La présente invention concerne la détection de la
présence et de la concentration d'une espèce de composés non
liés., par exemple des hormones. dans un échantillon liquide
comme du sérum. Plus particulièrement, l'invention concerne
un mode opératoire convenant bien à la détection d'une espèce
libre de composés du type capable de se lier de façon réversible
à une protéine dans des échantillons contenant l'espèce libre,
la protéine de liaison et une certaine concentration d'un
complexe espèce-protéine.
La technique "du dosage par compétition" pour mesu-
rer, à des fins de diagnostic, la concentration de diverses
substances douées d'une activité biologique est maintenant bien
connue et admise. La technique implique un système de réaction
dans lequel on fait incuber de l'anticorps spécifique de
l'espèce à déterminer avec l'échantillon d'essai et une partie
aliquote d'un analogue de l'échantillon pouvant être distingué. L'analogue et l'espèce naturelle entrent en compétition pour
les sites de fixation sur l'anticorps et, après séparation de l'anticorps et du reste du système de réaction, on peut doser
l'analogue dans l'anticorps ou le liquide surnageant. La quantité d'analogue associée à l'anticorps est une fonction inverse
de la concentration de l'espèce que l'on souhaite déterminer
dans l'échantillon.
Deux procédés courants pour effectuer de telles déterminations impliquant une compétition sont connus sous le
nom de "dosage radio-immunologique en phase liquide" et "dosage radio-immunologique en phase solide". Dans chaque système, la
substance immunogène liée à un anticorps doit être enlevée de
la substance immunogène non liée afin de permettre une mesure
de la quantité d'analogue marqué fixé à l'anticorps. A partir
de cette mesure, on détermine la quantité de substance immunogène existant dans l'échantillon.
Dans. les dosages radio-immunologiques "en phase
liquide", on fait incuber en solution l'anticorps, l'analogue
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nombre de sites de liaison de l'anticorps sont disponibles et
la réaction s'effectue rapidement. Pour séparer la substance immunogène complexée avec .1'anticorps, d'une part, de la substance immunogène non complexée, d'autre part, on précipite le complexe
<EMI ID=2.1>
le liquide surnageant.
Les dosages radio-immunologiques "en phase solide" évitent l'étape de la précipitation. L'anticorps est lié à un
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fugation des morceaux de verre ou une décantation des tubes revêtus sépare la substance immunogène complexée avec l'anticorps, d'une part, de la substance immunogène non complexée,
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un certain nombre de sites actifs disponibles sur l'anticorps sont bloqués par le morceau de verre ou par le tube.
Des hormones comme celles excrétées par la thyroïde, les testicules, les ovaires, le cortex surrénal, et d'autres glandes de mammifères, sont souvent transportées dans le
système circulatoire en association avec des protéines ou globulines capables de fixer ces hormones. Souvent, il est important pour le diagnostic de pouvoir déterminer la présence et la concentration d'une hormone libre par opposition à de l'hormone liée à une protéine ou à l'hormone totale. Par exemple, la thyroxine (T4) existe dans le courant sanguin en équilibre dynamique sous forme d'une espèce liée à une protéine de transport (globuline de liaison de la thyroxine, albumine ou pré-albumine) et, en une faible fraction (potentiellement 0,1 %
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du système des hormones thyroïdiennes. Malheureusement, la méthodologie des dosages de T. libre est pénible, compliquée, onéreuse et sujette à des erreurs en raison de la difficulté de normalisation des matières et de mesure de très faible quantité d'une hormone non liée en présence de quantités surabondantes d'une hormone liée de façon relativement lâche à une protéine. Le mode opératoire de dosage par compétition, indiqué ci-dessus, n'est pas: capable de déterminer les concentrations des composés ou espèces libres.
Parmi les procédés pour mesurer T. libre et d'autres hormones existant"in vivo" sous forme de complexes protéiniques, le procédé utilisant une membrane de dialyse assure un degré élevé de précision. On met un sac de dialyse, contenant des quantités connues, du sérum' à. vérifier et d'une hormone marquée, en suspension dans un tampon. L'hormone marquée se répartit entre les états libre et lié dans les mêmes proportions que l'hormone du sérum. La masse d'hormone marquée que l'on ajoute doit être extrêmement faible afin d'éviter de perturber gravement le système mais le taux de comptage doit être élevé pour permettre la détection de faible quantité. Dans le cas
des marques radio-actives, cela exige d'utiliser une hormone marquée ayant une très grande activité spécifique. Au bout d'une période convenable (environ 24 heures) l'hormone marquée et l'hormone naturelle non liée à une protéine diffusent à travers le sac semi-perméable de dialyse cependant que l'hormone liée
à une protéine (poids moléculaire supérieur à 20 000) demeure dans le sac de dialyse. Pour déterminer la quantité d'hormone libre présente dans le sérum, on dose l'hormone marquée dans une partie aliquote du tampon. A la suite de ce dosage, on peut calculer la fraction d'hormone marquée ayant pénétré dans le tampon et en déduire la fraction d'hormone totale existant à l'état libre. Pour transformer cette fraction en unités massiques
(par exemple ng/dl) d'hormone libre, il faut également effectuer sur l'échantillon un dosage d'hormone totale.
Ce système et ce procédé peuvent donner des résultats
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hormones libres mais cela ne convient que médiocrement pour une application de routine à des dosages en série. Il faut effectuer deux dosages, et la précision du résultat final peut être compromise par l'un ou l'autre mode opératoire. Il faut utiliser des quantités relativement grandes de radio-activité par dosage. Des impuretés gênantes présentes dans l'hormone marquée peuvent soulever des problèmes spéciaux et il faut de longues durées d'incub ation. On ne peut utiliser que du sérum, et il doit être extrêmement frais. En outre, la collecte et la normalisation de toutes les matières nécessaires pour le dosage ne peuvent s'effectuer que de façon routinière ou courante. Ainsi, l'application
du mode opératoire est limitée en raison du prix de revient
élevé et de la quantité de travail que ce procédé exige, ainsi que de l'obligation de faire appel à un personnel expérimenté.
Un autre procédé de dosage d'une hormone libre met en jeu la cinétique de la réaction et exige deux dosages séparés. Chaque dosage mesure une courbe cinétique liée à la rapidité avec laquelle un anticorps capture une hormone, par
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primaire de liaison comme une globuline de liaison de la thyroxine-
Dans un tel système de dosage, des imprécisions proviennent d'états pathologiques graves. S'il y a plus de sites de liaison à la protéine que le nombre habituel, l'attraction effective de la globuline pour l'hormone sera supérieure et la vitesse de liaison à un anticorps diminuera. Dans le cas de l'analyse de la thyroxine, cela risque d'apparaître comme si l'échantillon comportait peu de T4 alors qu'en fait il risque de
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liée.
En somme, la présente invention propose un procédé, un corps pouvant réagir et un nécessaire d'essai pour le dosage direct des hormones non liées et d'autres espèces analogues. Le dosage peut être effectué en présence des protéines du sérum et de l'hormone liée.
Selon l'invention, on fait incuber des micro-capsules semi-perméables, contenant de l'anticorps complémentaire de l'hormone ou d'une autre espèce à déceler, avec à la fois un analogue de l'hormone pouvant s'en distinguer et avec l'échantillon d'essai. L'analogue peut, avant l'incubation, être introduit dans les microcapsules en des quantités telles que l'anticorps soit saturé en site de liaison de l'hormone. Les parois des micro-capsules constituent des membranes séparant l'échantillon d'essai de l'anticorps et elles ont une perméabilité suffisante pour permettre le passage de l'espèce libre et de son analogue mais insuffisante pour permettre le passage de l'anticorps, des protéines naturelles ou d'une hormone liée à une protéine.
Lorsqu'on ajoute un échantillon d'essai à une quantité déterminée ou partie aliquote des micro-capsules, de l'hormone libre diffuse à travers les membranes et entre en compétition avec son analogue pour se fixer sur les sites de l'anticorps. Ainsi, la distribution de l'analogue entre l'anticorps et le reste du système de réaction devient une indication de la quantité de l'hormone libre présente à l'origine dans l'échantillon. Ce mode opératoire combine la précision inhérente à un dosage radioimmunologique classique en phase liquide et la simplicité et
la commodité d'un dosage en phase solide.
On sépare ensuite l'anticorps avec l'hormone qui
lui est liée (et l'analogue lié) de l'espèce libre, et l'on dose l'analogue dans l'anticorps ou dans le reste du système
de réaction. On peut effectuer la séparation en provoquant une modification osmotique entraînant l'affaissement des capsules
et la migration hors de celle-ci des hormones non liées. On
peut y parvenir, par exemple, en ajoutant de la sérum-albumine
ou de la polyéthylène-imine au système, ce qui favorise la
sortie du liquide intra-capsulaire. En variante, on peut tout simplement enlever l'espèce libre par lavage des microcapsules. On interprète les résultats en comparant le dosage
de teneur en analogue à un témoin, comme une courbe de la concentration de l'hormone libre en fonction du comptage de radio-activité, de l'intensité d'une fluorescence ou d'une
autre caractéristique du marqueur servant à indiquer la présence de l'analogue.
Le dosage peut servir à déceler la présence et/ou
la concentration de la thyroxine libre, de la tri-iodo-thyronine, de la thyroxine nêonatale, de la testostérone, du cortisol, d'autres hormones stéroïdes, et d'autres substances se liant de façon réversible à une protéine. Le dosage peut également servir à déceler des espèces qui ne se lient pas à un degré important
à une protéine, par exemple des produits ou drogues comme la digoxine. On peut déterminer pratiquement n'importe quelle matière pourvu que l'on dispose d'une substance complémentaire
de liaison et d'un analogue de la matière pouvant s'en distinguer, ou pourvu qu'on puisse produire une telle substance ou un tel analogue.
Le dosage peut être effectué en série lorsqu'on utilise un nécessaire d'essai comprenant de l'analogue, des micro-capsules contenant des quantités témoins d'anticorps et
des témoins à blanc contenant des concentrations prédéterminées de l'espèce en cause, ainsi qu'un corps pouvant réagir pour enlever des capsules, après achèvement de l'incubation, l'espèce non liée et l'analogue. Pour permettre un contrôle de la qualité, la solution présente dans la. micro-capsule peut être colorée. L'existence d'un liquide surnageant coloré, après dépôt ou sédimentation des capsules par centrifugation, risque ainsi d'indiquer une rupture des micro-capsules et une perte éventuelle d'anticorps. Contrairement à. des dosages classiques, le dosage de l'invention évite une perte de corrélation clinique avec des états diagnostiqués dans une large plage de concentrations
de la protéine, de l'hormone et des substances gênantes.
L'invention vise à proposer un procédé rapide, simple et reproductible de détection de la présence et de la concentration d'une espèce non liée à une protéine dans un échantillon liquide, un corps pouvant réagir et qui est utile pour de tels dosages, et un nécessaire d'essai convenant pour conduire rapidement et commodément de tels dosages. L'invention vise
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dans des échantillons extraits du sang humain et contenant T4 liée à une protéine.
L'invention vise également à proposer un procédé faisant appel à une compétition pour la détermination d'une substance immunogène. Ce procédé combine les avantages d'un système pour dosage radio-immunologique en phase solide et les avantages d'un système pour dosage radio-immunologique en
phase liquide. L'invention vise également à proposer un procédé hautement fiable pour la détermination de la quantité de digoxine présente dans du sérum.
Ces objets, caractéristiques et avantages de l'invention, ainsi que d'autres encores, apparaîtront à l'examen de la description détaillée suivante faite, à titre nullement limitatif, en regard des dessins annexés sur lesquels :
la figure 1 illustre une courbe de référence réalisée selon le mode opératoire de l'invention. Cette courbe indique <EMI ID=10.1>
de l'axe des ordonnées (axe des y) en fonction de la concentration de T4 libre, en ng/dl, sur une échelle logarithmique de l'axe des abscisses (axe des x) ; (voir les données correspondantes au tableau I) ; la figure 2 illustre une seconde courbe de référence pour un dosage de T 4 libre selon l'invention en coups par minute (échelle linéaire sur l'axe des ordonnées) en fonction de T4 libre, en ng/dl (échelle logarithmique sur l'axe des abscisses). Les données correspondant à. cette figure se <EMI ID=11.1> la figure 3 est un graphique présentant, en fonction du temps (en heures, en abscisses) le taux de comptage (en coups par minute, cpm, en ordonnées) dans le cas de T4 (125I) <EMI ID=12.1>
semi-perméables immergées dans des solutions type ou titrées
de T4 libre. A mesure que T4 du sérum remplace T4 ( 125 I) aux sites de liaison de T. sur l'anticorps, le taux de comptage caractérisant l'hormone restant en association avec l'anticorps diminue. On note que le taux de remplacement est largement linéaire jusqu'à 2 heures d'incubation à 37[deg.]C ; la figure 4 est un graphique illustrant la corrélation des résultats (dosage de T4 libre, en ng %) entre la technique de dosage par dialyse (en ordonnées ; ng % D) et le système de dosage radio-immunologique avec micro-encapsulation
(en abscisses; ng % R) ; la figure 5 est un graphique illustrant la plage <EMI ID=13.1>
micro-encapsulation (ordonnées : nombre d'échantillons ; abscisses : T4 libre en ng %) ; la figure 6 est un graphique illustrant la corréla- <EMI ID=14.1>
que l'on obtient par dosage radio-immunologique cinétique et
par le système de dosage avec micro-encapsulation selon l'invention ; la figure 7 montre, à partir des résultats apparaissant au tableau V, une courbe de référence pour la digoxine ; l'échelle linéaire des ordonnées indique le nombre de coups par minute (cpm) x 1Q<3> dans le cas de la digoxine liée ou fixée à de l'anticorps, et l'échelle logarithmique des abscisses indique
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semi-logarithmique ; la figure 8 montre le pourcentage de digoxine liée (pourcentage relatif), en ordonnées, linéaires, en fonction
de la concentration de la digoxine (en abscisses logarithmiques, ng/ml). Le pourcentage de digoxine liée (pourcentage relatif)
est calculé, (à partir des résultats du tableau VIII) par la formule suivante :
Pourcentage relatif de substance liée = nombre moyen de coups
par minute (cpm) de la substance liée/nombre moyen de cpm de la substance liée correspondant
à 0 ng/dl de digoxine sur la courbe de référence X
100 ; et la figure 9 est un schéma montrant la rétention de l'anticorps spécifique de la digoxine (9) et le libre passage de la digoxine (16) et/ou de la substance immunogène (18) dans des microcapsules formées selon la présente invention.
Le procédé de l'invention exige l'incubation de l'échantillon, contenant l'espèce ou composé à déceler, avec un anticorps complémentaire de cette espèce (ou une autre substance capable de se lier réversiblement avec l'espèce) et un analogue
de l'espèce pouvant être distingué, et la séparation de l'échantillon et de l'anticorps par une ou des membranes semiperméables empêchant le passage de protéines à poids moléculaire élevé..
Des anticorps de l'espèce choisie peuvent être produits selon des techniques bien connues impliquant l'injection de l'hormone, éventuellement avec un adjuvant, à des
animaux de laboratoire puis l'extraction et la purification des anticorps produits. De nombreux anticorps de ce genre sont disponibles dans le commerce. De nombreux analogues de l'espèce décelable par le procédé de l'invention, et que l'on peut distinguer, sont également disponibles dans le commerce ou peuvent être obtenus à l'aide de techniques. connues.. Telles qu'on les utilise ici, les expressions "analogue que l'on peut distinguer" ou "analogue distingable" désignent une molécule ayant des propriétés de fixation à un anticorps semblables à et de préférence identiques à celles de l'espèce que l'on cherche à déceler, et qui se caractérise par une propriété permettant d'obtenir facilement une .mesure de sa concentration.
Des analogues préférés comprennent un échantillon de l'espèce à déceler marqué avec un atome radio-actif : par exemple des hormones thyroïdiennes peuvent commodément être marquées par
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du rayonnement gamma. Cependant, en envisage la possibilité d'utiliser d'autres types d'analogues, tant que l'analogue présente un poids moléculaire et les dimensions résultantes se situant bien au-dessous de ceux des protéines naturelles et de l'anticorps que l'on utilise. Ainsi, on peut produire des analogues en marquant un échantillon de l'espèce à déceler à l'aide d'une enzyme à poids moléculaire relativement bas, d'un fragment fluorescent ou d'un autre fragment permettant une mesure quantitative, par des moyens physiques ou chimiques,
de la concentration de l'analogue.
Pour la mise en pratique du dosage, l'anticorps et l'analogue doivent être séparés de l'échantillon par une ou plusieurs membranes dont la perméabilité suffit à empêcher le passage des anticorps et des protéines naturelles (qui ont uniformément un poids moléculaire excédant 20 000) mais peut permettre le libre passage de l'espèce à déceler et de son analogue. Dans une forme préférée de réalisation de l'invention, les membranes prennent la forme de microcapsules semi-perméables contenant l'anticorps et de l'analogue.
Il est intéressant de noter que les microcapsules semi-perméables que l'on utilise ont une perméabilité semblable à celle des membranes de dialyse décrites ci-dessus. Cependant, la paroi des microcapsules semi-perméables est des centaines de fois plus mince que des membranes classiques de dialyse, et sa surface spécifique de contact par unité de poids est supérieure d'un certain nombre d'ordre de grandeur. T4 libre ou d'autres
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déplacent, en proportion de leur concentration, T4 marquée de T4 fixée sur l'anticorps- Ainsi, on se rapproche, au cours de la période d'incubation d'un équilibre entre T4 libre et T4 marquée dans la capsule.
Des procédés convenables pour encapsuler des
.matières biologiques dans.des membranes ayant les propriétés précitées de perméabilité sont décrits en détail dans les demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 606 166, <EMI ID=18.1>
et n[deg.] 30 847 déposée le 17 avril 1979, ainsi que dans la
demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 24 600 déposée
par F.Lim le 28 mars 1979. Le procédé actuellement préféré
pour produire de telles microcapsules obtient, par une technique de polycondensation interfaciale, des membranes de polyamide semi-perméables. On choisit des solvants ou des systèmes de solvants mutuellement non miscibles les uns dans les autres,
par exemple de l'eau et un solvant à base de cyclohexane, et
l'on dissout dans l'eau, avec la matière à encapsuler, un monomëre capable de former, avec un second monomère complémentaire,
un polymère. On émulsifie ensuite au sein de l'autre solvant, le solvant aqueux contenant la matière à encapsuler, afin de
former plusieurs gouttelettes séparées. On ajoute ensuite à la phase continue de l'émulsion le second monomère complémentaire pour amorcer la polymérisation autour des gouttelettes à la limite des phases. On règle la perméabilité de la membrane et l'uniformité des dépôts de polymère en faisant varier l'affinité de la phase continue de l'émulsion pour le monomère encapsulé
au cours de la polymérisation et en réglant la concentration des monomères soumis 3 la réaction et la durée de la polymérisation.
Dans une approche, la phase continue est au début
un solvant ou un système de solvants présentant une affinité relativement grande pour le monomère encapsulé de sorte que,
dans un premier stade de la polymérisation, il se produit autour des gouttelettes un réseau de polymère relativement épais. Puis, la phase continue est modifiée de façon à diminuer son affinité pour le premier monomère, par exemple en diluant la phase continue avec un second.solvant ou bien en remplaçant la phase continue par un solvant frais . Lors de l'addition du second monomère, une polymérisation supplémentaire se produit de préférence au sein du réseau de polymère initialement déposé, en recouvrant des défauts de macroporosité et en aboutissant à des membranes de capsules uniformes permettant la diffusion des solutés au-dessous d'un certain poids moléculaire.
Dans une autre approche, la phase continue est choisie, au début, de façon. à présenter une faible affinité
pour le monomère encapsulé. de manière 5 former des membranes minces et relativement denses dans un premier stade de la polymérisation. Puis l'affinité de la phase continue pour le monomère encapsulé est accrue afin de faire passer des quantités supplémentaires du monomère à travers la membrane et de provoquer le dépôt d'une seconde couche externe de polymère insoluble.
Lorsque la phase discontinue des gouttelettes aqueuses est tamponnée de façon à assurer un environnement compatible à des matières biologiques labiles comme un anticorps, on peut conduire l'encapsulation de façon à conserver un large pourcentage de l'activité biologique de la matière labile. On conserve également la capacité de fonctionnement de la matière encapsulée en ajoutant en de petites quantités le second monomère
à la phase continue pendant toute la durée de la polymérisation de façon que sa concentration soit relativement faible à n'importe quel moment donné et que l'anticorps ne soit pas exposé à des concentrations élevées de substances potentiellement destructrices.
Dans un système préféré de réaction, des gouttelettes aqueuses contenant une diamine, une matière de charge à poids moléculaire élevé et l'anticorps sont produites dans une phase continue de cyclohexane dont l'affinité pour le monomère dissous dans la phase des gouttelettes est modifiée par l'addition de chloroforme comme diluant. L'addition d'un halogénure de diacide au système aboutit à la formation de microcapsules en polyamide semi-perméables. Cette approche par mtcro-encapsulation peut efficacement produire des membranes
dont la limite supérieure de perméabilité correspond à une
gamme de poids moléculaire se situant entre 2000 et 30 000. Ainsi, les capsules peuvent facilement être modifiées de façon à permettre la diffusion de nombreuses hormones.
Pour conduire le dosage, l'échantillon d'essai est mélangé aux microcapsules du type décrit et mis à incuber, de préférence à 37[deg.]C environ. Avant l'incubation, les capsules peuvent être mises en suspension dans une solution contenant
une concentration de l'analogue de l'espèce suffisante pour charger l'anticorps d'une quantité décelable de cet analogue. Cependant, le dosage peut être conduit par addi.tion de l'analogue au système de réaction pendant ou après incubation avec du sérum. Les protéines de l'échantillon et les complexes protéine-espèces ou composés ne peuvent traverser la paroi des microcapsules.
L'anticorps est ensuite séparé du reste du système de réaction (éventuellement à l'exclusion des membranes des microcapsules) et l'on dose l'analogue dans l'anticorps ou
dans le reste du système. Dans un procédé préféré de réalisation de la séparation, on ajoute une matière hydrophile à poids moléculaire élevé, comme une solution de polyéthylène-imine
ou de la sérum albumine au volume extra-capsulaire. Cela provoque une augmentation de l'osmolarité aboutissant à un affaissement des microcapsules et à la migration de l'hormone intra-capsulaire non liée et de son analogue passant dans le liquide surnageant. Il en résulte une pastille affaissée d'anticorps encapsulé qui, après un traitement facultatif de centrifugation, peut être isolé par aspiration ou décantation du liquide surnageant. En variante, on peut effectuer la séparation en extrayant par lavage l'espèce libre et l'analogue de la capsule.
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correspondantes, présentent les résultats de dosage destinés selon l'invention à déceler la présence de T4 libre, lorsqu'on
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1251 comme analogue, et des solutions contenant une concentration connue de T4 libre. Des essais effectués sur des échantillons inconnus en opérant de façon parallèle au mode opératoire utilisé pour assembler ces données peuvent être interprétés
par référence aux courbes étalon.
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Courbe de référence pour le dosage
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Décompte total
pour T4 (125I) ajoutée 86403
Durée d'incubation : 2 heures à 37[deg.]C
TABLEAU II
Courbe de référence pour le dosage
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Décompte total
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Durée d'incubation : 2 heures à 37[deg.]C L'invention se comprendra mieux à l'examen de
la descripti.on détaillée suivante d'au moins un exemple présenté à titre non limitatif.
Préparation des microcapsules
On prépare une solution de carbonate d'hexanediamine (pH = 8,5 + 0,1) en mélangeant 17,7 ml de 1,6-hexane-
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la solution durant une heure environ ou jusqu'à atteindre le niveau de pH voulu. On prépare une solution de chlorure de têrephtaloyle (TC1) en ajoutant 20 g de TC1 à 200 ml d'un solvant organique constitué par 4 parties de cyclohexane et une partie de chloroforme. On dissout TC1 en agitant vigoureusement
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par minute. On jette tout précipité éventuel.
On mélange 750 ml de cyclohexane avec 125 ml de "SPAN-85" (émulsifiant ester d'acide gras de sorbitane)
dans un mélangeur de 2 litres de capacité muni d'un barreau d'agitation magnétique. Tout en agitant, on ajoute au cyclohexane une solution mélangée obtenue à partir d'un millilitre d'antisêrum de thyroxine (à 4 % dans une solution saline tamponnée par du phosphate ; R.F. Laboratories, Houston, Texas, Etats-Unis d'Amérique, ou Radioassay Systems Laboratories, Carson, California, Etats-Unis d'Amérique) , 25 ml de polyvinylpyrrolidone à 4 % de sérum albumine de bovin et 30 ml d'une solution de carbonate d'hexanediamine. Lorsque les gouttelettes de la dimension voulue ont été produites, on ajoute 70 ml de solution de TC1. Trente secondes plus tard, on ajoute 37,5 ml de TC1. Soixante secondes plus tard, on ajoute 25 ml de chloroforme. On ajoute, à des intervalles de 30 secondes,
trois parties aliquotes supplémentaires de 25 ml chacune de chloroforme.
On recueille les microcapsules en centrifugeant le système de réaction en deux phases, en décantant le liquide surnageant et en mélangeant les capsules avec du "TWEEN 20"
(dérivé polyoxyéthylénique d'un ester partiel d'acide gras
<EMI ID=29.1>
avec une solution saline tamponnée par des phosphates. Les capsules retiennent la polyvinylpyrrolidone, la sérum-albumine de bovin et les matières de charge, ainsi que l'anticorps de thyroxine.
Saturation de l'anticorps par de -1 ' analogue Des microcapsules obtenues selon le mode opératoire ci-dessus peuvent être chargées par de la thyroxine marquée par
125 1 (Cambridge Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, Etats-Unis d'Amérique) selon les étapes suivantes :
1) On prend 100 tubes normalisés et l'on introduit dans chacun 0,5 ml de suspension des microcapsùles et 1,0 micro-
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microCurie par microgramme)- On laisse incuber à 37[deg.]C durant au moins 30 minutes.
2) On lave les microcapsules avec deux fois leur volume de solution saline tamponnée par des phosphates (0,15 M
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3) On centrifuge à 2000 g durant 15 minutes et l'on élimine par décantation le liquide surnageant.
4) On répète deux fois les étapes 2 et 3.
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fois son volume de la solution saline tamponnée par du phosphate, décrite ci-dessus. Le volume total est de 80 ml. On utilise 0,8 ml de la suspension des microcapsules par essai. Ainsi, les capsules permettent d'effectuer 100 essais.
Mode opératoire pour un essai
1) On place des échantillons d'essai (25 microlitres)
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libre dans des tubes séparés. Sur la courbe de référence provenant du tableau I, on utilise les concentrations de 0,5
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On peut incorporer à la série un tube témoin contenant 25 microlitres de solution saline pour qu'il permette encore de vérifier la précision du dosage.
2) On introduit à la pipette 800 microlitres de
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de présaturation) dans chaque tube.
3) On soumet chaque tube à du tourbillonnement et
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4) Après l'incubation, on introduit dans chaque tube 1,0 ml de solution saline tamponnée par des phosphates
et contenant 2,0 % de polyéthylène-imine (poids moléculaire :
40000-50000).
5) On fait incuber durant 20 minutes supplémentaires.
6) On élimine par décantation le liquide surnageant.
7) Pour chaque tube, on compte durant une minute le nombre de coups dans un ensemble de mesure pour un rayonnement gamma.
Calcul des résultats
1) Chaque fois où l'on effectue un dosage pour déterminer la concentration inconnue de T4 libre dans un ou
des échantillons, il convient de soumettre au même dosage des étalons afin de préparer une courbe de référence.
2) Après achèvement du dosage, on prépare une courbe de référence, comme représentée sur les figures 2 ou 3, en utilisant les valeurs obtenues à l'aide des étalons qui ont été dosés en même temps que les échantillons inconnus.
3) Pour chaque valeur, on peut tracer une courbe
du nombre de coups par minute (cpm), sur l'échelle linéaire d'un papier semi-logarithmique, en fonction de la concentration en . T4 libre, en nanogrammes pour cent, sur l'échelle logarithmique.
Au lieu de tracer la courbe du nombre de coups par minute (cpm) en fonction de la concentration de T4 libre, on peut tracer celles du pourcentage de substance liée (pourcen-
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Pour cela, on calcule le pourcentage de substance liée (pourcentage relatif) pour chaque échantillon étalon, pour un témoin ou pour un échantillon inconnu et l'on reporte les valeurs sur un papier serai- logarithmique, de façon semblable à celle décrite précédemment pour le nombre de coups par minute. On calcule comme suit le pourcentage de substance liée (ou pourcentage relatif) :
Pourcentage de substance liée cpm de la substance liée/nombre
(pourcentage relatif) moyen de cpm de la substance liée
pour l'échantillon étalon présentant la plus faible concentration en T4 libre.
La figure 4 est un graphique montrant la concentra- <EMI ID=38.1>
d'essai dont chacun a été dosé par le procédé de la présente invention et par le procédé de dialyse. On voit qu'il existe un degré élevé de corrélation entre les deux procédés de dosage.
La figure 5 est un graphique indiquant la fréquence d'une concentration en T4 libre donnée (ordonnée nombre d'échantillons présentant une concentration donnée ; abscisse :
T4 en ng %), le graphique se fondant sur environ 200 échantil- <EMI ID=39.1>
ci-dessus La figure 6 est un graphique de la concentration en T4 libre, en ng %, pour environ 100 échantillons d'essai dont chacun a été dosé par le procédé de la présente invention et par la technique de dosage radio-immunologique cinétique. On voit qu'il existe un degré élevé de corrélation entre les deux procédés de dosage.
Le tableau III montre le degré d'accord entre les résultats obtenus pour un même dosage.
TABLEAU III
Variation à l'intérieur d'un .même dosage
(valeurs en ng/dl)
<EMI ID=40.1>
<EMI ID=41.1>
<EMI ID=42.1>
résultats d'un dosage à l'autre.
. TABLEAU IV
Variations d'un dosage à l'autre
(valeurs en ng/dl)
<EMI ID=43.1>
Voici un mode opératoire de dosage de la digoxine.
<EMI ID=44.1>
un anticorps spécifique de la digoxine.
Voici les réactifs utilisés, et l'indication de leur
fournisseur :
Bicarbonate de sodium
Cyclohexane
Chloroforme
Chlorure de sodium Fisher Chemical Phosphate de sodium,monobasique
Phosphate de sodium,dibasique
<EMI ID=45.1>
Antiséruin anti-digoxine de lapin Arnel Products,Brooklyn
New York
Sérum-albumine de bovin
Bleu brillant Comassie R Sigma Chemical Polyvinylpyrrolidone-40 Aldrich Chemical Chlorure de térephtaloyle Eastman Kodak
Voici la quantité utilisée pour chaque ingrédient :
<EMI ID=46.1>
Voici les différentes étapes du mode opératoire.
Avant utilisation, on rince toute la verrerie à l'eau distillée.
1) On place sous la hotte un mélangeur en verre, de 2 litrea, sur un agitateur magnétique.
2) Sur une paillasse voisine de la hotte, on met le microscope en état de fonctionnement.
3) Dans. une éprouvette graduée, en verre, de 250 ml, on mesure soigneusement 125 ml de "Span-85".
4) On verse la quantité mesurée de "Span-85" dans
le mélangeur en verre dans la hotte.
5) On mesure 750 ml de cyclohexane dans une éprouvette graduée en verre de 1000 ml. On verse dans le mélangeur en verre dans la hotte.
6) On place un couvercle sur le mélangeur.
7) On met en marche l'agitateur magnétique.
8) On mesure 30 ml de carbonate d'hexanediamine ;
30 ml de solution saline tamponnée par des phosphates ; 25 ml de polyvinylpyrrolidone à 15 %, bleu de Comassie et 4 % de sérum-albumine de bovin ; 5 ml d'anticorps ; on mélange les 40 ml de solution saline tamponnée avec les 5 ml d'anticorps dans une éprouvette graduée de 50 ml.
9) On place un barreau d'agitation de 5 cm avec une rondelle de rotation dans un bécher de 400 ml. On place sur l'agitateur magnétique.
<EMI ID=47.1>
On démarre le fonctionnement de l'agitateur magnétique.
il} A l'hexanediamine dans le bécher, on ajoute dans l'ordre spécifié ci-après : 25 ml à 15 % de polyvinylpyrrolidone/ bleu de Comassie/4 % de sérum albumine de bovin ; 35 ml de solution saline tamponnée/anticorps. On laisse mélanger durant
2 minutes puis on soumet les solutions à 3 minutes de mélange.
12) Pendant que la solution est soumise à l'action
de mélange, on mesure dans des éprouvettes cylindriques graduées séparées, en verre, de 100 ml de capacité, une portion de 70 ml et une portion de 37,5 ml de TC1 (chlorure de téréphtaloyle) .
On recouvre d'un verre de montre et l'on place dans la hotte.
-On mesure quatre portions de 25 ml de chloroforme dans des éprouvettes cylindriques graduées séparées en verre, de 25 ml. On recouvre d'un verre de montre et l'on place dans la hotte.
13) Par la tubulure latérale d'une fiole, on ajoute
<EMI ID=48.1>
trouvant dans la hotte.
14) Aussi rapidement que possible, on prélève avec une pipette de verre de 1 ml, à jeter après emploi, un échantillon de la solution se trouvant dans le mélangeur que l'on place sur la lamelle de microscope. On détermine la dimension des gouttelettes pour vérifier qu'elles sont bien acceptables
(diamètre de 10 à 80 microns).
15) Lorsque les gouttelettes ont une dimension acceptable, au temps T = 0, on ajoute par la tubulure latérale du mélangeur, la portion mesurée de 70 ml de TC1. A T = 30
(exactement 30 secondes plus tard) , on ajoute la seconde portion de 37,5 ml de TC1 dans le mélangeur par le bras latéral. On mélange durant 60 secondes exactement.
16) Au bout de ces 60 secondes (T = 90) , on ajoute une première portion de 25 ml de chloroforme. On mélange durant
30 secondes (T=120), on ajoute une seconde portion mesurée de
<EMI ID=49.1>
On ajoute une troisième portion mesurée de 25 ml de chloroforme et l'on mélange durant 30 secondes (T=180) . On ajoute une quatrième portion mesurée de 25 ml de chloroforme. On mélange durant exactement 30 secondes (T=210 secondes) . On arrête le mélangeur.
17) On verse le contenu du mélangeur dans deux bouteilles d'un litre, en matière plastique, pour centrifugeuse, qui ont été rincées 3 fois dans de l'eau distillée. On centrifuge durant 3 minutes à 500 tours par minute.
18) On décante soigneusement le liquide surnageant.
19) A chaque bouteille, on ajoute environ 50 ml de solution de "Tween-20" (c'est-à-dire environ le même volume de "Tween-20" que de capsules). On mélange bien avec le dispositif
à barreau d'agitation durant 5 minutes environ.
20) On ajoute environ 10 à 15 ml de solution saline tamponnée dans chaque houteille. On agite bien.
21) On répète 4 à 5 fois l'étape 20.
22) On ajoute 400 ml de solution tamponnée. On mélange bien.
23) On pèse puis,l'on centrifuge les bouteilles
<EMI ID=50.1>
surnageant. On ajoute environ 800 ml de solution saline tamponnée dans chaque bouteille. On agite bien et capsule.
24) On répète 10 fois l'opération de l'étape 23.
Après une aspiration finale, on introduit dans chaque bouteille
100 ml de solution tamponnée et l'on réunit le contenu des deux bouteilles. On secoue bien. On verse dans une éprouvette graduée en verre, de 500 ml, et l'on complète à 500 ml avec de la solution saline tamponnée.
25) On conserve dans une bouteille en verre, d'un litre, pour réactif à 4[deg.]C.
On prépare comme suit la solution de "Tween-20" de lavage. Le mode opératoire peut être appliqué le jour précédent l'utilisation de la solution.
1) On pèse 6,06 g de bicarbonate de sodium sur une balance de précision.
2) On verse soigneusement les 6,06 g de bicarbonate de sodium dans un ballon volumétrique de 250 ml contenant un barreau d'agitation.
3) On ajoute environ 200 ml d'eau purifiée, on place sur l'agitateur magnétique et l'on agite jusqu'à dissolution
du bicarbonate de sodium.
4) On enlève le barreau d'agitation et l'on ajoute de l'eau purifiée pour compléter à 250 ml.
5) On verse soigneusement dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml contenant un barreau d'agitation.
6) On mesure soigneusement 250 ml de "Tween-20" dans
<EMI ID=51.1>
7) On introduit le "Tween-20" dans le flacon d'Erlenmeyer contenant la solution de bicarbonate de sodium.
8) On place sur un agitateur magnétique et l'on agite jusqu'à mélange complet (environ 1 heure).
9) On conserve à 25[deg.]C environ dans une bouteille de un litre, en polyéthylène, fermée de façon étanche à l'aide d'une capsule vissée.
On prépare de la façon suivante la solution de chlorure de téréphtaloyle. Cette solution doit être préparée le jour de son utilisation et ne pas être réfrigérée.
1) On note sur la bouteille contenant le chlorure
<EMI ID=52.1>
poids de TC1, en grammes, par dix pour calculer le volume,
en millilitres, de solution de cyclohexane/chloroforme à ajouter à TC1. On s'assure que le volume total est suffisant pour le mode opératoire appliqué.
2) La solution de cyclohexane/chloroforme est constituée par quatre parties de cyclohexane avec une partie
de chloroforme. On divise par cinq le volume total de la solution
<EMI ID=53.1>
calculer le volume de chloroforme. On multiplie ce volume de chloroforme par quatre pour déterminer le volume de cyclohexane.
Donc :
(a) n millilitres de volume total de cyclohexane/ chloroforme : 5 = ni millilitres de chloroforme ;
(b) n' millilitres de chloroforme x 4 = n" millilitres de cyclohexane.
3) On mesure soigneusement dans des éprouvettes graduées les volumes calculés de cycicnexane et de chloroforme. On mélange dans un flacon d'Erlenmeyer. On fait doucement tourbillonner pour mélanger. On recouvre d'un verre de montre. On place dans
la hotte .
4) On place un agitateur magnétique dans la hotte.
5) On met la bouteille contenant TC1 sur l'agitateur magnétique. On ouvre cette bouteille et l'on y introduit aussi rapidement que possible un barreau d'agitation magnétique et
la solution de cyclohexane/chloroforme. On replace la capsule
(ou le bouchon) sur la bouteille.
6) On agite sur l'agitateur magnétique jusqu'à dissolution de tout le TC1. Il peut s'avérer nécessaire d'incliner ou Même de retourner la bouteille pour dissoudre le TC1 se
trouvant éventuellement autour du sommet de cette bouteille.
7) Aussi rapidement que possible, on verse une même quantité de solution de TC1 dans le nombre nécessaire de bouteilles de verre pour centrifugeuse, de 200 ml de capacité, et l'on ferme. On centrifuge durant 10 minutes à. 2 600 tours par minute à la température ambiante.
8) On verse le liquide surnageant dans des bouteilles de 500 ml, de couleur ambre, que l'on ferme bien.
9) On conserve les bouteilles bien fermées à
<EMI ID=54.1>
de sérum-albumine :
On applique le mode opératoire le jour de l'utilisation de la solution. Il ne faut pas réfrigérer celle-ci.
<EMI ID=55.1>
7,5 g de polyvinylpyrrolidone 40 ; 2 g de sérum-albumine de
bovin et 0,1 g de bleu Comassie.
2) On verse la polyvinylpyrrolidone 40 dans un bêcher de 50 ml en verre, comportant un barreau d'agitation.
3) On ajoute environ 20 ml de solution tamponnée par des phosphates. On place sur le bêcher une plaque de verre formant couvercle.
4) On agite sur un agitateur magnétique jusqu'à dissolution .
5) On verse 0,1 g de bleu Comassie et 2 g de sérumalbumine de bovin dans un autre bécher en verre de 50 ml.
6) On ajoute environ 20 ml de solution tamponnée par des phosphates. On place sur le bécher une plaque de verre de couverture.
7) On agite et chauffe légèrement en utilisant un agitateur magnétique n[deg.] 10 avec plaque chauffante, l'appareil
de chauffage étant réglé à la graduation 2. On laisse sous agitation jusqu'à dissolution (il faut environ 10 minutes) .
8) On introduit soigneusement un barreau d'agitation
et le contenu complet des bëchers contenant la solution de polyvinylpyxrolidone 40 et la solution de bleu Comassie dans un
<EMI ID=56.1>
9) On mélange sur un agitateur magnétique durant
10 minutes les solutions ainsi combinées. On enlève le barreau d'agitation.
<EMI ID=57.1>
par des phosphates.
11) A l'aide d'une solution 1 N d'hydroxyde de sodium,
<EMI ID=58.1>
d'origine, du pH final et de la quantité de NaOH 1 N que l'on utilise).
12) On filtre la solution avec un dispositif de filtration sur membrane "Nalgêne" à jeter après emploi (0,45 micron) .
<EMI ID=59.1>
polyéthylène, de 60 ml, fermée de façon étanche par un bouchon ou une capsule vissée.
Voici le mode opératoire pour préparer la solution saline tamponnée par des phosphates.
Ce mode opératoire peut être appliqué le jour précédent l'utilisation.
1) Dans une éprouvette cylindrique graduée en verre, de 1000 ml, on mesure soigneusement 1000 ml de la solution saline de réserve tamponnée par des phosphates.
2) On verse dans une bonbonne de polyéthylène de
20 litres.
3) A l'aide d'une éprouvette cylindrique graduée en
<EMI ID=60.1>
introduit dans la bonbonne contenant la solution saline tamponnée.
4) On agite à l'aide d'un agitateur à barreau magnétique.
5) On vérifie le pH que l'on ajuste, si nécessaire, à
<EMI ID=61.1>
6) On conserve la solution saline tamponnée par des phosphates dans la bonbonne de 20 litres, en polyéthylène, fermée de façon étanche. On conserve à 25[deg.]C environ jusqu' à utilisation.
Voici le mode opératoire pour préparer du carbonate de 1,6-hexanediamine.
Ce mode opératoire peut être appliqué le jour précédant l'utilisation.
1) On place une bouteille de 1,6-hexanediamine dans un bêcher de 3 litres. On introduit dans ce bêcher suffisamment d'eau du robinet pour atteindre le niveau de l'hexanediamine dans la bouteille.
2) On soulève le bouchon ou la capsule de la bouteille
<EMI ID=62.1>
3) On place le bêcher sur un agitateur magnétique à plaque chaude, dont le dispositif de chauffage est réglé à
la graduation 2, jusqu'à fusion complète de l'hexanediamine.
4) Dans une éprouvette cylindrique graduée en verre, de 25 ml, on mesure de façon précise 17,7 ml d'hexanediamine. On verse soigneusement dans une bouteille de 500 ml, de couleur ambre.
5) On mesure précisément 32 ml d'eau purifiée dans une éprouvette cylindrique graduée en verre, de 50 ml. On ajoute cette eau à l'hexanediamine dans la bouteille de couleur ambre.
6. On fait barboter dans la solution du C02 durant une heure environ jusqu'à ce que le pH soit égal à 8,5 + 0,1. On note le pH finalement obtenu.
7) On ferme bien la bouteille de couleur ambre qu'on conserve à 25[deg.]C environ.
La figure 9 montre schématiquement la microcapsule et le principe de son fonctionnemen t. On voit sur cette figure 9 de l'anticorps 9, spécifique de la digoxine, qui est enfermé au sein de la paroi 10 de la microcapsule 12. Cependant, la paroi 10 de la microcapsule 12 présente des ouvertures 14 assez petites pour permettre le libre passage de la digoxine. Ainsi, de la digoxine 16 provenant de l'échantillon et de la digoxine marquée 18 peuvent librement traverser les parois des microcapsules et entrer en compétition l'une avec l'autre pour les sites de l'anticorps 9. Une fois l'incubation achevée, la digoxine
16 ou 18 éventuellement non liée peut être éliminée par lavage de l'intérieur de la microcapsule.
Comme indiqué ci-dessus, une partie de la digoxine est marquée, et cette digoxine marquée entre en compétition avec de la digoxine non marquée provenant de l'échantillon pour les sites de l'anticorps spécifique de la digoxine. La digoxine marquée préférée est (125I)-digoxine que l'on peut obtenir
par exemple chez New England Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, Etats-Unis d'Amérique.
Voici le mode opératoire de l'essai de. dosage.
1) On obtient par un mode opératoire hien connu en pratique un ou des échantillons: du sérum à essayer. Dans le présent exemple, on utilise des témoins.
2) A l'aide d'une pipette, on introduit 0,1 ml
<EMI ID=63.1>
ou de sérum d'un patient inconnu, dans des tubes marqués de façon correspondante et contenant 0,5 ml de suspension des microcapsules d'anticorps de digoxine qu'on obtient comme décrit ci-dessus.
3) A l'aide d'une pipette, on introduit dans chaque
<EMI ID=64.1>
solution saline tamponnée par des phosphates). On fait tourbillonner durant 3 à 4 secondes au moins.
4) On fait incuber tous les tubes de réaction dans un bain-marie à 37[deg.]C durant au moins 15 minutes. /En variante, on fait incuber tous les tubes de réaction à la température ambiante (20[deg.]-25[deg.]C) durant au moins 30 minutes?.
<EMI ID=65.1>
dans chaque tube. On fait tourbillonner durant 3 à 4 secondes au moins.
6) On fait incuber tous les tubes de réaction à la
<EMI ID=66.1>
7). On centrifuge tous les tubes à 1600 g au moins durant 10 minutes à la température ambiante (20[deg.]-25[deg.]C) et l'on décante le liquide surnageant dans un récipient approprié, destiné à recevoir les rebuts ; on recueille la dernière goutte sur du papier buvard ou un autre papier absorbant.
8) Dans un ensemble de comptage pour rayonnement
gamma, réglé pour 125 I, on soumet tous les tubes à une minute
de comptage pour chaque tube.
9) On trace une courbe de référence montrant la relation entre des quantités connues de digoxine et le nombre
de coups mar minute, et on lit sur cette courbe les quantités inconnues de digoxine.
Voici des détails sur les réactifs utilisés :
L'anticorps de digoxine est encapsulé dans des microcapsules semi-perméables en "nylon" en suspension dans une solution saline tamponnée par des phosphates, telle que préparée ci-dessus.. Pour un contrôle de qualité, les microcapsules contiennent en plus de l'anticorps. un colorant bleu
<EMI ID=67.1>
couleur bleue, après dépôt ou sédimentation des microcapsules par centrifugation, indiquerait une rupture des microcapsules et la possibilité d'une fuite de l'anticorps.
Chaque millilitre de solution de digoxine marquée
<EMI ID=68.1>
à moins de 4,2 microCurie.
La solution tampon est un tampon de phosphates
0,015 M à pH 7,5, contenant du chlorure de sodium 0,15 M, 0,5 % de sérum-albumine de bovin et 0,1 % d'azoture de sodium.
La solution de lavage est une solution à 20 % de
<EMI ID=69.1>
pH 8,9, contenant du chlorure de sodium 0,15 M.
Les résultats. d'un essai typique de cette expérience sont présentés au tableau V et, graphiquement, sur les figures 7 et 8.
Sur la figure 7, le nombre de coups par minute
(x 10<3>) est reporté sur l'échelle linéaire des ordonnées d'un papier semi-logarithmique en fonction de la concentration de
la digoxine, en ng/ml (nanogrammes/millilitre) sur l'échelle logarithmique des abscisses. Au lieu de tracer la courbe des coups par minute en fonction de la concentration de la digoxine, on peut tracer la courbe du pourcentage de substance liée
(pourcentage relatif), sur l'échelle linéaire des ordonnées,
en fonction de la concentration de la digoxine (sur l'échelle logarithmique des abscisses : voir figure 8). On peut y parvenir en calculant le pourcentage de substance liée
(pourcentage relatif) pour chacun des échantillons titré, témoin, ou inconnu et en reportant ces valeurs sur du papier semi-logarithmique, d'une façon semblable à celle décrite cidessus dans le cas des coups par minute. Le pourcentage de substance (pourcentage relatif) se calcule comme suit :
Pourcentage de substance liée (nombre moyen de coups par
(ou pourcentage relatif) minute de la substance liée, dans
le cas de la solution titrée ou étalon à 0 ng/ml de digoxine)
X 100.
TABLEAU V
<EMI ID=70.1>
Nombre total de CPM : 26780
<EMI ID=71.1>
* = nombre de coups. par .minute de la substance liée dans le
cas d'une teneur nulle (0 ng/ml) de digoxine.
Le procédé de l'invention propose un dosage qui s'est
<EMI ID=72.1>
inférieure à 7 % et la variation d'un dosage à l'autre est inférieure à. 9 %.
Voici les coefficients de variation. (CV) pour deux échantillons témoins, dont chacun a été soumis 25 fois à des opérations de dosage groupées en une même expérience :
<EMI ID=73.1>
Voici les coefficients de variation, d'un dosage à l'autre, pour deux échantillons témoins ayant subi chacun trois essais au cours de dix huit expériences séparées :
<EMI ID=74.1>
Le tableau VImontre que le dosage de l'invention présente pour la digoxine une spécificité extrêmement élevée et exclut d'autres substances risquant éventuellement de gêner le dosage. Ce tableau montre le pourcentage de réactivité croisée de divers composés biochimiques en présence d'antisêrum antidigoxine dans des microcapsules.
TABLEAU VI
<EMI ID=75.1>
Le présent procédé s'est avéré être hautement quantitatif en permettant de récupérer au moins 96 % de la digoxine ajoutée dans les échantillons.
: TABLEAU VII
<EMI ID=76.1>
Il est particulièrement important de noter le degré élevé de corrélation entre les résultats obtenus à l'aide du procédé de l'invention et les déterminations de la digoxine effectuées par d'autres procédés de dosage-
Le tableau VIII montre des résultats d'essais comparatifs que l'on obtient avec le procédé de la présente invention et avec d'autres procédés de dosage.
Les systèmes A et C représentent des systèmes ou réactifs pour dosage en milieu liquide avec séparation des réactifs par précipitation, cependant que le système B utilise une séparation de la phase solide. On voit que le coefficient
<EMI ID=77.1>
lons dosés à l'aide du réactif ou système A, du réactif ou système B, du réactif ou système C et du réactif ou système de la présente invention.
TABLEAU VIII
ACCORD ENTRE DIVERS MODES OPERATOIRES DE DOSAGE
<EMI ID=78.1>
Il ressort de ce qui précède que la technique de dosage décrite ici peut servir à déterminer la présence et la concentration de n'importe quelle espèce libre, pourvu que l'on dispose d'une substance complémentaire capable de se lier spé-cifiquement à cette espèce et que l'on dispose d'un analogue de l'espèce pouvant s'en distinguer. Il faut aussi que le poids moléculaire de l'espèce ou du composé et de son analogue
soit suffisamment faible pour que l'on puisse utiliser des membranes de microcapsules permettant une diffusion sélective de ces substances tout en empêchant le passage de matières à poids moléculaire élevé comme les protéines naturelles. Heureusement, des hormones stêroldes, des hormones thyroïdiennes,
de nombreux produits pharmaceutiques, de nombreuses drogues et d'autres classes de substances présentant de l'importance
dans le domaine clinique se caractérisent par des dimensions moléculaires bien inférieures à celles des protéines naturelles.
Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé et au nécessaire de dosage décrits et représentés.
The present invention relates to the detection of
presence and concentration of a species of compounds not
related., for example hormones. in a liquid sample
like serum. More particularly, the invention relates to
a procedure well suited to the detection of a species
free of compounds of the type capable of reversibly binding
to a protein in samples containing the free species,
the binding protein and a certain concentration of a
species-protein complex.
The "competitive assay" technique for measuring
rer, for diagnostic purposes, the concentration of various
substances endowed with biological activity is now well
known and accepted. The technique involves a reaction system
in which one incubates the specific antibody of
the species to be determined with the test sample and a part
aliquot of a distinguishable sample analog. The analogue and the natural species compete for
the binding sites on the antibody and, after separation of the antibody and the rest of the reaction system, one can assay
the analog in the antibody or supernatant. The amount of analog associated with the antibody is an inverse function
the concentration of the species to be determined
in the sample.
Two common methods for making such determinations involving competition are known as
name of "liquid phase radioimmunoassay" and "solid phase radioimmunoassay". In each system, the
immunogenic substance bound to an antibody must be removed from
unbound immunogen to allow measurement
the amount of labeled analog bound to the antibody. From
from this measurement, the amount of immunogenic substance existing in the sample is determined.
In. radioimmunoassays "in phase
liquid ", the antibody, the analog
<EMI ID = 1.1>
number of antibody binding sites are available and
the reaction proceeds quickly. To separate the immunogenic substance complexed with the antibody, on the one hand, from the uncomplexed immunogenic substance, on the other hand, the complex is precipitated.
<EMI ID = 2.1>
the supernatant liquid.
"Solid phase" radioimmunoassays avoid the precipitation step. The antibody is linked to a
<EMI ID = 3.1>
fugation of pieces of glass or decantation of the coated tubes separates the immunogenic substance complexed with the antibody, on the one hand, from the uncomplexed immunogenic substance,
<EMI ID = 4.1>
a number of active sites available on the antibody are blocked by the piece of glass or the tube.
Hormones, such as those excreted by the thyroid, testes, ovaries, adrenal cortex, and other mammalian glands, are often carried in the
circulatory system in association with proteins or globulins capable of fixing these hormones. Often times, it is important for diagnosis to be able to determine the presence and concentration of a free hormone as opposed to the hormone bound to a protein or the total hormone. For example, thyroxine (T4) exists in the blood stream in dynamic equilibrium as a species bound to a transport protein (thyroxine binding globulin, albumin or pre-albumin) and, in a small fraction (potentially 0.1%
<EMI ID = 5.1>
of the thyroid hormone system. Unfortunately, the methodology of assays for T. free is cumbersome, complicated, expensive, and prone to error due to the difficulty of standardizing materials and measuring very small amounts of unbound hormone in the presence of overabundant amounts of. a hormone relatively loosely bound to a protein. The competitive assay procedure, indicated above, is not: capable of determining the concentrations of the free compounds or species.
Among the methods for measuring T. free and other hormones existing "in vivo" as protein complexes, the method using a dialysis membrane provides a high degree of accuracy. A dialysis bag, containing known quantities, of serum is put in. check and a labeled hormone, suspended in buffer. The labeled hormone distributes between the free and bound states in the same proportions as the serum hormone. The mass of labeled hormone that is added must be extremely low in order to avoid serious disruption of the system, but the count rate must be high to allow detection of small amounts. In the case
radioactive brands, this requires the use of a labeled hormone with very high specific activity. After a suitable period (about 24 hours) the labeled hormone and the natural hormone not bound to a protein diffuse through the semi-permeable dialysis bag while the bound hormone
to a protein (molecular weight greater than 20,000) remains in the dialysis bag. To determine the amount of free hormone present in the serum, the labeled hormone is assayed in an aliquot of the buffer. Following this assay, it is possible to calculate the fraction of labeled hormone which has entered the buffer and to deduce therefrom the fraction of total hormone existing in the free state. To transform this fraction into mass units
(eg ng / dl) of free hormone, a total hormone assay must also be carried out on the sample.
This system and method can give results
<EMI ID = 6.1>
free hormones but poorly suited for routine application at serial dosages. Two assays must be performed, and the accuracy of the final result may be compromised by either procedure. Relatively large amounts of radioactivity must be used per assay. Troublesome impurities present in the labeled hormone can give rise to special problems and long incubation times are required. You can only use serum, and it must be extremely cool. In addition, collection and standardization of all materials required for the assay can only be done on a routine or routine basis. Thus, the application
of the operating mode is limited due to the cost price
process and the amount of labor involved in this process, as well as the need for experienced personnel.
Another method of assaying a free hormone involves the kinetics of the reaction and requires two separate assays. Each assay measures a kinetic curve related to how quickly an antibody captures a hormone, e.g.
<EMI ID = 7.1>
primary binding as a thyroxine- binding globulin
In such a dosing system, inaccuracies arise from serious pathological conditions. If there are more protein binding sites than the usual number, the effective attraction of globulin to the hormone will be greater and the rate of binding to an antibody will decrease. In the case of thyroxine analysis, this may appear as if the sample contains little T4 when in fact it may
<EMI ID = 8.1>
linked.
In sum, the present invention provides a method, reactable body and test kit for the direct assay of unbound hormones and other like species. The assay can be performed in the presence of serum proteins and bound hormone.
According to the invention, semi-permeable microcapsules are incubated, containing antibody complementary to the hormone or of another species to be detected, with both an analogue of the hormone which can be distinguished from it. and with the test sample. The analog can, before incubation, be introduced into the microcapsules in amounts such that the antibody is saturated at the hormone binding site. The walls of the microcapsules constitute membranes separating the test sample from the antibody and they have sufficient permeability to allow the passage of the free species and its analogue but insufficient to allow the passage of the antibody, natural protein or a hormone bound to a protein.
When a test sample is added to a specified amount or aliquot of the microcapsules, free hormone diffuses through the membranes and competes with its analogue to bind to the sites of the antibody. Thus, the distribution of the analog between the antibody and the rest of the reaction system becomes an indication of the amount of free hormone originally present in the sample. This procedure combines the precision inherent in a conventional liquid phase radioimmunoassay with the simplicity and
the convenience of a solid phase assay.
The antibody is then separated with the hormone which
is bound to it (and the bound analog) of the free species, and the analog is assayed in the antibody or in the rest of the system
reaction. The separation can be effected by causing an osmotic change causing the capsules to collapse.
and the migration out of it of unbound hormones. We
can achieve this, for example, by adding serum albumin
or polyethyleneimine to the system, which promotes the
exit of the intra-capsular fluid. Alternatively, one can simply remove the free species by washing the microcapsules. The results are interpreted by comparing the dosage
of analog content in a control, such as a curve of the concentration of free hormone against the count of radioactivity, the intensity of a fluorescence or a
another feature of the marker to indicate the presence of the analog.
The assay can be used to detect the presence and / or
the concentration of free thyroxine, tri-iodothyronine, neonatal thyroxine, testosterone, cortisol, other steroid hormones, and other substances reversibly binding to a protein. The assay can also be used to detect species that do not bind to a significant degree
to a protein, for example products or drugs such as digoxin. Almost any material can be determined as long as a complementary substance is available
binding agent and an analogue of the material capable of being distinguished from it, or provided that such a substance or analogue can be produced.
The assay can be performed serially when using a test kit comprising analog, microcapsules containing control amounts of antibody and
blank controls containing predetermined concentrations of the offending species, as well as a reactive body to remove capsules, after completion of incubation, the unbound species and the analog. To allow quality control, the solution present in the. micro-capsule can be colored. The existence of a colored supernatant liquid, after deposition or sedimentation of the capsules by centrifugation, thus risks indicating a rupture of the microcapsules and a possible loss of antibodies. Contrary to. of conventional assays, the assay of the invention avoids loss of clinical correlation with conditions diagnosed over a wide range of concentrations
protein, hormone and interfering substances.
The invention aims to provide a rapid, simple and reproducible method of detecting the presence and concentration of a species not bound to a protein in a liquid sample, a reactable body which is useful for such assays, and a test kit suitable for quickly and conveniently carrying out such assays. The invention aims
<EMI ID = 9.1>
in samples extracted from human blood and containing T4 bound to a protein.
The invention also aims to provide a method using competition for the determination of an immunogenic substance. This method combines the advantages of a solid phase radioimmunoassay system with the advantages of a solid phase radioimmunoassay system.
liquid phase. The invention also aims to provide a highly reliable method for determining the amount of digoxin present in serum.
These objects, characteristics and advantages of the invention, as well as other stills, will become apparent on examination of the following detailed description given, in no way limiting, with reference to the appended drawings in which:
FIG. 1 illustrates a reference curve produced according to the procedure of the invention. This curve indicates <EMI ID = 10.1>
the ordinate axis (y axis) as a function of the concentration of free T4, in ng / dl, on a logarithmic scale of the abscissa axis (x axis); (see corresponding data in Table I); FIG. 2 illustrates a second reference curve for an assay of free T 4 according to the invention in counts per minute (linear scale on the y-axis) as a function of free T4, in ng / dl (logarithmic scale on the horizontal axis). The data corresponding to. this figure is <EMI ID = 11.1> figure 3 is a graph showing, as a function of time (in hours, on the x-axis) the count rate (in counts per minute, cpm, on the y-axis) in the case of T4 (125I ) <EMI ID = 12.1>
semi-permeable immersed in standard or titrated solutions
of free T4. As T4 of the serum replaces T4 (125 I) at the T binding sites on the antibody, the count rate characterizing the hormone remaining in association with the antibody decreases. It is noted that the replacement rate is largely linear up to 2 hours of incubation at 37 [deg.] C; FIG. 4 is a graph illustrating the correlation of the results (assay of free T4, in ng%) between the dialysis assay technique (on the ordinate; ng% D) and the radioimmunoassay system with microencapsulation
(on the x-axis; ng% R); Figure 5 is a graph showing the range <EMI ID = 13.1>
micro-encapsulation (ordinates: number of samples; abscissa: free T4 in ng%); Figure 6 is a graph illustrating the correlation - <EMI ID = 14.1>
obtained by kinetic radioimmunoassay and
by the dosing system with microencapsulation according to the invention; FIG. 7 shows, from the results appearing in Table V, a reference curve for digoxin; the linear ordinate scale indicates the number of counts per minute (cpm) x 1Q <3> in the case of digoxin bound or bound to antibody, and the logarithmic abscissa scale indicates
<EMI ID = 15.1>
semi-logarithmic; Figure 8 shows the percentage of digoxin bound (relative percentage), on the ordinate, linear, as a function
the concentration of digoxin (on the logarithmic abscissa, ng / ml). The percentage of digoxin bound (relative percentage)
is calculated, (from the results of Table VIII) by the following formula:
Relative percentage of substance bound = average number of hits
per minute (cpm) of bound substance / mean number of cpm of corresponding bound substance
at 0 ng / dl of digoxin on the reference curve X
100; and FIG. 9 is a diagram showing the retention of the digoxin specific antibody (9) and the free passage of digoxin (16) and / or the immunogenic substance (18) in microcapsules formed according to the present invention.
The method of the invention requires the incubation of the sample, containing the species or compound to be detected, with an antibody complementary to this species (or another substance capable of reversibly binding with the species) and an analogue.
of the distinguishable species, and the separation of the sample and the antibody by a semipermeable membrane (s) preventing the passage of high molecular weight proteins.
Antibodies of the selected species can be produced according to well known techniques involving the injection of the hormone, optionally with an adjuvant, at
laboratory animals followed by extraction and purification of the antibodies produced. Many such antibodies are commercially available. Numerous analogues of the species detectable by the method of the invention, and which can be distinguished, are also commercially available or can be obtained using techniques. As used herein, the terms "distinguishable analog" or "distinguishable analog" refer to a molecule having antibody binding properties similar to and preferably identical to those of the species. which one seeks to detect, and which is characterized by a property making it possible to easily obtain a measurement of its concentration.
Preferred analogs include a sample of the species to be detected labeled with a radioactive atom: for example thyroid hormones can conveniently be labeled with
<EMI ID = 16.1>
gamma radiation. However, consider the possibility of using other types of analogs, as long as the analog has a molecular weight and the resulting dimensions well below those of the natural proteins and the antibody being. uses. Thus, analogues can be produced by labeling a sample of the species to be detected with a relatively low molecular weight enzyme, fluorescent fragment or other fragment allowing quantitative measurement, by means physical or chemical,
of the concentration of the analog.
For the practice of the assay, the antibody and analog must be separated from the sample by one or more membranes of sufficient permeability to prevent the passage of antibodies and natural proteins (which uniformly have a molecular weight exceeding 20 000) but may allow the free passage of the species to be detected and its analogue. In a preferred embodiment of the invention, the membranes take the form of semi-permeable microcapsules containing the antibody and the analog.
It is interesting to note that the semipermeable microcapsules which are used have a similar permeability to that of the dialysis membranes described above. However, the wall of semi-permeable microcapsules is hundreds of times thinner than conventional dialysis membranes, and its specific contact surface area per unit weight is a number of orders of magnitude greater. T4 free or others
<EMI ID = 17.1>
displace, in proportion to their concentration, labeled T4 from T4 fixed on the antibody. Thus, during the incubation period, an equilibrium between free T4 and labeled T4 is approached in the capsule.
Suitable methods for encapsulating
Biological materials in membranes having the above permeability properties are described in detail in United States Patent Application Nos. 606,166, <EMI ID = 18.1>
and n [deg.] 30,847 filed April 17, 1979, as well as in the
United States Patent Application No. 24,600 filed
by F. Lim on March 28, 1979. The presently preferred method
to produce such microcapsules obtains, by an interfacial polycondensation technique, semi-permeable polyamide membranes. Solvents or solvent systems that are mutually immiscible with one another are chosen,
for example water and a cyclohexane-based solvent, and
is dissolved in water, with the material to be encapsulated, a monomer capable of forming, with a second complementary monomer,
a polymer. The aqueous solvent containing the material to be encapsulated is then emulsified in the other solvent, in order to
form several separate droplets. The second additional monomer is then added to the continuous phase of the emulsion to initiate polymerization around the droplets at the phase boundary. The permeability of the membrane and the uniformity of the polymer deposits are controlled by varying the affinity of the continuous phase of the emulsion for the encapsulated monomer.
during the polymerization and by controlling the concentration of the monomers subjected to the reaction and the duration of the polymerization.
In one approach, the continuous phase is at the beginning
a solvent or solvent system having a relatively high affinity for the encapsulated monomer such that,
in a first stage of the polymerization, a relatively thick polymer network is produced around the droplets. Then, the continuous phase is modified so as to reduce its affinity for the first monomer, for example by diluting the continuous phase with a second solvent or else by replacing the continuous phase with a fresh solvent. Upon addition of the second monomer, further polymerization preferably occurs within the initially deposited polymer network, covering macroporosity defects and resulting in uniform capsule membranes permitting diffusion of solutes below. a certain molecular weight.
In another approach, the continuous phase is chosen, at the beginning, so. to have a low affinity
for the encapsulated monomer. so as to form thin and relatively dense membranes in a first stage of polymerization. Then the affinity of the continuous phase for the encapsulated monomer is increased in order to pass additional amounts of the monomer through the membrane and to cause the deposition of a second outer layer of insoluble polymer.
When the discontinuous phase of the aqueous droplets is buffered so as to provide a compatible environment for labile biological materials such as an antibody, encapsulation can be carried out so as to retain a large percentage of the biological activity of the labile material. The operability of the encapsulated material is also retained by adding the second monomer in small amounts.
in the continuous phase throughout the duration of the polymerization so that its concentration is relatively low at any given time and the antibody is not exposed to high concentrations of potentially destructive substances.
In a preferred reaction system, aqueous droplets containing a diamine, high molecular weight filler and antibody are produced in a continuous phase of cyclohexane whose affinity for the monomer dissolved in the droplet phase is altered by addition of chloroform as a diluent. The addition of a diacid halide to the system results in the formation of semi-permeable polyamide microcapsules. This mtcroencapsulation approach can efficiently produce membranes
whose upper limit of permeability corresponds to a
molecular weight range between 2000 and 30,000. Thus, the capsules can easily be modified to allow the diffusion of many hormones.
To carry out the assay, the test sample is mixed with microcapsules of the type described and incubated, preferably at about 37 [deg.] C. Before incubation, the capsules can be suspended in a solution containing
a concentration of the analog of the species sufficient to load the antibody with a detectable amount of that analog. However, the assay can be carried out by adding the analog to the reaction system during or after incubation with serum. Proteins in the sample and protein-species or compound complexes cannot penetrate the wall of the microcapsules.
The antibody is then separated from the rest of the reaction system (possibly excluding the membranes of the microcapsules) and the analog is assayed in the antibody or
in the rest of the system. In a preferred method of effecting the separation, a high molecular weight hydrophilic material, such as a polyethyleneimine solution, is added.
or serum albumin with extra-capsular volume. This causes an increase in osmolarity resulting in collapse of the microcapsules and migration of unbound intracapsular hormone and its analogue passing into the supernatant. This results in a collapsed pellet of encapsulated antibody which, after an optional centrifugation treatment, can be isolated by aspiration or decantation of the supernatant. Alternatively, the separation can be effected by washing out the free species and the analog from the capsule.
<EMI ID = 19.1>
corresponding, present the assay results intended according to the invention to detect the presence of free T4, when
<EMI ID = 20.1>
1251 as an analogue, and solutions containing a known concentration of free T4. Tests performed on unknown samples by operating in parallel to the procedure used to assemble these data can be interpreted
by reference to the standard curves.
<EMI ID = 21.1>
Reference curve for dosing
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
Total count
for T4 (125I) added 86403
Incubation time: 2 hours at 37 [deg.] C
TABLE II
Reference curve for dosing
<EMI ID = 24.1>
<EMI ID = 25.1>
Total count
<EMI ID = 26.1>
Incubation time: 2 hours at 37 [deg.] C The invention will be better understood on examination of
the following detailed description of at least one example presented without limitation.
Preparation of microcapsules
A solution of hexanediamine carbonate (pH = 8.5 + 0.1) is prepared by mixing 17.7 ml of 1,6-hexane-
<EMI ID = 27.1>
the solution for about an hour or until the desired pH level is reached. A solution of terephthaloyl chloride (TC1) is prepared by adding 20 g of TC1 to 200 ml of an organic solvent consisting of 4 parts of cyclohexane and one part of chloroform. TC1 is dissolved by shaking vigorously
<EMI ID = 28.1>
per minute. Throw away any possible precipitate.
750 ml of cyclohexane are mixed with 125 ml of "SPAN-85" (sorbitan fatty acid ester emulsifier)
in a 2 liter capacity mixer fitted with a magnetic stirring bar. While stirring, a mixed solution obtained from one milliliter of thyroxine antiserum (4% in phosphate buffered saline solution; RF Laboratories, Houston, Texas, USA, is added to cyclohexane. or Radioassay Systems Laboratories, Carson, California, United States of America), 25 ml of 4% bovine serum albumin polyvinylpyrrolidone and 30 ml of hexanediamine carbonate solution. When the droplets of the desired size have been produced, 70 ml of TC1 solution are added. Thirty seconds later, 37.5 ml of TC1 are added. Sixty seconds later, 25 ml of chloroform are added. Add at 30 second intervals
three additional 25 ml aliquots of chloroform.
The microcapsules are collected by centrifuging the two-phase reaction system, decanting the supernatant liquid, and mixing the capsules with "TWEEN 20".
(polyoxyethylene derivative of a partial fatty acid ester
<EMI ID = 29.1>
with phosphate buffered saline solution. The capsules retain polyvinylpyrrolidone, bovine serum albumin and fillers, as well as thyroxine antibody.
Saturation of the Antibody with -1 'Analog Microcapsules obtained according to the above procedure can be loaded with thyroxine labeled with
125 1 (Cambridge Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, United States of America) according to the following steps:
1) 100 standardized tubes are taken and 0.5 ml of suspension of microcapsules and 1.0 micro-
<EMI ID = 30.1>
microCurie per microgram) - Allowed to incubate at 37 [deg.] C for at least 30 minutes.
2) The microcapsules are washed with twice their volume of phosphate buffered saline (0.15 M
<EMI ID = 31.1>
3) Centrifuged at 2000 g for 15 minutes and the supernatant liquid is removed by decantation.
4) Repeat steps 2 and 3 twice.
<EMI ID = 32.1>
times its volume of the phosphate buffered saline solution, described above. The total volume is 80 ml. 0.8 ml of the suspension of the microcapsules is used per test. Thus, the capsules allow to perform 100 tests.
Procedure for a test
1) Test samples (25 microliters) are placed
<EMI ID = 33.1>
free in separate tubes. On the reference curve from Table I, the concentrations of 0.5
<EMI ID = 34.1>
A control tube containing 25 microliters of saline solution can be included in the series to allow further verification of the accuracy of the assay.
2) 800 microliters of
<EMI ID = 35.1>
presaturation) in each tube.
3) Each tube is subjected to vortex and
<EMI ID = 36.1>
4) After incubation, 1.0 ml of phosphate buffered saline solution is added to each tube.
and containing 2.0% polyethyleneimine (molecular weight:
40000-50000).
5) Incubate for an additional 20 minutes.
6) The supernatant liquid is removed by decantation.
7) For each tube, the number of counts in a measuring system for gamma radiation is counted for one minute.
Calculation of results
1) Whenever an assay is performed to determine the unknown concentration of free T4 in one or more
samples, the standards should be assayed in the same way in order to prepare a standard curve.
2) After completion of the assay, a standard curve is prepared, as shown in Figures 2 or 3, using the values obtained using the standards which were assayed along with the unknown samples.
3) For each value, we can draw a curve
of the number of strokes per minute (cpm), on the linear scale of a semi-logarithmic paper, as a function of the concentration in. Free T4, in nanograms percent, on the logarithmic scale.
Instead of plotting the curve of the number of strokes per minute (cpm) as a function of the concentration of free T4, we can plot those of the percentage of bound substance (percent
<EMI ID = 37.1>
To do this, the percentage of bound substance (relative percentage) is calculated for each standard sample, for a control or for an unknown sample and the values are plotted on a semi-logarithmic paper, in a manner similar to that described previously for the number of strokes per minute. The percentage of bound substance (or relative percentage) is calculated as follows:
Percentage of bound substance cpm of bound substance / number
(relative percentage) mean cpm of bound substance
for the standard sample with the lowest concentration of free T4.
Figure 4 is a graph showing the concentration of <EMI ID = 38.1>
test each of which has been assayed by the method of the present invention and by the dialysis method. It is seen that there is a high degree of correlation between the two assay methods.
Figure 5 is a graph showing the frequency of a given free T4 concentration (ordinate number of samples with a given concentration; abscissa:
T4 in ng%), the graph being based on approximately 200 samples- <EMI ID = 39.1>
above Figure 6 is a graph of the concentration of free T4, in ng%, for about 100 test samples each of which was assayed by the method of the present invention and by the kinetic radioimmunoassay technique. It is seen that there is a high degree of correlation between the two assay methods.
Table III shows the degree of agreement between the results obtained for the same assay.
TABLE III
Variation within the same dosage
(values in ng / dl)
<EMI ID = 40.1>
<EMI ID = 41.1>
<EMI ID = 42.1>
results from one assay to another.
. TABLE IV
Variations from one dosage to another
(values in ng / dl)
<EMI ID = 43.1>
Here is a procedure for assaying digoxin.
<EMI ID = 44.1>
an antibody specific for digoxin.
Here are the reagents used, and the indication of their
provider :
Sodium bicarbonate
Cyclohexane
Chloroform
Sodium Chloride Fisher Chemical Sodium Phosphate, Monobasic
Sodium phosphate, dibasic
<EMI ID = 45.1>
Rabbit Anti-Digoxin Antiseruin Arnel Products, Brooklyn
New York
Bovine serum albumin
Brilliant Blue Comassie R Sigma Chemical Polyvinylpyrrolidone-40 Aldrich Chemical Terephthaloyl Chloride Eastman Kodak
Here is the amount used for each ingredient:
<EMI ID = 46.1>
Here are the different steps of the procedure.
Before use, all glassware is rinsed with distilled water.
1) A 2 liter glass mixer is placed under the hood on a magnetic stirrer.
2) On a bench next to the hood, the microscope is put into working order.
3) In. a 250 ml glass graduated cylinder, 125 ml of "Span-85" are carefully measured.
4) The measured quantity of "Span-85" is poured into
the glass mixer in the hood.
5) 750 ml of cyclohexane are measured in a 1000 ml glass graduated cylinder. Pour into the glass mixer in the hood.
6) A cover is placed on the mixer.
7) The magnetic stirrer is started.
8) 30 ml of hexanediamine carbonate are measured;
30 ml of phosphate buffered saline solution; 25 ml of 15% polyvinylpyrrolidone, Comassie blue and 4% bovine serum albumin; 5 ml of antibody; the 40 ml of buffered saline solution is mixed with the 5 ml of antibody in a 50 ml graduated cylinder.
9) A 5 cm stir bar with a spinning washer is placed in a 400 ml beaker. Place on the magnetic stirrer.
<EMI ID = 47.1>
The operation of the magnetic stirrer is started.
II} To the hexanediamine in the beaker are added in the order specified below: 25 ml at 15% polyvinylpyrrolidone / Comassie blue / 4% bovine serum albumin; 35 ml of buffered saline / antibody. We let mix for
2 minutes then the solutions are subjected to 3 minutes of mixing.
12) While the solution is subjected to the action
of mixture, in separate graduated cylindrical cylinders, glass, 100 ml capacity, a portion of 70 ml and a portion of 37.5 ml of TC1 (terephthaloyl chloride).
Cover with a watch glass and place in the hood.
- Four 25 ml portions of chloroform are measured in separate 25 ml glass graduated cylindrical test tubes. Cover with a watch glass and place in the hood.
13) By the side tubing of a flask, we add
<EMI ID = 48.1>
lying in the hood.
14) As quickly as possible, a sample of the solution in the mixer is taken with a 1 ml glass pipette, discarded after use, and placed on the microscope slide. The size of the droplets is determined to verify that they are acceptable
(diameter from 10 to 80 microns).
15) When the droplets have an acceptable size, at time T = 0, the measured portion of 70 ml of TC1 is added via the side pipe of the mixer. At T = 30
(exactly 30 seconds later), the second 37.5 ml portion of TC1 is added to the mixer through the side arm. Mix for exactly 60 seconds.
16) At the end of these 60 seconds (T = 90), a first portion of 25 ml of chloroform is added. We mix during
30 seconds (T = 120), a second measured portion of
<EMI ID = 49.1>
A third measured portion of 25 ml of chloroform is added and the mixture is mixed for 30 seconds (T = 180). A fourth measured portion of 25 ml of chloroform is added. Mix for exactly 30 seconds (T = 210 seconds). We stop the mixer.
17) The contents of the mixer are poured into two one liter plastic centrifuge bottles which have been rinsed 3 times in distilled water. Centrifuged for 3 minutes at 500 revolutions per minute.
18) The supernatant liquid is carefully decanted.
19) To each bottle, add approximately 50 ml of "Tween-20" solution (ie approximately the same volume of "Tween-20" as capsules). We mix well with the device
with a stirring bar for about 5 minutes.
20) Approximately 10-15 ml of buffered saline solution is added to each bottle. We shake well.
21) We repeat step 20 4 to 5 times.
22) 400 ml of buffered solution are added. We mix well.
23) We weigh and then centrifuge the bottles
<EMI ID = 50.1>
supernatant. About 800 ml of buffered saline solution is added to each bottle. Shake well and capsule.
24) The operation of step 23 is repeated 10 times.
After a final aspiration, we introduce into each bottle
100 ml of buffered solution and the contents of the two bottles are combined. We shake well. Pour into a glass graduated cylinder, 500 ml, and make up to 500 ml with buffered saline solution.
25) Store in a glass bottle, one liter, for reagent at 4 [deg.] C.
The washing "Tween-20" solution is prepared as follows. The procedure can be applied the day before using the solution.
1) 6.06 g of sodium bicarbonate is weighed on a precision balance.
2) The 6.06 g of sodium bicarbonate are carefully poured into a 250 ml volumetric flask containing a stir bar.
3) Add about 200 ml of purified water, place on the magnetic stirrer and stir until dissolved.
sodium bicarbonate.
4) Remove the stir bar and add purified water to make up to 250 ml.
5) Carefully pour into a 500 ml Erlenmeyer flask containing a stir bar.
6) Carefully measure 250 ml of "Tween-20" in
<EMI ID = 51.1>
7) "Tween-20" is introduced into the Erlenmeyer flask containing the sodium bicarbonate solution.
8) Place on a magnetic stirrer and stir until complete mixing (about 1 hour).
9) Store at approximately 25 [deg.] C in a one-liter polyethylene bottle, tightly closed using a screw cap.
The solution of terephthaloyl chloride is prepared as follows. This solution should be prepared on the day of use and not be refrigerated.
1) Note on the bottle containing the chloride
<EMI ID = 52.1>
weight of TC1, in grams, by ten to calculate the volume,
in milliliters of cyclohexane / chloroform solution to be added to TC1. It is ensured that the total volume is sufficient for the procedure applied.
2) The cyclohexane / chloroform solution consists of four parts of cyclohexane with one part
of chloroform. Divide the total volume of the solution by five
<EMI ID = 53.1>
calculate the volume of chloroform. This volume of chloroform is multiplied by four to determine the volume of cyclohexane.
So :
(a) n milliliters of total volume of cyclohexane / chloroform: 5 = ni milliliters of chloroform;
(b) n "milliliters of chloroform x 4 = n" milliliters of cyclohexane.
3) The calculated volumes of cycicnexane and chloroform are carefully measured in graduated cylinders. Mix in an Erlenmeyer flask. Gently swirl to mix. We cover with a watch glass. We place in
the hood .
4) A magnetic stirrer is placed in the hood.
5) The bottle containing TC1 is placed on the magnetic stirrer. This bottle is opened and a magnetic stirring bar is introduced as quickly as possible and
cyclohexane / chloroform solution. We replace the capsule
(or the cap) on the bottle.
6) Stir on the magnetic stirrer until all the TC1 has dissolved. It may be necessary to tilt or even invert the bottle to dissolve the TC1 itself.
possibly finding around the top of this bottle.
7) As quickly as possible, pour the same amount of TC1 solution into the required number of glass centrifuge bottles, 200 ml in capacity, and close. It is centrifuged for 10 minutes at. 2,600 revolutions per minute at room temperature.
8) The supernatant liquid is poured into 500 ml bottles, amber in color, which are tightly sealed.
9) Keep the bottles tightly closed at
<EMI ID = 54.1>
serum albumin:
The procedure is applied on the day of use of the solution. It should not be refrigerated.
<EMI ID = 55.1>
7.5 g of polyvinylpyrrolidone 40; 2 g of serum albumin
bovine and 0.1 g of Comassie blue.
2) The polyvinylpyrrolidone 40 is poured into a 50 ml glass beaker, comprising a stirring bar.
3) About 20 ml of phosphate buffered solution is added. A glass plate forming a cover is placed on the beaker.
4) Stir on a magnetic stirrer until dissolved.
5) 0.1 g of Comassie blue and 2 g of bovine serum albumin are poured into another 50 ml glass beaker.
6) About 20 ml of phosphate buffered solution is added. A cover glass plate is placed on the beaker.
7) The mixture is stirred and heated slightly using a magnetic stirrer n [deg.] 10 with a heating plate, the apparatus
heating being set at graduation 2. The mixture is left stirring until dissolved (approximately 10 minutes).
8) We carefully introduce a stirring bar
and the complete contents of the beakers containing the solution of polyvinylpyxrolidone 40 and the solution of Comassie blue in a
<EMI ID = 56.1>
9) Mix on a magnetic stirrer for
10 minutes the solutions thus combined. The stirring bar is removed.
<EMI ID = 57.1>
by phosphates.
11) Using a 1N solution of sodium hydroxide,
<EMI ID = 58.1>
original, the final pH and the amount of 1N NaOH used).
12) The solution is filtered with a disposable "Nalgene" membrane filtration device (0.45 micron).
<EMI ID = 59.1>
polyethylene, 60 ml, tightly closed with a cap or screw cap.
Here is the procedure for preparing the phosphate buffered saline solution.
This procedure can be applied the day before use.
1) In a 1000 ml graduated cylindrical glass cylinder, carefully measure 1000 ml of the phosphate buffered saline stock solution.
2) Pour into a polyethylene carboy of
20 liters.
3) Using a cylindrical test tube graduated in
<EMI ID = 60.1>
introduced into the carboy containing the buffered saline solution.
4) Stirred using a magnetic bar stirrer.
5) The pH is checked and adjusted, if necessary, to
<EMI ID = 61.1>
6) The phosphate-buffered saline solution is stored in the 20-liter, sealed polyethylene carboy. Store at about 25 [deg.] C until use.
Here is the procedure for preparing 1,6-hexanediamine carbonate.
This procedure can be applied the day before use.
1) Place a bottle of 1,6-hexanediamine in a 3 liter beaker. Sufficient tap water is introduced into this beaker to reach the level of hexanediamine in the bottle.
2) Lift the cap or the cap of the bottle
<EMI ID = 62.1>
3) The beaker is placed on a hot plate magnetic stirrer, the heating device of which is set at
graduation 2, until complete fusion of hexanediamine.
4) In a 25 ml graduated cylindrical glass cylinder, 17.7 ml of hexanediamine are measured accurately. Carefully poured into a 500 ml bottle, amber in color.
5) 32 ml of purified water are measured precisely in a 50 ml cylindrical graduated glass cylinder. This water is added to the hexanediamine in the amber colored bottle.
6. The CO2 solution is bubbled through for about an hour until the pH is equal to 8.5 + 0.1. The pH finally obtained is noted.
7) Close the amber-colored bottle tightly and store at approximately 25 [deg.] C.
FIG. 9 shows schematically the microcapsule and the principle of its operation. We see in this figure 9 of the antibody 9, specific for digoxin, which is enclosed within the wall 10 of the microcapsule 12. However, the wall 10 of the microcapsule 12 has openings 14 small enough to allow the free passage of digoxin. Thus, digoxin 16 from the sample and labeled digoxin 18 can freely pass through the walls of the microcapsules and compete with each other for antibody 9 sites. After incubation is complete. , digoxin
Optionally unbound 16 or 18 can be washed away from the inside of the microcapsule.
As indicated above, part of the digoxin is labeled, and this labeled digoxin competes with unlabeled digoxin from the sample for sites of the digoxin specific antibody. The preferred labeled digoxin is (125I) -digoxin which can be obtained
for example at New England Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, United States of America.
Here is the test procedure. dosage.
1) One or more samples are obtained by a procedure well known in practice: serum to be tested. In this example, cookies are used.
2) Using a pipette, 0.1 ml is introduced
<EMI ID = 63.1>
or serum from an unknown patient, in tubes correspondingly labeled and containing 0.5 ml of suspension of digoxin antibody microcapsules obtained as described above.
3) Using a pipette, we introduce into each
<EMI ID = 64.1>
phosphate buffered saline). Swirl for at least 3 to 4 seconds.
4) All reaction tubes are incubated in a 37 [deg.] C water bath for at least 15 minutes. / Alternatively, all reaction tubes are incubated at room temperature (20 [deg.] - 25 [deg.] C) for at least 30 minutes ?.
<EMI ID = 65.1>
in each tube. Swirl for at least 3 to 4 seconds.
6) All reaction tubes are incubated at
<EMI ID = 66.1>
7). All the tubes are centrifuged at 1600 g at least for 10 minutes at room temperature (20 [deg.] - 25 [deg.] C) and the supernatant liquid is decanted into an appropriate container intended to receive the rejects; the last drop is collected on blotting paper or other absorbent paper.
8) In a counting assembly for radiation
gamma, set for 125 I, all tubes are subjected to one minute
count for each tube.
9) A reference curve is plotted showing the relationship between known amounts of digoxin and the number
beats per minute, and the unknown quantities of digoxin are read on this curve.
Here are details of the reagents used:
The digoxin antibody is encapsulated in semi-permeable "nylon" microcapsules suspended in phosphate-buffered saline, as prepared above. For quality control, the microcapsules additionally contain antibody. a blue dye
<EMI ID = 67.1>
blue color, after deposition or sedimentation of the microcapsules by centrifugation, would indicate a rupture of the microcapsules and the possibility of leakage of the antibody.
Each milliliter of labeled digoxin solution
<EMI ID = 68.1>
at less than 4.2 microCurie.
The buffer solution is a phosphate buffer
0.015 M at pH 7.5, containing 0.15 M sodium chloride, 0.5% bovine serum albumin and 0.1% sodium azide.
The washing solution is a 20% solution of
<EMI ID = 69.1>
pH 8.9, containing 0.15 M sodium chloride.
The results. of a typical run of this experiment are shown in Table V and, graphically, in Figures 7 and 8.
In figure 7, the number of strokes per minute
(x 10 <3>) is plotted on the linear ordinate scale of a semi-logarithmic paper as a function of the concentration of
digoxin, in ng / ml (nanograms / milliliter) on the logarithmic scale of the abscissa. Instead of plotting the curve of counts per minute as a function of the concentration of digoxin, one can plot the curve of the percentage of bound substance.
(relative percentage), on the linear ordinate scale,
as a function of the concentration of digoxin (on the logarithmic scale of the abscissas: see FIG. 8). This can be achieved by calculating the percentage of bound substance
(relative percentage) for each of the titrated, control, or unknown samples and plotting these values on semi-logarithmic paper, in a manner similar to that described above for counts per minute. The percentage of substance (relative percentage) is calculated as follows:
Percentage of substance bound (average number of strokes per
(or relative percentage) minute of the bound substance, in
the case of the titrated or standard solution at 0 ng / ml of digoxin)
X 100.
TABLE V
<EMI ID = 70.1>
Total CPMs: 26,780
<EMI ID = 71.1>
* = number of strokes. per minute of the substance bound in the
case of zero digoxin content (0 ng / ml).
The method of the invention provides an assay which has
<EMI ID = 72.1>
less than 7% and the variation from one dosage to another is less than. 9%.
Here are the coefficients of variation. (CV) for two control samples, each of which was subjected 25 times to assay operations grouped in a single experiment:
<EMI ID = 73.1>
Here are the coefficients of variation, from one assay to another, for two control samples each having undergone three tests in eighteen separate experiments:
<EMI ID = 74.1>
Table VI shows that the assay of the invention has an extremely high specificity for digoxin and excludes other substances which may possibly interfere with the assay. This table shows the percentage of cross-reactivity of various biochemicals in the presence of antiserum antidigoxin in microcapsules.
TABLE VI
<EMI ID = 75.1>
The present method has been found to be highly quantitative allowing at least 96% of the digoxin added to the samples to be recovered.
: TABLE VII
<EMI ID = 76.1>
It is particularly important to note the high degree of correlation between the results obtained using the method of the invention and the determinations of digoxin made by other assay methods.
Table VIII shows comparative test results obtained with the method of the present invention and with other assay methods.
Systems A and C represent systems or reagents for liquid assay with separation of the reactants by precipitation, while System B uses solid phase separation. We see that the coefficient
<EMI ID = 77.1>
Lons assayed using reagent or system A, reagent or system B, reagent or system C and reagent or system of the present invention.
TABLE VIII
AGREEMENT BETWEEN VARIOUS DOSAGE OPERATING MODES
<EMI ID = 78.1>
It appears from the above that the assay technique described here can be used to determine the presence and concentration of any free species, provided that one has a complementary substance capable of binding specifically to this. species and that there is an analogue of the species that can be distinguished from it. It is also necessary that the molecular weight of the species or compound and its analogue
is sufficiently low that it is possible to use microcapsule membranes allowing selective diffusion of these substances while preventing the passage of high molecular weight materials such as natural proteins. Fortunately, steroid hormones, thyroid hormones,
many pharmaceuticals, drugs and other classes of substances of importance
in the clinical field are characterized by molecular dimensions much smaller than those of natural proteins.
It goes without saying that, without departing from the scope of the invention, numerous modifications can be made to the method and to the dosage kit described and shown.