tous l'antigène membranaire des cellules lymphoïdes humaines appelé CALLA (gp 100). Les études de distribution cellulaire, d'immunoprécipitation membranaire et de liaison compétitive effectuées simultanément avec le premier anticorps monoclonal de souris anti-CALLA décrit par Ritz en
1980 (Nature, 284,583,1980) et avec les 4 anticorps monoclonaux de rat AL2,AL3,AL4 et AL5 ont démontré que ces derniers reconnaissaient bien le CALLA.
Les procédés faisant l'objet de la présente invention ont l'avantage de produire, en une seule fusion, quatre hybrides distincts sécrétant quatre anticorps monoclonaux anti-CALLA. Ce résultat est unique à notre connaissance.
Les anticorps monoclonaux anti-CALLA sont d'une très grande utilité diagnostique en onco-hématologie. Ils ont en outre un potentiel thérapeutique intéressant dans le cadre des autogreffes de moelle osseuse dans les leucémies lymphoblastiques aiguës.
La présente invention sera mieux comprise par l'exemple non limitatif décrit ci-après.
Un rat LOUVAIN est immunisé aux semaines 0 et 4 par l'injection intra-péritonéale de 10 millions de cellules provenant d'un patient leucémique et cryopréservées dans l'azote liquide. Une dernière injection intra-péritonéale de 50 millions de telles cellules est faite 15 semaines plus tard. Le rat est sacrifié quatre jours après la dernière injection et ses cellules de rate sont fusion-
<EMI ID=2.1>
des cellules de myélome de rat du type IR983F (Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 131D,359,1980). Le mélange de cellules fusionnées est suspendu en milieu sélectif HAT de Littlefield, et ensemencé à 105 cellules/ puits de 0.2 ml en plaques microtitres préalablement garnies de cellules péritonéales de rat. Les premiers clones hybrides sont visibles dès le sixième jour après la fusion. La présence d'anticorps spécifiques dans les surnageants de culture est évaluée par immunofluorescence indirecte sur les cellules leucémiques utilisées comme cibles d'immunisation. Lors de l'évaluation de la fusion au 16ème jour,
58.6% des puits ensemencés contenaient des clones hybrides, et 10.5% des puits ensemencés contenaient des hybrides sécrétant des anticorps se liant nettement aux cellules-cibles leucémiques.
Les cellules des puits avec anticorps spécifiques ont été dévelopées en culture. La plupart des hybrides sécrétant un anticorps spécifique ont été cryopréservés dans l'azote liquide. Quelques-uns ont pu être développés immédiatement sur rat LOUVAIN. Ces hybrides ont été développés sous forme de tumeur ascitique sur rats LOUVAIN et clonés plusieurs fois par dilution limite. Des tests de spécificité cellulaire nous ont permis de repérer 4 anticorps spécifiques anti-CALLA du type AL2,AL3,AL4 et AL5. Leur spécificité anti-CALLA a été démontrée par l'immunoprécipitation d'extraits membranaires préalablement marqués avec un isotope radioactif et par des tests de liaison compétitive avec l'anticorps monoclonal de souris anti-CALLA J5 (Ritz, Nature, 284,
583,1980).
REVENDICATIONS
1. Procédé pour produire en une seule fusion cellulaire plusieurs anticorps monoclonaux de rat anti-CALLA caractérisé par la fusion cellulaire d'une lignée de myélome de rat Louvain et de cellules de rate provenant d'un rat Louvain immunisé avec des cellules d'un patient leucémique, par la sélection et l'isolement des cellules hybrides obtenues, par le développement des clones hybrides sélectionnés sur rat Louvain et par l'extraction des anticorps monoclonaux de l'ascite de ces animaux.
2. Procédé pour produire en une seule fusion cellulaire plusieurs anticorps monoclonaux de rat anti-CALLA suivant
"PROCESS FOR PRODUCING IN A SINGLE FUSION
CELLULAR MULTIPLE MONOCLONAL ANTIBODIES
ANTI-CALLA RAT "
PROCESS FOR PRODUCING IN A SINGLE CELL FUSION MULTIPLE MONOCLONAL ANTIBODY RAT ANTIBODIES
The present invention relates to a method for obtaining anti-CALLA rat monoclonal antibodies. CALLA or Common Acute Lymphoblastic Leukaemia Antigen
(Greaves et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 4,67,1975)
is a differentiating antigen of human lymphoid cells.
<EMI ID = 1.1>
Milstein in 1975 (Nature, 256,495,1975) obtain mouse monoclonal antibodies by the fusion of mouse myeloma cells and mouse spleen cells, previously immunized with an antigen.
It has also been known since the publication of Ritz et al. in 1980 (Nature, 284,583,1980) to obtain anti-CALLA mouse monoclonal antibodies. The drawbacks of anti-CALLA mouse hybridomas lie in obtaining modest amounts of ascites, generally less than 5 ml per animal. This low profitability leads to a high production cost.
It has been known since the publication of Galfré et al. in 1979 (Nature, 277, 131, 1979) to obtain monoclonal rat antibodies by the fusion of rat spleen cells previously immunized with mouse IgG. Rat hybridomas have the advantage of providing 20 to 40 ml of ascites per animal, which would reduce production costs by about half.
The present invention makes it possible to obtain, by fusion of rat myeloma cells and rat spleen cells previously immunized with human leukemia cells, anti-CALLA rat monoclonal antibodies. Such monoclonal antibodies have never been obtained so far. In addition, four antiCALLA rat monoclonal antibodies can be obtained in a single fusion. They will be designated in the present invention by AL2, AL3, AL4 and AL5.
The object of the present invention is to produce several anti-CALLA rat monoclonal antibodies in a single cell fusion.
According to the present invention, the method is characterized by the cell fusion of a Leuven rat myeloma line and this spleen cells originating from a Leuven rat previously immunized with cells of a leukemia patient, by selection and isolation of the hybrid cells obtained, by the development of the hybrid clones selected from Louvain rats and by the extraction of monoclonal antibodies from ascites and these animals.
According to the present invention, the Louvain rat myeloma line is deficient in Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase (HGPRT) and non-secretory of immunoglobulins. It therefore does not pollute the environment by the secretion of non-antibody immunoglobulins. It also has a good coefficient of cell hybridization, as illustrated later in the example.
According to the present invention, the spleen cells come from Louvain rats immunized with living cells, isolated from the blood of a patient suffering from acute leukemia and cryopreserved in liquid nitrogen. Said cells have much more CALLA than the positive CALLA cell lines used by those who have obtained anti-CALLA mouse monoclonal antibodies.
According to the present invention, the spleen cells come from Louvain rats, previously immunized with doses of at least 10 million human leukemia cells by intraperitoneal injection, these cells being taken from a leukemia patient and cryopreserved in the 'liquid nitrogen. These doses are higher than those generally used in mice and are essential for achieving adequate immune stimulation of the rat spleen.
According to a preferred embodiment, the spleen cells come from Louvain rats immunized by injections spread over at least 4 months. This type of scheme differs from those of 4-5 days to 4-5 weeks which were used to obtain monoclonal antibodies from anti-CALLA mice. This applied immunization scheme makes it possible to obtain, in a single fusion, several distinct monoclonal antibodies all recognizing CALLA. It has been found that we only get 4 (AL2, AL3, AL4, AL5).
According to the present invention, the selection and isolation of the hybrid cells is carried out by cloning on sublayers of rat peritoneal cells. Like the underlayers of irradiated thymocytes, the latter facilitate the growth of hybrids at extreme cellular dilutions.
The development of the selected hybrid clones is done on syngeneic LOUVAIN rats, or on hybrids of LOUVAIN rats and another rat strain. The methods used are known and are, for example, those used by H. Bazin et al. to develop rat myelomas in vivo (Int.J. Cancer, 10,568, 1972).
The 4 rat monoclonal antibodies obtained according to the methods of the present invention all recognize the membrane antigen of human lymphoid cells called CALLA (gp 100). Cell distribution, membrane immunoprecipitation and competitive binding studies carried out simultaneously with the first anti-CALLA mouse monoclonal antibody described by Ritz in
1980 (Nature, 284,583,1980) and with the 4 rat monoclonal antibodies AL2, AL3, AL4 and AL5 demonstrated that the latter recognized CALLA well.
The methods which are the subject of the present invention have the advantage of producing, in a single fusion, four distinct hybrids secreting four anti-CALLA monoclonal antibodies. This result is unique to our knowledge.
The anti-CALLA monoclonal antibodies are of great diagnostic utility in onco-hematology. They also have an interesting therapeutic potential in the context of bone marrow autografts in acute lymphoblastic leukemias.
The present invention will be better understood by the nonlimiting example described below.
A LEUVEN rat is immunized at weeks 0 and 4 by the intraperitoneal injection of 10 million cells from a leukemia patient and cryopreserved in liquid nitrogen. A final intraperitoneal injection of 50 million such cells is made 15 weeks later. The rat is sacrificed four days after the last injection and its spleen cells are fused-
<EMI ID = 2.1>
rat myeloma cells of the IR983F type (Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 131D, 359,1980). The mixture of fused cells is suspended in HAT selective medium from Littlefield, and inoculated with 105 cells / well of 0.2 ml in microtiter plates previously filled with rat peritoneal cells. The first hybrid clones are visible from the sixth day after the fusion. The presence of specific antibodies in the culture supernatants is evaluated by indirect immunofluorescence on the leukemia cells used as immunization targets. When evaluating the merger on the 16th day,
58.6% of the seeded wells contained hybrid clones, and 10.5% of the seeded wells contained hybrids secreting antibodies clearly binding to leukemia target cells.
Well cells with specific antibodies were grown in culture. Most hybrids secreting a specific antibody have been cryopreserved in liquid nitrogen. Some were able to be developed immediately on LOUVAIN rats. These hybrids were developed as an ascites tumor in LOUVAIN rats and cloned several times by limiting dilution. Cell specificity tests enabled us to identify 4 specific anti-CALLA antibodies of the AL2, AL3, AL4 and AL5 type. Their anti-CALLA specificity has been demonstrated by immunoprecipitation of membrane extracts previously labeled with a radioactive isotope and by competitive binding tests with the anti-CALLA J5 mouse monoclonal antibody (Ritz, Nature, 284,
583.1980).
CLAIMS
1. Method for producing, in a single cell fusion, several monoclonal anti-CALLA rat antibodies characterized by the cell fusion of a line of Leuven rat myeloma and spleen cells originating from a Leuven rat immunized with cells of a leukemic patient, by the selection and isolation of the hybrid cells obtained, by the development of the hybrid clones selected on Louvain rats and by the extraction of monoclonal antibodies from the ascites of these animals.
2. Method for producing in a single cell fusion several monoclonal anti-CALLA rat antibodies according to