Acide désoxyribonucléique insolubilisé-
La présente invention concerne des épreuves par immunofluorescence et plus particulièrement une épreuve par immunofluorescence indirecte en phase solide pour la mise en
<EMI ID=1.1>
ribonucléique natif.
On connaît depuis plus de 10 ans l'utilisation
de l'albumine de sérum de boeuf méthylée comme véhicule pour acide nucléique à des fins d'immunisation /Plescia et al,
<EMI ID=2.1> <EMI ID=3.1>
principale de ces chercheurs était de produire des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique dénaturé (en hélice
<EMI ID=4.1>
mine de sérum de boeuf méthylée insolubles de plus petit poids moléculaire.
<EMI ID=5.1>
à-dire produit de conjugaison, albumine de sérum de boeuf mé-
<EMI ID=6.1>
utilisé comme substrat pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif. Les autorités compétentes avaient bien au contraire recommandé de ne pas utiliser de produits de conjugaison albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif pour des immunisa-
<EMI ID=7.1>
méthylée avec 1 \acide désoxyribonucléique natif conduit à la formation d'un caillot fibreux compact qu'il est virtuellement impossible d'injecter.
Des moyens classiques pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif
sont entre autres-le dosage radioimmunologique et l'agglutination de latex. Toutefois, le premier mode opératoire est onéreux et lent et le second est relativement peu sensible.
Il serait donc nécessaire de disposer d'un moyen peu onéreux, sensible et rapide pour- éviter ces inconvénients. Comme précisé ci-après, l'invention procure ce moyen d'investigation.
Le procédé de l'invention pour mettre en évidence et/ou doser quantitativement les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif et d'autres anticorps dans la sérum de divers patients atteints d'une affection spécifique comprend les stades suivants:
<EMI ID=8.1>
nucléique natif avec du sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique pendant une durée suffisante;
B. on lave le mélange de sérum et de produit floculé et on en sépare le liquide surnageant;
C. on ajoute au produit floculé lavé un anticorps
<EMI ID=9.1> .mélange marqué à,incuber pendant une durée suffisante;
D. on lave le produit floculé incubé et on en sépare le liquide surnageant et
E. on met un culot du mélange d'anticorps en suspension dans un milieu de lavage et on détermine la fluorescence du produit floculé, laquelle est proportionnelle à la concentration des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.
Suivant l'invention, les anticorps à l'égard de l'_acide désoxyribonucléique sont mis en évidence par
une épreuve d'immunofluorescence indirecte en phase solide au moyen d'un produit de conjugaison stable et insoluble formé par l'albumine de sérum de boeuf méthylée et par l'acide désoxyribonucléique natif en double hélice.
D.'autres produits de conjugaison insolubles peuvent
<EMI ID=10.1>
thyroglobuline humaine ou d'un extrait nucléaire de thymus de veau avec de l'albumine de sérum de boeuf méthylée. Ces produits de conjugaison insolubles sont utilisés comme sub- <EMI ID=11.1>
autoimmunes.
Suivant l'invention, on utilise un produit de conjugaison stable et insoluble albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif dans une épreuve d'immunofluorescence indirecte en phase solide pour mettre en évidence les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.
Suivant une forme de réalisation de l'invention,
on met à incuber pendant une durée suffisante des quantités
<EMI ID=12.1>
métbylée - acide désoxyribonucléique natif et du sérum d'un patient atteint de- lupus érythémateux systémique. Après incubation, le mélange est lavé avec une solution et le liquide surnageant en est séparé. Ensuite, un anticorps anti-immunoglobuline marqué à la fluorescéine est ajouté au produit floculé lavé et le mélange marqué est mis à incuber pendant une durée suffisante. Le produit floculé incubé est alors lavé et le liquide surnageant en est séparé.
Un culot du mélange d'anticorps est mis en suspension dans un milieu,-de lavage et la fluorescence du produit
<EMI ID=13.1>
tion et l'émission respectivement. Comme la fluorescence
du produit floculé est proportionnelle à la concentration des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif, il est possible de mettre ces anticorps en évidence.
Le mélange incubé peut être lavé avec un milieu de lavage comme de la solution physiologique salée tamponnée
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
est marqué au moyen d'un agent fluorescent, par exemple l'iso-
<EMI ID=16.1>
Les intensités de fluorescence mesurées sur le sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique sont comparées à l'intensité de fluorescence de fond d'un sérum témoin normal. La différence de fluorescence entre les sérums est_la base pour la détermination des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif que contient le sérum du patient atteint de lupus érythémateux systémique.
L'épreuve permettant de mettre les anticorps en
<EMI ID=17.1>
indirecte en phase solide pour laquelle on utilise un produit de conjugaison stable et insoluble formé par un polymère soluble choisi parmi l'acide désoxyribonucléique natif en double hélice, l'immunoglobuline G de lapin, la thyroglobuline humaine et un extrait nucléaire de thymus de veau avec l'albumine de sérum de boeuf méthylée qui insolubilise ce polymère-
Suivant l'invention, lorsque le polymère soluble
<EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1>
que natif en cas de lupus érythémateux systémique.
Lorsque le polymère soluble est l'immunoglobuline G de lapin, 1 \épreuve permet de déceler les anticorps à l'égard de l'immunoglobuline G telle qu'elle apparaît dans l'arthrite rhumatoide. Lorsque le polymère soluble est la thyroglobuline
<EMI ID=20.1>
L'extrait nucléaire de thymus de veau insolubilisé permet. de déceler les anticorps antinucléaires.
Suivant la présente invention, d'autres substances
<EMI ID=21.1>
boeuf méttylée pour former le produit de conjugaison insoLu�
ble permettant de déceler les anticorps à l'égard d'antigènes dans différentes affections. Ces substances solubles sont notamment l'albumine de sérum humain méthylée et un. extrait nucléaire cellulaire soluble comme l'antigène nucléaire extractible) pour le diagnostic d'affections mixtes, des tissus conjonctifs.
Dans le produit de conjugaison insoluble, l'albumine de sérum de boeuf méthylée peut être remplacée pour l'insolubilisation des polymères solubles, par exemple de l'acide désoxyribonucléique natif. La Demanderesse a en effet découvert
<EMI ID=22.1>
dans la mise en évidence des anticorps lorsque l'albumine de sérum humain métbylée est utilisée pour insolubiliser les polymères solubles.
Le précipite insoluble, c'est-à-dire le produit de conjugaison, albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif conserve la structure en double
<EMI ID=23.1>
montre l'analyse à la sonde fluorescente effectuée sur le précipité suivant le procédé de Morgan et Pulleyblank (Bio-
<EMI ID=24.1>
celui de l'acide désoxyribonucléique natif avant son insolubilisation. En d'autres termes, le produit de conjugaison conserve les propriétés de fluorescence, aux valeurs élevées du pH, qui sont caractéristiques de l'acide désoxyribonucléique natif en double hélice.
De même, le produit de conjugaison insoluble formé <EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
désoxyribonucléique natif, conserve le caractère antigénique du polymère soluble. Cette propriété est mise en évidence
<EMI ID=27.1>
désoxyribonucléique soluble inhibe spécifiquement la réac-
<EMI ID=28.1>
duit de floculation insoluble albumine de sérum de boeuf
<EMI ID=29.1>
nuciéique natif soluble libre n'est décelable dans le liquide surnageant après plusieurs lavages. Par conséquent, le produit de conjugaison albumine de sérum de boeuf méthylée -
<EMI ID=30.1>
Les exemples suivants illustrent plus en détail les formes de réalisation préférées et avantages de l'invention.
EXEMPLE 1 -
Synthèse du produit de conjugaison albumine de sérum de boeuf
<EMI ID=31.1>
Conformément à l'invention, on prépare comme décrit ci-après le produit de conjugaison pour déceler les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.
<EMI ID=32.1>
thymus de veau, d'Escherichia coli ou de sperme de saumon dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate en une concentration de 1,0 mg/ml. On dissout ensuite dans de l'eau de l'albumine de sérum de boeuf méthylée en une concentration de 10 mg/ml. On mélange les deux solutions dans un rapport optimal préalablement établi pour assurer la préci- <EMI ID=33.1>
méthylée à 10 mg/ml pour 1 mg d'acide désoxyribonucléique natif) et on met le mélange à incuber pendant 2 heures à 37[deg.]C.
On lave le précipité avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate en opérant par centrifugation jusqu'à ce qu'on ne puisse plus déceler d'acide désoxyribonucléique natif dans le liquide surnageant rejeté.
On met le culot en suspension dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate. On homogénéise le produit floculé au moyen d'un broyeur à tissu en verre pour obtenir une suspension plus uniforme, puis on étalonne la concen.tration en produit floculé en utilisant un fluoromètre Turner
<EMI ID=34.1>
fuge la suspension et on met le culot en suspension dans
un volume convenable de solution physiologique salée tamponnée au phosphate additionnée de 5% d'albumine de sérum de
<EMI ID=35.1>
qu'on lyophilise. Après reconstitution, on vérifie la présence d'acide désoxyribonucléique natif libre soluble par addition de bromure d'éthidium au liquide surnageant limpide après centrifugation. Celui-ci ne contient pas d'acide désoxyribonucléique natif libre et la fluorescence observée à
540/590 nanomètres n'augmente par conséquent pas.
On prépare le produit de conjugaison insoluble pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif dans le sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique-
On prépare en substance comme décrit ci-dessus les produits de conjugaison insolubles immunoglobuline G de lapin, albumine de sérum de boeuf méthylée, thyroglobuline humaine albumine de sérum de boeuf méthylée et extrait nucléaire de thymus de veau - albumine de sérum de boeuf méthylée. Les seules différences sont les valeurs optimales du rapport
de l'albumine de sérum de boeuf méthylée à l'immunoglobuline G, à la thyroglobuline ou à l'extrait nucléaire de thymus de
<EMI ID=36.1>
bilisation du produit floculé résultant.
EXEMPLE 2 -
<EMI ID=37.1>
sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif avec 100/ul d'un sérum convenablement dilué (par exemple 1:2, 1:4 ou 1:10) provenant d'un patient atteint de lupus érythémateux syst.émique. On met le mélange à incuber pen-
<EMI ID=38.1>
lange par centrifugation à trois reprises avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate, c'est-à-dire en ajoutant 4 ml de solution physiologique salée tamponnée au phosphate, en centrifugeant le tube à essai à 2000 g et
en séparant par aspiration le liquide surnageant limpide.
<EMI ID=39.1>
(c'est-à-dire 1:400) et on met le mélange à incuber pendant
30 minutes à la température ambiante. On lave deux fois par centrifugation le mélange de produit floculé et d'anticorps marqué-
On met le culot de mélange de produit :floculé et d'anticorps en suspension dans 2,0 ml de solution physiologique salée tamponnée au phosphate et on mesure la fluorescence à 490/520 nanomètres pour l'excitation et l'émission, respectivement. On effectue l'épreuve par fluorescence à l'aide d'un spectrofluorumètie à monochromateurs, en l'occurrence le
<EMI ID=40.1>
On compare les intensités relevées sur le sérum
de patients atteints de lupus érythémateux systémique à l'intensité de fond d'un sérum témoin normal.
EXEMPLE 3 - Epreuves par immunofluorescence
On applique l'épreuve par immunofluorescence décrite dans l'exemple 2 pour déceler les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif dans le sérum de différents patients atteints de lupus érythémateux systémique. Pool déceler convenablement les anticorps dans le sérum de ces pa-
<EMI ID=41.1>
vidus normaux.
On trouvera ci-après une liste d'intensités relevées sur des sérums témoins normaux dont chacun provient d'un individu différent avec indication de la moyenne et de l'écart type,
ce qui permet d'apprécier la reproductibilité des opérations.
<EMI ID=42.1>
Fluorescence du sérum d'un individu normal
<EMI ID=43.1>
moyenne - écart type = 0,179 � 0,006
<EMI ID=44.1> buline G humaine de chèvre marquée à la fluores.céine.
Les intensités de fluorescence reprises ci-après relevées sur le sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique permettent la comparaison avec les résultats ci-dessus. Ces valeurs sont celles relevées sur le sérum
<EMI ID=45.1>
témique.
Fluorescence du sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
buline G humaine de chèvre marquée à la fluorescéine.
Comme le montrent les tableaux ci-dessus, la fluorescence du sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique est spécifiquement supérieure à la fluorescence
de fond d'un sérum témoin normal. On peut déduire des expériences que le sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique contient des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.
<EMI ID=48.1>
phase solide pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique
Pour déterminer si la réaction observée est celle de l'acide désoxyribonucléique avec un anticorps à 1 'égard de cet acide désoxyribonucléique, on exécute les expériences ci-après d'inhibition de la fixation. On répartit du sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique et du
<EMI ID=49.1>
de l'acide désoxyribonucléique libre (en quantité de 0 à lOO�ug) et on met les différents mélanges à incuber pendant
<EMI ID=50.1>
comme dans l'exemple 2.
<EMI ID=51.1>
NA. = non applicable
<EMI ID=52.1>
corps d'un sérum de patient atteint de lupus érythémateux systémique sur le produit de conjugaison albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique lors d'une préincubation du sérum avec de l'acide désoxyribonucléique soLu�
ble. Le degré d'inhibition est proportionnel à la concentration de l'inhibiteur.
EXEMPLE 5' -
Comparaison de l'épreuve par immunofluorescence indirecte
<EMI ID=53.1>
immunologique, on examine le sérum de 10 patients atteints de lupus érythémateux systémique tant par immunofluorescence indirecte en phase solide qu'au moyen d'une trousse de dosage
<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
fluorescence indirecte en phase solide est aussi sensible que le dosage radio-immunologique.
EXEMPLE 6 -
Mise en évidence des anticorps antinucléaires avec un extrait
<EMI ID=57.1> On purifie les noyaux cellulaires de thymus de veau et on extrait le produit nucléaire par exposition aux ultrasons à 60 kHz pendant 3 minutes dans du tampon au phosphate hypotonique. On précipite l'extrait nucléaire avec de l'albumine de sérum de boeuf méthylée et on lave le précipité une
<EMI ID=58.1>
le précipité comme substrat pour déceler des anticorps antinucléaires en appliquant le mode opératoire de l'exemple 2. On identifie en outre des sérums donnant une réaction positive aux anticorps antinucléaires en utilisant .une trousse de lames porte-objets disponible dans le commerce et on exprime La concentration en anticorps sous la forme du titre.
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
Les anticorps antinucléaires des classes IgG et IgM
<EMI ID=61.1>
phase solide. Les échantillons de sérum de titre élevé ont une fluorescence élevée en proportion. Parfois .(voir échan-
<EMI ID=62.1>
dérance d'une classe d'anticorps (IgM) sur une autre.
Insolubilized deoxyribonucleic acid
The present invention relates to immunofluorescence assays and more particularly to an indirect solid phase immunofluorescence assay for testing.
<EMI ID = 1.1>
native ribonucleic acid.
We have known for more than 10 years the use
methylated bovine serum albumin as a nucleic acid vehicle for immunization / Plescia et al,
<EMI ID = 2.1> <EMI ID = 3.1>
principal of these researchers was to produce antibodies to denatured deoxyribonucleic acid (helical
<EMI ID = 4.1>
Lower molecular weight insoluble methylated beef serum lead.
<EMI ID = 5.1>
i.e. conjugate product, intermediate bovine serum albumin
<EMI ID = 6.1>
used as a substrate for the demonstration of antibodies to native deoxyribonucleic acid. On the contrary, the competent authorities had recommended not to use methylated bovine serum albumin - native deoxyribonucleic acid conjugation products for immunizations.
<EMI ID = 7.1>
methylated with native deoxyribonucleic acid results in the formation of a compact fibrous clot which is virtually impossible to inject.
Conventional means for the detection of antibodies to native deoxyribonucleic acid
are among others-radioimmunoassay and latex agglutination. However, the first procedure is expensive and slow and the second is relatively insensitive.
It would therefore be necessary to have available an inexpensive, sensitive and rapid means of avoiding these drawbacks. As specified below, the invention provides this means of investigation.
The method of the invention for demonstrating and / or quantitatively assaying antibodies to native deoxyribonucleic acid and other antibodies in the serum of various patients with a specific condition comprises the following steps:
<EMI ID = 8.1>
native nucleic acid with serum from a patient with systemic lupus erythematosus for a sufficient duration;
B. the mixture of serum and flocculated product is washed and the supernatant liquid is separated therefrom;
C. an antibody is added to the washed flocculated product
<EMI ID = 9.1>. Labeled mixture, incubate for a sufficient time;
D. the incubated flocculated product is washed and the supernatant liquid is separated therefrom and
E. A pellet of the antibody mixture is suspended in a washing medium and the fluorescence of the flocculated product is determined, which is proportional to the concentration of the antibodies to the native deoxyribonucleic acid.
According to the invention, the antibodies to deoxyribonucleic acid are demonstrated by
an indirect solid phase immunofluorescence test using a stable insoluble conjugate of methylated bovine serum albumin and native double helix deoxyribonucleic acid.
D. Other insoluble conjugates may
<EMI ID = 10.1>
human thyroglobulin or a nuclear extract of calf thymus with methylated bovine serum albumin. These insoluble conjugates are used as sub- <EMI ID = 11.1>
autoimmunes.
According to the invention, a stable and insoluble methylated bovine serum albumin-native deoxyribonucleic acid conjugate is used in an indirect solid phase immunofluorescence test to demonstrate antibodies to native deoxyribonucleic acid. .
According to one embodiment of the invention,
are incubated for a sufficient time quantities
<EMI ID = 12.1>
metbylated - native deoxyribonucleic acid and serum from a patient with systemic lupus erythematosus. After incubation, the mixture is washed with a solution and the supernatant liquid is separated therefrom. Next, a fluorescein-labeled anti-immunoglobulin antibody is added to the washed flocculated product and the labeled mixture is incubated for a sufficient time. The incubated flocculated product is then washed and the supernatant liquid is separated therefrom.
A pellet of the antibody mixture is suspended in a washing medium, and the product fluoresces
<EMI ID = 13.1>
tion and emission respectively. Like fluorescence
of the flocculated product is proportional to the concentration of the antibodies with regard to the native deoxyribonucleic acid, it is possible to demonstrate these antibodies.
The incubated mixture can be washed with a washing medium such as physiological saline buffered solution.
<EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
is labeled with a fluorescent agent, for example iso-
<EMI ID = 16.1>
The fluorescence intensities measured on the serum of a patient with systemic lupus erythematosus are compared to the background fluorescence intensity of a normal control serum. The difference in fluorescence between the sera is the basis for the determination of antibodies to native deoxyribonucleic acid contained in the serum of the patient with systemic lupus erythematosus.
The test to put the antibodies in
<EMI ID = 17.1>
indirect solid phase for which a stable and insoluble conjugation product is used formed by a soluble polymer chosen from native double helix deoxyribonucleic acid, rabbit immunoglobulin G, human thyroglobulin and a nuclear extract of calf thymus with methylated bovine serum albumin which insolubilizes this polymer-
According to the invention, when the soluble polymer
<EMI ID = 18.1>
<EMI ID = 19.1>
than native in case of systemic lupus erythematosus.
When the soluble polymer is rabbit immunoglobulin G, the test will detect antibodies to immunoglobulin G as it occurs in rheumatoid arthritis. When the soluble polymer is thyroglobulin
<EMI ID = 20.1>
The nuclear extract of insolubilized calf thymus helps. to detect antinuclear antibodies.
According to the present invention, other substances
<EMI ID = 21.1>
methylated beef to form the unsolu conjugation product �
ble for detecting antibodies to antigens in different conditions. These soluble substances include methylated human serum albumin and a. soluble cellular nuclear extract as extractable nuclear antigen) for the diagnosis of mixed conditions, connective tissue.
In the insoluble conjugate, methylated bovine serum albumin can be substituted for the insolubilization of soluble polymers, for example native deoxyribonucleic acid. The Applicant has in fact discovered
<EMI ID = 22.1>
in the demonstration of antibodies when metbylated human serum albumin is used to insolubilize soluble polymers.
Insoluble precipitate i.e. conjugate, methylated bovine serum albumin - native deoxyribonucleic acid retains the duplicate structure
<EMI ID = 23.1>
shows the fluorescent probe analysis carried out on the precipitate according to the method of Morgan and Pulleyblank (Bio-
<EMI ID = 24.1>
that of native deoxyribonucleic acid before its insolubilization. In other words, the conjugate retains the fluorescence properties, at high pH values, which are characteristic of native double helix deoxyribonucleic acid.
Likewise, the insoluble conjugate product formed <EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
Native deoxyribonucleic, retains the antigenic character of the soluble polymer. This property is highlighted
<EMI ID = 27.1>
soluble deoxyribonucleic acid specifically inhibits the reaction
<EMI ID = 28.1>
bovine serum albumin insoluble flocculation fluid
<EMI ID = 29.1>
Free soluble native nucleic acid is not detectable in the supernatant after several washes. Therefore, the methylated bovine serum albumin conjugate -
<EMI ID = 30.1>
The following examples further illustrate the preferred embodiments and advantages of the invention.
EXAMPLE 1 -
Synthesis of the bovine serum albumin conjugate
<EMI ID = 31.1>
In accordance with the invention, the conjugate product is prepared as described below for detecting antibodies to native deoxyribonucleic acid.
<EMI ID = 32.1>
thymus from calf, Escherichia coli or salmon sperm in physiological phosphate buffered saline solution at a concentration of 1.0 mg / ml. Methylated bovine serum albumin is then dissolved in water in a concentration of 10 mg / ml. The two solutions are mixed in an optimal ratio previously established to ensure precision. <EMI ID = 33.1>
methylated at 10 mg / ml for 1 mg of native deoxyribonucleic acid) and the mixture is incubated for 2 hours at 37 [deg.] C.
The precipitate is washed with physiological phosphate buffered saline solution by centrifugation until no more native deoxyribonucleic acid can be detected in the discarded supernatant.
The pellet is suspended in physiological phosphate buffered saline. The flocculated product is homogenized by means of a glass cloth mill to obtain a more uniform suspension, then the concentration of the flocculated product is calibrated using a Turner fluorometer.
<EMI ID = 34.1>
fuge the suspension and suspend the pellet in
a suitable volume of physiological phosphate buffered saline supplemented with 5% serum albumin of
<EMI ID = 35.1>
that we lyophilize. After reconstitution, the presence of soluble free native deoxyribonucleic acid is verified by addition of ethidium bromide to the clear supernatant liquid after centrifugation. This does not contain free native deoxyribonucleic acid and the fluorescence observed at
540/590 nanometers therefore does not increase.
The insoluble conjugate is prepared for the detection of antibodies to native deoxyribonucleic acid in the serum of patients with systemic lupus erythematosus.
The insoluble conjugation products of rabbit immunoglobulin G, methylated bovine serum albumin, human thyroglobulin, methylated bovine serum albumin and nuclear extract of calf thymus - methylated bovine serum albumin are prepared in substance as described above. The only differences are the optimal values of the report
bovine serum albumin methylated with immunoglobulin G, thyroglobulin or thymus nuclear extract of
<EMI ID = 36.1>
bilisation of the resulting flocculated product.
EXAMPLE 2 -
<EMI ID = 37.1>
Methylated beef serum - native deoxyribonucleic acid with 100 µl of a suitably diluted serum (eg 1: 2, 1: 4 or 1:10) from a patient with systemic lupus erythematosus. The mixture is incubated for
<EMI ID = 38.1>
Mix by centrifugation three times with physiological phosphate buffered saline, i.e. adding 4 ml of physiological saline phosphate buffered saline, centrifuging the test tube at 2000g and
removing the clear supernatant liquid by suction.
<EMI ID = 39.1>
(i.e. 1: 400) and the mixture is incubated for
30 minutes at room temperature. The mixture of flocculated product and labeled antibody is washed twice by centrifugation.
The mixture of product: flocculated and antibody pellet was suspended in 2.0 ml of physiological phosphate buffered saline and fluorescence was measured at 490/520 nanometers for excitation and emission, respectively. The fluorescence test is performed using monochromator spectrofluorumetry, in this case the
<EMI ID = 40.1>
We compare the intensities recorded on the serum
of patients with systemic lupus erythematosus at the background intensity of a normal control serum.
EXAMPLE 3 - Immunofluorescence assays
The immunofluorescence test described in Example 2 was applied to detect antibodies to native deoxyribonucleic acid in the serum of various patients with systemic lupus erythematosus. Pool properly detect antibodies in the serum of these pa-
<EMI ID = 41.1>
normal vidus.
Below is a list of intensities recorded on normal control sera each of which comes from a different individual with indication of the mean and standard deviation,
which makes it possible to assess the reproducibility of operations.
<EMI ID = 42.1>
Fluorescence of serum from a normal individual
<EMI ID = 43.1>
mean - standard deviation = 0.179 � 0.006
<EMI ID = 44.1> human goat bulin G labeled with fluorescein.
The fluorescence intensities shown below in the serum of patients suffering from systemic lupus erythematosus allow comparison with the results above. These values are those recorded on the serum
<EMI ID = 45.1>
testimonial.
Fluorescence of serum from patients with systemic lupus erythematosus
<EMI ID = 46.1>
<EMI ID = 47.1>
fluorescein labeled human goat bulin G.
As shown in the tables above, the fluorescence of serum from a patient with systemic lupus erythematosus is specifically greater than the fluorescence
background of a normal control serum. It can be inferred from experiments that the serum of patients with systemic lupus erythematosus contains antibodies to native deoxyribonucleic acid.
<EMI ID = 48.1>
solid phase for the detection of antibodies to deoxyribonucleic acid
To determine whether the observed reaction is that of deoxyribonucleic acid with an antibody to this deoxyribonucleic acid, the following binding inhibition experiments were carried out. Serum from a patient with systemic lupus erythematosus and
<EMI ID = 49.1>
free deoxyribonucleic acid (in an amount of 0 to 100 µg) and the different mixtures are incubated for
<EMI ID = 50.1>
as in example 2.
<EMI ID = 51.1>
N / A. = not applicable
<EMI ID = 52.1>
body of a patient serum with systemic lupus erythematosus on the methylated bovine serum albumin - deoxyribonucleic acid conjugate during preincubation of the serum with deoxyribonucleic acid soLu �
corn. The degree of inhibition is proportional to the concentration of the inhibitor.
EXAMPLE 5 '-
Comparison of the indirect immunofluorescence test
<EMI ID = 53.1>
Immunologically, the serum of 10 patients with systemic lupus erythematosus is examined both by indirect solid-phase immunofluorescence and by means of an assay kit
<EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
<EMI ID = 56.1>
Indirect solid phase fluorescence is as sensitive as the radioimmunoassay.
EXAMPLE 6 -
Demonstration of antinuclear antibodies with an extract
<EMI ID = 57.1> The calf thymus cell nuclei were purified and the nuclear product extracted by exposure to ultrasound at 60 kHz for 3 minutes in hypotonic phosphate buffer. The nuclear extract is precipitated with methylated bovine serum albumin and the precipitate is washed thoroughly.
<EMI ID = 58.1>
the precipitate as a substrate for detecting antinuclear antibodies by applying the procedure of Example 2. Sera which give a positive reaction to the antinuclear antibodies are further identified using a commercially available slide kit and expressed. The antibody concentration in the form of the title.
<EMI ID = 59.1>
<EMI ID = 60.1>
Antinuclear antibodies of the IgG and IgM classes
<EMI ID = 61.1>
solid phase. High titer serum samples have high proportionate fluorescence. Sometimes. (See sample
<EMI ID = 62.1>
derance from one class of antibodies (IgM) to another.